EXPERIMENTO 2

METODOS CUANTITATIVOS PARA LA IDENTIFICACION DE

AMINOACIDOS Y PROTEINAS

OBJETIVOS

REQUISITOS

Identificar por mtodos

colorimetritos los 20 L-
aminocidos (AA), que
forman las protenas, basados
en las reacciones de los
grupos R

Repasar las estructuras

de los 20 L-
aminocidos (AA), que
forman las protenas y
las caractersticas de las
protenas.

1.
FUNDAMENTOS
Por la estructura peptdica y la presencia de determinados grupos (grupos R), las
protenas pueden reaccionar con una variedad de agentes originndose productos
coloreados. Estas reacciones son la base para la determinacin cuantitativa y cualitativa
de las protenas. Por presentarse variaciones en la composicin de los aminocidos de
las diferentes protenas, se manifiestan diferentes colores y grados de intensidad para
una misma reaccin, ntimamente relacionado con la naturaleza de la protena
analizada.
1.1

Fundamentos qumicos de las pruebas.

1.1.1

Prueba de la ninhidrina (Hidrato de tricetohidrindeno).

Todas aquellas sustancias que presentan al menos un grupo amino y uno carboxilo libre,
reaccionaran con la ninhidrina. La positividad se manifiesta por la aparicin de un color
violceo o amarillo. Debido a que las protenas y los aminocidos, poseen esta
caracterstica, la reaccin sirve para identificarlos. Algunas soluciones de amonio y
aminas, dan la coloracin caracterstica, aparentemente debido a una oxidacin y
reduccin intramolecular de la ninhidrina en presencia de amonaco. Los aminocidos
porina e hidroxiprolina, que no poseen grupo amino sino imino (-NH-), dan un color
rojo que pasa rpidamente a amarillo. La reaccin se muestra en la figura 1
27

Figura 1 Reaccin de la prueba de la ninhidrina

CO

OH
C

+
OH

CO

CH

H
C OOH
2 H 2O

Ninhidrina

Aminocido

CO
N

CO

CH

CO

C
N

CO

C OOH

C
C OOH

(BASE DE SCHIFF)
R
CO

H
C
N H2

CO

H 2O

C O2

(2-amino-1,3-dicetohidrindeno)

CO

CO

H
+

C
CO

NH2

OH
C

CO

OH

2 H2O
(2-amino-1,3-dicetohidrindeno)

Ninhidrina

CO

OC
C HN

CO

OC

(Ninhidrina-dicetohidrindeno)
color violeta

1.1.2

Prueba de Biuret

Es una prueba general para polipptidos y protenas ya que sirve para reconocer las
uniones peptidicas. La positividad se manifiesta por la aparicin de una coloracin
violeta. La formacin de un complejo de coordinacin entre los cationes cpricos en
medio alcalino con las uniones peptdicas.
28

Figura 2 Reaccin de la prueba de Biuret

OH

OH
Cu

NH2

CO

HN

NH
CO

NH 2

OH
1.1.3

CO

NH2

2H N

OC

OH

Prueba de coagulacin:

Es una prueba para identificar: albminas, globulinas, glutelinas y prolaminas. La

positividad se manifiesta por la formacin de un cogulo. No se conoce exactamente el
mecanismo de reaccin, se cree que ocurre cierta deshidratacin de la molcula
proteica.
1.1.4

Prueba de Sulfato de amonio:

Las protenas, como otros coloide son precipitadas por soluciones concentradas de sales
de amonio[NaCl. (NH4)2SO4 y NaSO4 ]. Aparentemente la precipitacin se debe a la
neutralizacin y deshidratacin de la molcula, seguida de agregacin y precipitacin.
1.1.5

Prueba xantoprotica:

Es una reaccin que reconoce los aminocidos que poseen el grupo bencnico (tirosina,
fenilalanina, triptfano). Las protenas que tienen en su composicin estos aminocidos
tambin darn la reaccin. La positividad se reconoce por la aparicin de un color
amarillo o verde debido a la formacin de nitrocompuestos.
1.1.6

Prueba de los grupos SH:

Es una prueba para identificar aminocidos azufrados y las protenas que los contiene,
se reconocen por la formacin de una coloracin negra o gris. La figura siguiente
muestra dicha reaccin.
29

Figura 3. Reaccin de la prueba de los grupos SH

CH2

CH2OH

CH2

CHNH2

CHNH2

COOH

COOH

2 NaOH

CHNH2
SNa2 +
COOH

(Lanteonina)

(Serina
O

SNa2 +

H3C
H3C

(Acetato de plomo)
1.1.7

O
O

SPb + 2 CH3COONa

Pb

(Negro)

Prueba de Sakaguchi:

Es una prueba para identificar arginina y se usa para identificar protenas ya que casi
todas las protenas poseen ese aminocido. El desarrollo de un color rojo marca la
reaccin positiva y se debe a la presencia del grupo guanidina, que caracteriza la
arginina. (Figura 4)
Figura 4 Grupo guanidina

NH
H 2N

C
NH

(Grupo guanidina)
1.1.8

Prueba de Hopkins-Cole:

Es para identificar el triptfano y las protenas que lo contienen. La positividad se

reconoce por la aparicin de un anillo color violeta-rojizo. La reaccin es la siguiente
(figura 4)
30

Figura 5 Reaccin de la prueba de Hopkins-Cole

O
CH2
N

CH

COOH +

NH2

COOH

(Triptfano)

(Acido g
H2O H2SO4
O
NH
CH2

C
COOH

O
C
H

H
(alfa-iminoglioaxil-beta-indolproponico)
1.1.9

Prueba de Milln:

La reaccin es debida a la presencia del grupo hidroxifenlico (-C6H4OH) en la

molcula proteica. Cualquier compuesto fenlico no sustituido en la posicin 3,5, como
la tirosina, fenol y timol, dan positiva la reaccin. El mecanismo de la reaccin es poco
conocido, posiblemente se deba a la formacin del complejo oxido de mercurio y fenol.
2. MATERIALES Y MTODOS
2.1 Materiales
Tubos de ensayo, mechero y pinzas de madera

31

2.2 Mtodos
Prueba

Procedimiento
En un tubo de ensayo colocar:

2.21.
P. Ninhidrina:
(Hidrato
de Sustancia problema
tricetohidrindeno
al 0.1 %)
Reactivo ninhidrina
Calentar hasta ebullicin por 1 min.
Deje enfriar y observe
2.2.2.
Sustancia problema
P. Biuret:
NaOH al 10 %
Mezclar e ir aadiendo gota a gota el sulfato cprico al
0.5 % (CuSO4), agitando despus de cada adicin, hasta
la aparicin de un color violeta, azul o amarillo. El color
violeta indica la reaccin positiva.
2.2.3.
Sustancia problema
P. Coagulacin
cido actico al 30 % (CH3COOH)
Solucin saturada de Cloruro de sodio (NaCl)
Mezclar bien y calentar a la llama por 1 min. En el caso
de la albmina o la globulina se presenta un
enturbamiento mas o menos intenso que persiste al
enfriamiento, tambin puede observarse pequeos
grumos en las paredes del tubo. Observe el tubo sobre un
fondo oscuro.
2.2.4.
P. Sulfato de Sustancia problema
amonio (NH4SO4)
Solucin de Sulfato de amonio al 50 %
Mezclar bien
Dejar en reposo durante 10 min.. Observe si se forma un
precipitado. Centrifugar a 3000 r.p.m. por 10 min.,
observar. La reaccin positiva se manifiesta por la
formacin de un precipitado, dependiendo directamente
de la concentracin de albmina presente en la muestra.
2.2.5.
P. Xantoprotica Sustancia problema
cido ntrico concentrado (HNO3)
Mezclar bien
Calentar a la llama y observar

32

Volumen

1 ml
1 ml

1 ml
1 ml

2 ml
4 gotas
1 ml

1 ml
1 ml

1 ml
0.5 ml

Prueba
2.2.6.
P. Grupos SH

2.2.7.
P. Sakaguchi

2.2.8.
P. Hopkins-Cole

Procedimiento
En un tubo de ensayo colocar:

Volumen

Sustancia problema
Hidrxido de sodio al 40 % (NaOH)
Acetato de Plomo
Mezclar bien
Calentar a la llama por 4 min. Mezclando continuamente
y observar

1 ml
1 ml
1 ml

Sustancia problema
Hidrxido de sodio al 40 % (NaOH)
Naftol
Hipoclorito de sodio al 2 %
Mezcal bien y observar.
Sustancia problema
Reactivo de Hopkins- Cole
(Preparacin: 10 mg de magnesio en 250 ml de cido
oxlico, se completa a 1litro con agua destilada)

2 ml
5 gotas
8 gotas
10 gotas
1 ml

3 ml
cido sulfrico concentrado (H2SO4), se deja caer
lentamente por las paredes del tubo, observar.
2.2.9.
P. Milln

Sustancia problema
Reactivo de Milln
(Preparacin: Hg y HNO3 En una proporcin de 1:3,
diluir con 2 volmenes de agua la solucin resultante.

1 ml
2 ml

4 gotas

3.

AUTO-EVALUACIN.

1.
2.
3.

Diga cules son los fundamentos qumicos de las pruebas estudiadas.

Cuales son las aplicaciones prcticas de las pruebas.
Para el siguiente pentapptido, diga cuales pruebas y porque sern positivas. (ALAVAL-GLY-GLU-LYS)
Defina los siguientes trminos: aminocidos, protenas, anlisis cualitativo,
cuantitativo.
Dibuje los 20 L- - AA y clasifquelos segn la polaridad de sus grupos -R.
Efectu un enlace peptdico.

4.
5.
6.

33

2.3

Marcha analtica
SUSTANCIA DESCONOCIDA
Prueba Ninhidrina
(-) incolora
No es protena ni
aminocido

(+) Violeta o amarillo claro

protena, polipptido o
aminocido

(+) Rojo o
amarillo fuerte
Hidroxiprolina o
prolina

Prueba Biuret
(-) Azul o amarillo
aminocidos

(+) Violeta
Protenas y polipptidos

P. Xantoprotica

(-) Incoloro
Otros
aminocidos

P. Coagulacin

(+) Amarillo, naranja

o verde
Tirosina, fenilalanina
o triptfano

(-) No cuagula
Histonas,
protaminas o
polipptidos

P. Sulfato
de amonio

P. Hopkins-Cole

(+) Azul o
violeta
Triptfano

(+) Cuagula
Albminas o
glubulinas

(+) Precipita
Globulinas

(-) Incoloro
Tirosina o
Fenilalanina

(-) No
Precipita
Albminas

P. Milln
Grupo SH

(+) Rojo
Tirosina

(-) Incoloro
Fenilalanina

P. Sakaguchi
(-) Incoloro otros
aminocidos

(-) Incolora
Otros aminocidos
(+) Rojo
Arginina

34

(+) Negro o gris

Cistena, cistina,
metionina

4.
ANEXO
ESTRUCTURA Y ALGUNAS PROPIEDADES DE LOS AMINOACIDOS
4.1
Aminocidos no polares:
Grupo R
pKa'
pKa'
pKa'
Nombre
+
Abreviacin
R
-COOH
-NH3
PM
Alanina,
Ala (A)
89

CH3
CH3
CH
CH3

Valina,
Val (V)
117
Leucina,
Leu (L)
131
Isoleucina,
Ile (I)
131

CH3
CH
CH3
CH3

CH2

CH2

CH
CH3

Prolina,
Pro (P)
115

pI

2,34

9,69

6,00

2,32

9,62

5,96

2,36

9,60

5,98

2,36

9,60

6,02

1,99

10,60

6,30

2,28

9,21

5,74

1,83

9,13

5,48

2,83

9,39

5,89

COO

H
Metionina,
Met (M)
149

CH3

S CH2

Fenilalanina,
Phe
F
165

CH2

CH2

Triptofano,
Trp (W)
204

CH2
N
H

35

4.2

Aminocidos polares:
Grupo R
Nombre
Abreviacin
PM
Glicina,
Gly (G)
75

Serina,
Ser (S)
105
Treonina,
Thr (T)
119

CH2

CH3

Cisteina,
Cys (C)
121
Tirosina,
Tyr (Y)
181
Asparagina,
Asn (N)
132
Glutamina,
Gln (Q)
146

OH

CH2

CH2

OH

SH

HO

pKa'
-NH3+

pKa'
R

pI

2,34

9,60

5,97

2,21

9,15

5,68

2,63

10,43

5.,0

1,71

10,78

8,33

2,20

9,11

10,07 5,66

2,02

8,80

5,41

2,17

9,13

5,65

5,07

CH2

O
NH2

C CH2

O
NH2

pKa'
-COOH

C CH 2

CH2

36

4.3

Aminocidos acdicos:
Grupo R

Nombre
Abreviacin
PM
Acido
Asprtico,
Asp (D)
133

O
-

pKa' pKa'
R
-NH3+

pHI

2,09

9,82

3,86

2,7

2,19

9,67

4,25

3,22

O C CH2
O

Acido
Glutmico,
Glu (E)
147
4.4

pKa'
-COOH

O C CH 2

CH2

Aminocidos Bsicos:
Grupo R

Nombre
Abreviacin
PM
Lisina,
Lys (K)
146

NH3

CH2CH2CH2CH2

NH2
Arginina,
Arg (R)
174
Histidina,
His (H)
155

NH2

pKa'
-COOH

pI

2,18

8,95

10,53 9,74

2,17

9,04

12,48 10,76

1,82

9,17

6,00

C NH CH2CH2CH2

CH2
HN

pKa'
pKa'
R
-NH3+

NH

37

7,8

5.

INFORME 2 (PRUEBAS CUALITATIVAS PARA AMINOCIDOS Y

PROTEINAS)

Apellidos
Grupo de prcticas
Fecha
Calificaciones
Entrada

Nombres
N del mesn
N del estudiante
Desarrollo

Informe

Definitiva

1.
Complete el siguiente cuadro con la informacin deseada. En la casilla N0
Muestra, coloque el numero de cada tubo de las muestras problemas que se le entrego. Use
los signos (+) o (-), para reportar la positividad o negatividad de la reaccin. Sobre la base
de los resultados de sus pruebas, Ud. puede identificar la muestra problema y escribir la
composicin mas resaltante en las casillas correspondientes.
N0 Muestra
P. Ninhidrina
P. Biuret
P. Coagulacin
P. Sulfato amonio
P. Xantoprotica
P. Grupos SH
P. Sakaguchi
P. Hopkins-Cole
P. Milln
Nombre
de la
muestra
problema
Composicin
de la
sustancia
identificada

Nota: El informe debe ser entregado al finalizar la prctica, sin anexar hojas.
38