UNIVERSIDAD ALFONSO X

EL SABIO
GRADO EN ODONTOLOGA

MICROBIOLOGA E INMUNOLOGA
GENERAL Y BUCAL

GUIN DE PRCTICAS
CURSO 16/17
1er CUATRIMESTRE

NORMAS PARA EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

1. Es obligatoria la utilizacin de la bata de laboratorio abrochada y de manga
larga durante las clases.
2. Las mesas de trabajo debern mantenerse libres de todo aquel material u
objeto que no sea estrictamente necesario para el desarrollo de la prctica.
Los abrigos, bolsos, libros, u otro material deber situarse en las zonas
dedicadas a tal fin.
3. No se permite la entrada al laboratorio de comida o bebida. Durante las
clases prcticas, los alumnos debern abstenerse de comer, fumar o mascar
chicle, evitando en todo momento llevarse a la boca lpices, bolgrafos u
otros objetos, para evitar el peligro de contaminacin.
4. En el laboratorio se debe llevar el pelo recogido y se tendr especial
precaucin con la llama de los mecheros.
5. Al comienzo de cada una de las prcticas, el profesor dar por escrito o
expondr

verbalmente

los

fundamentos

tericos

de

la

sesin

correspondiente. El alumno deber atender minuciosamente las indicaciones.

6. Los trabajos no darn comienzo hasta haber recibido los alumnos las
instrucciones pertinentes. Si el alumno no ha comprendido lo que debe
hacerse o tuviera alguna duda al respecto, deber consultar al profesor
antes de dar comienzo la prctica
7. En caso de producirse algn accidente (quemadura, corte, rotura de
material, derramamiento de cultivos, salpicadura en conjuntiva, etc.) o de
observar alguna anomala, el alumno deber advertir inmediatamente al
profesor, quien tomar las medidas oportunas.
8. No debe arrojarse por la pila, ni a la basura, los cultivos y materiales con
los que se ha estado trabajando, hasta que no hayan sido esterilizados.
Cualquier material sospechoso de contaminacin deber ser depositado en
los recipientes de evacuacin dispuestos a tal efecto (cubo negro).
9. Durante la clase prctica, el alumno velar por el buen uso del material e
instrumental disponible. Finalizadas las prcticas, el alumno recoger
minuciosamente el material utilizado y dejar ordenado el puesto de trabajo.
10.

Antes de salir del laboratorio es preciso lavarse las manos con agua y jabn,
y aclararlas con una solucin antisptica.

11.

La nota de prcticas se compone de una evaluacin continuada formada por

el trabajo diario y el examen del ltimo da. El incumplimiento de las normas
podr suponer un decenso de la nota final.

NDICE
DA 1
Prctica 1:

Toma y transporte de muestras

Medios de cultivo
Tcnicas de siembra

Prctica 2:

Identificacin microbiolgica: Tincin de Gram

DA 2
Prctica 1:

Lectura de cultivos

Practica 2:

Pruebas bioqumicas

Da 3
Prctica 2:

Lectura de las pruebas bioqumicas

Prctica 3:

Sensibilidad a los antimicrobianos: difusin y macrodilucin

DA 4
Prctica 3:

Lectura de las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos

Elaboracin de un informe microbiolgico

Prctica 4:

Esterilizacin. Tincin de esporas

DA 5
Prctica 4:
Examen

Lectura de las pruebas de esterilizacin

PRCTICA 1

TOMA Y TRANSPORTE DE MUESTRAS

MEDIOS DE CULTIVO
TCNICAS DE SIEMBRA

RECOGIDA DE MUESTRA
ENVO DEL INFORME

INTERPRETACIN
DEL INFORME Y
TRATAMIENTO

SISTEMA DE TRANSPORTE

ELABORACIN
DEL INFORME

PROCESAMIENTO
DE MUESTRA

MICROBILOGO
Papel del laboratorio de microbiologa en el diagnstico etiolgico de
enfermedades infecciosas: El objetivo de estas prcticas es conocer el proceso
completo desde que se toma una muestra hasta la obtencin de un diagnstico, si
no conocemos y entendemos este proceso los errores aparecern y los perjudicados
sern nuestros pacientes. En el segundo Cuatrimestre se realizarn pruebas
complementarias a estas prcticas, todas ellas deben entenderse en conjunto como
la prctica habitual de una clnica.

TOMA Y TRANSPORTE DE MUESTRAS

FUNDAMENTO
Normas generales para la correcta toma de muestras

Las muestras deben ir CORRECTAMENTE ETIQUETADAS y acompaadas de una hoja o

informe en el que deben constar: procedencia de la muestra, tipo de examen requerido,
diagnstico de presuncin, da y hora de la toma de la muestra, sexo y edad del paciente.
Las muestras deben ser recogidas en DISPOSITIVOS ESTRILES, evitando la
contaminacin biolgica y/o qumica.

La muestra debe ser REPRESENTATIVA.

La muestra debe ser recogida en una CANTIDAD ADECUADA.

Todas las muestras deben ser TRANSPORTADAS LO ANTES POSIBLE al laboratorio, y se

deben de salvaguardar del calor moderado o extremo y del fro extremo.

Transporte de muestras
El mtodo de transporte debe asegurar el cumplimiento de estos objetivos:

Evitar el contacto de la muestra con el oxgeno.

Impedir la desecacin de la muestra.
Impedir que se multipliquen o mueran los microorganismos presentes en la muestra.

Los sistemas de transporte ms adecuados para muestras de la cavidad oral son:

Jeringa montada. Una vez tomada la muestra se eliminan las burbujas de aire y se
introduce la punta de la aguja en un tapn de goma estril.
Hisopo. Se colocar en un tubo que contenga un medio semislido, previamente
reducido y esterilizado (PRAS).
Recipientes cerrados con atmsfera anaerobia. Tienen una atmsfera de CO2 o N2
libre de oxgeno, y un sistema de caldo o agar. Monouso.

MATERIAL

Hisopos estriles

Hisopos estriles con medio de transporte.

MTODO
1. Toma de muestra de:
a) Cavidad oral: lengua, encas, faringe, ...
b) Fosas nasales
c) Uas
d) Exudado tico
2. Elaboracin de un informe para la recogida de muestras. Cumplimentacin de
volantes.
3. Envo de muestras
4. Siembra de las muestras

INFORME MICROBIOLGICO PARA RECOGIDA DE MUESTRAS

N HISTORIA
Estudio solicitado por:

PRIMER APELLIDO

Servicio

SEGUNDO APELLIDO

Dr:

NOMBRE:

Planta/Hab/Cama

EDAD:

SEXO:

Tratamiento antimicrobiano previo:

No

Si

URGENTE

(Especificar:)
ORDINARIO

AMBULANTE INGRESADO

DIAGNOSTICO CLINICO:
Marcar con una X la opcin elegida para cada muestra (solo una muestra por volante)
TIPO DE MUESTRA Y FECHA DE TOMA /./..

PETICION

ORINA ESPUTO HECES

EXAMEN MICROSCOPICO DIRECTO

EX. NASAL EX. FARINGEO L.C.R.

TINCION DE GRAM

EX. HERIDA EX. OTICO SANGRE

TINCION B.A.A.R. (Ziehl)

EX. MUCOSA ORAL CATETER

TINCION GIEMSA

EX. CONJUNTIVAL BIOPSIA TEJIDO

CULTIVO DE MICOBACTERIAS

LIQ. PLEURAL LIQ. ASCITICO

CULTIVO DE BACTS. AEROBIAS

LIQ. DIALISIS LIQ. ARTICULAR

CULTIVO DE BACTS. ANAEROBIAS

ABSCESO SUPERFICIE R.N.

CULTIVO MICOLOGICO

SEMEN EX. URETRAL EX. VAGINAL

PARASITOS

B.A.S. L.B.A. CEPILLO TELESCOPADO

VIRUS (Adeno/Rota/VRS)

PIEL UAS CUERO CABELLUDO

ANTIGENOS BACT. MENINGITIS

OTRAS: Especificar

CULTIVO LEGIONELLA

I.F.D LEGIONELLA

I.F.D CHLAMYDIAS

OTRAS PETICIONES. Especificar.

OBSERVACIONES:
CONTROL INTERNO: N DE IDENTIFICACION DE MUESTRA:

MEDIOS DE CULTIVO
FUNDAMENTO
Composicin de los medios de cultivo

H2O
Peptonas: fuente C, N y S
Glcidos: fuente C y energa
Extracto de carne
Extracto de levadura
Suero o sangre de caballo o carnero
NaCl
Sales minerales
Agentes solidificantes:
. Agar: polisacrido de algas rojas. Lquido: 80-100C, slido <45C. No solidifica a pH
cido.
. Gelatina
. Gel de slice o silicagel: slido a pH cido.

Clasificacin medios cultivo:

Esimportante destacar que cada medio puede clasificarse de varias formas segn su
estado, composicin o utilidad como se detalla a continuacin
A. Segn su contenido

Definidos o sintticos. Composicin qumica exacta conocida.

Indefinidos o no sintticos. Composicin qumica exacta desconocida; su empleo se

basa en la experiencia. Ej. con extracto de carne, cerebro, ...

B. Segn su estado fsico

Lquidos. Poseen consistencia lquida. Si existe crecimiento aparece turbidez.

Slidos. Contienen 15 g agar/l. Donde se deposita una bacteria aparece una masa,
macroscpicamente visible denominada colonia, que es un clon procedente de una nica
bacteria original.

Semislidos. Contienen 7-8 g agar/l. Se usan para estudiar movilidad bacteriana o para
pruebas bioqumicas.

C. Segn su utilidad

Generales o bsicos. Contienen las sustancias nutritivas mnimas para el crecimiento

de bacterias metablicamente no exigentes.

Enriquecidos. Adems de los compuestos bsicos se han aadido ciertas sustancias

imprescindibles para el desarrollo de microorganismos exigentes en requerimientos
nutritivos. En ellos crecen prcticamente todas las bacterias.

Diferenciales. Incorporan elementos que facilitan la diferenciacin de las colonias

formadas por uno u otro tipo de bacteria, generalmente por variaciones de color de las
colonias, consecuencia de la manifestacin de alguna propiedad bioqumica de estos
microorganismos.

Selectivos. Inhiben el crecimiento de unas bacterias permitiendo el desarrollo de otras.

Contienen sustancias inhibidoras tales como bilis, cristal violeta, antibiticos.

Medios de transporte. Permiten la supervivencia de los microorganismos presentes en

una muestra patolgica durante algn tiempo. Se utilizan para el transporte de
muestras.

M. de conservacin. Sirven para mantener la viabilidad de los microorganismos

durante mucho tiempo en condiciones de baja temperatura.

M. de identificacin. Se utilizan para detectar diferentes productos catablicos

microbianos.

MATERIAL
Diferentes medios de cultivo de diferentes caractersticas: medios deshidratados, medios
preparados, placas, tubos, ...

BSICOS

Caldo Tioglicolato

Agar Muller Hinton

ENRIQUECIDOS

Agar sangre

Agar Chocolate

DIFERENCIALES

Agar Mac Conkey

Agar Verde Brillante

Agar sangre

TCNICAS DE SIEMBRA
DELIMITACIN DEL REA DE TRABAJO
Se deber trabajar siempre junto a la llama del mechero o en un entorno de unos 20 cm
alrededor de la misma.

FLAMEADO DE UN ASA DE SIEMBRA

Siempre que se vaya a utilizar un asa de
siembra deber esterilizarse por flameado
en la llama del mechero. El asa deber
situarse lo ms vertical posible hasta que
todo

el

filamento

se

ponga

al

rojo

simultneamente.
Terminada la esterilizacin del asa esta
debe utilizarse con precaucin, de manera
que

no

toque

ningn

material

contaminado (mesas, tubos, material de

laboratorio).
Una vez el asa ha sido utilizada, esta
debe

ser

flameada

de

nuevo

con

objeto de esterilizarla. Si se deposita

sobre la mesa sin esterilizar podremos
contaminar

la

zona

de

trabajo

nosotros mismos.

TCNICAS DE SIEMBRA
Con aguja de siembra

Agotamiento de asa en placa

4
1
3
2

En superficie

MTODO
1. Siembra de las muestras recogidas en los medios de cultivo adecuados.

INCUBACIN EN ESTUFA
Atmsfera de incubacin:

Microaerofilia
CO2
Aerofilia
Anaerobiosis

Temperatura de incubacin

Bacterias (mesfilos: 37 C)
Hongos (28 C, 37 C).

Tiempo de incubacin

Bacterias: 18-24 h

Micobacterias: 4-6 semanas

Hongos: 1-4 semanas

LECTURA DE CULTIVOS
Observacin macroscpica de los cultivos en medios slidos y lquidos:

Observacin de colonias: morfologa, color, tamao, consistencia, ...)

Turbidez en medios lquidos: observacin de la zona de crecimiento en el tubo.

Modificaciones observadas en los medios de cultivo: p. ej. hemlisis

Crecimiento en medio lquido

GRUMOSO

UNIFORME

INTERMEDIO

EN FONDO

Crecimiento en medio slido

VELO
SUPERFICIE

BORDES DEFINIDOS
SUPERFICIE LISA

PLANA

EXTENDIDA

CONCAVA

Crecimiento en olas tpico del gnero

Proteous

BORDES IRREGULARES
SUPERFICIE RUGOSA

UMBILICADA

CONVEXA

PRCTICA 2

IDENTIFICACIN MICROBIOLGICA
1. OBSERVACIN MICROSCPICA
FUNDAMENTO DEL MICROSCOPIO PTICO
El microscopio ptico permite observar objetos invisibles a simple vista, y superiores a 0.2
m. Posee una fuente de iluminacin con un condensador para regularla y un sistema de
lentes para amplificar las imgenes, formado por el objetivo, que es la lente prxima a la
platina, superficie donde se coloca la preparacin para ser observada, y los oculares, que son
las lentes a travs de las cuales se efecta la observacin.
El microscopio posee un revolver en el que se hallan dispuestos varios objetivos con lentes
de diferente capacidad de aumento que pueden intercambiarse. Los aumentos obtenidos con
el microscopio son los siguientes:

OCULAR
x 10

OBJETIVO

AUMENTO

x 10

100

x 40

400

x 100

1000

Al objetivo de 100 se le conoce como objetivo de inmersin, ya que al utilizarlo debe

ponerse una gota de aceite entre la preparacin y el objetivo, para unificar la refringencia del
sistema. Sin esta gota no se ve, pero hay que evitar que el aceite toque otros objetivos y en
todo caso limpiarlos bien despus de utilizar el aceite.
Para enfocar se dispone de un tornillo macromtrico y otro micromtrico que permiten
adecuar la distancia entre el objetivo y la preparacin, de modo que esta puede ser
enfocada.
Hay que tener precaucin al descender el objetivo para enfocar ya que puede golpearse la
preparacin y romperse tanto sta como la propia lente debido a su fragilidad, por lo que
debe enfocarse con mucho cuidado.
La intensidad de la luz debe ajustarse a las necesidades de observacin, controlando tanto la
emitida por la fuente, como su regulacin por la altura del condensador y el ajuste de su
diafragma.
Al acabar la observacin despus de retirar la preparacin debe LIMPIARSE CON GRAN
CUIDADO, con un papel suave y adecuado empapado en etanol, eliminando el aceite del
objetivo y la platina.

OBSERVACIN DE LAS BACTERIAS

El poder de resolucin del ojo humano es inferior al tamao de las bacterias. La visualizacin
de stas se efecta a travs del:
1. Microscopio ptico

Examen en fresco: KOH, solucin salina, ...

Tinciones bacterianas
-

T. simples. Sirven para observar la morfologa. Ej. Azul metileno.

Mtodo Gram. Tincin diferencial. Permite: observar morfologa y clasifica a

las bacterias en G(+) y G(-).

T.

cido-resistentes.

(Ziehl-Neelsen).

Detectan

bacterias

con

un

alto

contenido lipdico en la pared celular, como las bacterias cido-alcohol

resistentes (Ej. Micobacterias).
-

T. con colorantes fluorescentes. Ej. Naranja de acridina, FITC.

T. negativa. Nigrosina (tinta china): sirve para observar las cpsulas.

2. Microscopio electrnico
Posee un mayor poder de resolucin (hasta 250.000 aumentos), permitiendo el estudio de
virus y de las estructuras internas de la clula bacteriana.

MATERIAL

Batera de reactivos y colorantes

Muestras de microorganismos
Cristalizador y puente para el cristalizador
Portaobjetos y cubreobjetos
Aceite de inmersin

MTODO
Preparacin de una muestra para observacin
1. Toma de inculo
Con un asa de siembra estril se toma un pequeo inculo de un medio slido.
2. Extensin
En un portaobjetos se pone una gota de suero salino estril. El inculo es extendido en la
gota de agua depositada sobre el portaobjetos. Se deja secar la gota al aire o con calor
suave.
3. Fijacin
La preparacin se fija pasndola suavemente por la llama del mechero.

4. Tincin de Gram
Observacin de la morfologa bacteriana y clasificacin en G(+) o G(-).
Violeta genciana - 2 min.
Lavado con agua
Lugol - 1 min.
Lavado con agua
Alcohol-acetona- 30 seg
Lavado con agua
Safranina - 1 min.
Lavado con agua y secado.

5. Observacin al microscopio

Se observa la preparacin al microscopio con el objetivo de inmersin

Bacillus

Enterobacteria

Levaduras y Bacterias Gram -

2. PRUEBAS DE IDENTIFICACIN BIOQUMICA

FUNDAMENTO
Cada bacteria depositada sobre la superficie de un medio de cultivo slido se
multiplica durante la incubacin y da lugar a una enorme acumulacin de bacterias
que forman una colonia de tamao visible macroscpicamente. Todas las clulas
que la forman son idnticas entre si y constituyen un clon.
Para identificar una colonia bacteriana, de cada colonia diferente hay que efectuar
una extensin en un porta y practicar una tincin de Gram; as, las bacterias se
pueden clasificar en cuatro grupos:
1.
2.
3.
4.

Cocos gram-positivos
Cocos gram-negativo
Bacilos gram-positivos
Bacilos gram-negativos

Para poder identificar el gnero y especie bacteriana, dentro de cada grupo se

efectan una serie de pruebas metablicas. A continuacin veremos las ms
importantes:
1. Identificacin de cocos grampositivos
Pruebas bioqumicas gen.
Staphylococcus:
-

Catalasa
Test rpido de
aglutinacin en porta
(coagulasa)
API Staph

Pruebas bioqumicas gen.

Streptococcus:
-

Catalasa
Hemlisis
Optoquina
Bacitracina
Bilis Esculina

2. Identificacin de bacilos gramnegativos

-

Siembra en medios diferenciales y selectivos (agar verde brillante y

McConkey)
API Enterobacterias, Enterotube
Prueba del indol

3. Identificacin de levaduras
- Pruebas basadas en la utilizacin/fermentacin de diversos sustratos:
Auxocolor.
- Test de filamentacin

MATERIAL

Microorganismos problema.
Material necesario para la realizacin de las pruebas anteriormente sealadas.

MTODO

El profesor de prcticas dar las explicaciones necesarias para la realizacin de cada

prueba.

CATALASA

AGLUTINACIN EN PORTA

SISTEMA DE IDENTIFICACIN API

La batera de pruebas API20E API Staph son un sistema de identificacin rpida para
bacterias de la familia Enterobacteriaceae y el gnero Staphylococcus respectivamente.
Bsicamente consta de 23 tests bioqumicos estandarizados y miniaturizados y una base de
datos. Este sistema presenta las ventajas de ser rpido, eficaz y de permitir realizar
numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API contiene 20 microtubos o pocillos con distintos
sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioqumica distinta. Los microtubos se
inoculan con una suspensin de microorganismos, en agua o solucin salina, que rehidrata
los medios. Las tiras se incuban a 37 C y por efecto del metabolismo bacteriano se van a
producir cambios de colores espontneos o bien al aadir reactivos. La lectura de las
reacciones se hace mediante comparacin con una tabla de lectura
1.- Preparacin de cmara hmeda:
Se humidifica el sistema aadiendo agua
destilada en los pocillos de la base de
plstico transparente
2.- Preparacin del inculo: Se toma
con el asa de siembras una colonia de la
cepa a analizar y se resuspende en 5ml de
suero fisiolgico estril. Se homogeneiza
la suspensin.

3.- Siembra de los pocillos: Con ayuda

de una pipeta Pasteur estril (y chupetn)
se rellenan los pocillos del sistema de
identificacin segn las indicaciones.
Hasta el borde del tubo en todos los
casos excepto:
-en los marcados con el rectngulo abierto [_] en los que se rellena tambin la cpula (CIT, VP, GEL).
-en el caso de los tubos marcados con subrayado _ (ADH, LDC, ODC, H2S, URE), se realizar
anaerobiosis mediante adicin de parafina rellenando la cpula del tubo (una vez lleno el tubo con la
muestra). Se incuba a 37 C durante 18-24 h

Se observan los resultados de las pruebas bioqumicas en cada pocillo

Cocos Gram +

Bacilos Gram -

CATALASA

Staphylococcus

Cultivo en medios
diferenciales y selectivos

Streptococcus

AGLUTINACIN

API

HEMLISIS

+
S. saprofiticus
S. epidermidis

OPTOQUINA

BACITRACINA
S

API

Staphylococcus aureus

R
S. grupo B,D,C,E,F

S. Grupo A

S. epidermidis
S. saprofiticus
S. viridans

S. pneumoniae

BILIS ESCULINA

S. grupo B

+
S. Grupo D
Enterococcus faecalis

20

PRCTICA 3

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS

ANTIMICROBIANOS

FUNDAMENTO
Existen distintos mtodos para determinar la sensibilidad de los microorganismos a los
diferentes antimicrobianos: DIFUSIN y DILUCIN.
Independientemente del mtodo utilizado, la informacin se traduce en una clasificacin de
los microorganismos en sensibles, intermedios o moderadamente resistentes y resistentes.
La interpretacin se puede hacer segn distintos criterios (poblacionales, farmacolgicos y/o
clnicos), y suele aceptarse que un microorganismo es sensible cuando se puede tratar la
infeccin a las dosis recomendadas, intermedio cuando requiere dosis altas pero
alcanzables sin que existan riesgos de toxicidad para el paciente y resistente cuando no se
inhibe a concentraciones teraputicas.
Habitualmente, se acepta que no es necesario realizar pruebas de sensibilidad cuando no se
han descrito resistencias, y que s es necesario hacerlas cuando no se pueda predecir la
sensibilidad de un microorganismo. As, los microorganismos a los que ms frecuentemente
se les realizan estas pruebas son a los gramnegativos, S. aureus, algunos anaerobios,
patgenos oportunistas... Otro motivo para la utilizacin de estas pruebas es la labor de
vigilancia epidemiolgica del

laboratorio,

que

informar

sobre

la evolucin

de

las

resistencias.

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD POR DIFUSIN: ANTIBIOGRAMA

Esta tcnica se basa en el uso de discos que contienen una determinada concentracin de
antibitico, el cual va a difundir al medio, produciendo un gradiente de concentracin, de
manera que segn nos alejemos del lugar en el que se sita el disco, la concentracin ir
descendiendo. La distancia a la que se inhibe el crecimiento del microorganismo inoculado en
el medio se denomina halo de inhibicin, se mide en mm, y es inversamente proporcional
a la CMI (Concentracin Mnima Inhibitoria).

MATERIAL

Microorganismos problema.
Discos de antibiticos.
Placas con medio de cultivo, hisopos, ...

21

MTODO
1. Se toman algunas colonias de una placa reciente y se suspenden en solucin salina,
ajustando su concentracin aproximadamente a 105 UFC/ml (Unidades formadoras de
colonias/ml).
2. A continuacin, esta suspensin se inocula en una placa con agar Mueller-Hinton mediante
un hisopo con el que se extiende la suspensin por toda la superficie de la placa.
3. Antes de que transcurran 15 minutos y mediante pinzas estriles se aadirn los discos
con antibitico. Los discos llevan una determinada concentracin de cada antibitico y deben
estar separados unos de otros, al menos, 15 mm de distancia. Las placas se introducen para
incubar en la estufa a una temperatura de 37 C, durante 18-24 horas.
4. Las placas se colocarn con el agar hacia arriba, para evitar que el agua de condensacin
se acumule sobre el cultivo.
5. Transcurrido este tiempo se sacan las placas de la estufa y se procede a su lectura. Para
ello se miden los mm de halo y se interpretan en funcin del antibitico y del
microorganismo. Existen tablas que recogen los criterios en funcin de los cuales
clasificamos a los microorganismos en sensibles (S), de resistencia intermedia (RI) o
resistentes (R).

INTERPRETACIN DE LOS DIAMETROS DEL ANTIBIOGRAMA

Existen tablas que recogen los criterios en funcin de los cuales clasificamos a los
microorganismos en sensibles (S), de resistencia intermedia (RI) o resistentes (R)
22

INTERPRETACIN DE LOS DIAMETROS DEL ANTIBIOGRAMA

23

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD POR DILUCIN:

MACRODILUCIN EN CALDO
Consiste en la determinacin de la CMI (Concentracin Mnima Inhibitoria) utilizando una
serie de tubos que contienen caldo y diferentes concentraciones de antibitico.

MATERIAL

Microorganismos problema.
Antibiticos.
Tubos, caldo Mueller-Hinton, micropipetas, placas, ...

MTODO
1. Se utiliza una batera de tubos de ensayo, cada uno de los cuales contiene 1 ml de caldo
Mueller-Hinton. Al primer tubo se le aade 1 ml del caldo con el antibitico a una
concentracin determinada, se mezcla por inversin del tubo, y se pasa 1 ml al tubo
siguiente.
2. En el tubo 2 se repite el mismo proceso y se pasa 1 ml al tubo 3, y as sucesivamente. De
esta forma hacemos lo que se denomina un banco de diluciones, como consecuencia del
cual tendremos una batera de tubos con 1 ml de caldo Mueller-Hinton con concentraciones
de antimicrobiano al duplo, es decir, cada tubo contendr doble concentracin que el
siguiente.
3. Para preparar el inculo a partir de un cultivo joven se siembran 3-4 colonias en caldo
Mueller-Hinton, y se incuba el matraz hasta que alcance una turbidez que se corresponda
con una concentracin de 106 UFC/ml. El ajuste de la concentracin del inculo se puede
realizar utilizando la escala de McFarland o un espectofotmetro.
4. Una vez ajustado el inculo a 106 UFC/ml, se aade 1 ml a cada uno de los tubos de la
batera que se ha preparado siguiendo las instrucciones anteriores, de manera que el inculo
final es de 5x105 UFC/ml.
5. Los tubos se incuban en la estufa a 37 C durante 18-24 horas, tras las cuales se realiza
la lectura observando la turbidez. La concentracin de antimicrobiano del primer tubo en el
que no haya crecimiento (no haya turbidez) ser la CMI.

LECTURA E INTERPRETACIN PRUEBAS DE SENSIBILIDAD

Lectura del antibiograma.

Lectura de la CMI.
Interpretacin de los resultados.

Concentracin mnima inhibitoria

(CMI): Se trata de la dosis mnima
con la que un frmaco inhibe el
crecimiento
de
un
determinado
patgeno, y es indicativa de la
eficacia del antibitico

24

PREPARACIN BATERA TUBOS CON ANTIBITICO

1 ml ATB
32 mg/l

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

CONTROL

16 mg/l

8 mg/l

4 mg/l

2 mg/l

1 mg/l

INOCULACIN
1 ml

1 ml

8 mg/l

1 ml

4 mg/l

1 ml

2 mg/l

1 ml

1 mg/l

1 ml

0.5 mg/l

OBSERVACIN CRECIMIENTO
CMI

8 mg/l

4 mg/l

2 mg/l

1 mg/l

0.5 mg/l

25

PRCTICA 4

ESTERILIZACIN. DETECCIN DE ESPORAS DE Bacillus spp.

FUNDAMENTO
Las bacterias de los gneros Bacillus y Clostridium se caracterizan porque forman
endosporas. Las endosporas son formas de resistencia que garantizan la supervivencia de la
especie ante situaciones adversas (agotamiento de nutrientes, cambios de temperatura,
acumulacin de metabolitos txicos...). Estas estructuras, que contienen una copia completa
del genoma, se desarrollan en el interior de la clula bacteriana, pudiendo alcanzar un
dimetro considerablemente mayor que el de la clula. La clula acaba por lisarse y morir
dejando libre a la espora. Las endosporas germinarn cuando las condiciones ambientales
vuelvan a ser favorables. Algunas enfermedades muy conocidas son producidas por especies
de los gneros Clostridium y Bacillus: C. tetani (ttanos), C. perfringens (gangrena gaseosa),
C. botulinum (botulismo), B. anthracis (antrax).
El gnero Bacillus est formado por bacterias Gram (+) aerobias formadoras de endosporas.
El anlisis de esporas se puede realizar en aguas, alimentos y material quirrgico puesto que
su gran termorresistencia les convierte en potenciales supervivientes a procesos de
esterilizacin incorrectos.

Esterilizacin y desinfeccin

Calor seco: Horno Pasteur

Calor hmedo: Autoclave (Ciclo de esterilizacin: 20 min, 120 C, 1 at)

Controles

de

esterilizacin:

Qumico

(cintas

indicadoras)

microbiolgico

(esporas

bacterianas).

Desinfeccin

MATERIAL

Muestras a analizar
Morteros estriles.
Bao termosttico.
Autoclave.
Reactivos para tincin de esporas, tubos, pipetas,

MTODO
Tincin de esporas
1. Realizar un frotis y fijar a la llama del mechero
2. Aadir Verde malaquita.
3. Calentar hasta la emisin de vapores.

10 min.

4. Lavado con agua

5. Aadir Safranina 1 min
6. Lavar con agua y secar
7. Observar al microscopio con el objetivo de inmersin.

21

Deteccin de esporas
1. Se dispone de dos soluciones posiblemente contaminadas con bacterias problema A
y B.
2. Se rotulan tres tubos eppendorf como A1, A2 y A3 y se reparte 1 ml de la bacteria A
a cada uno.
3. Se rotulan otros tres eppendorf como B1, B2 y B3 y se reparte 1 ml de la bacteria B a
cada uno.
4. Los A1 y B1 se dejan encima de la mesa (Incubacin a temperatura ambiente). Estos
tubos sirven como control positivo de crecimiento.
5. Los tubos A2 y B2, se introducen a continuacin en el bao previamente calentado a
85 C durante 10 minutos. Transcurrido ese tiempo se proceder a sembrar las
muestras (10 l) en placas de agar.
6. Los tubos A3 y B3, se introducen en el autoclave (120 C, 1 at, 20 min), para
posteriormente hacer una siembra en placas de agar.
7. Sembrar cada muestra del siguiente modo

A1

A2

A3

B1

B2

B3

8. Todas las placas de agar se incubarn en la estufa durante 18-24 horas, observando
transcurrido ese tiempo la existencia o no de crecimiento.

Autoclave

Esporas de Bacillus subtilis

Ciclo de esporulacin

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API STAPH

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