Manual Inmunología Aplicada

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA

DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS
INMUNOLOGA APLICADA

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE
BIOTECNOLOGA
MANUAL DE PRCTICAS
DEL
LABORATORIO DE INMUNOLOGIA APLICADA
Profesores de Laboratorio
Dra. Mara del Carmen Oliver Salvador
M. en C. Paola B. Zrate Segura
Dr. Luis Gilberto Torres Bustillos
M. en C. Rodrigo Balam Muoz Soto
IBT Hctor Molina Jimnez
IBT Hernn Corts Arroyo
OCTUBRE 2008

INMUNOLOGA APLICADA
NDICE GENERAL
PRCTICA 1. TIPIFICACIN DE GRUPOS SANGUNEOS
PRCTICA 2. ESQUEMAS DE INMUNIZACIN
PRCTICA 3. REACCIONES DE PRECIPITACIN
14
PRCTICA 4. DETERMINACIN DE PROTENA POR EL MTODO DE BRADFORD 18

PRCTICA 5. DETERMINACIN DE REACCIN Ag-Ac POR
ELECTROTRANSFERENCIA
20

INMUNOLOGA APLICADA
REGLAMENTO DEL LABORATORIO
El laboratorio representar el 30% de la calificacin final de la materia de Inmunologa

Aplicada.
La calificacin de laboratorio se distribuir de la siguiente manera:
1. TRABAJO PRCTICO 40%
- Asistencia al laboratorio.
- Puntualidad. Se dar un mximo de tolerancia de 10 minutos.
- Manutencin de los conejos. Se evaluar la limpieza del bioterio as como
el cumplimiento y la responsabilidad de los conejos diariamente.
- Cada alumno deber presentarse a la sesin de laboratorio con bata y con
el manual de prcticas engargolado en el cual debern anotar todos los resultados
obtenidos en las prcticas.
No se permitir el acceso al laboratorio si no se cumple este requisito.
- El material se entregar una vez llenado de manera correcta el vale
correspondiente.
- El comportamiento del alumno dentro del laboratorio estar regido por el
reglamento general del laboratorio de biotecnologa.
2. INFORME POR EQUIPO 40%
Este porcentaje se divide en:
- Introduccin 10%
- Objetivo
- Resultados 15%
- Discusin de resultados 20%
- Cuestionario 20%
- Conclusiones 30%
- Referencias 5%
(diferentes a las mencionadas en la prctica)
3. EXAMEN DE LABORATORIO
Consistir en una evaluacin del conocimiento adquirido durante las prcticas

INMUNOLOGA APLICADA
PRCTICA 1
TIPIFICACIN DE GRUPOS SANGUNEOS
1. INTRODUCCIN
SISTEMA ABO
Los eritrocitos poseen en su membrana sustancias antignicas determinadas
genticamente, las cuales pueden identificarse mediante anticuerpos especficos. El
primer grupo de estas sustancias fue identificado por Landsteiner en 1901, y le llam
sistema ABO, el cual consiste en que un individuo tiene en sus glbulos rojos uno, dos o
ninguno de los dos antgenos (A y/o B) pertenecientes a este sistema. As, los individuos
pueden ser del tipo A, si solamente poseen el antgeno A; del tipo B, si nicamente tienen
el antgeno B; del tipo AB si poseen ambas, o del tipo 0 si no tienen ninguno de los dos.
La naturaleza qumica de los determinantes antignicos es polisacardica.
Aproximadamente el 85% de la poblacin posee sustancias con caractersticas
antignicas y estructurales similares a las presentes sobre las membranas de los
eritrocitos en prcticamente todas las secreciones corporales. A estos individuos se les
llama secretores.
Los carbohidratos que forman estructura antignica A y B en la membrana de los
glbulos rojos, tambin estn presentes en otros materiales biolgicos como bacterias,
alimentos y otros agentes ampliamente distribuidos que constituyen un persistente
estmulo. Los humanos reaccionan a este estmulo produciendo anticuerpos contra
aquellos antgenos que no forman parte de su propia estructura celular. Por esta razn, el
anticuerpo anti-A se produce en personas del grupo AB, que contienen ambos antgenos,
no forman dichos anticuerpos. A estos anticuerpos se les llama isohemaglutininas.
Sistema Rh
En 1939. Levine y Stetson reportaron el caso de una mujer con severa reaccin
hemoltica despus de la transfusin sangunea proveniente de su esposo. El antgeno
responsable fue diferente de los ya conocidos en la poca.
En 1940, Landsteiner y Winier inmunizaron conejos y cobayos con eritrocitos de
monos Macacus rhesus, basandose en la suposicin de que en los eritrocitos de estos
monos podran existir antgenos similares a los de los humanos. El suero obtenido
aglutinaba los glbulos rojos de los monos rhesus y del 85% de la poblacin humana
blanca.
Hasta ese momento todo sugera que el supuesto antgeno hallado por
Landsteiner y Wiener en monos, y el supuesto antgeno descrito por Levine y Stetson en
humanos, era el mismo. Posteriores investigaciones demostraron que los supuestos
antgenos eran diferentes; se determin que la mayora de los humanos tienen el antgeno
del mono rhesus y adems otro diferente, pero relacionado. A sugerencia de Levine, se
conserv la demostracin del factor Rh para el antgeno humano, y se le asign el nombre
de LW al antgeno comn al hoimbre y al mono.
A mediados de la dcada de los 40, se haban identificado cinco antgenos como
pertenecientes al actualmente denominado Rh. Estos cinco antgenos (C, c, D, E, e) se
combinan entre s, dando lugar a diversos patronesantignicos. El D tiene dominancia
antignica. Los individuos que presentan el antgeno D en sus eritrocitos se denominan
Rh(+), y aquellos que no tienen el antgeno D se denominan Rh(-).

INMUNOLOGA APLICADA
Adems de los sistemas AB0 y Rh pueden ser detectados otros sistemas

antignicos de la membrana de los eritrocitos (Lewis, Duffy, MN, Ss. Li, etc). Estos
sistemas se consideran secundarios.
El conocimiento de los antgenos sanguneos ABO y Rh. Como antgenos
celulares importantes en transfusiones sanguneas, en medicina legal y en la
isoinmunizacin materno-fetal.
Los anticuerpos del sistema ABO son principalmente de clase IgM. Por lo que son
altamente aglutinantes y fijadores de complemento. Por este motivo, la determinacin de
este sistema es de gran relevancia en transfusiones sanguneas.
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GENERAL
Determinar el sistema ABO y Rh de diferentes muestras.
2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
2.2.1 Realizar la extraccin sangunea por jeringa
2.2.2 Realizar la tipificacin sangunea del sistema ABO
3. MATERIALES Y REACTIVOS
3.1 Material por grupo
Centrfuga clnica
Bao mara a 37C
3.2 Material por equipo
1 Frasco de torundas de alcohol
2 portaobjetos
3 pipetas Pasteur
Jeringa desechable de 5 mL con aguja de 21x32mm
2 tubos de ensaye de 13x 100mL
1 pipeta serolgica de 5 mL
1 pipeta serolgica de 1 mL
5 palillos de madera
Sueros tipificadotes anti-A, anti-B, anti-AB
Solucin de albumina bovina al 25%
Eritrocitos humanos tipo A, B y 0, en suspensin al 5%
2 tubos de ensaye 10 x 75mm
Tubo con tapn de rosca
Suero tipificador anti-D comercial
Solucin salina al 0.85%
Suero de Coombs
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
4.1. Tipificacin Sangunea
1. Obtener aproximadamente 5 mL de sangre venosa y colocarla en un tubo sin
anticoagulante, permitir que se retraiga el cogulo incubando a 37C 10 min y centrifugar
para separar el suero del paquete celular.

INMUNOLOGA APLICADA
2. Rotular una placa o portaobjetos de la siguiente manera: anti-A, anti-B, anti-AB y

testigo. Rotular otra placa diferente con: A, B y 0.
3. Del mismo tubo donde se dej coagular la sangre, con una pipeta pasteur tomar
eritrocitos del fondo (de los no atrapados en el cogulo). Colocar una gota de esta
suspensin en el portaobjetos que tiene las marcas anti A, anti-B, anti-AB y testigo.
4. Cerca de cada gota, adicionar una gota de suero comercial anti-A, anti-B y antiAB, segn corresponda y en el lugar marcado como testigo, colocar una gota de la
solucin de albmina al 25%. Mezclar primero suavemente con un palillo y despus con
movimientos rotatorios.
5. Buscar la presencia de aglutinacin antes de 25 seg.
Por ejemplo, si se observa el siguiente resultado:
Aglutinacin
Anti-A
-
Anti-B
+
Anti-AB
+
Testigo
-
Esto indicara que los eritrocitos probados corresponden al grupo sanguneo B.

6. Para buscar las isohemaglutininas, en la otra placa marcada como A, B y 0,
colocar una gota del individuo frente a las marcas y agregar cerca una gota de eritrocitos
previamente tipificados de tipo sanguneo A, B y 0, segn corresponda.
7. Mezclar suavemente, primero con ayuda de un palillo y despus con
movimientos rotatorios.
8. Buscar la presencia de aglutinacin.
Resultados.
De acuerdo al ejemplo anterior, los resultados esperados para confirmar el grupo
sanguneo seran:
Aglutinacin
A
+
B
-
0
-
Por lo que el individuo correspondera al tipo B.

En el sistema ABO el grupo sanguneo esta dado por la siguiente tabla.
Reaccin de los eritrocitos con antisueros
comerciales
Anti-A
Anti-B
Anti-AB
+
+
+
+
+
+
+
-
Reaccin con el suero con antgenos

conocidos
A
B
O
+
+
+
+
-
Grupo
sanguneo
A
B
AB
O
En caso de que se presente aglutinacin en el testigo, se debe a que existen

autoanticuerpos antieritrocitos y esto DEBE de ser reportado inmediatamente.
4.2. Sistema Rh
De este sistema por su mayor inmunogenicidad, slo se determina de forma
rutinaria el antgeno D en caso de requerirse una transfusin sangunea. Por la
naturalez proteica del antgeno, los anticuerpos inducidos son de clase IgG que
pueden atravesar placenta y causar hemlisis intrauterina en caso de incompatibilidad
materno-fetal.

INMUNOLOGA APLICADA
1. Con una pipeta Pasteur colocar cuatro gotas de sangre en un tubo con tapn de
rosca que contenga 2 mL de SS.
2. Marcar dos tubos: Rh y Testigo, colocar una gota de eritrocitos en cada uno.
3. Al tubo Rh adicionar una gota de suero anti-D y agitar suavemente.
4. Al testigo adicionar SS y agitar suavemente.
5. Centrifugar 1000 rpm 60seg
6. Buscar aglutinacin, en caso de que el tubo Rh presente es Rh(+)
7.Si no hay en ninguno incubar a 37C, 20 min y lavar 3 veces con SS centrifugando a
1500 rpm 2 min. Despus de la ltima centrifugacin remover el sobrenadante y
adicionar al paquete celular dos gotas de suero de Coombs.
8. Resuspender suavemente y centrifugar ambos tubos a 1000 rpm 60 seg.
Resultados.
Presencia de aglutinacin.
Rh con aglutinacin corresponde al grupo Du Rh(+), en caso negativo Rh(-).
Testigo debe ser negativo, en caso opuesto es autoinmune. Para transfusin el sujeto
clasificado como Du, se considera como donador Rh (+) y receptor Rh (-).
5. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.
1. Bird, G. W.G. and Cunningham, J. 1977. Agglutination and agglutinationinhibition. Techniques in Clinical Immunology. R.A. Ed. Thompson, Black Scientific
Publications. Oxford.
2. Dodd, B.E. and Lincoln, P.J. 1975. Blood Group Topics. John Turk Editor. Year
Book Medical Publishers, Inc.Chicago.

INMUNOLOGA APLICADA
PRCTICA 2
ESQUEMAS DE INMUNIZACIN
1. INTRODUCCIN.
La Inmunizacin es el proceso, natural o artificial, mediante el cual un individuo
competente desarrolla una respuesta inmune al entrar en contacto con un inmungeno. El
tipo y magnitud de la respuesta producida se deben a mltiples variables entre ellas se
encuentra: la inmunogenicidad de un antgeno, que depende de su complejidad
estructural, peso molecular, conformacin y naturaleza qumica, dosis, va de
administracin etc.
La sntesis de anticuerpos (Ac) es dirigida contra molculas especficas que el organismo
no reconoce como propias (determinantes antignicos), para que esta sntesis ocurra,
primero debe existir un contacto entre las clulas encargadas de la sntesis y el
determinante antignico, contacto que es mediado por algunas clulas involucradas en la
respuesta celular.
Cuando un organismo se expone a un antgeno desconocido, el sistema inmune puede
requerir mucho tiempo para producir cantidades apreciables de anticuerpos. Al final de la
infeccin la concentracin alcanzada de anticuerpos declina. A tal respuesta se le llama
primaria. Cuando el organismo se expone posteriormente al antgeno, la respuesta ocurre
mucho ms rpido y la concentracin alcanzada, es apreciablemente mayor, en este caso
se habla de respuesta secundaria.
La aplicacin prctica de los antisueros es muy diversa, pues se puede utilizar con fines
teraputicos (inmunizacin pasiva), en diversos estados infecciosos o txicos (neumona
lobar, ttanos, etc.). Adems son tiles en la identificacin de microorganismos aislados
de procesos infecciosos y en la clasificacin taxonmica de diversas especies. Tambin
han servido como herramienta de trabajo para dilucidar mecanismos inmunolgicos
bsicos (especificidad inmunolgica, activacin del complemento, fagocitosis,
citotoxicidad, etc.) y en la determinacin rpida y especfica de la naturaleza de diversas
sustancias
qumicas
(protenas,
carbohidratos,
haptenos,
etc).
ADYUVANTES INMUNOLGICOS
Son sustancias inmunomoduladoras que constituyen una familia muy heterognea
si se toman en consideracin su origen, naturaleza qumica y actividad biolgica
especfica; Como los agentes inmunopotenciadores, a los cuales se les atribuyen 2
funciones fundamentales: la estimulacin de la resistencia no especfica del husped
contra las enfermedades infecciosas y el cncer; y, por otra parte, la potenciacin de la
inmunogenicidad de las vacunas comerciales y de la respuesta de los animales de
laboratorio durante la inmunizacin experimental con vistas a la produccin de antisueros.
Los adyuvantes son sustancias o preparados que incorporados al antgeno o inyectados
simultneamente con l, hacen ms efectiva la respuesta inmune. Con su empleo se logra
una economa de antgeno y de tiempo, as como un mayor nivel de anticuerpos
especficos. El aumento de la inmunogenicidad puede estar mediado por uno o varios de
los siguientes procesos:
a) Incremento de la produccin de anticuerpos especficos frente a un antgeno
vacunal.

INMUNOLOGA APLICADA
b) Aumento de la afinidad de los anticuerpos inducidos con una potenciacin de su

funcin neutralizante, germicida, opsonizante etc.
c) Incremento de la magnitud y/o efectividad de la respuesta mediada por clulas
T.
d) Generacin de una respuesta humoral y/o celular de mayor duracin.
e) Generacin de una respuesta incrementada de memoria inmunolgica.
Algunos adyuvantes son en si antignicos (endotoxinas de bacterias gramnegativas,
como Bordetella pertussis, o algunas bacterias grampositivas y el gnero de las
micobacterias, etc.) mientras que otros no lo son (tartrato de alumnico de potasio o
alumbre, fosfato de calcio, aceite mineral, lanolina, diversos agentes tensodepresores,
polinucletidos y otros).
El adyuvante incompleto de Freund es una mezcla de aceite mineral (Drakeol, Bayol o
Nujol) con un detergente (Falba, Arlacel, Aquafor) en diferentes proporciones, por
ejemplo, Arlacer-Drakeol (1:9); Arlacel-Bayol (3:17). El adyuvante completo de Freud
(FCA) contiene adems del aceite y el detergente, una micobacteria (M. tuberculosis, M.
bovis u otras) cuya cantidad es variable (de 1 a 5 mg de la bacteria, peso seco, por cada
mL de la mezcla incompleta de Freund). Este ha sido utilizado durante ms de 50 aos en
la produccin de antisueros en animales y es empleado con frecuencia cuando se dispone
de cantidades limitadas de antgenos o cuando presentan una baja inmunogenicidad. La
gravedad de su toxicidad fue reconocida inmediatamente, pero los esfuerzos por
encontrar opciones igualmente efectivas y menos txicas no han resultado del todo
exitosos. Con los avances alcanzados en numerosas reas de las ciencias biolgicas y el
creciente inters por el bienestar de los animales de experimentacin, existe una
considerable presin para restringir el uso del FCA, y aunque no se cuenta en la
actualidad con alternativas definitivas para este adyuvante, en diferentes estudios
comparativos se informan resultados estimulantes en cuanto a eficiencia, menor nmero
de efectos adversos y mayor facilidad en la manipulacin.
En los humanos no se recomienda el uso de este tipo de adyuvante Freund completo e
incompleto ya que frecuentemente su aplicacin conduce al desarrollo de granulomas
severos.
VAS DE INMUNIZACIN.
Se pueden emplear vas tales como la oral, nasal, intramuscular, intravenosa,
intracardiaca, intraperitoneal, intradrmica, subcutnea, etc.
El estado fsico del antgeno (particulado o soluble) debe tenerse en cuenta para escoger
la ruta de inmunizacin; es decir, los antgenos particulados por lo general son
introducidos por va intravenosa, mientras que los antgenos en solucin pueden
introducirse por otras vas como la intramuscular, la intraperitoneal, la subcutnea o la
intradrmica. En estas dos ltimas vas preferentemente se utiliza al antgeno
acompaado con adyuvante.
La mayora de las veces slo se logra una respuesta adecuada llevando a cabo ms de
un estmulo antignico, asegurando as que se obtendrn ttulos altos de anticuerpos o el
nmero deseado de clulas especficas estimuladas.
2. OBJETIVOS.
2.1. OBJETIVO GENERAL.
Desarrollar diferentes esquemas de inmunizacin en animales.
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INMUNOLOGA APLICADA
2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS.

2.2.1. Desarrollar esquema de inmunizacin en conejos raza Nueva Zelanda
2.2.2. Desarrollar el esquema de inmunizacin para diversos antgenos
3. MATERIALES Y REACTIVOS.
3.1 Material por Grupo.
Centrfuga clnica.
Bao Mara a 37C.
3.2. Material por Equipo.
Antgeno suficiente para inmunizar a conejos, de acuerdo al protocolo de
inmunizacin.
Un conejo que no rebase 5 Kg. de peso (de preferencia de color blanco, para
facilitar la localizacin de la vena marginal de la oreja).
Adyuvante incompleto de Freund.
Jeringas de 1 mL con aguja de 25x16 (5/8) mm.
Un lienzo para sujetar al conejo.
Un frasco con torundas de algodn y alcohol al 70%.
Frasco de solucin salina fisiolgica estril (0.85%).
Mechero Bunsen.
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL.
4.1 TOMA DE MUESTRA SANGUNEA
Para todos los antgenos el sangrado se hace antes y despus de la ltima inmunizacin,
tratando de extraer la mayor cantidad de sangre posible. El sangrado previo es
indispensable para contar con un suero testigo.
Venosa.
1. Inmovilizar al animal.
2. Tomar la oreja.
3. Limpiar la zona de la vena lateral con alcohol al 70%.
4. Sujetar y colocar una torunda con agua tibia para ayudar a la exposicin del a
vena.
5. Hacer un corte con una navaja de bistur estril de 2mm de longitudinalmente a
la vena y colectar 2 mL por goteo en un tubo sin anticoagulante.
6. Una vez colectados los 2mL, colocar un vendolete en la oreja.
Antes de iniciar el esquema de inmunizacin correspondiente. Dejar coagular la

muestra sangunea y separar el suero por centrifugacin. Este suero, ser el
testigo, debe ser conservado en un tubo de ensayo, sellado y rotulado
adecuadamente, en congelacin, hasta que se concluya con el esquema.
4.2. ESQUEMAS DE INMUNIZACIN.
A. mexicaina (Proteasa de origen vegetal, extrada, tratada y purificada)
Inyeccin
Tiempo
(Das)
Dosis
(mg)
Va
11

0.5
15
0.5
3
Sangrado
30
39
0.5
--
INMUNOLOGA APLICADA
El antgeno se disuelve en 0.5 mL de SS al 0.85%

emulsificando con 0.5 mL de adyuvante incompleto
de Freund va intradrmica o subcutnea.
Se sigue el mismo procedimiento de la primera
inmunizacin pero usando el adyuvante incompleto
de Freund, por va subcutnea o intradrmica.
En SS 0.85%, por va subcutnea o intradrmica.
Va intravenosa o intracardaca para la obtencin
del antisuero.
SS = Solucin Salina
Nota: la dosis debe ser ajustada de acuerdo a la pureza observada en el gel (cuantificacin por
densitometra y por la concentracin final obtenida por la tcnica de Bradford.
A. Papana (Proteasa de origen vegetal, extrada, tratada y purificada)

Inyeccin
1
Tiempo
(Das)
0
Dosis
(mg)
0.5
Va
15
0.5

de Freund, por va subcutnea o entradrmica.
30
0.5
Sangrado
39
--

del antisuero.
El antgeno se disuelve en 0.5 mL de SS al 0.85%

emulsificando con 0.5 mL de adyuvante incompleto
SS = Solucin Salina
B. Salmonella entrica transformada con plsmidos pL-STPN.

Las cepas fueron sembradas en tioglicolato durante 10h para inducir la
expresin de las protenas, la inoculacin se realizara en concentraciones de
1x 10 5 celulas/mL.
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INMUNOLOGA APLICADA
Inyeccin
Tiempo
(Das)
Dosis
(mg)
Va
0.5
15
0.5
El antgeno se disuelve en 0.5mL de SS al 0.85%

emulsificando con 0.5mL de adyuvante incompleto
de Freund, por va subcutnea o intradrmica.
30
0.5
Sangrado
39
--

del antisuero.
SS = Solucin Salina
4.2. Una vez terminado el esquema de inmunizacin en cada caso, realice un gel de
electroforesis de poliacrilamida utilizando muestras del suero testigo, del suero obtenido
despus de terminado el esquema de inmunizacin y de los antgenos utilizados. Colocar
el siguiente orden en el gel.
1. Marcador de peso molecular.
2. Antisuero del conejo antes de iniciar el esquema de inmunizacin.
3. Antisuero del conejo una vez concluido el esquema de inmunizacin.
4. Antgeno inyectado.
5. Estandar de IgG de conejo.
4.3. Cuantificar por medio de densitometra la proporcin de IgG obtenidas. (% pureza).
4.4. Reportar el gel final como resultado de esta prctica.
5. CUESTIONARIO.
5.1 Qu es un antgeno soluble y qu es un antgeno partculado?
5.2 Por qu se utilizan las diferentes vas de inmunizacin para los antgenos?
5.3 Investigue la importancia del uso de adyuvantes en la vacunacin, los principales
tipos de adyuvantes y su mecanismo de accin, as como restricciones de uso.
5.4 Cite 5 tipos de antgenos utilizados para la inmunizacin de animales,
describiendo la naturaleza del antgeno, la va de inmunizacin que se utiliza y
especie de animal en que se desarrolla.
5.5 . Investigue las nuevas vas de administracin de protenas para generar
respuesta inmune.
5.6 . Explique de que depende el desencadenamiento un tipo especfico de
respuesta inmune (no especfica, humoral o celular) en un organismo.
5.7 . Investigue el peso molecular de las IgG y compare los resultados obtenidos en
el gel de acrilamida.
6. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.
6.1. Correa, D., Mandujano A., (2000) Manual de tcnicas modernas en Inmunologa.
Teora y prctica. 1. Edicin. INDRE-SSA. Mxico.
6.2. Manual de laboratorio de Inmunologa. (1998). Departamento de Inmunologa. Escuela
Nacional de Ciencias Biolgica. ENCB-IPN. Mxico.
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INMUNOLOGA APLICADA
6.3. Biotecnologa Aplicada. (2000). Vol. 17 (3) Ed. Elfos Scientiae. La Habana Cuba.
6.4 Grupta R., Relyveld E., Lindblad B., Bizzine B., Ben-Efraim S. and Grupta C (1993).
Adjuvants-a balance between toxicity and adjuvancicity. Vaccine (11):293-306.
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INMUNOLOGA APLICADA
PRCTICA 3
REACCIONES DE PRECIPITACIN
1. INTRODUCCIN
La reaccin de la precipitacin se presenta cuando un antgeno multivalente en estado
soluble, se une con su anticuerpo especfico y as da lugar a la formacin de un complejo
insoluble. Esta reaccin se utiliza ampliamente para demostrar y cuantificar antgenos y
anticuerpos y se puede llevar a cabo en medio de lquido o semislido.
La precipitacin en medio lquido puede ser semicuantitativa o cuantitativa. En la primera,
slo se estima la cantidad relativa de precipitado formado y en la segunda, al precipitado
formado se le determina la concentracin de protenas totales por mtodos
espectrofotomtricos o bien por el anlisis de nitrgeno proteico empleado en el mtodo
de Kjelndahl.
Cuando la reaccin se realiza en medio lquido, la cantidad de precipitado vara segn la
proporcin de los reactivos. Si se dispone de una serie de tubos capilares que contengan
el mismo volumen de suero y cantidades crecientes de antgeno, puede observarse que el
precipitado formado alcanza un mximo, despus del cual, progresivamente, se encuentra
una disminucin en la cantidad de precipitado.
Si se analizan los sobrenadantes de todos los tubos, los correspondientes a los que
presentan un mximo de precipitacin prcticamente no tienen antgeno ni anticuerpos,
en tanto, en los precedentes puede demostrarse la presencia de anticuerpos y en el resto,
la presencia de antgenos.
Si los resultados se grafican, colocando en el eje de las abscisas la cantidad de antgeno
agregado y en el eje de las ordenadas la cantidad de precipitado, se obtiene una curva,
generalmente en forma de campana, que se puede dividir en tres regiones.
La reaccin de precipitacin en medio semislido, se efecta en un gel y se conoce como
inmunodifusin. Esta consiste en la difusin, a travs de un gel, de un antgeno, y su
anticuerpo homlogo con la consiguiente aparicin de una banda de precipitado en el sitio
donde se alcanzan las concentraciones ptimas de ambos reactivos.
La velocidad de la difusin depende de la forma, tamao y la concentracin de las
molculas precipitantes, as como de la temperatura a la cual se realice la reaccin.
Cuando se tienen dos o ms tipos de molculas, stas se pueden difundir a diferente
velocidad. En el sitio donde se localicen zonas de concentracin ptima de antgeno y de
anticuerpos se formarn bandas de precipitacin.
Existen diferentes tipos de inmunodifusin; aquel en el que ambos reactivos difunden
libremente en el gel es llamado doble difusin o mtodo de Ouchterlony, el cual puede
tener diversas aplicaciones, por ejemplo, la determinacin de la posible relacin
inmunolgica entre dos antgenos y del nmero de sistemas antgeno-anticuerpo
presentes, as como la semicuantificacin de un antgeno o de un anticuerpo.
Otra variante en la que slo uno de los reactivos (generalmente el antgeno) difunde en el
gel, donde se haya embebido el otro (generalmente el antisuero), se conoce como
imunodifusin simple. En la imunodifusin radial se aplica este principio para determinar
cuantitativamente la concentracin del antgeno, ste se encuentra en una concentracin
inicial tan alta, que se forman complejos solubles y a medida que se van difundiendo, la
15

INMUNOLOGA APLICADA
concentracin disminuye hasta que, en el sitio donde los reactivos estn en proporciones
ptimas, se forma un halo de precipitacin cuyo dimetro tiene relacin directa a la
concentracin del antgeno.
La tcnica de imunoelectroforsis fue propuesta por Grabar y Williams quienes
combinaron las tcnicas de electroforesis y de inmunodifusin para separar y determinar
la presencia de los componentes de una mezcla de sustancias antignicas.
Primeramente, los componentes de la mezcla son separados por la aplicacin de una
corriente elctrica y posteriormente, se hacen reaccionar con sus anticuerpos especficos,
con los que se realiza la precipitacin. Esta prueba es ampliamente utilizada para
determinar la pureza de sustancias antignicas.
En la contrainmunoelectroforesis, los antgenos y sus anticuerpos simultneamente se
someten a la accin de un campo elctrico en un gel a Ph de 8.6. En estas condiciones,
los anticuerpos casi no tienen carga, por lo que no se desplazarn bajo el efecto de la
corriente elctrica, sin embargo, se mueven hacia el ctodo debido al flujo endosmtico
del regulador usado.
Los antgenos que poseen carga negativa migran hacia el nodo y mediante la
disposicin apropiada de los pozos en el agar, se puede lograr que el antgeno y el
anticuerpo se encuentren, reaccionen y se desarrollen bandas de precipitacin en poco
tiempo, dependiendo de la concentracin y de la velocidad de migracin de los reactivos.
Obviamente, este mtodo no es aplicable a antgenos con carga positiva o neutra.
2. OBJETIVOS.
2.1. OBJETIVO GENERAL.
Evidenciar la reaccin de precipitacin que se lleva a cabo cuando hay interaccin
entre antgeno soluble con anticuerpo homlogo.
2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS
2.2.1 Desarrollar la tcnica de precipitacin en capilar para la cuantificacin de los
anticuerpos presente en un antisuero especfico.
2.2.2 Valorar la reaccin de precipitacin
3.1Material por equipo.
- 11 tubos capilares de 100 mm de largo y de 1.6 a 1.8 mm de dimetro.
- 8 tubos de ensaye de 13 x 100mm.
- 8 pipetas de 1.0 ml.
- 1 gradilla de plastilina.
- Papel absorbente.
3.2 Reactivos
- 5 ml. de solucin salina isotnica.
- 1.0 ml. de solucin de antgeno que se desea probar.
- 1.0 ml. del antisuero correspondiente.
- Antisuero del conejo obtenido antes de empezar el esquema de inmunizacin.
4.1. PRECIPITACION EN CAPILAR.
16

INMUNOLOGA APLICADA
1. Se toman 7 capilares y con ayuda de un marcador se marcan a a un volumen de

0.5 mL y 1 mL
2. En 7 tubos de ensaye de 13 x100 mm debidamente rotulados, se hacen diluciones
seriadas de la solucin de antgeno:
a) Se colocan 0.5 ml de solucin salina en cada uno de los tubos de ensaye.
b) Al tubo 1 se le agrega 0.5 ml de la solucin del Ag, se mezclan bien con la misma
pipeta (dilucin 1: 2).
c) Con una pipeta diferente se toman 0.5 ml del tubo 1 y se pasan al tubo 2, se
mezclan bien con la misma pipeta (dilucin 1: 4)
d) El procedimiento se repite para los tubos siguientes (dilucin 1:8 a 1:128).
3. Se toma un tubo capilar y por capilaridad se absorbe un volumen tal de antisuero
que llegue hasta la primera marca. La parte externa del capilar se limpia con papel
absorbente (papel filtro grueso).
4. El tubo capilar se gira ligeramente y se hace descender el volumen de antisuero
hasta el otro borde.
5. Por el extremo en el que se encuentra el antisuero en seguida se absorbe la
cantidad necesaria de antgeno sin diluir (dilucin 1:1), de tal modo que el volumen
total llegue hasta la siguiente marca del tubo. Se limpia la parte externa con papel
absorbente.
6. Es necesario realizar dicha operacin con sumo cuidado, evitando que el antisuero
se salga del capilar y contamine el antgeno.
7. Con el dedo ndice se tapa uno de los extremos del capilar y se deja que el
contenido quede centrado en el capilar.
8. Un extremo se introduce en una barra de plastilina.
9. Se repite el procedimiento sealado en los incisos de 3 al 8 usando cada una de
las diluciones del antgeno (de 1:2 a 1:128).
10. Un capilar se llena hasta la segunda marca con antgeno sin diluir y otro, en la
misma forma, nicamente con antisuero. El primero es el testigo del antgeno y el
segundo es el del anticuerpo.
11. Se dejar reposar y al trmino de la prctica a temperatura ambiente, si no hay
reaccin aparente se guardan en el refrigerador y observar a las 12 y 24 horas.
12. Se mide la cantidad de precipitado en milmetros.
4.2 PRECIPITACION EN CAPILAR.
Observe cuidadosamente la serie de tubos capilares y mida la altura de la columna
de material precipitado en aquellos en que se encuentre. Con estos datos complete una
tabla que contengan los siguientes datos: Numero de tubo, factor de dilucin,
concentracin del antgeno y altura de la columna.
Numero de Capilar
1
2
3
4
Dilucin del antgeno
Concentracin del
antgeno
Precipitacin en mm
1:1
1:4
1:16
1:64
5. CUESTIONARIO
Que metodologas actuales se pueden aplicar para medir la reaccin antgenoanticuerpo.
17

INMUNOLOGA APLICADA
Desarrolle un esquema para cuantificar la reaccin antgeno anticuerpo en el

laboratorio.
Qu sugerencias tiene para optimizar la prctica.
A nivel comercial que pruebas biolgicas-clnicas se utilizan en la reaccin Ag-Ac?
6. REFERENCIAS.
7.1. Correa, D., Mandujano A., (2000) Manual de tcnicas modernas en Inmunologa.
Teora y prctica. 1. Edicin. INDRE-SSA. Mxico.
7.2. Manual de laboratorio de Inmunologa. (2). Departamento de Inmunologa. Escuela
Nacional de Ciencias Biolgica. ENCB-IPN. Mxico.
7.3. Biotecnologa Aplicada. (2000). Vol. 17 (3) Ed. Elfos Scientiae. La Habana Cuba.
7.4. Mueller UW, Hawes CS, Jones WR. Monoclonal antibody production by hybridoma
growth in Freunds adjuvant primed mice. J. Immunol. Methods 1986; 87:193.
18

INMUNOLOGA APLICADA
PRCTICA 4
DETERMINACIN DE PROTENA POR EL MTODO DE BRADFORD
1. INTRODUCCIN
El mtodo de Bradford, (1976) involucra la unin del azul brillante de Coomassie
G-250 a la protena. Esta unin provoca un cambio en el mximo de absorcin de 465 a
595 nm y este incremento a 595 nm es el que se cuantifica. Dicha unin es independiente
de la composicin de aminocidos de las protenas.
2. OBJETIVO
2.1 OBJETIVO GENERAL
Determinar de manera cuantitativa el anticuerpo producido, para realizar la
inmunodeteccin en medio slido western blot
2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS
Cuantificar el anticuerpo producido por la tcnica de Bradford
Determinar la variacin de las muestras
3.1 Material por equipo.
- Espectrofotometro
- celdas de cuarzo para leer
- tubos tipo ependorff
- 1 gradilla
- Micropipetas
- Puntas
3.2 Reactivos
- Reactivo de Bradford
- Suero del conejo obtenido despus el esquema de inmunizacin.
Se determina la concentracin de protenas, por medio de una curva tipo con BSA
y el reactivo de Bradford, como se indica abajo:
(BSA)
200 0.0 0.025 0.05 0.075 0.10 0.125 0.15 0.175 0.20 0.225 0.25
g/mL (mL)
Agua destilada 0.25 0.225 0.20 0.175 0.15 0.125 0.10 0.075 0.05 0.025 0.0
(mL)
Reactivo
de 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75
Bradford (mL)
19

Concentracin
de BSA g/mL)
20
40
60
INMUNOLOGA APLICADA
80
100
120 140
160 180
200
Cada una de las diluciones se realiza por triplicado. Despus de 5 min de agregado el
reactivo de Bradford, se lee la absorbancia a 595 nm, ajustando el equipo con un blanco
de reactivos (el que no contiene protena) y se calcula la ecuacin de la recta.
La cantidad de protena contenida en la muestra se determina interpolando el dato de
absorbencia en la curva tipo elaborada con la albmina de suero de bovino a diferentes
concentraciones. Se utiliza la ecuacin obtenida de la curva tipo
ANEXOS
Preparacin del reactivo de Bradford: 100 mg de azul brillante de Coomassie G-250 se
disuelven en 50mL de etanol al 95%. A esta solucin se le aaden 100 mL de cido
fosfrico al 85% (w/v). La solucin resultante se diluye a un volumen final de 1litro. Las
concentraciones finales en el reactivo son 0.01% (w/v) del colorante, 4.7% (w/v) de etanol
y 8.5% (w/v) de cido fosfrico.
5. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72:
248-254. 1976.
Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69
(1990).
20

INMUNOLOGA APLICADA
PRCTICA 5
DETERMINACIN DE REACCIN Ag-Ac POR ELECTROTRANSFERENCIA
1. INTRODUCCIN
La tcnica de inmunoelectrotransferencia (IET), descrita por Towbin et al en 1979, es uno
de los mtodos ms tiles con que se cuenta para el anlisis antignico (Peferoen et al,
1982). Esta metodologa combina el poder resolutivo de la electroforesis en geles de
poliacrilamida (PAGE), en presencia o en ausencia de detergentes como el docecil sulfato
de sodio (SDS), con las reacciones inmunoenzimticas en fase slida. Las protenas
separadas por pesos moleculares son electrotransferidas a membrana de nitrocelulosa
(NC) o de Nylon, en donde se unen a los grupos reactivos de stas, quedando
inmovilizadas y expuestas en la superficie para reaccionar con los anticuerpos
correspondientes. El patrn que se obtiene sobre el papel de NC es una copia del patrn
de separacin obtenido en el gel. Posteriormente de bloquean los sitios reactivos del
papel de NC que quedan libres, con alguna protena que no interfiera y a continuacin se
hace reaccionar con los anticuerpos problema, los cuales podrn unirse a sus antgenos
correspondientes inmovilizados en el papel (Brunete, 1981). La siguiente reaccin que se
efecta corresponde a la primera interaccin antgeno-anticuerpo, que se pone de
manifiesto al agregar un segundo anticuerpo unido a una enzima como peroxidasa u otro
conjugado como protena A de Staphyloccocus aureus igualmente marcada.
En el ensayo enzimtico se agrega el sustrato y un cromgeno que precipiten in situ para
hacer visible la reaccin. Se puede identificar la clase de respuesta inmunolgica del
husped (IgM, IgG, IgA, IgE), usando el conjugado correspondiente.
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GENERAL.
Cuantificar el anticuerpo producido, para realizar la inmunodeteccin en medio slido
western blot
2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
2.2.1 Determinar la presencia del antgeno por medio de la tcnica
electrotransferencia.
2.2.2 Realizar la transferencia y deteccin por unin especifica.
2.2.3. Corroborar que el esquema de inmunizacin se llevo de la manera adecuada
3.1. Material por equipo.

Cmara de electrotransferencia
Fuente de Poder
Papel filtro Whatman 3mm
Papel de Nitrocelulosa
Ambos papel de nitrocelulosa y papel filtro hay que cortarlos del mismo tamao del gel de
porteinas (SDS-PAGE).
Vasos de precipitado
de
21

INMUNOLOGA APLICADA
Micropipetas
Matraces aforados
Matraces erlenmeyer

3.2. Reactivos

Acrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8%

Amortiguador del gel separador pH 8.8
Amortiguador de corrida 5X / SDS
Amortiguador de muestra pH 6.8
Persulfato de amonio al 10%
Sol. de azul de bromofenol 10 mg/mL
Sol. teidora
Sol. desteidora
Amortiguador de electrotransferencia [25 mM Tris-HCl, 192 mM glicina, 20% (v/v)

metanol, 0.01% (w/v) SDS, pH 8.3].
Solucin salina de fosfatos 0.01M, NaCl 0.15M, pH 7.2 (PBS)
Amortiguador de lavado (PBS-Tween 20,, 0.05%)
Rojo de Ponceau [0.2% en cido tricloroactico 3%]
Solucin de bloqueo
Solucin cromgeno /sustrato

4.1 Tratamiento de las muestras
5. A la muestra de protena con concentracin conocida se lleva a un volumen de 85 L
con amortiguador de muestra. Adicionar con 10 L de la sol. de azul de bromofenol y 5 L
de -mercaptoetanol.
6. Poner a ebullicin durante 5 minutos y enfriar.
4.2 Procedimiento para el gel de SDS-PAGE
7. Limpiar con etanol al 70% las placas de vidrio.
8. Colocar el juego de placas de vidrio y separadores en la base para preparar el gel.
9. Preparar el gel separador con forme a la Tabla 1, considerando que al final se adiciona
el TEMED y Persulfato de amonio para vaciar en la cmara de electroforesis. Vaciar el gel
separador evitando la formacin de burbujas hasta dejar un espacio de 3 cm a partir del
borde superior de los vidrios (Tabla 1).
Tabla 1.Gel separador para 15 mL
Sol. stock (mL) / Conc. gel (%)
Sol. Acrilamida bisacrilamida
Amortiguador pH 8.8
Agua desionizada
Persulfato de amonio
5
6
7
8
9
10
12
13
15
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
6.0
6.5
7.5
3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75
8.75 8.25 7.75 7.25 6.75 6.25 5.25 4.75 3.75
0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
22

TEMED
INMUNOLOGA APLICADA
0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
10. Dejar polimerizar de 20-30 minutos

11. Preparar el gel concentrador como lo ndica la Tabla 2, vaciar en la parte superior del
gel.
Tabla 2. Gel concentrador para 2 mL
Sol. Acrilamida bisacrilamida
Amortiguador pH 6.8
Agua desionizada
Persulfato de amonio
TEMED
0.26 mL
0.5 mL
1.22 mL
0.01 mL
0.002 mL
3.
4.
5.
6.
7.
Colocar el peine con cuidado de no formar burbujas y dejar polimerizar por 20 min.
Preparar las muestras y el marcador de peso molecular.
Montar las placas de vidrio en su base y sta en la cmara de electrofresis.
Preparar el amortiguador de corrida al 1X.
Llenar la cmara interna con amortiguador de corrida hasta el lmite y la parte
externa hasta cubrir los electrodos.
8. Cargar el gel con las muestras y el marcador de peso molecular.
9. Tapar y conectar los electrodos a la fuente de poder.
10. Iniciar con un voltaje de 50 V hasta que las muestras pasen del gel concentrador,
posteriormente aumentar a 100 V hasta que el frente alcance la parte inferior del
gel.
11. Apagar la fuente de poder y recuperar el amortiguador de corrida (se puede
utilizar hasta 3 veces)
12. Desmontar la cmara y extraer con cuidado el gel. Colocar el gel en un recipiente
adecuado y teirlo con la sol. correspondiente. Colocar en agitacin orbital durante
1 hora aprox. Retirar el gel y sumergirlo en la sol. desteidora hasta desteir bien
el gel.
Una vez obtenido el gel SDS-PAGE, se sumerge en amortiguador de transferencia.
4.3 Preparacin de la cmara y transferencia.
1.- Colocar fibras Scotch y papeles Whatman (grosor 0.16 mm) en un recipiente con
suficiente amortiguador de transferencia, 30 minutos antes de transferir.
2.- Cortar la membrana de nitrocelulosa (NC) de acuerdo al tamao del gel (utilizando
guantes) y colocarla en otro recipiente que contenga amortiguador de transferencia.
3.- Colocar dos fibras Scoth en un cassette para electrotransferencia, sobre las cuales
se colocan dos porciones de papel filtro teniendo cuidado que no queden burbujas
atrapadas entre los papeles; despus colocar el gel y sobre este la membrana de NC;
eliminar las burbujas.
4.- Con un lpiz marcar el frente de electroforesis del gel, sobre el papel de NC y sealar
el nmero de carril de acuerdo a la colocacin de las muestras, colocar otros dos papeles
filtros sobre la NC y otras dos fibras. Cerrar el cassette e insertarlo en el contenedor.
5.- Colocar el contenedor en la cmara y llenarla con el amortiguador de transferencia,
tapar y conectar los electrodos de tal manera que el nodo (-) quede del lado del gel y el
23

INMUNOLOGA APLICADA
ctodo (+) del lado de la NC; conectar a la fuente de poder y transferir durante 1 hora a
100 V, cuidando de que la temperatura del lquido no se eleve a ms de 60 C.
6.- Al terminar la transferencia tomar la membrana de NC con guantes y colocarla en un
recipiente con solucin para teir (durante 20 minutos)
7.- Observar en la membrana si se distinguen las protenas que fueros transferidas, lavar
con agua destilada para retirar el exceso de colorante y secar; si no se alcanzan a
distinguir las bandas teir otros 20 min.
4.4 Reaccin inmunoenzimtica
1.- Colocar la membrana de NC en un recipiente que contenga 30-50 mL del amortiguador
de bloqueo e incubar 2 h a temperatura ambiente en agitacin continua.
2.- Eliminar el exceso de solucin de bloqueo por decantacin y hacer 3 lavados con PBSTween de 5 min. Cada uno con agitacin contina.
3.- Incubar la membrana con el suero o anticuerpo de inters a las diluciones establecidas
con anterioridad.
4.- Eliminar el exceso y lavar come en el paso 2.
5.- Posteriormente se agrega el conjugado correspondiente en la dilucin apropiada con
PBS-Tween. Se incuba durante 2 h a temperatura ambiente con agitacin continua.
6.- Se repite el paso 4.
7.- Por ltimo se agrega la solucin cromgeno/sustrato para dot-ELISA e
inmunoelectrotransferencia y se espera hasta que aparezcan las bandas; despus se
enjuaga con agua desionizada y se deja secar.
ANEXOS
SOLUCIONES PARA GEL SDS-PAGE
Acrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8%
Pesar 29.2 g de acrilamida (99.9% pureza) ms 0.8g de bis-acrilamida. Disolver en agua
bidestilada y aforar a 100 mL. Filtrar con papel Whatman 1. Guardar en frasco mbar a 4
C. Usar guantes al pesar ya que la archilamida es un compuesto neurotxico.
Pesar 9.081 g de Tris-base, y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar
el pH con HCl (aprox. 1 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.
Pesar 3.027 g de Tris-base y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar el
pH con HCl (aprox. 1.5 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.
Amortiguador de corrida 5X / SDS
Pesar 7.55 g de Tris-base, 36 g de Glicina y 2.5 g de SDS, disolver con agua desionizada
y aforar a 500 mL. Al usar ajustar a 1X.
Amortiguador de muestra pH 6.8
Pesar 1.52 g de Tris-base y 2.0 g de SDS. Disolver en 40 mL de agua desionizada y
ajustar el pH a 6.8 con HCl (aprox. 2.0 mL). Adicionar 20 mL de glicerol y ajustar el
volumen a 100 mL.
Persulfato de amonio al 10%
24

INMUNOLOGA APLICADA
Se prepara al momento de usarlo. Preparar el volumen mnimo necesario.

Sol. de azul de bromofenol 10 mg/mL
Pesar 100 mg de azul de bromofenol y disolverlo en 10 mL de agua desionizada. Guardar
en refrigeracin.
Sol. teidora
Para preparar 100 mL se usan 50 mL de Metanol, 10 mL de cido actico y 40 mL de
agua desionizada y 0.05 g de azul de Coomassie. Disolver el azul de Commasie en el
metanol y adicionar el cido actico. Aforar con el agua desionizada.
Sol. desteidora
Para preparar 500 mL se usan 25 mL de cido actico, 82.5 mL de metanol y 392.5 mL de
agua desionizada.
SOLUCIONES DE ELECTROTRANSFERENCIA
Amortiguador de transferencia
(Tris 0.025M, glicina 0.192M, pH 8.3, metanol 20% v/v). Medir 125 mL de Trizma-base 2M
y agregar 14.49 g de glicina, aadir 200mL de metanol aforar a 1000 mL con agua
bidestilada. Guardar a 4C. Nota: No ajustar pH oscila entre 8.1 y 8.4 dependiendo de la
calidad del tris, el metanol debe ser grado analtico, este amortiguador se puede usar
hasta 3 veces, despus de cada uso filtrar con papel Whatman n 1.
Solucin salina de fosfatos 0.01 M, NaCl 0.15 M, pH 7.2 (PBS)
Medir 800 mL de agua desionizada y agregar 100 mL de PB 10X y 8.75 g de NaCl.
Disolver las sales y ajustar el pH. Aforar a 1 L con agua desionizada. La solucin de PB
se prepara con 2.62 g de fosfato de sodio monobsico monohidratado y 11.5 g de fosfato
de sodio dibsico anhidro. Disolver en 200 mL de agua desionizada y aforar a 1 L con
agua desionizada.
Amortiguador de lavado (PBS-Tween 20, 0.05%)
A un litro de PBS pH 7.2 aadir 500 L de Tween 20.
Solucin de bloqueo.
Pesar 5 g de leche descremada en polvo y disolverlo en 100 mL de PBS-Tween 20.
Guardar a -20 C.
Rojo de Ponceau 0.2% en cido tricloroactico 3%
Pesar 200 mg de rojo de Ponceau y aadir 3 g de cido tricloroactico. Aforar a 100 ml
con agua desionizada. Mantener a 4 C en frasco color ambar.
Solucin cromgeno / sustrato
Pesar 25 mg de 4-cloro-1-naftol, aadir 5 mL de metanol absoluto y 25 mL de PBS,
agregar 25 l de perxido de hidrgeno al 3%. Nota: esta solucin se prepara
inmediatamente antes de usarla.
5. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
25

INMUNOLOGA APLICADA
1. Fundenberg, Hugh, Stites Daniel, Caldwell, Joseph, Wells, Vivian, Manual de

Inmunologa clinica, segunda edicin, editorial el Manual Moderno, Mexico, 1980, pp. 5060.
2. Towbin H., Staehelin, Gorgon J.. Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl
Sci USA, 1979, 76:4350.
3. Peferoen M. R., Huybrechts R., De Loof A. Vaccum-blotting: A new simple and efficient
transfer of proteins from sodium docedyl sulfate-polyacrylamide gels to nitrocellulose.
FEBS Lett. 1982, 145:369.

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2. Rotular una placa o portaobjetos de la siguiente manera: anti-A, anti-B, anti-AB y

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b) Aumento de la afinidad de los anticuerpos inducidos con una potenciacin de su

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2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS.

Antes de iniciar el esquema de inmunizacin correspondiente. Dejar coagular la

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El antgeno se disuelve en 0.5 mL de SS al 0.85%

A. Papana (Proteasa de origen vegetal, extrada, tratada y purificada)

Se sigue el mismo procedimiento de la primera

En SS 0.85%, por va subcutnea o intradrmica.

Va intravenosa o intracardaca para la obtencin

El antgeno se disuelve en 0.5 mL de SS al 0.85%

B. Salmonella entrica transformada con plsmidos pL-STPN.

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El antgeno se disuelve en 0.5mL de SS al 0.85%

En SS 0.85%, por va subcutnea o intradrmica.

Va intravenosa o intracardaca para la obtencin

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1. Se toman 7 capilares y con ayuda de un marcador se marcan a a un volumen de

Dilucin del antgeno

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Desarrolle un esquema para cuantificar la reaccin antgeno anticuerpo en el

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