Fundamentos Uv Vis

Fundamentos de la
espectroscopa
UV-visible moderna
Conceptos bsicos
Tony Owen
Copyright Agilent Technologies 2000

Todos los derechos reservados. Esta prohibida la
reproduccin, adaptacin o traduccin, sin el
permiso previo y por escrito, excepto aquello
permitido por la ley de Derechos de Autor.
Impreso en Alemania 06/00
Nmero de publicacin 5980-1397ES
Prlogo
Prlogo
En 1988 publicamos un libro titulado The Diode-Array

Advantage in UV/Visible Spectroscopy. En ese momento,
aunque los detectores de diodos estaban en el mercado
desde 1979, sus caractersticas y sus ventajas comparados
con los espectrmetros convencionales de barrido, no eran
demasiado conocidas. Nosotros intentamos rectificar
aquella situacin. El libro fue bien recibido y se
distribuyeron varios miles de copias.
Mucho ha cambiado desde aquel primer libro y pensamos
que este es un momento adecuado para otra publicacin.
Ha aumentado el uso de los ordenadores en la evaluacin
de datos; las Buenas Prcticas de Laboratorio tienen ahora
gran importancia; y la nueva generacin de espectrofotmetros de diodos se caracteriza por un mejor rendimiento.
Con este libro, nuestro objetivo es revisar todos los
aspectos de importancia de la espectroscopa UV-visible,
para la obtencin de resultados. El control por microprocesador y/u ordenador hace que el proceso de datos sea
menos penoso y mejora la productividad. Como fabricantes
de instrumentos, nos gustara creer que los equipos son
ahora ms fciles de manejar. A pesar de estas ventajas, el
conocimiento de los fundamentos de la espectroscopa
UV-visible, de las limitaciones instrumentales y de los
peligros del tratamiento y la qumica de muestras, sigue
siendo esencial para obtener buenos resultados.
Adems, quisieramos demostrar que la idea de una medida
a una sola longitud de onda es insuficiente para obtener
resultados ptimos. Mltiples medidas a mltiples longitudes de onda o (preferiblemente) espectros completos, dan
lugar a la mejor exactitud y precisin de resultados y
proporciona la informacin necesaria para detectar errores.
Me gustara aprovechar esta oportunidad para agradecer a
mis colegas de Agilent Technologies, demasiados para
nombrarlos a todos, todo lo que he aprendido de ellos sobre
espectroscopa UV-visible, durante aos.
iii
iv
Contenidos
captulo 1 Principios y aplicaciones de
espectroscopa UV-visible
Principios bsicos................................................................................................ 2
El espectro electromagntico.................................................................... 2
Longitud de onda y frecuencia .................................................................. 3
Origen de los espectros UV-visible ........................................................... 3
Transmitancia y absorbancia..................................................................... 6
Derivadas de espectros .............................................................................. 6
Obtener las derivadas de los espectros ........................................... 8
Aplicaciones ........................................................................................ 9
Seal/ruido .......................................................................................... 9
Consideraciones instrumentales .................................................... 10
Anlisis cualitativo ............................................................................................ 10
Identificacin:
espectros y estructura .............................................................................. 10
Confirmacin de la identidad .................................................................. 11
Color ........................................................................................................... 13
Otra informacin cualitativa.................................................................... 14
Temperatura de fusin de las protenas y los cidos nuclicos . 14
Actividad enzimtica ........................................................................ 15
Consideraciones instrumentales ............................................................. 16
Anlisis cuantitativo.......................................................................................... 16
Ley de Beer ................................................................................................ 16
Requisitos de la muestra.................................................................. 20
Anlisis multicomponente ....................................................................... 21
Principio de aditividad ..................................................................... 21
Mtodo de ecuaciones simultneas simples ................................. 21
Mtodo de mnimos cuadrados....................................................... 24
Otros mtodos................................................................................... 26
Requisitos de la muestra.................................................................. 27
Requisitos instrumentales........................................................................ 27
Cuantificacin indirecta ................................................................................... 28
Derivatizacin qumica............................................................................. 28
Valoraciones espectrofotomtricas ........................................................ 28
Ensayos cinticos enzimticos................................................................ 28
captulo 2 Instrumentacin
Diseo instrumental .......................................................................................... 32
Componentes............................................................................................. 32
Fuentes .............................................................................................. 33
Contenidos
Dispositivos de dispersin .............................................................. 34

Detectores ......................................................................................... 35
Optica ................................................................................................. 38
El espectrofotmetro convencional ....................................................... 38
El espectrofotmetro de diodos.............................................................. 39
Configuracin ............................................................................................ 41
Diseo de haz simple ....................................................................... 41
Diseo de doble haz ......................................................................... 42
Diseo con divisin de haz.............................................................. 44
Diseo de doble
longitud de onda ............................................................................... 45
Medida de un espectro ............................................................................. 45
Parmetros instrumentales clave .................................................................... 46
Resolucin espectral ............................................................................... 46
Exactitud y precisin de longitud de onda ............................................ 50
Exactitud y precisin fotomtrica .......................................................... 51
Luz dispersa....................................................................................... 51
Ruido .................................................................................................. 52
Rango dinmico lineal .............................................................................. 53
Deriva ......................................................................................................... 55
captulo 3 Tratamiento y medida de muestra

Muestras lquidas ............................................................................................... 58
Cubetas....................................................................................................... 58
Material .............................................................................................. 58
Tipos de cubeta................................................................................. 59
Fuentes de error ............................................................................... 60
Cuidado de las cubetas .................................................................... 61
Eleccin de disolvente ............................................................................. 61
Efecto del disolvente, concentracin, pH y temperatura .................... 62
Muestras slidas ................................................................................................ 64
Sin referencia............................................................................................. 64
Indice de refraccin.................................................................................. 65
Geometra de la muestra .......................................................................... 65
Absorbancia dbil.............................................................................................. 66
Cambiar la anchura
de rendija.................................................................................................... 66
Promedio de tiempo ................................................................................. 67
Promedio de longitud de onda ................................................................ 67
Absorbancia fuerte ............................................................................................ 68
Interferencia....................................................................................................... 69
Tipos de interferencia............................................................................... 69
Otros compuestos absorbentes ...................................................... 70
Dispersin.......................................................................................... 70
Tcnicas de correccin ............................................................................ 71
vi
Contenidos
Isoabsorbancia.................................................................................. 72
Anlisis multicomponente............................................................... 72
Modelar el fondo............................................................................... 73
Referencia interna ............................................................................ 74
Correccin de tres puntos ............................................................... 74
Espectroscopa derivada ................................................................. 75
Problemas fotoqumicos ................................................................................... 79
Fluorescencia ............................................................................................ 79
Descomposicin de la muestra........................................................................ 80
captulo 4 Desarrollo y validacin del mtodo

Desarrollo del mtodo ...................................................................................... 82
Linealidad................................................................................................... 83
Exactitud.................................................................................................... 87
Precisin..................................................................................................... 88
Sensibilidad................................................................................................ 89
Rango.......................................................................................................... 91
Selectividad................................................................................................ 91
Robustez..................................................................................................... 93
Requisitos instrumentales........................................................................ 94
Validacin del mtodo....................................................................................... 94
captulo 5 Operacin de rutina

Verificacin del rendimiento del instrumento ............................................... 96
Parmetros de test .................................................................................... 96
Exactitud y precisin de longitud de onda.................................... 97
Exactitud y precisin fotomtrica.................................................. 98
Luz dispersa....................................................................................... 98
Resolucin......................................................................................... 99
Ruido .................................................................................................. 99
LLanura de la lnea de base ........................................................... 100
Estabilidad....................................................................................... 100
Linealidad ........................................................................................ 100
Patrones ................................................................................................... 101
Patrones de emisin ....................................................................... 101
Patrones slidos de absorcin...................................................... 101
Patrones lquidos de absorcin..................................................... 102
Requisitos de las normas........................................................................ 104
GLP/GMP ......................................................................................... 104
Farmacopea europea ..................................................................... 104
Farmacopea de
Estados Unidos ............................................................................... 106
Mtodos americanos de test estndar ......................................... 107
vii
Contenidos
Recomendaciones ................................................................................... 109

Autotest del instrumento ................................................................................ 114
Idoneidad del sistema ..................................................................................... 115
Operacin apropiada....................................................................................... 115
Almacn electrnico............................................................................... 116
Procedimientos estndar de operacin................................................ 116
Datos colaterales ............................................................................................. 116
Longitudes de onda de confirmacin ................................................... 117
Espectros completos .............................................................................. 117
Estadsticas .............................................................................................. 119
apndice A Exactitud y precisin

Definicin de los trminos ............................................................................. 122
apndice B Caractersticas de los

espectrofotmetros de diodos
Ventajas de la espectroscopa de diodos ...................................................... 124
Rpida adquisicin espectral................................................................. 124
Medida multilongitud de onda simultnea........................................... 125
Reseleccin de longitud
de onda ..................................................................................................... 126
Sensibilidad.............................................................................................. 127
Estadsticas de las medidas ................................................................... 127
Robustez y
fiabilidad................................................................................................... 127
Area abierta de muestra ......................................................................... 128
Desventajas de la espectroscopa de diodos................................................ 128
Resolucin ............................................................................................... 128
Luz dispersa ............................................................................................. 129
Descomposicin de
la muestra................................................................................................. 129
Complejidad............................................................................................. 130
Errores en la medida de muestras fluorescentes................................ 130
apndice C Referencias
indice
viii
captulo 1
captulo 1
Principios y
aplicaciones de
espectroscopa
UV-visible
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
Este captulo presenta la teora bsica y los principios

de la espectroscopa UV-visible, proporcionando una
valiosa visin de los usos y limitaciones de esta
tcnica para el anlisis qumico. Tambin se revisan,
brevemente, las aplicaciones principales de la
espectroscopa UV-visible.
Principios bsicos
El espectro La radiacin ultravioleta (UV) y visible comprende slo una
electromagntico pequea parte del espectro electromagntico, que incluye
otras formas de radiacin como radio, infrarrojo (IR),
csmica y rayos X (Figura 1).
Frecuencia [Hz]
Longitud de onda [m]

Figura 1
El espectro electromagntico
Radio
NMR
Televisin
Rdar
Microondas
Infrarrojo
Infrarrojo
Visible
Ultravioleta
visible
Rayos X
Rayos gamma
Rayos csmicos
Ultravioleta
La energa asociada con la radiacin electromagntica se

define por la siguiente ecuacin:
E = h
donde E es la energa (en julios), h es la constante de
Planck (6.62 10-34 Js) y es la frecuencia (en segundos).
Longitud de onda y La radiacin electromagntica puede considerarse una

frecuencia combinacin de campos elctricos y magnticos alternos
que viajan por el espacio con un movimiento de onda. Como
la radiacin acta como una onda, puede clasificarse segn
la longitud de sta o la frecuencia, relacionadas por:
= c
donde es la frecuencia (en segundos), c es la velocidad de
la luz (3 108 ms-1) y es la longitud de onda (en metros).
En espectroscopa UV-visible, la longitud de onda
normalmente se expresa en nanometros (1 nm = 10-9 m).
De las ecuaciones anteriores se deduce que radiacin con
longitud de onda ms corta tiene mayor energa. En espectroscopa UV-visible, la luz UV de longitud de onda ms
pequea tiene la energa ms alta. En algunos casos, esta
energa es suficiente para causar reacciones fotoqumicas
no deseadas al medir los espectros (recuerde, es el componente UV de la luz el que causa las quemaduras solares).
Origen de los espectros Cuando la radiacin interacciona con la materia, pueden

UV-visible ocurrir varios procesos como reflexin, dispersin,
absorbancia , fluorescencia/fosforescencia (absorcin y
reemisin) y una reaccin fotoqumica (absorbancia y
rotura de enlaces). En general, cuando se miden espectros
UV-visible, slo es deseable que ocurra absorbancia.
Como la luz es una forma de energa, la absorcin de la luz
por la materia causa que aumente el contenido de energa
de las molculas (o tomos). La energa potencial total de
una molcula, generalmente se representa como la suma de

sus energas electrnica, vibracional y rotacional:
E total = E electronica + E vibracional + E rotacional

La cantidad de energa que una molcula posee en cada
forma no es un continuo, sino una serie de niveles o estados
discretos. La diferencias de energa entre los diferentes
estados siguen el orden:
E electronica > E vibracional > E rotacional

En algunas molculas y tomos, los fotones de luz UV y
visible tienen suficiente energa para causar transiciones
entre los diferentes niveles. La longitud de onda de la luz
absorbida es aquella que tiene la energa requerida para
mover un electrn desde un nivel de energa inferior a uno
superior. La Figura 2 muestra un ejemplo de transiciones
electrnicas en el formaldehdo y las longitudes de onda de
la luz que las causan.
transicin
transicin
Figura 2
Transiciones electrnicas en el formaldehdo
Estas transiciones deben resultar en bandas de absorbancia

muy estrechas, a longitudes de onda caractersticas de la
diferencia entre los niveles de energa de las especies
absorbentes. Esto es cierto para los tomos, como se
muestra en la Figura 3.
Figura 3
Transiciones electrnicas y espectros de los tomos
Sin embargo en las molculas, los niveles de energa

vibracional y rotacional estn superpuestos sobre los
niveles de energa electrnica. Como pueden ocurrir
muchas transiciones con diferentes energas, las bandas se
ensanchan (Figura 4). El ensanchamiento es incluso mayor
en las disoluciones, debido a las interacciones
disolvente-soluto.
niveles de energa electrnica

niveles de energa vibracional
niveles de energa rotacional
transicin electrnica
Figura 4
Transiciones electrnicas y espectros UV-visible en molculas
Transmitancia y Cuando la luz atraviesa o se refleja en la muestra, la

absorbancia cantidad de luz absorbida es la diferencia entre la radiacin
incidente (Io) y la transmitida (I). La cantidad de luz
absorbida se expresa como transmitancia o absorbancia. La
transmitancia normalmente se da en trminos de una
fraccin de 1 o como porcentaje, y se define como se indica
a continuacin:
T = I I o o % T = ( I I o ) 100
La absorbancia se define:
A = log T
Para la mayora de las aplicaciones se utilizan valores de
absorbancia, ya que la relacin entre sta y tanto la
concentracin como el paso ptico es, normalmente, lineal.
Derivadas de espectros Si un espectro se expresa en absorbancia (A) como una

funcin de longitud de onda (), las derivadas son:
Orden cero:
A = f( )
Primer orden:
dA
------- = f ( )
d
Segundo orden:
Ad-------= f ( )
2
d
La Figura 5 de la pgina siguiente muestra los efectos de la

derivacin en una banda gaussiana simple. Las derivadas de
los espectros son siempre ms complejos que el espectro de
orden cero.
La primera derivada es la velocidad de cambio de la
absorbancia frente a la longitud de onda. Empieza y termina
en cero, pasando por cero a la misma longitud de onda que
la max de la banda de absorbancia. Esta derivada tiene una
banda positiva y una negativa con un mximo y un mnimo a
las mismas longitudes de onda que las de los puntos de
inflexin de la banda de absorbancia. Este funcin bipolar
es caracterstica de todas las derivadas de orden impar.
La caracterstica ms significativa de la derivada de
segundo orden es una banda negativa con un mnimo a la
misma longitud de onda que la del mximo de la banda de
orden cero. Esta derivada tambin muestra dos bandas
satlite positivas, a cada lado de la banda principal. La
cuarta derivada muestra una banda positiva con un mximo
a la misma longitud de onda que el mximo de la banda de
orden cero. Las derivadas de orden par muestran una banda
negativa o positiva, con mnimos o mximos a la misma
longitud de onda que la max de la banda de absorbancia.
Absorbancia
Absorbancia
1 derivada
2 derivada
3 derivada
4 derivada
Figura 5
Derivadas de los espectros de una banda gaussiana de absorbancia
Obtener las derivadas de los

espectros
Pueden utilizarse mtodos pticos, electrnicos y

matemticos, para generar las derivadas de los espectros.
Aunque las tcnicas pticas y electrnicas fueron la base de
la primitiva espectroscopa UV-visible, han sido muy
superadas por los mtodos matemticos.
Para calcular la derivada a una longitud de onda
determinada (), se selecciona una ventana de n puntos y
se ajusta un polinomio por el mtodo de mnimos
A = a 0 + a 1 + + a l
cuadrados. Los coeficientes a0 al a cada longitud de onda

son los valores derivados, donde a1 es la primera derivada,
a2 es la segunda, etc. Savitzky y Golay desarrollaron un
mtodo muy eficaz para realizar los clculos, que son la
base del algoritmo de derivacin en la mayora de los
instrumentos comerciales. Este mtodo tambin suaviza los
datos. Si el orden del polinomio (l) es menor que el nmero
de datos (2n+1) en la ventana, generalmente el polinomio
no pasa por todos los puntos. Por lo tanto, el ajuste por
mnimos cuadrados da lugar a una aproximacin suavizada
a los puntos originales de los datos.
Aunque transformar un espectro UV-visible a su derivada de
primer o mayor orden, normalmente, resulta en un perfil
ms complejo que el espectro de orden cero (Figura 5), no
aumenta la informacin intrnseca contenida. De hecho,
disminuye debido a la prdida de datos, como los factores
de desplazamiento (offset) constantes.
Aplicaciones
Las derivadas de los espectros pueden utilizarse para

resaltar las diferencias entre espectros, resolver bandas
solapadas para el anlisis cualitativo (vea Confirmacin de
la identidad en la pgina 11) y, ms importante, reducir los
efectos de interferencias debidas a dispersin, matriz u
otros compuestos absorbentes para el anlisis cuantitativo
(vea Espectroscopa derivada en la pgina 75).
Seal/ruido
Un efecto no deseado de la derivacin es la disminucin de

la relacin S/N en las derivadas de orden superior. Esta
disminucin se debe a la discriminacin (Espectroscopa
derivada en la pgina 75) y al hecho de que el ruido
siempre muestra las seales ms agudas del espectro. Por
tanto, si los datos espectrales utilizados en el clculo de
derivadas tienen intervalos de 2 nm, el ruido tiene una
anchura de banda de 2 nm. Si la banda del analito tiene una
anchura de 20 nm, la S/N de la primera derivada ser 10
veces peor que en el espectro de orden cero. Puede
utilizarse la tcnica polinmica de suavizado de
Savitzky-Golay para mitigar la disminucin de S/N, pero
debe tenerse cuidado ya que un grado demasiado alto de

suavizado distorsiona el espectro derivado.
Consideraciones
instrumentales
Para que la resolucin de las derivadas aumente, es necesario un incremento de la reproducibilidad de longitud de
onda del espectrofotmetro. Pequeos errores de pueden
resultar en errores de seal mucho mayores en el modo
derivada que en el modo de absorbancia.
El efecto negativo de la derivacin sobre S/N tambin
demanda un aumento de las caractersticas de bajo ruido
del espectrofotmetro. Si ste puede barrer y promediar
mltiples espectros, puede mejorarse la S/N antes de la
derivacin.
Anlisis cualitativo
Identificacin: Generalmente, los espectros UV-visible muestran algunas
espectros y estructura bandas anchas. Comparada con tcnicas como infrarrojo,
que produce muchas bandas estrechas, la espectroscopa
UV-visible proporciona informacin cualitativa limitada. La
mayor parte de la absorcin de los compuestos orgnicos
resulta de la presencia de enlaces (es decir, insaturados).
Un cromforo es un grupo molecular que, normalmente,
contiene un enlace . Cuando se inserta en un hidrocarburo
saturado (que no exhibe un espectro de absorbancia
UV-visible), se forma un compuesto con una absorcin
entre 185 y 1000 nm. La Tabla 1 lista algunos cromforos y
las longitudes de onda de sus mximos de absorbancia.
Tabla 1
Cromforos seleccionados y sus mximos de absorbancia

Cromforo
Frmula
Ejemplo
max (nm)
Carbonilo (cetona)
RRC=O
Acetona
271
Acetaldehdo
293
Carbonilo (aldehdo) RHC=O
10
Tabla 1
Cromforos seleccionados y sus mximos de absorbancia

Carboxilo
RCOOH
Acido actico
204
Amida
RCONH2
Acetamida
208
Etileno
RCH=CHR
Etileno
193
Acetileno
RC=CR
Acetileno
173
Nitrilo
RC=N
Acetonitrilo
< 160
Nitro
RNO2
Nitrometano
271
La presencia de una banda de absorbancia a una

determinada longitud de onda es una buena indicacin de la
presencia de un cromforo. Sin embargo, la posicin del
mximo no es fija sino que depende, en parte, del entorno
molecular del cromforo y del disolvente en el que pueda
disolverse la muestra. Otros parmetros, como pH y
temperatura, tambin pueden causar cambios tanto en la
intensidad como en la longitud de onda de los mximos de
absorbancia.
Conjugando el doble enlace con otros dobles enlaces,
aumenta tanto la intensidad como la longitud de onda de las
bandas de absorcin. Para algunos sistemas moleculares,
como hidrocarburos conjugados o carotenoides, la relacin
entre intensidad y longitud de onda ha sido investigada
sistemticamente.
Los iones de los metales de trasicin tambin tienen niveles
de energa electrnica que causan absorcin de 400700 nm
en la regin visible.
Confirmacin de la Aunque los espectros UV-visible no permiten una

identidad identificacin absoluta, se usan frecuentemente para
confirmar la identidad de una sustancia mediante la
comparacin del espectro medido con uno de referencia.
Cuando los espectros son muy similares, pueden utilizarse
espectros derivados. Como se muestra en la Figura 6, el
11
nmero de bandas aumenta con el orden de derivada. Este

aumento de complejidad de los espectros derivados puede
ser til en el anlisis cualitativo, para caracterizar materiales o para identificacin. Por ejemplo, el espectro del
esteroide testosterona muestra una nica banda ancha, sin
estructura, centrada alrededor de 330 nm, mientras que la
segunda derivada muestra seis picos distintos.
El efecto de mejora de resolucin puede utilizarse tambin
en la identificacin. La Figura 6 muestra una simulacin por
ordenador. Cuando dos bandas gaussianas con una anchura
de banda espectral natural (NBW) de 40 nm, separadas por
30 nm, se suman en el modo de absorbancia, resulta una
banda con un mximo entre los dos componentes, es decir,
no estn resueltos. En la cuarta derivada, estas dos bandas
son claramente visibles, con mximos centrados cerca de la
max de las bandas de los componentes.
Absorbancia
4 derivada
Figura 6
Mejora de la resolucin
12
Color El color es una propiedad importante de una sustancia. El

color de la materia est relacionado con su absortividad o
reflexividad. El ojo humano ve el color complementario al
que se absorbe, como se observa en la Figura 7 y la Figura 8.
Figura 7
Transmisin y color
Long. de onda [nm]
Color absorbido
rojo
naranja
amarillo-verde
verde
verde azulado
azul verdoso
azul
violeta
Color complementario
verde azulado
azul verdoso
prpura
rojo-prpura
rojo
naranja
amarillo
amarillo-verde
Figura 8
Absorbancia y colores complementarios
13
En la prctica, tanto la generacin como la sensacin de

color son muy complejas y dependen de muchos factores,
como el espectro del iluminante y, en el caso de slidos, de
la estructura de la superficie. Se han desarrollado sistemas
especializados, como el CIE L*a*b, e instrumentacin para
medida de color. Cuando estn equipados con el software
apropiado, la mayora de los espectrofotmetros pueden
utilizarse para medir el color. Una discusin a fondo sobre
este tema est fuera del objetivo de este libro. Varias
publicaciones2,3 discuten en detalle el color y su medida,
muy correctamente.
Otra informacin La espectroscopa UV-visible puede utilizarse para determicualitativa nar muchas caractersticas fsico-qumicas de los compuestos y, por tanto, puede proporcionar informacin como la
identidad. A continuacin se presentan dos ejemplos.
Temperatura de fusin de las
protenas y los cidos
nuclicos
Los espectros de absorbancia de las protenas resultan

principalmente de la presencia de los aminocidos
aromticos triptfano, tirosina y fenilalanina. Una protena
a temperatura ambiente tiene una estructura o
conformacin terciaria especfica que crea un entorno
electrnico determinado para los aminocidos aromticos.
Si se calienta la protena, a una cierta temperatura, se
desdobla o funde y pierde su estructura. En este proceso, el
entorno electrnico de los aminocidos aromticos cambia,
lo que resulta en cambios o variaciones espectrales.
Puede utilizarse anlisis multicomponente (vea Anlisis
multicomponente en la pgina 21) para determinar la
cantidad de cada aminocido aromtico que est presente
en una protena intacta.4
El cido desoxirribonuclico (DNA) en su estado nativo,
consta de dos cadenas de molculas de desoxirribosa
enlazadas helicoidalmente. Las cadenas estn unidas por
enlaces de hidrgeno entre las bases purina y pirimidina (la
adenina se une a la timina (A-T) y la guanina a la citosina
(G-C)). Estas bases son las principales responsables de la
14
absorbancia UV del DNA, con un mximo a 260 nm. Como

en un sistema multicomponente, la absorcin observada de
una molcula de DNA debe ser igual a la suma de las
absorbancias individuales:
A DNA = A adenina + A guanina + A cito sin a + Atimina

Sin embargo, la absorbancia observada es siempre
significativamente menor que la esperada debido a que el
enlace de hidrgeno entre las bases cambia su entorno
electrnico. Cuando se calienta una molcula, el enlace de
hidrgeno se rompe, la doble hlice se desenrosca y la
absorbancia aumenta, de manera que se acerca a la
esperada de la suma de todas las bases. Este proceso de
desnaturalizacin tambin se conoce como fusin. En un
experimento de fusin de DNA, se aumenta paso a paso la
temperatura de una disolucin de DNA y se mide la
absorbancia a 260 nm a cada temperatura, representndose
como una curva de fusin.
El punto medio del rango de temperatura sobre el que
ocurre la fusin, es el valor Tm. El Tm de una muestra
particular de DNA depende principalmente del porcentaje
de parejas G-C de la muestra, cada una de las cuales
contiene tres enlaces de hidrgeno (en contraste, cada
pareja A-T contiene dos enlaces de hidrgeno). Cuanto
mayor es el porcentaje de parejas G-C en la muestra, mayor
es el Tm observado.
Actividad enzimtica
La actividad de una enzima es una medida de su eficacia

como catalizador. La concentracin de enzima en una
preparacin impura puede expresarse en trminos de
unidades por mililitro y la actividad especfica de la
preparacin, puede expresarse en unidades por miligramo
de protena. Al purificarse la enzima, la actividad especfica
aumenta hasta un lmite (el de la enzima pura).
Como la velocidad de reaccin vara con factores tales
como concentracin del sustrato, pH, fuerza inica y
15
temperatura, las condiciones bajo las que se determina la

actividad deben estar definidas con precisin. Estas
condiciones son, normalmente, las ptimas de ensayo a una
temperatura fija (25, 30 o 37 C), con todos los sustratos
presentes en condiciones de saturacin. Para determinar la
actividad, se prepara un sistema con concentraciones
conocidas de sustrato y, si es necesario, coenzima. Se aade
un peso conocido de la enzima y se determina la velocidad
de reaccin. Las medidas de actividad se realizan
principalmente en el campo de la investigacin donde se
aislan y purifican enzimas, as como para la fabricacin de
kits de ensayos enzimticos, en los que la actividad de la
enzima debe ser igual en todos los lotes.
Consideraciones La exactitud de longitud de onda absoluta y la exactitud

instrumentales fotomtrica absoluta son muy importantes para el anlisis
cualitativo, particularmente para la identificacin y
confirmacin de compuestos desconocidos. A menudo, se
comparan espectros adquiridos en diferentes instrumentos
a diferentes tiempos. A este respecto, los espectros pueden
haber sido medidos a una resolucin instrumental definida.
Anlisis
cuantitativo
Ley de Beer Si 100 fotones de luz entran en una cubeta y slo 50 salen
por el otro lado, la transmitancia es 0.5, o del 50 %. Si estos
50 fotones atraviesan, entonces, una cubeta idntica, slo
saldrn 25, etc. La Figura 9 muestra la representacin de la
transmitancia frente a la concentracin.
16
Transmisin
Paso ptico
Figura 9
Transmitancia y concentracin: la ley de Bouguer-Lambert
Generalmente se piensa que Lambert (1760) formul la

primera ecuacin matemtica sobre este efecto, aunque
ahora parece que se le adelant Bouguer en 1729. La
expresin matemtica es:
T = I Io = e
kb
donde Io es la intensidad incidente, I es la intensidad

transmitida, e es la base de los logaritmos naturales, k es
una constante y b es el paso ptico (normalmente en
centmetros).
La ley de Beer es idntica a la ley de Bouguer, excepto
porque est expresada en trminos de la concentracin. La
cantidad de luz absorbida es proporcional al nmero de
molculas absorbentes por las que pasa la luz. La Figura 10
muestra una representacin de la transmitancia frente al
paso ptico.
17
Transmisin
Paso ptico
Figura 10
Transmitancia y paso ptico: ley de Beer
Combinando las dos leyes se obtiene la ley

Beer-Bouguer-Lambert:
T = I Io = e
kbc
donde c es la concentracin de las especies absorbentes

(normalmente expresada en gramos por litro o miligramos
por litro). Esta ecuacin puede transformarse en una
expresin lineal tomando el logaritmo y, normalmente, se
expresa en la forma decdica:
A = log T = log ( I I o ) = log ( I o I ) = bc

donde es la absorcin molar o coeficiente de extincin.
Esta expresin se conoce como ley de Beer. La Figura 11
muestra una representacin de la absorbancia frente a la
concentracin.
18
Absorbancia [UA]
Concentracin
Figura 11
La ley de BeerBouguer-Lambert
El coeficiente de extincin () es caracterstico de una

sustancia en condiciones definidas de longitud de onda,
disolvente y temperatura. En la prctica, el coeficiente de
extincin medido tambin depende de las caractersticas
del instrumento utilizado. Por esta razn, normalmente no
se utilizan valores predeterminados del coeficiente de
extincin para anlisis cuantitativo. En su lugar, se
construye una curva de calibracin o curva de trabajo para
la sustancia a analizar, utilizando una o dos disoluciones
patrn con concentraciones conocidas del analito.
Para transiciones electrnicas, la diferencia de energa
entre los estados fundamental y excitados, es relativamente
grande. Por tanto, a temperatura ambiente, es muy probable
que todas las molculas estn en estado electrnico
fundamental. La absorcin y vuelta al estado fundamental,
son procesos rpidos y el equilibrio se alcanza muy
rpidamente. Por consiguiente, la absorcin de luz
UV-visible es cuantitativamente muy exacta. La simple
relacin lineal entre la absorbancia y la concentracin y la
relativa facilidad de medida de la luz UV-visible, ha hecho
19
de la espectroscopa UV-visible la base de miles de mtodos

analticos cuantitativos.
Suponiendo que el espectro de orden cero obedece la ley de
Beer, existe una relacin lineal similar entre la
concentracin y la amplitud, para todos los rdenes de
espectros derivados:
Orden cero:
A = bc
Primera derivada:
d
dA
------- = ------ bc
d
d
n derivada:
d
Ad-------= -------- bc
d
d
a , donde A es la absorbancia, es el coeficiente de

extincin, b es el paso ptico y c la concentracin.
Para cuantificar un solo componente, la seleccin de
longitudes de onda es ms difcil con espectros derivados
que con espectros de absorbancia, ya que hay presentes
picos positivos y negativos. Las derivadas de orden par
tienen un mximo o un mnimo a la misma max que el
espectro de absorbancia, pero en las derivadas de orden
impar esta longitud de onda es un punto de corte con el
cero. Tomando la diferencia entre el mximo ms alto y el
mnimo ms bajo se obtiene la mejor S/N pero puede
resultar en una mayor sensibilidad para las interferencias
de otros componentes.
Requisitos de la muestra
Para resultados exactos, la muestra a analizar debe

contener slo el componente absorbente para el que se ha
realizado la calibracin. Si la muestra es una disolucin,
debe utilizarse como blanco el disolvente puro. Puede que
sea posible corregir una interferencia con una segunda
longitud de onda.
20
Anlisis Se han realizado casi tantos anlisis multicomponente con

multicomponente espectros UV-visible como de un solo componente, pero
debido a que las tcnicas usadas en anlisis multicomponente a menudo producan resultados incorrectos (como se
detalla a continuacin), no eran muy aplicados. Sin
embargo, los instrumentos modernos producen datos ms
precisos y las modernas tcnicas de ajuste de curvas dan
lugar a resultados ms exactos y, quizs ms importante,
indican cuando los resultados son incorrectos. Por estas
razones, los anlisis multicomponente UV-visible se han
hecho ms populares.
Principio de aditividad
Segn la ley de Beer (Ley de Beer en la pgina 16), la

absorbancia es proporcional al nmero de molculas que
absorben radiacin a la especificada. Este principio es
cierto si hay presente ms de una especie absorbente.
Todos los mtodos cuantitativos multicomponente estn
basados en el principio de que la absorbancia de una mezcla
a cualquier longitud de onda, es igual a la suma de la
absorbancia de cada componente de la mezcla, a esa .
Mtodo de ecuaciones
simultneas simples
El mtodo simple de anlisis multicomponente se basa en

medidas a un nmero de longitudes de onda igual al nmero
de componentes de la mezcla. Las longitudes de onda
elegidas normalmente son aquellas del mximo de
absorbancia de cada componente. Para la calibracin, se
mide la absorbancia de patrones puros de concentracin
conocida, para determinar el coeficiente de extincin de
cada componente a cada longitud de onda seleccionada.
La absorbancia de la mezcla a cada longitud de onda es la
suma de la absorbancia de cada componente a esa longitud
de onda, que al fin y al cabo depende del coeficiente de
extincin y de la concentracin de cada componente. As,
para dos componentes x e y, las ecuaciones son:
A ( x + y ) = A x + A y = e x bc x + e y bc y
y
21
A ( x + y ) = A x + A y = e x bc x + e y bc y
donde A es la absorbancia a longitud de onda , A es la
absorbancia a longitud de onda , e es la absortividad
molar a longitud de onda , e es la absortividad molar a
longitud de onda , c es concentracin y b es el paso ptico.
Absorbancia [UA]
Estas ecuaciones se resuelven fcilmente para determinar

la concentracin de cada componente. Si las medidas
siempre fueran perfectas, podran obtenerse resultados
exactos incluso para mezclas de componentes con espectros muy similares. Sin embargo, siempre hay errores en las
medidas que pueden afectar significativamente a la exactitud de los resultados si los espectros estn muy solapados.
La Figura 12 muestra una mezcla simulada de dos componentes sin solapamiento de los espectros en los mximos.
Longitud de onda [nm]

Figura 12
Una mezcla de dos componentes con poco solapamiento espectral
En contraste, la Figura 13 muestra una mezcla simulada de

dos componentes con un solapamiento significativo de los
espectros, en los mximos de absorbancia.
22
Absorbancia [UA]

Figura 13
Mezcla de dos componentes con un solapamiento espectral
significativo
Para una mezcla de x e y donde cx = cy = 1, las

absorbancias medidas deberan ser:
Con poco solapamiento espectral
Con solapamiento espectral
A(x + y) = 1.1 + 0.0 = 1.1
A(x + y) = 0.6 + 0.5 = 1.1
A(x + y) = 0.0 + 0.9 = 0.9
A(x + y) = 0.4 + 0.5 = 0.9
Si ocurre un error del 10 % en la medida de A(x + y) y

A(x + y), es decir, A(x + y) = 0.99 (- 10 %) y A(x + y) = 0.99
23
(+ 10 %), el clculo cuantitativo da lugar a los resultados

mostrados en la Tabla 2:
Tabla 2
Comparacin de los resultados de anlisis multicomponente para ejemplos con

poco y sustancial solapamiento espectral
Poco solapamiento
Mtodo de mnimos
cuadrados
Mucho solapamiento
Componente
Concentracin Concentracin
nominal
calculada
% error
Concentracin
calculada
% error
0.9
- 10 %
- 100 %
1.1
+ 10 %
1.98
+ 98 %
Puede reducirse el efecto del ruido aleatorio mediante el

uso de informacin espectral adicional, es decir puede
utilizarse una serie de datos para cuantificacin, en lugar de
slo dos. En este llamado sistema sobredeterminado, un
ajuste por mnimos cuadrados de los espectros patrn al
espectro de la muestra medida, da lugar a resultados
cuantitativos.5,6 La Figura 14 muestra un espectro para la
mezcla de dos componentes mostrada en la Figura 13, con
un 10 % de error aleatorio en cada punto medido.
24
Medido
Absorbancia [UA]
Real

Figura 14
Espectro mezcla con un 10 % de error aleatorio a cada
longitud de onda
Con 21 puntos (intervalos de 2 nm sobre 200240 nm), los

resultados cuantitativos del mtodo de mnimos cuadrados
tienen un error < 1 % comparados con un error de
aproximadamente el 10 %, usual en las medidas a dos
longitudes de onda, como se muestra en la Tabla 3.
Tabla 3
Comparacin de los resultados de anlisis multicomponente de los mtodos de

ecuaciones simultneas simples y mnimos cuadrados
Usando slo 210 y
230 nm
Usando 200240 nm
Componente
Concentracin Concentracin
nominal
calculada
% error
Concentracin
calculada
% error
0.0
- 10 %
1.003
+ 0.3 %
1.98
+ 10 %
0.995
- 0.5 %
25
Este mtodo permite el anlisis de las mezclas ms

complejas y de mezclas simples de componentes con
espectros similares.
El residual del clculo de mnimos cuadrados es un buen
indicador de lo bien que los espectros patrn ajustan en los
espectros de muestra y, por lo tanto, es un buen indicador
de la probable exactitud de los resultados.
Absorbancia [UA]
Un ejemplo de anlisis multicomponente es la

cuantificacin de cinco hemoglobinas en sangre, con
mnima preparacin de la muestra.7 La Figura 15 muestra
los espectros de absorcin de los derivados de
hemoglobina. Este anlisis se realizaba anteriormente
utilizando varias tcnicas analticas, incluyendo
espectroscopa y valoraciones.
Sulfhemoglobina
Oxihemoglobina
Carboxihemoglobina
Hemoglobina (pH 7.07.4)
Desoxihemoglobina

Figura 15
Espectros de absorcin de derivados de hemoglobina
Otros mtodos
Otros mtodos estadsticos de anlisis multicomponente

incluyen mnimos cuadrados parcial (PLS), regresin del
componente principal (PCR) y mnimos cuadrados mltiple
(MLS). En teora, estos mtodos ofrecen algunas ventajas
26
sobre los descritos anteriormente, pero en la prctica el

proceso de calibracin es mucho ms complejo.
Requisitos de la muestra
Los mtodos de ecuaciones simultneas simples y mnimos

cuadrados dan lugar a resultados exactos slo si se realiza
calibracin utilizando patrones puros o mezclas de
patrones, para cada componente de la muestra que
contribuya al espectro UV. La muestra desconocida no debe
tener ninguna capacidad adicional de absorcin.
Requisitos La cuantificacin de un componente normalmente se realiinstrumentales za midiendo con el mismo instrumento, uno o una serie de
patrones y a continuacin, el desconocido. Esta calibracin
debera eliminar los efectos instrumentales, haciendo que la
exactitud de longitud de onda y fotomtrica absolutas,
fueran relativamente poco importantes. Por el contrario, la
reproducibilidad fotomtrica es esencial para resultados
precisos. Si se mide slo en el mximo de absorbancia, la
reproducibilidad de es tambin de poca importancia
debido a que la velocidad del cambio de absorbancia con
es baja. Sin embargo, si se utiliza una longitud de onda del
lateral de la banda, la reproducibilidad ser muy
importante. Finalmente, el rango instrumental lineal es
crtico, ya que la calibracin supone una relacin lineal.
Un anlisis multicomponente exacto requiere una S/N
excelente, especialmente si se utiliza el mtodo de ecuaciones simultneas simples. En mnimos cuadrados, los
datos de los laterales de las bandas de absorbancia se incorporan al clculo, haciendo que la reproducibilidad de sea
tambin esencial. Adems, como se necesitan ms datos, es
necesario un barrido rpido para buena productividad.
27
Cuantificacin
indirecta
Derivatizacin qumica Debido a que muchos compuestos exhiben dbil o ninguna
absorbancia en las regiones UV o visible, se han
desarrollado varios mtodos con derivatizacin qumica.
Tales mtodos, normalmente implican el aadir un reactivo
orgnico, que forma un complejo con fuerte absortividad.
La etapa final de medida es prcticamente igual que la de
los mtodos directos. Con esta tcnica, la eleccin
apropiada del reactivo puede mejorar significativamente
tanto la sensibilidad como la selectividad.
Valoraciones En anlisis volumtricos, el cambio de color que seala el

espectrofotomtricas final de una valoracin normalmente se detecta
visualmente. Este proceso es inherentemente subjetivo y
puede ser una fuente de error. El uso de un
espectrofotmetro para detectar el final, introduce la
objetividad y la automatizacin en el anlisis.
Ensayos cinticos El anlisis UV-visible directo de un componente en matrices

enzimticos biolgicas, por ejemplo sangre o alimentos, es difcil. Las
interferencias de otros componentes a menudo
imposibilitan la medida directa de una propiedad
especfica, como la absorbancia. La separacin del
compuesto de inters puede ser costosa y pesada y por
tanto, impracticable en el anlisis de rutina.
Pueden utilizarse ensayos enzimticos en el anlisis
indirecto de un compuesto o un grupo de compuestos en
una matriz compleja. Si se selecciona la enzima
cuidadosamente, cualquier cambio en la muestra posterior
a la adicin de la enzima, ser el resultado slo de la
reaccin del compuesto o compuestos especficos. Esta
selectividad es la base de los ensayos enzimticos.
28
Los ensayos enzimticos pueden dividirse en dos tipos:

ensayos de velocidad y ensayos de punto final. La velocidad
de una enzima depende de muchos facyores, que incluyen
temperatura, pH, actividad enzimtica, concentracin de la
enzima y concentracin del sustrato. Sin embargo, si todos
los parmetros estn controlados a un nivel constante, la
velocidad de reaccin es directamente proporcional a la
concentracin del sustrato. Con los ensayos de punto final,
se seleccionan las condiciones de manera que la conversin
del sustrato a producto se complete dentro de un periodo
razonable de tiempo (520 min). La diferencia entre la
absorbancia inicial y final es directamente proporcional a la
cantidad de sustrato.
29
30
captulo 2
captulo 2
Instrumentacin
31
Instrumentacin
Idealmente, los instrumentos analticos siempre dan

lugar a medidas correctas de un parmetro qumico o
fsico-qumico, pero en la prctica todos los equipos
estn sujetos a error. En este captulo se revisan los
componentes bsicos de un espectrofotmetro y las
distintas configuraciones instrumentales posibles. Se
discuten tambin los parmetros instrumentales clave
y sus posibles efectos adversos sobre las medidas.
Diseo instrumental
Componentes Un espectrofotmetro es un instrumento para medir la
transmitancia o absorbancia de una muestra, en funcin de
la longitud de onda de la radiacin electromagntica. Los
componentes clave de un espectrofotmetro, son:8
una fuente que genera una banda ancha de radiacin
electromagntica
un dispositivo de dispersin que selecciona una longitud
de onda particular (o ms correctamente, una banda de
ondas) de la radiacin de la fuente
un rea de muestra
uno o ms detectores para medir la intensidad de la
radiacin
32
Instrumentacin
Otros componentes pticos, como lentes o espejos,

transmiten la luz a travs del instrumento.
Irradiacin espectral
Fuentes

Figura 16a
Espectro intensidad de la lmpara
de arco de deuterio
La fuente ideal de luz sera aquella que generara una

intensidad constante a todas las longitudes de onda, con
bajo ruido y gran estabilidad. Sin embargo, estas fuentes no
existen. Dos son las fuentes utilizadas, comnmente, en los
espectrofotmetros UV-visible.
La primera fuente, la lmpara de arco de deuterio, produce
un buen continuo de intensidad en la regin UV y ofrece
una intensidad til en la regin visible (Figura 16). Aunque
las modernas lmparas de arco de deuterio tienen bajo
ruido, ste, a menudo, es un factor limitante en el ruido
general del instrumento. Con el tiempo, la intensidad de luz
de una lmpara de arco de deuterio disminuye de modo
homogneo. Estas lmparas tienen una vida media (el
tiempo requerido para que la intensidad caiga a la mitad de
su valor inicial) de, aproximadamente, 1000 horas.
La segunda fuente, la lmpara halgena de wolframio

(Figura 17), ofrece buena intensidad en parte del espectro
UV y sobre el rango visible completo. Este tipo de lmpara
tiene muy bajo ruido y poca deriva y tiene, tpicamente, una
vida til de 10000 h.

Figura 17
Espectro intensidad de la lmpara
halgena de wolframio
La mayora de los espectrofotmetros utilizados para medir

el rango UV-visible contienen ambos tipos de lmparas. En
estos instrumentos, se utiliza un selector de fuente para
cambiar de lmpara segn corresponda, o se mezcla la luz
procedente de las dos fuentes para dar lugar a una sola
banda ancha.
33
Instrumentacin
Una fuente alternativa de luz es la lmpara de xenon

(Figura 18), que produce un buen continuo en las regiones
completas UV y visible. Sin embargo, debido a que el ruido
de las lmparas actuales de xenon es significativamente
peor que el de las lmparas de deuterio o wolframio, las
lmparas de xenon se utilizan slo para aplicaciones como
medidas de reflectancia difusa, en las que el factor principal
en una intensidad elevada.
Figura 18
Espectro intensidad de la
lmpara de xenon
Dispositivos de dispersin
(a)
(b)
Estos dispositivos causan que diferentes longitudes de onda

de luz sean dispersadas con ngulos distintos. Cuando se
combinan con una rendija adecuada de salida, pueden
utilizarse para seleccionar una longitud de onda (o, ms
exactamente, una estrecha banda de onda) de luz de una
fuente continua. Comnmente, se utilizan dos dispositivos
de dispersin, prismas y redes hologrficas de difraccin,
en los espectrofotmetros UV-visible.
Prisma
Cuando la luz solar incide sobre un prisma, se genera un

arcoiris. Este principio se utiliza en los espectrofotmetros.
Los prismas son simples y baratos, pero la dispersin
resultante es angularmente no lineal (Figura 19a). Adems,
el ngulo de dispersin depende de la temperatura.
Red de difraccin
1er orden
2 orden
Figura 19
Dispositivos de dispersin
Por esto, la mayora de los espectrofotmetros modernos

contienen redes hologrficas en lugar de prismas. Estos
dispositivos son de cristal, en los que se realizan hendiduras
muy estrechas. Tradicionalmente esto se realizaba mecnicamente, pero actualmente se utiliza un proceso ptico
hologrfico. Las dimensiones de las hendiduras son del
mismo orden que las longitudes de onda de la luz que se va
34
Instrumentacin
dispersar. Finalmente, se aplica un recubrimiento de

aluminio para crear una superficie reflectante. La luz que
incide sobre la red se refleja con diferentes ngulos,
dependiendo de . Las redes hologrficas producen una
dispersin angular lineal con la longitud de onda y son
insensibles a la temperatura. Sin embargo, reflejan luz de
diferentes rdenes, que se solapan (Figura 19b). Como
resultado, deben utilizarse filtros para asegurar que slo la
luz del orden deseado alcanza el detector. Una red cncava
dispersa y enfoca la luz, simultneamente.
Un monocromador consta de una rendija de entrada, un
dispositivo de dispersin y una rendija de salida. Idealmente, lo que sale es luz monocromtica. En la prctica, sin
embargo, es una banda, ptimamente, simtrica. La anchura
de la banda a la mitad de su altura, es la anchura de banda
instrumental (IBW).
Detectores
Ctodo
Anodo
Figura 20
Detector tubo fotomultiplicador
Un detector convierte una seal de luz en una seal

elctrica. Idealmente, debe ofrecer una respuesta lineal en
un amplio rango, con bajo ruido y alta sensibilidad.
Normalmente, los espectrofotmetros contienen un tubo
fotomultiplicador o un tubo fotodiodo, como detector.
El tubo fotomultiplicador (Figura 20) combina la conversin de la seal con varias etapas de amplificacin, dentro
del cuerpo del tubo. El material del ctodo determina la
sensibilidad espectral. Un solo fotomultiplicador da lugar a
una buena sensibilidad en el rango UV-visible completo.
Este tipo de detector ofrece alta sensibilidad a bajos niveles
de luz. Sin embargo, en aplicaciones analticas espectroscpicas, una alta sensibilidad est asociada con bajas
concentraciones, lo que resulta en bajas absorbancias, lo
que al final da lugar a altos niveles de intensidad. Para
detectar con exactitud pequeas diferencias entre las
medidas de blanco y de muestra, el detector debe tener bajo
ruido a altos niveles de intensidad.
35
Instrumentacin
Cada vez ms, los fotodiodos se utilizan como detectores en

espectrofotmetros (Figura 21). Tienen un rango dinmico
ms ancho y son ms robustos que los fotomultiplicadores.
En un fotodiodo, la luz que incide sobre el material
semiconductor permite que los electrones fluyan a su
travs, reduciendo la carga en un condensador conectado a
l. La carga necesaria para recargar el condensador, a
intervalos regulares, es proporcional a la intensidad de la
luz. Los primeros fotodiodos tenan baja sensibilidad en el
rango UV, pero este problema se ha corregido en los
detectores modernos. Los lmites de deteccin son, aproximadamente, 1701100 nm para detectores de silicio.
Contacto metlico
capa p
capa n
Fotn
Regin
intrnseca
Bloque de oro
Figura 21
El detector de fotodiodos
Algunos espectrofotmetros modernos contienen una

matriz de fotodiodos. Esta consiste en una serie de fotodiodos colocados a los lados de un cristal de silicio. Cada
diodo tiene un condensador dedicado y est conectado, por
un interruptor, a una lnea comn de salida. Los interruptores se controlan por un registro de cambio (Figura 22).
Inicialmente, los condensadores estn cargados. Cuando
los fotones penetran el silicio, se generan portadores de
36
Instrumentacin
carga elctrica libres que descargan los condensadores.

Estos se recargan a intervalos regulares, que representan el
periodo de medida para cada ciclo de barrido.
Luz
Fotodiodo
Condensador
Registro
de cambio
Interruptor
transistor
Lnea de vdeo
Ciclo de lectura
Figura 22
Diagrama esquemtico de una matriz de fotodiodos
La cantidad de carga necesaria para recargar los condensadores es proporcional al nmero de fotones detectados por
cada diodo, lo que al final es proporcional a la intensidad de
luz. El espectro de intensidad se obtiene midiendo la
variacin de intensidad de luz sobre el rango completo de
longitud de onda. La matriz, tpicamente, comprende entre
200 y 1000 elementos, dependiendo del instrumento y de la
aplicacin. Por ejemplo, la matriz de diodos del espectrofotmetro Agilent 8453 consta de 1024 elementos y el rea
fotosensible mide, aproximadamente 25 0.5 mm. El ciclo
de lectura, que corresponde al tiempo de iluminacin, es
100 ms.
La tecnologa de matriz de fotodiodos es similar a la del
microprocesador. Las matrices son dispositivos complejos
pero, debido a su estado slido, tienen mayor fiabilidad.
37
Instrumentacin
Optica
Para transmitir y enfocar la luz por el instrumento, se

utilizan lentes o espejos cncavos. Las lentes son baratas
pero sufren de aberracin cromtica, es decir, luz de
diferentes longitudes de onda no se enfoca en exactamente
el mismo punto del espacio. Sin embargo, con un diseo
cuidadoso, la aberracin cromtica de las lentes
individuales de un sistema ptico, puede utilizarse para
cancelarse mutuamente, y puede construirse un sistema
ptico eficaz con estos componentes simples y baratos.
Las lentes acromticas combinan mltiples lentes de
diferentes cristales con distintos ndices de refraccin, en
una lente bastante libre de aberracin cromtica. Estas
lentes se utilizan en las cmaras. Ofrecen un buen
rendimiento, pero a un coste relativamente alto.
Los espejos cncavos son menos costosos de fabricar que
las lentes acromticas, completamente libres de aberracin.
Sin embargo, la superficie de aluminio se corroe fcilmente,
resultando en una prdida de eficacia.
En cada superficie ptica, incluyendo las interfases entre
los componentes de una lente acromtica, el 510 % de la
luz se pierde por absorbancia o reflexin. Por lo tanto,
idealmente, los espectrofotmetros deberan estar
diseados con un mnimo nmero de superficies pticas.
El espectrofotmetro La Figura 23 muestra un esquema de un espectrofotmetro

convencional convencional de haz simple. La luz policromtica de la
fuente se enfoca sobre la rendija de entrada de un
monocromador, que transmite selectivamente una estrecha
banda de luz. Esta luz, entonces, atraviesa el rea de
muestra hasta el detector. La absorbancia de la muestra se
determina midiendo la intensidad de luz que alcanza el
detector cuando no hay muestra (el blanco) y
comparndola con la intensidad de la luz que alcanza el
detector despus de atravesar la muestra. Como se indica
anteriormente, la mayora de los espectrofotmetros
contienen dos lmparas, de deuterio y de wolframio y
38
Instrumentacin
utilizan tubos fotomultiplicadores o, ms recientemente,

fotodiodos, como detectores.
Muestra
Monocromador
Detector
Rendija de salida
Fuente
Rendija de
entrada
Dispositivo de
dispersin
Figura 23
Esquema de un espectrofotmetro convencional
Este diseo es el adecuado para medir la absorbancia en un

solo punto del espectro. Es menos apropiado, sin embargo,
para medir diferentes compuestos a diferentes longitudes
de onda o para obtener espectros de muestras. Para realizar
estas tareas con un espectrofotmetro convencional, deben
rotarse las partes del monocromador, lo que introduce el
problema de irreproducibilidad mecnica en las medidas.
Adems, la adquisicin de datos en serie es un proceso
inherentemente lento.
El espectrofotmetro La Figura 24 muestra un diagrama esquemtico de un

de diodos espectrofotmetro de diodos. La luz policromtica de una
fuente atraviesa el rea de muestra y es enfocada en la
rendija de entrada del policromador. Este dispersa la luz
sobre una matriz de diodos, en la que cada diodo mide una
banda estrecha del espectro. La anchura de banda de la luz
detectada por un diodo est relacionada con el tamao de la
39
Instrumentacin
rendija de entrada del policromador y con el tamao del

diodo. Cada diodo, en efecto, realiza la misma funcin que
la rendija de salida de un monocromador.
Matriz
de diodos
Policromador
Muestra
Fuente
Dispositivo de
dispersin
Rendija de
entrada
Figura 24
Esquema de un espectrofotmetro de diodos
El policromador (rendija de entrada ms dispositivo de

dispersin) y la matriz de diodos estn contenidos en una
unidad conocida como espectrgrafo. Como las posiciones
relativas de la muestra y el elemento dispersivo estn
invertidas respecto a un instrumento convencional, esta
configuracin, a menudo, se denomina ptica inversa.
Para minimizar posibles reacciones fotoqumicas, se utiliza
un obturador para bloquear la luz de la fuente hasta que
pueda realizarse una medida. Cuando la medida se inicia, el
obturador se abre automticamente y la luz pasa a travs de
la muestra hasta la matriz de diodos. Se mide la diferencia
entre las intensidades de luz que alcanzan el detector con y
sin muestra, segn se describe en El espectrofotmetro
convencional en la pgina 38. Un espectrofotmetro de
diodos es, inherentemente, muy rpido debido a su
capacidad de adquisicin paralela de datos y de barrido
40
Instrumentacin
electrnico, tiene excelente reproducibilidad de longitud de

onda y es de elevada fiabilidad.
Configuracin Comercialmente, existen varias configuraciones de

espectrofotmetros. Cada una de ellas tiene ventajas y
desventajas.
Diseo de haz simple
Tanto los espectrofotmetros convencionales como los de

diodos son de haz simple. Los instrumentos de haz simple
son de bajo coste y el sencillo sistema ptico ofrece alto
rendimiento y, por consiguiente, alta sensibilidad. Los
espectrofotmetros de referencia utilizados por
instituciones como el National Institute of Standards and
Technology (NIST) de los Estados Unidos y el National
Physical Laboratory (NPL) en el Reino Unido, son de haz
simple.
Los espectrofotmetros de matriz de diodos son
particularmente adecuados para la configuracin de haz
simple, ya que se adquieren espectros muy rpidamente y
porque el intervalo de tiempo entra las medidas de blanco y
muestra es mnimo. Adems, pueden utilizarse referencias
internas para reducir an ms los efectos de deriva de la
lmpara (consulte Referencia interna en la pgina 74).
La Figura 25 muestra el sistema ptico de un moderno
espectrofotmetro de diodos, el Agilent 8453. Esta
configuracin de haz simple tiene un nmero mnimo de
componentes pticos, obtenindose la eficacia ms
elevada, y contiene una matriz de 1024 diodos que permite
medir en el rango de 190 a 1100 nm con buena resolucin.
41
Instrumentacin
Obturador
Lente
Muestra
Lmpara
de
wolframio
Lmpara
de deuterio
Lente
Rendija
Red
Matriz de
1024 diodos
Figura 25
Diagrama ptico del espectrofotmetro de diodos Agilent 8453
Diseo de doble haz
En un espectrofotmetro convencional de haz simple, el

blanco y la muestra se miden consecutivamente, con un
intervalo de varios segundos para una medida a una
longitud de onda y hasta de varios minutos en una medida
de un espectro completo. Las variaciones de la lmpara
pueden dar lugar a errores significativos en intervalos
largos de tiempo.
El espectrofotmetro de doble haz fue desarrollado para
compensar los cambios de intensidad de la lmpara entre
las medidas de blanco y muestra. En esta configuracin, se
coloca un chpper en el paso ptico, cercano a la fuente. El
chpper hace que al detector llegue intermitentemente la
luz de referencia y la luz que atraviesa la muestra. Gira a
una velocidad tal que las medidas alternas de blanco y
muestra ocurren varias veces por segundo, corrigiendo, por
lo tanto, los cambios a medio y largo plazo de la intensidad
de la lmpara (deriva).
La Figura 26 muestra un esquema de un espectrofotmetro
de doble haz. Comparado con los diseos de haz simple, los
42
Instrumentacin
instrumentos de doble haz contienen ms componentes

pticos, lo que reduce el rendimiento y la sensibilidad. Para
obtener alta sensibilidad, pueden requerirse largos tiempos
de medida. Adems, el diseo mecnico ms complejo del
espectrofotmetro de doble haz, puede resultar en una
menor fiabilidad.
Monocromador
Rendija
de salida
Referencia
Dispositivo
de dispersin
Fuente
Rendija de
entrada
Chpper
Detector
Muestra
Figura 26
Sistema ptico de un espectrofotmetro de doble haz
Tradicionalmente, la mayor estabilidad de los instrumentos

de doble haz, ha sido fundamental en el diseo de los espectrofotmetros de alto rendimiento. Sin embargo, recientes
avances en el diseo de lmparas y de la electrnica han
mejorado la estabilidad de los espectrofotmetros de haz
simple y han llevado a un resurgimiento de esta configuracin. Los instrumentos de haz simple ofrecen mayor sensibilidad y ms facilidad de uso, con derivas slo un factor de
dos, peores que las de los instrumentos de doble haz.
El primer espectrofotmetro de diodos comercial, el
HP 8450A, era un diseo multihaz (Figura 27). El director de
haz se usaba para alternar el paso de luz por la posicin de
referencia y hasta por cuatro posiciones de muestra (en la
figura slo se muestra una de ellas).
43
Instrumentacin
Lmpara visible
Espejos de
esquina de
la cubeta
Celda de
referencia
Lmpara UV
Elipse de
la fuente
Espejo de
la fuente
UV
Elipse del
espectrgrafo
Espejo superior
director del haz
Celda de
muestra
Visible
Red
hologrfica
Rendija del
espectrgrafo y
matrices del detector
Espejo inferior
director del haz
Espejos
esquina
de cubeta
Figura 27
Sistema ptico del espectrofotmetro de diodos HP 8450A
Diseo con divisin de haz
El espectrofotmetro con divisin de haz (Figura 28) simula

el espectrofotmetro de doble haz pero utiliza un divisor en
lugar de un chpper para dirigir la luz por los pasos de
blanco y muestra, simultneamente, hasta dos detectores
idnticos pero separados. Esta configuracin permite medir
el blanco y la muestra al mismo tiempo. Aunque el diseo
de divisin de haz es mecnicamente ms simple que el
instrumento real de doble haz y requiere menos elementos
pticos, el uso de dos detectores independientes introduce
otra posible fuente de deriva.
44
Instrumentacin
Monocromador
Rendija de
salida
Dispositivo
de dispersin
Fuente
Referencia
Detector
Muestra
Detector
Rendija
de entrada
Figura 28
Sistema ptico de un espectrofotmetro con divisin de haz
Este diseo proporciona alta estabilidad, aunque no tan

elevada como el instrumento de doble haz ya que dos
detectores pueden variar independientemente y, bajo ruido,
aunque no tan bueno como el del instrumento de haz
simple, ya que la luz se divide de manera que menos del
100 % atraviesa la muestra.
Diseo de doble
longitud de onda
Con un espectrofotmetro de doble longitud de onda,

puede medirse simultneamente a dos en aplicaciones
especiales, como el estudio de dos reacciones concurrentes
en una muestra. El monocromador contiene dos dispositivos de dispersin (transformndolo en un duocromador),
con la salida combinada en un haz simple. Estos instrumentos complejos, normalmente, son significativamente ms
costosos que los convencionales y han sido sustituidos por
espectrofotmetros de diodos, que son instrumentos
multilongitud de onda.
Medida de un espectro El grado de interaccin de la muestra con la radiacin

(transmitancia o absorbancia) se determina midiendo la
intensidad de la radiacin incidente (sin la muestra) y la
45
Instrumentacin
intensidad transmitida (con la muestra). Estas intensidades

se denominan Io y I, respectivamente, en las ecuaciones de
Transmitancia y absorbancia en la pgina 6.
Como la mayora de las muestras medidas en espectroscopa UV-visible estn en disolucin, debe medirse el blanco
en una cubeta que contenga el disolvente puro utilizado
para preparar la muestra. Este proceso elimina de la medida
de la muestra, cualquier absorbancia debida al disolvente.
Con un instrumento de haz simple, la cubeta con el disolvente se coloca en el espectrofotmetro y se mide el blanco.
Entonces, se mide la disolucin de muestra en la misma
cubeta. Todos los instrumentos modernos almacenan
automticamente los valores de referencia Io, que se usan
para calcular los valores de absorbancia de la muestra.
Con un instrumento de doble o haz dividido, se necesitan
dos cubetas. Ambas se llenan incialmente con disolvente
puro y se realiza la denominada medida de balance. Esta
medida refleja la diferencia de absorbancia entre los dos
pasos pticos utilizados. Entonces, se llena una cubeta con
disolucin de muestra y se miden Io e I, de modo
prcticamente simultneo. El espectro resultante se corrige
restando el espectro de balance.
Parmetros
instrumentales
clave
En esta seccin se discuten algunos parmetros instrumentales que pueden afectar a la exactitud y la precisin de los
valores de absorbancia (vea en el Apndice A la definicin
de los trminos exactitud y precisin). En el captulo 3
Tratamiento y medida de muestra se describen fuentes de
error relacionadas con el tratamiento de muestra.
Resolucin espectral La resolucin espectral es una medida de la capacidad de

un instrumento para diferenciar entre dos longitudes de
onda adyacentes. Dos se consideran resueltas, normalmente, si el mnimo entre los dos picos de la seal de salida
del detector es menor que el 80 % del mximo. Esto se
46
Instrumentacin
conoce como el criterio Rayleigh. La Figura 29 muestra

esquemticamente un caso para dos lneas de emisin
adyacentes (la entrada al instrumento) y la seal actual que
es la salida del detector.
Seal de
salida del detector
Intensidad
Longitud de onda
Longitud de onda
Figura 29
Definicin de resolucin
La resolucin est muy relacionada con la anchura de

banda espectral instrumental (SBW). La SBW se define
como la anchura, a la mitad de su intensidad mxima, de la
banda de luz que sale del monocromador (ver la Figura 30).
Absorbancia
I
0.5 I
Longitud de
onda
Figura 30
Anchura de banda espectral
instrumental
SBW
47
Instrumentacin
La exactitud de cualquier absorbancia medida depende de

la relacin de la SBW a la anchura de banda natural (NBW)
de la sustancia absorbente. La NBW es la anchura de la
banda de absorcin de la muestra a la mitad de su mximo
de absorcin (Figura 31).
Absorbancia
NBW
Longitud de
onda
Figura 31
Anchura de banda espectral natural
Absorbancia
Una relacin SBW/NBW de 0.1 o menos, dar lugar a una

medida de absorbancia con una exactitud del 99.5 % o
mejor.8,9 A una relacin SBW/NBW mayor de 0.1, el
espectro medido se distorsiona progresivamente, como se
muestra en la Figura 32. Las bandas no pueden resolverse
correctamente y ocurrirn errores significativos en los
valores de absorbancia, a la mayora de las longitudes de
onda. SBW es principalmente una funcin de las anchuras
de las rendijas de entrada y salida del monocromador y de
la dispersin generada por la red de difraccin. No son
inusuales resoluciones de 0.5, 0.2 y 0.1 nm, pero mayores
resoluciones pueden causar un considerable deterioro de la
relacin S/N.10
Longitud de onda
Figura 32
Efecto de variar la SBW sobre la
forma de la banda medida
48
Absorbancia
Instrumentacin
Espectro
original
Absorbancia
Proceso de
muestreo
Espectro
digitalizado
Longitud de onda
Figura 33
Efecto del muestreo digital
En los espectrofotmetros modernos, el intervalo de

muestreo utilizado para digitalizar el espectro para su
evaluacin y almacenamiento, tambin afecta a la
resolucin (en un espectrofotmetro de diodos, la
digitalizacin ocurre en la propia matriz). La Figura 33
muestra este efecto. Si el intervalo de muestreo es grande
relativamente a la SBW, la resolucin del instrumento se
degradar. Un intervalo de muestreo ms pequeo mejora
la resolucin pero resulta en ficheros espectrales mucho
ms grandes, que pueden ser difciles de manejar. En la
prctica, es mejor fijar el intervalo de muestreo a un valor
igual o ms pequeo que la SBW.
Cuando se consideran requisitos instrumentales, es
importante determinar cul es la resolucin necesaria.
Como se trat en el captulo 1 Principios y aplicaciones de
espectroscopa UV-visible, las bandas de absorcin en la
regin UV-visible son ms bien anchas, particularmente
para muestras en disolucin. Para aproximadamente el 99 %
de las medidas de rutina, una SBW de 2 nm es ms que
adecuada para obtener medidas exactas de absorbancia, de
bandas con una NBW de 20 nm o mayor.
Si un instrumento con una SBW de 2 nm se utiliza para
medir muestras con una NBW ms estrecha de 20 nm (por
ejemplo, benceno), resultar en un error en las medidas de
absorbancia absoluta. Este error aumenta al disminuir la
NBW (ver Figura 32). Para medidas absolutas de
absorbancia, es necesario un instrumento con una SBW
ms estrecha. Sin embargo, la mayora de las medidas
UV-visible se utilizan para cuantificacin, lo que
normalmente requiere slo medidas relativas (por ejemplo,
la absorbancia de una concentracin desconocida relativa a
la absorbancia de un patrn). Una calibracin realizada
utilizando patrones, que encierran la concentracin de la
muestra desconocida, dar lugar a resultados cuantitativos
exactos incluso para bandas muy estrechas.
49
Instrumentacin
Exactitud y precisin de La diferencia entre exactitud y precisin de longitud de

longitud de onda onda, normalmente, no se entiende demasiado bien (vea en
el Apndice A una explicacin de la diferencia entre ellas).
La exactitud de longitud de onda es importante para
comparar medidas realizadas en diferentes instrumentos.
Sin embargo, en la mayora de los anlisis UV-visible las
medidas se realizan en el mismo instrumento relativamente
a un patrn y, la precisn de longitud de onda (es decir, la
repetitividad) es ms importante.
La Figura 34 muestra el efecto de una pobre repetitividad de
longitud de onda. Si se selecciona una en el mximo de
absorcin para medidas cuantitativas, los pequeos errores
que ocurran al reprogramar el espectrofotmetro a esa
longitud de onda, tendrn un mnimo efecto sobre la
absorbancia medida. Este mtodo da lugar a los resultados
cuantitativos ms reproducibles. Por otro lado, elegir una
longitud de onda en un lateral de la banda de absorcin, con
el mismo error al reprogramar , resultar en errores
significativos en la absorbancia medida. En este caso, no
sern fiables los resultados cuantitativos.
Absorbancia [UA]
Error = 0.0 UA
Error = 0.1 UA (10 %)

Figura 34
Efecto de una pobre repetitividad de la longitud de onda
50
Instrumentacin
Todos los textos estndar sobre espectroscopa UV-visible

sealan que, para una cuantificacin exacta, la longitud de
onda analtica debe estar en el mximo de absorcin,
incluso aunque otras longitudes de onda puedan dar lugar a
una mejor selectividad. Sin embargo, estos textos estn
basados en tcnicas de barrido mecnico convencional y no
se aplican a los instrumentos de diodos, que tienen una
repetitividad de longitud de onda prcticamente absoluta.
Exactitud y precisin Suponiendo un buen diseo ptico y electrnico, slo dos

fotomtrica factores influyen en la exactitud y precisin fotomtrica: la
luz dispersa y el ruido.
Luz dispersa
La luz dispersa se define como aquella luz detectada de

cualquier longitud de onda, que cae fuera de la anchura de
banda de la longitud de onda seleccionada. La ecuacin
utilizada para calcular la transmitancia y, por lo tanto, la
absorbancia, es:
T = ( I + Is ) ( Io + Is )
donde T es la transmitancia, Io es la intensidad de la luz
incidente, I es la intensidad de la luz transmitida e Is es la
intensidad de la luz dispersa.
La intensidad de la luz dispersa, normalmente, no depende
de la luz transmitida. Si Is es prcticamente constante, se
convierte en el trmino dominante a bajos niveles de I. A
elevada absorcin, la luz dispersa causa un hbito negativo
en la respuesta del instrumento y, eventualmente, es el
factor limitante para la absorbancia y, por lo tanto, para la
concentracin que pueda ser medida. Por lo tanto, se ve
comprometida la exactitud fotomtrica del instrumento. La
Figura 35 muestra el efecto de varios niveles de luz dispersa
sobre la absorbancia medida, comparada con la
absorbancia actual.
51
Absorbancia medida [UA]
Instrumentacin
0.00 % Luz dispersa

0.01 % Luz dispersa
0.10 % Luz dispersa
1.00 % Luz dispersa
Absorbancia real [UA]

Figura 35
Efecto de la luz dispersa sobre la absorbancia medida de la muestra
Ruido
Un espectrofotmetro, tpicamente, tiene dos factores de

ruido. El primero (ruido fotnico o Schott) resulta de la
distribucin estadstica de los fotones emitidos por una
fuente de luz. Es proporcional a la raiz cuadrada de la
intensidad de luz. Cuando se miden muestras de baja
concentracin con bajas absorbancias, este factor puede
evitar una medida exacta de la pequea diferencia entre dos
niveles de luz. El segundo factor es inherente a la
electrnica del instrumento (amplificador del detector,
convertidor analgico-digital, etc.) y es independiente de la
intensidad medida. Este factor se convierte en significativo
a altos niveles de absorbancia, donde la seal de muestra es
muy pequea. Puede minimizarse mediante un buen diseo.
El ruido afecta negativamente a la precisin de las medidas
y, para una medida sola, puede introducir tambin errores
en la exactitud. Sin embargo, el ruido puede reducirse
aumentando el tiempo de medida (vea Promedio de
tiempo en la pgina 67).
52
Instrumentacin
Rango dinmico lineal Una especificacin citada con frecuencia y, a menudo, mal
entendida, es el rango del instrumento. En la mayora de los
casos, ste es simplemente el rango numrico que un
instrumento puede mostrar. Una especificacin ms til es
el rango dinmico lineal que especifica para una desviacin
aceptable de la linealidad (en porcentaje de absorbancia),
los valores mnimo y mximo de absorbancia.
Pueden calcularse los errores potenciales a diferentes
absorbancias, a partir de la luz dispersa y el ruido.
Por tanto, el error debido a la luz dispersa (%) es igual a
( A t Am )100 At
donde At es la absorbancia real y Am es la absorbancia
medida.
At = log ( I I o )
Am = log [ ( I + I s ) ( I o + I s ) ]
donde Io es la intensidad de luz incidente, I es la intensidad
de luz transmitida y Is es la intensidad de luz dispersa. La
Figura 35 muestra el error debido slo a la luz dispersa.
Adems, la absorbancia medida puede ser errnea debido al
ruido del instrumento.
Por consiguiente, el error debido al ruido (%) es igual a
( A t A m ) ( A t 100 )
donde
A t = log ( l l o )
A m = A t + T 100 A pn + A en
Am =
T 100 A pn A en
53
Instrumentacin
donde Apn es el ruido fotnico en UA, Aen es el ruido

electrnico en UA y T es la transmitancia como porcentaje.
% Error
El error total a cualquier absorbancia es la suma de los

errores debidos a la luz dispersa y el ruido. La Figura 36
representa el error total para un ejemplo con ruido fotnico
de 0.0004 UA y ruido electrnico de 0.0001 UA. El
grfico muestra que las medidas de absorbancia hechas
desde, aproximadamente, 0.3 a 1.0 UA tienen la exactitud y
precisin ms elevadas. El rango dinmico instrumental
puede determinarse a partir del error de medida aceptable.
Curva de error de luz dispersa

Curva de error de luz dispersa + ruido
Curva de error de luz dispersa - ruido
Absorbancia [UA]
Figura 36
Error de absorbancia terica frente a absorbancia
54
Instrumentacin
Deriva Otra causa potencial de error fotomtrico es la deriva. Esta

normalmente resulta de variaciones de la intensidad de la
lmpara entre las medidas de Io y la de I. Los cambios en la
electrnica del instrumento tambin pueden causar deriva.
Un buen diseo instrumental puede minimizar la deriva,
pero este efecto puede reducir la exactitud de los
resultados, especialmente en un periodo prolongado de
tiempo (Figura 37). Con datos a mltiple longitud de onda,
el problema de la deriva puede minimizarse utilizando
tcnicas como la de referencia interna (vea Referencia
interna en la pgina 74).
Absorbancia [UA]
Error

Figura 37
Efecto de la deriva sobre los valores de absorbancia medida
55
Instrumentacin
56
captulo 3
captulo 3
Tratamiento y
medida de
muestra
57
Tratamiento y medida de muestra
Conocidas las limitaciones instrumentales y si el

espectrofotmetro opera correctamente, las mayores
fuentes de error en espectroscopa UV-visible estn
relacionadas con el tratamiento y la qumica de la
muestra. En este captulo se discuten las potenciales
fuentes de error y los pasos para evitarlas.
Muestras lquidas
Cubetas La espectroscopa UV-visible se utiliza principalmente, para
medir lquidos o disoluciones. Esto es ms simple y permite
un anlisis cuantitativo ms exacto que realizar medidas de
reflectancia en slidos. En esta tcnica, una cubeta debe
contener el lquido o disolucin en el rea de muestra.
Material
Idealmente, las cubetas deberan ser completamente

transparentes a todas las longitudes de onda, ya que la
absorbancia de la propia cubeta reduce el rango dinmico
lineal efectivo para la muestra. Por ejemplo, si el lmite
superior del rango dinmico lineal es 2.5 UA pero la cubeta
absorbe 1 UA, el rango restante utilizable para la muestra
estar entre 1 y 2.5 UA, que es slo 1.5 UA.
Las cubetas ms baratas son de plstico, normalmente
acrlico. Estas cubetas no son resistentes a todos los
disolventes y absorben fuertemente por debajo de 300 nm,
hacindolas inadecuadas para medir en esta regin. La
58
consistencia (absorbancia y paso ptico) puede variar entre

cubetas, dependiendo del fabricante.
Las cubetas de vidrio son ligeramente ms caras que las de
plstico pero son ms duraderas y, con el cuidado apropiado, pueden durar aos. El vidrio absorbe por debajo de
320 nm y por tanto, no es adecuado para medir en este rea.
Las cubetas de cuarzo fundido son razonablemente transparentes por debajo de 210 nm. Las mejores cubetas son de
slice fundida sinttica de alta pureza, siendo
razonablemente transparentes por debajo de 190 nm.
La Figura 38 muestra la absorcin de los diferentes
materiales. Observe que todos exhiben al menos el 10 % de
prdida por transmisin a todas las longitudes de onda.
Transmitancia [%]
Slice
fundida
Cuarzo
fundido
Plstico
acrlico
Vidrio
Vidrio
ptico
Figura 38
Caractersticas de transmisin ptica de los materiales de cubetas
Tipos de cubeta
Existe una amplia gama de cubetas pero aqu slo se

describen las ms importantes. La cubeta ms utilizada es la
rectangular abierta (Figura 39a). Estas cubetas pueden
tener pasos pticos de 1 a 100 mm, pero el ms popular es
10 mm. Casi todas las cubetas rectangulares tienen una
59
anchura exterior de 12.5 mm. Cuando el volumen de

muestra es limitado, a menudo se utilizan cubetas con
apertura (Figura 39b).
Si el volumen de muestra es muy limitado, pueden utilizarse
microcubetas que reducen la apertura del rea de muestra a
una seccin muy pequea (2 2.5 mm), Figura 40a. Slo se
requieren aproximadamente 60 l de muestra para medir.
Con ultramicrocubetas especiales, pueden medirse volmenes por debajo de 5 l. Para aplicaciones automatizadas, se
utilizan cubetas de flujo (Figura 40b). Las cubetas modernas se conectan a un tubo de transferencia de muestra.
Puede disponerse de cubetas de flujo de varios tamaos de
apertura y geometras, con amplio rango de paso ptico.
Figura 39
Cubetas estndar (a) y con
apertura (b)
En las cubetas con apertura y microcubetas, se bloquea

parte del haz de luz, se reduce el rendimiento y se compromete de algn modo, la sensibilidad. La prdida de
sensibilidad depende del grado de apertura y de la
geometra ptica.
Fuentes de error
Si las cubetas estn apropiadamente diseadas y utilizadas,
su contribucin a los errores de absorbancia debe ser
mnima. Sin embargo, el analista debe estar al tanto de
varias fuentes potenciales de error.
Como la absorbancia medida depende del paso ptico, la
precisin de ste es importante en las medidas absolutas.
La tolerancia de paso ptico para cubetas de alta calidad es
0.01 mm para pasos entre 0.5 y 100 nm.11 Para una
exactitud cuantitativa mxima, debe utilizarse la misma
cubeta para las medidas de patrn y muestra.
Figura 40
Cubetas micro (a) y de flujo (b)
Cuando se coloca en el haz, una cubeta se transforma en un

componente ptico activo. Superficies pticas no planas o
no paralelas pueden desviar el haz y causar errores de
absorbancia (vea Geometra de la muestra en la pgina
60
65). Las mejores cubetas tienen superficies pticas muy

planas y paralelas que minimizan su influencia como
componente ptico. La cubeta siempre debe colocarse en la
misma direccin en el soporte para asegurar que los efectos
pticos son idnticos en las medidas de blanco y muestra.
En cubetas con apertura, las partes que no contienen la
muestra deben estar apropiadamente cubiertas (como en
las figuras) para evitar transmisiones y reflexiones no
deseadas a travs de las paredes. Si se utilizan cubetas sin
cubrir, las medidas sern errneas. El grado de error
depende de la geometra ptica del rea de muestra. Si el
haz ptico se enfoca de manera que gran proporcin de luz
atraviesa una apertura muy pequea de la cubeta, los
resultados con cubetas sin cubrir sern razonablemente
exactos, ya que la ptica har el efecto de auto-cubierta. En
cambio, si el haz ptico es ancho y colimado (paralelo),
pasar mucha luz a travs de las paredes de la cubeta en
lugar de atravesar la muestra y las medidas sern inexactas.
Cuidado de las cubetas
Las cubetas deben manejarse cuidadosamente para evitar

araarlas. Debe evitarse tocar las superficies pticas con
los dedos, ya que la grasa de las huellas dactilares puede
absorber significativamente. Si las superficies pticas de la
cubeta estn ligeramente sucias, pueden limpiarse con un
pauelo de papel fotogrfico. Si la cubeta est muy
contaminada, puede limpiarse con un detergente sulfnico
suave o con un lquido especial de limpieza. En casos
extremos, puede utilizarse un tratamiento con cido
clorhdrico o ntrico.
Eleccin de disolvente El disolvente ideal para la preparacin de muestras sera

aquel que disolviera todos los tipos de compuestos, sera no
inflamable y no txico, adems de completamente
transparente a todas las longitudes de onda. El agua
destilada se acerca al ideal pero no es adecuado para
muchos compuestos orgnicos no polares. La Tabla 1 lista
algunos de los disolventes ms utilizados. Con la excepcin
del agua, todos ellos exhiben una longitud de onda de corte
61
en el rango UV, por debajo del cual absorben demasiado

para realizar medidas de muestra.
Tabla 4
Propiedades de algunos disolventes comunes

Longitud de onda
Disolvente
Polaridad*
de corte (nm)**
Riesgos***
Agua destilada
78.5
< 195
ninguno
Hexano
1.9
199
Etanol (absoluto)
24.3
207
Metanol
32.6
210
Ciclohexano
2.0
211
Cloroformo
4.8
246
F/T
Dimetilsulfxido
ninguna
270
Acetona
20.7
331
Constante dielctrica a temperatura ambiente

Longitud de onda a la que la transmitancia a paso ptico de 10 mm es < 25 %
***
F = inflamable; T = txico; H = riesgo para la salud
**
Con disolventes orgnicos voltiles, como acetona o

cloruro de metileno, es aconsejable utilizar una cubeta
cerrada para eliminar la evaporacin, que podra dar lugar a
cambios rpidos de concentracin.
Efecto del disolvente, Varios factores, que incluyen el disolvente utilizado, junto
concentracin, pH y con la concentracin, pH y temperatura de la muestra,
temperatura pueden afectar a la posicin e intensidad de las bandas de
absorcin de las molculas. Estos parmetros deben
controlarse para asegurar mxima precisin y para poder
comparar espectros medidos bajo diferentes condiciones.
La polaridad de un disolvente puede modificar el entorno
electrnico de un cromforo absorbente. En general, la
magnitud de la variacin puede correlacionarse con la
62
polaridad del disolvente. Por tanto, por ejemplo, el mximo

de absorcin de la acetona puede variar de 259 a 279 nm,
dependiendo del disolvente. Para anlisis comparativo,
debe utilizarse un solo disolvente para todas las medidas.
La concentracin, normalmente, slo afecta a la intensidad
de las bandas. A concentraciones ms altas, sin embargo,
las interacciones moleculares (por ejemplo, dimerizacin)
pueden causar cambios en la forma y posicin de la banda
de absorbancia. En ltimo trmino, estos cambios afectan a
la linealidad de la concentracin frente a la relacin de
absorbancia y puede llevar a resultados cuantitativos
inexactos.
Los efectos del pH sobre los espectros de absorbancia
pueden ser muy grandes y resultar, principalmente, de las
variaciones del equilibrio entre dos formas diferentes. Por
ejemplo, los indicadores de pH cambian de color a
diferentes valores. Si el espectro de la muestra se afecta por
el pH, debe utilizarse un regulador para controlar este
parmetro. Observe, sin embargo, que la mayora de los
reguladores exhiben una absorbancia significativa, lo que
puede afectar al rango de longitud de onda sobre el que
pueden realizarse las medidas.
La temperatura tambin puede afectar a las medidas
UV-visible. Una simple expansin, especialmente en
algunos disolventes orgnicos, puede ser suficiente para
cambiar la absorbancia aparente y, por lo tanto, la exactitud
de los resultados cuantitativos. Adems, la temperatura
puede afectar a los equilibrios, qumicos o fsicos. Un buen
ejemplo de equilibrio fsico es la desnaturalizacin de los
cidos nuclicos al aumentar la temperatura, lo que cambia
la absortividad. Finalmente, sobre todo en disolventes
orgnicos, pueden ser significativos los cambios del ndice
de refraccin con la temperatura. Si las corrientes de
conveccin causan que haya diferencias de temperatura en
distintas partes de la cubeta, el efecto Schlieren resultante
puede cambiar la absorbancia aparente. Si se observa que la
temperatura tiene efecto considerable sobre las medidas,
63
debe controlarse este parmetro utilizando un soporte

termostatizado. Este puede ser un simple soporte envuelto
por agua, utilizado junto a un bao de agua circulante, o un
controlador Peltier de temperatura, ms sofisticado. Con
disolventes orgnicos, es aconsejable utilizar una cubeta
cerrada para minimizar el efecto Schlieren.
Muestras slidas
Varios factores pueden interferir con la medida exacta y

precisa de muestras slidas transparentes, como vidrios o
cristales.
Sin referencia A menudo se miden muestras slidas para determinar el

espectro o cuantificar un componente de la matriz. Sin
embargo, una muestra de la matriz que no contenga el
analito, no siempre puede conseguirse. En este caso, puede
realizarse la medida del blanco con aire, ya que no es
posible obtener un blanco real (matriz sin analito). Este
proceso, en el mejor de los casos, resultar en un
desplazamiento constante a todas las longitudes de onda y,
en el peor, en un espectro medido que ser una mezcla del
analito y la matriz. Es posible el anlisis cuantitativo exacto
si se dispone de dos o ms patrones y si se utiliza una curva
de calibracin que no est forzada a pasar por cero. La
interseccin con el eje Y representa, entonces, la
absorbancia debida a la matriz. Si no se dispone de
mltiples patrones, la referencia interna utilizando una
longitud de onda de referencia a la que no haya absorbancia
del analito, es a menudo, una alternativa viable.
64
Indice de refraccin
Haz colimado
Muestra
Detector
Haz enfocado
Luz no
detectada
La carencia de una muestra de referencia tambin causa un

cambio significativo del ndice de refraccin entre el blanco
(aire) y la muestra slida. Si el haz ptico se colima
perpendicularmente a la muestra, este efecto no es
importante. Sin embargo, si el haz se enfoca, la muestra
slida se convierte en un componente activo ptico y altera
la longitud del paso. Este cambio del paso ptico puede, en
ltimo caso, causar una modificacin significativa del grado
de iluminacin del detector entre el blanco y la muestra
(Figura 41), resultando en un error de la absorbancia
aparente. Este problema es muy difcil de detectar y, si el
instrumento es de diseo de enfoque de haz, no tiene fcil
solucin. Sin embargo, este efecto puede minimizarse
colocando la muestra tan cerca del detector como sea
posible.
Figura 41
Efecto del ndice de refraccin
Geometra de la A menudo las muestras slidas pueden ser de vidrio, filtros

muestra de plstico moldeados o lentes (por ejemplo, lentes de
cristales solares). Estas muestras son componentes pticos
activos del sistema y desvan o cambian la longitud focal del
haz de luz. Como resultado, el detector falla al detectar
parte de la luz (Figura 42), que se mide, entonces, como
absorbancia aparente. Este efecto puede probarse rotando
o invirtiendo la muestra en su soporte y puede minimizarse
colocando la muestra tan cerca del detector como sea
posible.
65
Area fotosensible
Detector
Muestra plana
Detector
Muestra con bordes
Figura 42
Efecto de una geometra no plana de la muestra
Absorbancia dbil
Un problema en qumica analtica es la baja sensibilidad,

que puede ser debida a una baja concentracin de la
muestra o a una absortividad muy dbil del analito. A bajas
absorbancias, el ruido en las medidas resulta en una
prdida de precisin de manera que cualquier medida
simple puede ser inexacta. Reducir directamente el nivel de
ruido mejora la precisin de los resultados. La
especificacin de ruido debe ser un parmetro clave en la
seleccin del espectrofotmetro, pero observe que variar
los parmetros de medida reducir el nivel de ruido.
Cambiar la anchura Si el espectrofotmetro tiene una anchura variable de

de rendija rendija, el nivel de ruido puede reducirse aumentando esta
anchura para que ms luz atraviese los componentes
pticos. Este aumento de la rendija da lugar a una mejor
relacin S/N pero reduce la resolucin del instrumento.
66
Promedio de tiempo
Absorbancia [UA]
S/N = 5.5
Absorbancia [UA]
0.1 seg
S/N = 18
Tomar la media de los datos reduce el ruido por la raiz

cuadrada del nmero de puntos promediados. La Figura 43
muestra la mejora de la relacin S/N con el aumento del
tiempo de integracin, para un colorante a muy baja
concentracin. Las medidas se realizaron utilizando un
espectrofotmetro de diodos con tiempos de integracin de
0.1 y 1.6 s. La mejora actual es cercana al valor terico
esperado de cuatro. Observe que ampliar el tiempo de
integracin mejorar la sensibilidad slo hasta que otros
efectos, como la deriva, sean dominantes.
1.6 seg

Figura 43
Efecto del t de integracin en S/N
Promedio de longitud Otra tcnica es promediar la longitud de onda. La Figura 44

de onda muestra una banda ancha de absorcin. Las medidas
cuantitativas convencionales se realizan en el mximo de
absorcin. Si se dispone de los datos a todas las longitudes
de onda, pueden incluirse en la media valores adicionales a
ambos lados del mximo. La reduccin del ruido es
equivalente a la raiz cuadrada del nmero de puntos. Sin
embargo, cuantos ms datos se aaden, la absorbancia
media se reduce, lo que tiene un efecto negativo sobre la
seal. Para una particular anchura de banda de absorcin,
un nmero determinado de puntos dar lugar a la S/N
ptima (Figura 44).
67
S/N
Seal
Ruido
Absorbancia
Absorbancia
Longitud de onda
NBW
# de puntos
Rango
ptimo
Figura 44
Efecto del promedio de longitud de onda sobre S/N
La deriva tambin afecta a la exactitud de las medidas de

absorbancia. Puede utilizarse una referencia interna
(Referencia interna en la pgina 74) para mejorar la
precisin y la exactitud a bajos niveles de absorbancia.
Absorbancia fuerte
Cuando las muestras absorben fuertemente, puede

excederse el rango dinmico lineal del instrumento, siendo
la relacin entre absorbancia y concentracin, no lineal
(Rango dinmico lineal en la pgina 53). La solucin ms
fcil a este problema es diluir la muestra a un nivel de
absorbancia dentro del rango dinmico lineal. Con
muestras slidas esto no es posible. Adems, cualquier
etapa de tratamiento de muestra, incluso la dilucin,
introduce errores y debe, por lo tanto, ser evitada. Una
alternativa es seleccionar una o ms longitudes de onda en
el lateral de la banda de absorbancia, donde la absortividad
es menor (Figura 45). Cuando se utiliza para calibracin la
longitud de onda del mximo (241 nm), puede medirse una
concentracin mxima de aproximadamente 0.26 mg/ml,
con una exactitud razonable. Sin embargo, utilizar la
68
Absorbancia [UA]
0.1428 mg/ml
espironoloactona
Absorbancia medida [UA]
absorbancia en el lateral de la banda (266 nm) permite

medir concentraciones de hasta 5 mg/ml con igual
exactitud. Un prerrequisito para esta tcnica es una
excelente reproducibilidad de longitud de onda (Exactitud
y precisin de longitud de onda en la pgina 50).
Concentracin [mg/ml]
Figura 45
Cambio de longitud de onda para aumentar el rango dinmico
Interferencia
Tipos de interferencia Idealmente, la absorbancia que ocurre durante las medidas
UV-visible tiene que deberse slo al analito de inters. Sin
embargo, en la prctica, a menudo aparecen absorbancias
que interfieren con las medidas, por razones qumicas o
fsicas.
69
Otros compuestos
absorbentes
La presencia de cualquier compuesto que absorba en la

misma regin que el de inters, resultar en un error en la
medida de absorbancia. A veces, slo est presente un
nico compuesto absorbente conocido, por ejemplo un
subproducto de la sntesis de un compuesto farmacutico.
En otros casos, mltiples especies absorbentes, muchas de
ellas conocidas (por ejemplo, muestras biolgicas como
sangre), pueden causar una ancha absorcin matriz.
Dispersin
Un problema de los anlisis farmacuticos y biolgicos es la

dispersin, scattering, causada por las partculas
suspendidas en disolucin. En anlisis farmacuticos, estas
partculas suelen ser los excipientes o rellenos utilizados en
las formulaciones de las tabletas o cpsulas. La dispersin
de radiacin resulta en una absorbancia aparente de fondo
que interfiere con las medidas de absorbancia. Filtrar las
muestras antes de las medidas elimina la dispersin pero no
siempre es practicable y, a menudo, el analista trabaja con
espectros que incluyen este problema.
Detector
Muestra transparente
Detector
Muestra con dispersin
La dispersin causa una absorbancia aparente debida a que

la luz, en lugar de pasar a travs de la disolucin hasta el
detector, se dispersa con cierto ngulo. Por lo tanto, incluso
si no hay absorcin, menos luz alcanza el detector, como se
muestra en la Figura 46.
En la parte UV-visible del espectro, pueden observarse dos
tipos de dispersin. La dispersin Rayleigh ocurre cuando
las partculas son pequeas relativamente a la longitud de
onda de la luz y es inversamente proporcional a la cuarta
potencia de . La dispersin Tyndall ocurre cuando las
partculas son grandes relativamente a la longitud de onda
de la luz y es inversamente proporcional al cuadrado de .
En sistemas qumicos, el exponente de la longitud de onda
puede variar de - 4 a - 2, dependiendo de la distribucin de
tamaos de las partculas:
Figura 46
Dispersin (Scattering)
A scatter 1
70
Absorbancia [UA]
donde A es la absorbancia debida a la dispersin, es la

longitud de onda y n es el orden de dispersin, scattering.
Esta relacin causa que el error debido a la dispersin
aumente al disminuir la longitud de onda, Figura 47.
dispersin Tyndall
dispersin Rayleigh

Figura 47
Espectros de dispersin
La magnitud del efecto de dispersin puede reducirse

colocando la muestra lo ms cerca posible del detector. Sin
embargo, con una dispersin significativa, se pierde luz y la
sensibilidad y la exactitud del anlisis cuantitativo se ven
seriamente comprometidas.
Tcnicas de correccin Pueden utilizarse varias tcnicas para eliminar o reducir los
errores de interferencia. En general, si el origen del error es
conocido y reproducible entre muestras, puede eliminarse.
Por el contrario, si el origen es desconocido y vara de
muestra a muestra, el error puede reducirse pero no
eliminarse. Las tcnicas de correccin siempre requieren
datos de al menos dos longitudes de onda. Las tcnicas ms
sofisticadas requieren datos multilongitud de onda o
espectrales.
71
Cuando est presente un componente interferente de

espectro conocido, puede eliminarse el error introducido
por este compuesto a la longitud de onda analtica,
seleccionando una longitud de onda de referencia a la que la
interferencia exhiba la misma absorbancia que a la longitud
de onda analtica. La absorbancia a esta longitud de onda de
referencia se resta de la abosrbancia a la longitud de onda
analtica, Figura 48. La absorbancia residual es la
absorbancia real del analito.
Absorbancia [UA]
Isoabsorbancia
Espectro del analito

Espectro interferente
Espectro medido

Figura 48
Correccin de isoabsorbancia
Esta tcnica es menos fiable cuando los espectros del

analito y de la interferencia son muy similares. Adems,
permite corregir slo una interferencia.
Anlisis multicomponente
Una extensin de la isoabsorbancia es el anlisis

multicomponente, descrito en Anlisis multicomponente
en la pgina 21. Aqu, deben medirse como patrones los
espectros de las interferencias. Esta tcnica puede
aplicarse con xito cuando los espectros se solapan de
manera considerable y cuando hay presente ms de un
compuesto interferente.
72
Modelar el fondo es apropiado cuando la interferencia se

debe a un proceso fsico (frecuentemente, dispersin) en la
que la interferencia a la longitud de onda analtica puede
estimarse por extrapolacin a partir del modelo en otro
rango de . Se selecciona una parte del espectro donde la
absorbancia aparente se debe slo a la interferencia.
Entonces, se ajusta un polinomio a esta parte del espectro
utilizando un ajuste por mnimos cuadrados al logaritmo de
la absorbancia:
A = a
log ( A ) = log ( a ) + n log ( )

donde A es absorbancia, es longitud de onda, n es el orden
de la relacin entre absorbancia y longitud de onda y a es
una constante. La absorbancia de fondo al resto de las
longitudes de onda puede estimarse utilizando los
coeficientes determinados por el ajuste. Estos valores se
restan de los valores medidos, para obtener las
absorbancias debidas al analito, Figura 49.
Espectro
medido
Absorbancia [UA]
Modelar el fondo
Espectro extrapolado
de dispersin

Figura 49
Modelo de fondo
73
Referencia interna
Una de las tcnicas ms simples de correccin es la

referencia interna, que utiliza una sola longitud de onda de
referencia. Este mtodo se suele utilizar cuando aparece
deriva de la lnea de base entre medidas En general, es
mejor elegir una longitud de onda de referencia lo ms
cerca posible de la longitud de onda analtica, pero sin
absorbancia significativa del analito. La absorbancia a la
longitud de onda de referencia se resta de la de la longitud
de onda analtica. Se corrige cualquier interferencia
constante a todas las longitudes de onda, Figura 50. Aunque
en la prctica las interferencias no suelen ser constantes a
todas las longitudes de onda, esta simple tcnica a menudo
da lugar a sorprendentes mejoras en la exactitud.
Absorbancia [UA]
Espectro a
Espectro b

Figura 50
Referencia interna
Correccin de tres puntos
La correccin de tres puntos, o Morton-Stubbs, utiliza dos

longitudes de onda de referencia, normalmente aquellas a
los lados de la longitud de onda analtica. Se estima
entonces la absorbancia interferente de fondo a la longitud
de onda analtica, usando interpolacin lineal (Figura 51).
Este mtodo representa una mejora sobre la tcnica de
referencia a una , porque corrije cualquier absorbancia de
74
fondo que exhiba una relacin lineal con la longitud de

onda. En muchos casos, si el rango de longitud de onda es
estrecho, ser una correccin razonable para absorbancias
de fondo no lineales, como la resultante de la dispersin o
de una matriz comleja.
Absorbancia [UA]
Espectro
medido

Figura 51
Correccin de tres puntos (Morton-Stubbs)
Espectroscopa derivada
Debido a dos de sus propiedades, la espectroscopa

derivada puede utilizarse para reducir o eliminar la
interferencia de fondo de varios orgenes. Primero,
cualquier interferencia con una relacin directamente
proporcional a diferentes rdenes de , de forma general
1
A = a0 + a1 + + an
se elimina por el uso de derivadas de orden cada vez mayor.

As, un desplazamiento constante de la lnea de base (a0) se
elimina por la primera derivada, una absorbancia de fondo
que aumenta linealmente con , se elimina por la segunda
derivada, etc. Desafortunadamente, slo el desplazamiento
constante de la lnea de base es comn en espectroscopa
UV-visible.
75
Segundo, y quizs ms importante que la primera

propiedad, las derivadas discriminan bandas anchas de
absorbancia relativamente a bandas estrechas de
absorbancia. Esta discriminacin resulta del hecho de que
la amplitud (Dn) de una banda gaussiana en la ensima
derivada, es inversamente proporcional a la anchura de
banda original (W) elevada al grado n:
1
n
D -------n .
W
Por lo tanto, para dos bandas coincidentes de igual
intensidad pero diferente anchura en el orden cero, la
amplitud de la derivada n de la banda ms aguda (X) es
mayor que la de la banda ms ancha (Y), en un factor que
depende de la anchura de banda relativa y del orden de la
derivada:
n
WY
DX
--------- = --------n
n
DY
DX
La Figura 52 muestra el efecto de tomar las derivadas de
dos bandas con NBW de 160 y 40 nm, respectivamente. En
modo absorbancia, estas bandas tienen igual amplitud. En
la primera derivada, la banda ms estrecha tiene 4 veces
mayor amplitud y, en la segunda derivada tiene 16 veces
mayor amplitud. Esta propiedad mejora la exactitud de la
cuantificacion de cualquier componente de banda ancha.
Este ltimo puede ser un componente intereferente, como
se muestra en la Figura 52.
76
Absorbancia
Primera derivada
Segunda derivada

Figura 52
Discriminacin de bandas anchas en espectroscopa derivada
El espectro resultante de dispersin es tambin de banda

ancha y el uso de derivadas puede reducir tambin su
contribucin. Por ejemplo, la Figura 53 muestra una banda
de absorbancia con una NBW de 40 nm y la misma banda en
la presencia de fondo de dispersin. Sin ninguna
correccin, la amplitud a 500 nm es 1.0920 A en lugar de
1.0 A, debido a la contribucin de la dispersin. La
cuantificacin a esta longitud de onda resulta en un error
del + 9.2 %. Tomar la primera derivada reduce la
contribucin del componente de dispersin, de manera que
utilizando del mximo al mnimo del pico, la seal en la
presencia de dispersin es 0.02992 A en lugar de 0.03024 (un
error de cuantificacin de slo - 1.1 %).
77
Absorbancia
Espectro medido
Espectro actual
Primera derivada

Figura 53
Correccin de la dispersin por espectroscopa derivada
Normalmente, sin embargo, el problema analtico no puede

definirse de modo tan simple como dispersin, variacin de
lnea de base o componentes de absorcin ancha no
deseados. Lo normal es que una combinacin de dos o ms
de estos efectos resulte en una matriz de fondo de
absorcin ancha. La espectroscopa derivada es una
herramienta excelente para reducir o eliminar estas fuentes
de error difciles de caracterizar.
78
Problemas
fotoqumicos
Fluorescencia Algunas muestras fluorescen, es decir, emiten luz de un
rango de longitud de onda cuando se irradian con luz de una
longitud de onda ms corta (de ms energa). Esta luz
emitida resulta en un error en la medida de absorbancia. La
magnitud y posicin del error depende de si el instrumento
tiene una ptica convencional o una ptica inversa.
En un instrumento de ptica convencional, la muestra se
ilumina con luz de longitud de onda, variable con el tiempo.
Al barrer el rango de longitud de onda de excitacin, ocurre
absorcin y se inicia el proceso de fluorescencia que emite
luz a longitudes de onda ms largas. Como el detector no
puede diferenciar entre las longitudes de onda individuales,
la absorbancia medida a la longitud de onda de excitacin
es muy baja (Figura 54). Al barrer el rango de longitud de
onda de emisin, no aparece fluorescencia y las medidas de
absorcin son, por lo tanto, exactas.
Absorbancia [UA]
Longitud de onda de
excitacin
Espectro medido con

ptica convencional
Espectro medido con
ptica inversa
Longitud de onda
de emisin

Figura 54
Efecto de la fluorescencia sobre el espectro medido de absorbancia
79
En un instrumento de ptica inversa, la muestra se ilumina

con todas las longitudes de onda simultneamente,
incluyendo luz de la longitud de onda de excitacin. Por
tanto, la muestra fluoresce y emite luz pero, como la
seleccin de longitud de onda ocurre despus de que la luz
haya pasado a travs de la muestra, la luz emitida es dirigida
a la longitud de onda correcta. La absorbancia medida a la
longitud de onda de emisin es, por lo tanto, muy baja
(Figura 54), pero la absorbancia medida a la longitud de
onda de excitacin es correcta.
Optica convencional
Detector
Optica inversa
Rendija detector
Figura 55
Angulos de aceptacin y magnitud
del error de fluorescencia
Descomposicin de
la muestra
Un factor adicional que afecta a la magnitud del error es el

denominado ngulo de aceptacin del detector, Figura 55.
La luz fluorescente se emite en todas direcciones. Si el
ngulo de aceptacin es ancho, una parte significativa de la
luz fluorescente alcanzar al detector. Por el contrario, si el
ngulo de aceptacin del detector es estrecho, slo una
pequea cantidad de luz fluorescente alcanzar el detector
y el error de absorbancia ser tambin pequeo. Los
instrumentos de ptica inversa tienen un ngulo estrecho
de aceptacin del detector y por lo tanto son menos
susceptibles al error de fluorescencia.
Colocando un filtro en el haz de luz, puede eliminarse el
error debido a la fluorescencia. En un instrumento
convencional, el filtro se sita entre la muestra y el detector
para filtrar las longitudes de onda de emisin, mientras que
en un instrumento de ptica inversa, el filtro de coloca
entre la fuente y la muestra para eliminar las longitudes de
onda de excitacin.
Algunas muestras son sensibles a la reaccin fotoqumica,

especialmente cuando se exponen a luz UV de baja longitud
de onda. En casos extremos, puede ser necesario un filtro
para eliminar esta luz.
80
captulo 4
captulo 4
Desarrollo y
validacin del
mtodo
81
Desarrollo y validacin del mtodo
Conocer los errores que pueden deberse al instrumento, al tratamiento de muestra y a la propia muestra,
permite desarrollar mtodos analticos que minimicen
sus efectos sobre los resultados. En este captulo se
revisan los criterios para definir un buen mtodo y las
estrategias para localizar los parmetros ptimos.
Desarrollo del
mtodo
Debido a que la mayora de las aplicaciones UV-visible son

la cuantificacin de un solo componente, este captulo est
dirigido a la optimizacin de tales mtodos. El desarrollo
del mtodo implica la seleccin de una o varias longitudes
de onda que den lugar a los mejores resultados para un
determinado anlisis o instrumento. En ste, deben
definirse parmetros como exactitud, precisin,
sensibilidad, linealidad, rango, selectividad y robustez.
Como estos parmetros no pueden ser optimizados al
mismo tiempo, debe determinarse antes del anlisis
aquellos que se desea optimizar, as como los requisitos.
Hasta hace poco, la instrumentacin limitaba la eleccin de
longitud de onda (debido principalmente a problemas de
reproducibilidad de ) y/o no se dispona de las
herramientas adecuadas para comparar las opciones. Estas
limitaciones ya no existen en los instrumentos modernos.
NOTA: El desarrollo del mtodo implica el uso de varias
herramientas estadsticas. Los detalles de estas
herramientas y sus ventajas, estn fuera del objetivo de este
libro, pero existen varias publicaciones excelentes.1215
82
Linealidad Linealidad es la capacidad del mtodo para producir

resultados proporcionales, directamente o mediante una
transformacin matemtica, a la concentracin del
analito en las muestras, dentro de un determinado
rango.16
En las medidas UV-visible, la relacin lineal ms usual es la
ley de Beer, que indica que la absorbancia de un soluto es
directamente proporcional a su concentracin (vea Ley de
Beer en la pgina 16). Una curva de calibracin lineal que
relacione la absorbancia con la concentracin, debe tener la
forma:
A = kc
donde A es la absorbancia, c es la concentracin y k es el
factor de calibracin (la pendiente de la curva de
calibracin). Por lo tanto, al comprobar la linealidad se
prueba cmo las medidas actuales se ajustan al modelo
terico (ley de Beer).
Tericamente slo se requiere la medida de absorbancia de
un patrn de concentracin conocida, como calibrado para
la cuantificacin. El valor medido de absorbancia dividido
por la concentracin, es la pendiente. Varios parmetros
instrumentales y de la muestra (vea el captulo 2
Instrumentacin y el captulo 3 Tratamiento y medida de
muestra) pueden causar desviaciones de la ley de Beer y
pueden resultar errores cuantitativos significativos si la
curva de calibracin no est caracterizada con exactitud
(Figura 56). Sin embargo, como estas desviaciones
dependen de la longitud de onda, la seleccin del valor
apropiado de sta puede minimizar su influencia sobre los
resultados.
83
Absorbancia [UA]
Absorbancia medida
del patrn
ad
urv
ci
br a
ali
c
e
r
t e
ica
Concentracin conocida
del patrn
Concentracin
Posibles curvas
de calibracin reales
Absorbancia medida
de la muestra
d
rva
Cu
ec
t
in
rac
b
i
l
a
ic
er
Posibles resultados
de cuantificacin
Concentracin
Absorbancia [UA]
Figura 56
Errores potenciales resultantes de una calibracin inadecuada
Absorbancia [UA]
Concentracin
Concentracin
Figura 57
Grupos de datos de calibracin
Para construir una curva de calibracin, deben medirse los

espectros de un grupo de, al menos, tres disoluciones
patrn del analito. Las concentraciones de los patrones
deben encerrar el rango de concentracin esperado de las
muestras de anlisis. Idealmente, todos los valores patrn
medidos deben estar sobre una lnea recta, pero en la
prctica, los valores siempre presentan cierta dispersin
(Figura 57). Debe aplicarse un mtodo estadstico para
encontrar el mejor ajuste de los datos a la curva de
calibracin y, en una segunda etapa, para determinar qu
tipo de curva de calibracin da lugar al mejor ajuste. El
mtodo estadstico ms frecuente es la regresin lineal, que
tambin se conoce como el mtodo de mnimos cuadrados.
Para comparar dos curvas de calibracin, se requiere medir
la bondad del ajuste de los patrones. Varios valores estadsticos, como el coeficiente de correlacin, el error estndar
de regresin y la incertidumbre, pueden usarse para esta
medida. De estos, el coeficiente de correlacin es el ms
popular. Este valor siempre est entre + 1 y - 1. Un valor + 1
indica una relacin lineal perfecta entre absorbancia y
concentracin, siendo A creciente. Un valor - 1 tambin
84
indica una relacin lineal perfecta, con A decreciente (lo

que puede ocurrir si se usan derivadas). El valor 0 indica
que no hay correlacin entre absorbancia y concentracin.
Para determinar el mejor valor o combinacin de longitudes
de onda, se miden los espectros de un grupo de patrones
puros con un amplio rango de concentraciones. Se aplica
una curva de calibracin lineal a cada longitud de onda y se
calculan las estadsticas elegidas para valorar la linealidad.
Para una evaluacin ms rpida, es til una representacin
grfica de las estadsticas frente a la longitud de onda.
Coeficiente correlacin
Absorbancia [UA]
La Figura 58 muestra los espectros de cuatro patrones de

colorantes amarillos y el correspondiente coeficiente de
correlacin para una curva de calibracin lineal simple. La
mejor calibracin en trminos de la linealidad se realiza en
el punto en el que el coeficiente de correlacin se aproxima
a la unidad. En este ejemplo, la longitud de onda del
mximo (414 nm) no es idntica a aquella (402 nm) que d
lugar a la mejor linealidad. Tpicamente, pueden esperarse
valores del coeficiente de correlacin mejores de 0.999.
Rango
ptimo

Figura 58
Seleccin de las longitudes de onda para la mejor linealidad
85
Si una longitud de onda individual no proporciona el grado

requerido de linealidad, puede utilizarse una combinacin
de . Por ejemplo, el uso de una longitud de onda de
referencia interna para eliminar los errores de variacin de
lnea de base en las medidas, mejorar los resultados.
Si no puede obtenerse el grado de linealidad deseado con
una curva de calibracin lineal simple, puede aplicarse un
tipo diferente de curva para minimizar la influencia de la no
idealidad de los resultados. Tpicamente se utilizan
ecuaciones de la forma:
A = a + kc
A = kc + kc
A = a + kc + kc
De nuevo, debe utilizarse el coeficiente de correlacin u

otra herramienta estadstica para valorar la calidad relativa
de las curvas de calibracin. Observe que cuando se utilizan
tipos de curva de calibracin con mayor grado de libertad,
se requieren ms patrones para caracterizar adecuadamente la curva.
Para anlisis multicomponente, tambin se supone que se
cumple la ley de Beer. Sin embargo, en este caso, el modelo
de clculo incluye la ley de aditividad para explicar la
absorbancia total a cada longitud de onda. No puede usarse
el test simple de linealidad descrito anteriormente. En su
lugar, puede utilizarse la desviacin estndar del residual
para probar el ajuste de los patrones al espectro medido.
Este valor es la suma de los cuadrados de las diferencias a
cada longitud de onda, entre el espectro medido y el
calculado. Puede suponerse que si el residual es cero, es
decir si los patrones pueden ajustarse perfectamente al
espectro medido, la ley de Beer y la ley de aditividad se
86
cumplen en el sistema en estudio. Si la desviacin estndar

del residual no es cero, el modelo terico no refleja el
sistema en estudio ya que una de las leyes no se obedece o
porque est presente un componente para el que no hay
patrn de calibracin. En la prctica, sin embargo, el
residual nunca es cero y debe determinarse empricamente
el valor aceptable para un anlisis, utilizando resultados
analticos que cumplan los requisitos de exactitud y
precisin.
Exactitud La exactitud de un mtodo es el grado de acuerdo entre el

resultado de un test individual generado por el mtodo y el
valor verdadero.16 (Vea en el Apndice A una explicacin
de la diferencia entre exactitud y precisin).
Para determinar qu valor o valores de longitud de onda dan
lugar a la mejor exactitud, se miden los espectros de un
grupo de patrones y se construyen curvas de calibracin a
todas las longitudes de onda, como se describi
anteriormente. Se requiere, entonces, una muestra de
concentracin conocida. Esta muestra es, idealmente, una
en la que se haya determinado la concentracin del analito
utilizando una tcnica diferente. Sin embargo, si no se
dispone de esta muestra, puede prepararse una sinttica
que contenga un peso conocido. Se mide el espectro de la
muestra, se realiza la cuantificacin y se compara con el
valor conocido. Una representacin grfica de los
resultados cuantitativos frente a la longitud de onda,
permite una rpida evaluacin.
La Figura 59 muestra los resultados de un colorante
amarillo. Aunque tendra que haberse fijado la longitud de
onda analtica a 414 nm utilizando mtodos tradicionales,
aquellos valores que dan lugar a la mejor exactitud estn en
la regin de los 400 nm.
87
Concentracin
Absorbancia [UA]
Concentracin medida
Concentracin real
Rango
ptimo

Figura 59
Seleccin de las longitudes de onda para la mejor exactitud
Como el ruido puede influir en la exactitud de una medida,

es preferible realizar una serie de medidas sobre la muestra
y calcular la media. Este mtodo reduce la contribucin del
ruido a errores en la exactitud.
Sin embargo, en anlisis multicomponente con rangos
espectrales, no puede deducirse el rango ptimo de
longitud de onda utilizando una tcnica tan simple. En su
lugar, debe determinarse el mejor rango a travs de un
proceso de tanteo del rango de longitud de onda y
comparando los resultados calculados con los valores
actuales.
Precisin La precisin de un mtodo es el grado de acuerdo entre los

resultados de los tests individuales cuando el
procedimiento se aplica repetidamente a mltiples
muestreos.16 (Vea en el Apndice A una explicacin de la
diferencia entre exactitud y precisin).
Para determinar la precisin se requiere un valor estadstico. La desviacin estndar, el porcentaje de desviacin
88
estndar relativa (obtenido dividiendo la desviacin

estndar por la media y multiplicando por 100) y el intervalo
de confianza, son las funciones ms populares para valorar
la precisin o repetitividad de un grupo de medidas.
Valor [mg/l]
Para determinar la precisin de un mtodo, se preparan un

grupo de unas 1020 muestras con la misma concentracin.
Entonces, se miden estas muestras y se calcula la cantidad
de analito. La desviacin estndar de los resultados es una
medida de la precisin. La Figura 60 muestra un ejemplo de
la dispersin de los resultados y de la desviacin estndar
que pueden esperarse de un buen anlisis.
Media = 31.41 mg/l

Desviacin estndar = 0.022 mg/l
Nmero de medidas
Figura 60
Determinacin de la precisin de un anlisis
Si no se obtiene el nivel deseado de precisin, deben

utilizarse tcnicas de reduccin de ruido como promedio de
longitud de onda, promedio de tiempo y referencia interna,
para mejorar los valores. Pueden aplicarse las mismas
tcnicas en anlisis multicomponente.
Sensibilidad Sensibilidad se refiere a la respuesta obtenida para una

determinada cantidad de analito y, a menudo, se indica
mediante dos factores analticos: el lmite de deteccin
(LOD) y el lmite de cuantificacin (LOQ).16
89
El LOD es la concentracin ms baja del analito que puede

ser detectada pero no necesariamente cuantificada, en
matrices de muestra. En general, el LOD es el punto al que
la seal del analito es igual a tres veces el ruido de la
medida. Los resultados de las medidas de algunos
espectrofotmetros listan las desviaciones estndar
basadas en el ruido de la medida. El LOD es,
aproximadamente, tres veces la desviacin estndar.
El LOQ es la concentracin ms baja del analito que puede
determinarse con una precisin y exactitud aceptables, en
matrices de muestra. Para calcular el LOQ, deben definirse
los lmites aceptables de precisin y exactitud (que
dependen de los objetivos del anlisis). Entonces, pueden
utilizarse las herramientas descritas anteriormente, para
determinar los lmites aceptables.
A menudo se supone que la longitud de onda con la mxima
absorbancia da lugar a la mejor sensibilidad. Sin embargo,
como el ruido instrumental puede variar significativamente
con la longitud de onda, esto no siempre es necesariamente
cierto. Un mtodo mejor de determinar el valor o valores de
longitud de onda de sensibilidad ptima, es medir el
espectro de una muestra de baja concentracin, varias
veces. Se calculan, entonces, la media y el porcentaje de
desviacin estndar relativa de los valores medidos a cada
longitud de onda. El valor de con el porcentaje de
desviacin estndar relativa ms bajo, probablemente dar
lugar a la mejor sensibilidad. La Figura 61 ilustra esta
tcnica para un colorante amarillo. Aunque las longitudes
de onda entre 400 y 450 nm ofrecen una sensibilidad
excelente, la mejor se obtiene a 220 nm.
90
% RSD
Absorbancia [UA]
Rango
ptimo

Figura 61
Seleccin de las longitudes de onda de mejor sensibilidad
En anlisis multicomponente, puede utilizarse esta tcnica

para identificar los valores ptimos de longitud de onda
para cada componente. Estas pueden aplicarse
directamente en el mtodo de ecuaciones simultneas
simples o como una gua del rango ptimo de longitud de
onda, en el mtodo de mnimos cuadrados.
Rango Rango es el intervalo entre (e incluidos) los niveles

superior e inferior del analito, que han sido calculados
con la precisin, exactitud y linealidad requeridos.16
El rango se determina analizando primero, muestras que
contengan distintas concentraciones del analito y, a
continuacin, utilizando las herramientas descritas
anteriormente para calcular la linealidad, precisin y
exactitud de los resultados.
Selectividad Selectividad es la capacidad de un mtodo para

cuantificar con exactitud y especificamente al analito o
analitos, en presencia de otros compuestos.16
91
La presencia de cualquier otro compuesto que absorba a la

longitud de onda utilizada para cuantificar el analito,
resultar en un error cuantitativo. Estos otros compuestos
pueden ser precursores de la sntesis, impurezas conocidas,
excipientes o productos de degradacin de la matriz. Si el
tipo de interferencia es conocido, la persona que desarrolla
el mtodo puede examinar los espectros del analito y de la
interferencia, para seleccionar una longitud de onda a la
que el analito tenga una absorbancia significativa pero a la
que sea pequea la de la interferencia. Si la eleccin de no
evita lo suficiente el efecto de la interferencia, puede
aplicarse una tcnica de correccin apropiada, como el uso
de una longitud de onda de isoabsorbancia (vea
Isoabsorbancia en la pgina 72).
Si la identidad y/o los espectros de las posibles
interferencias son desconocidos, puede utilizarse un
mtodo emprico casi idntico al descrito anteriormente,
para determinar qu longitud o longitudes de onda darn
lugar a la mejor exactitud. En este caso, las muestras de test
deben contener la interferencia. Si se conoce la
concentracin del analito en la muestra, la longitud de onda
que d el resultado ms cercano al valor conocido, ser la
correspondiente a la mejor selectividad (las impurezas
siempre aaden absorbancia, causando resultados
errneamente elevados).
En el ejemplo de la Figura 62, la muestra de colorante
amarillo ha sido contaminada con un colorante rojo. La
representacin de la concentracin frente a la longitud de
onda muestra que las entre 390 y 420 nm dan lugar a la
mejor selectividad. Observe que, debido al contaminante, el
rango del error de exactitud es mucho ms amplio que para
el colorante amarillo puro (Figura 59).
92
Concentracin [mg/l]
Absorbancia [UA]
Concentracin medida
Concentracin real
Rango
ptimo

Figura 62
Seleccin de la longitud de onda para la mejor selectividad
Robustez Robustez es el grado de reproducibilidad de los resultados

de test, obtenidos analizando las mismas muestras bajo
varias condiciones normales de test.16
El mtodo no debe afectarse por cambios de tiempo o lugar.
La reproducibilidad del mtodo debe establecerse en varias
condiciones, por ejemplo con diferentes lotes de reactivos,
a diferentes temperaturas y con diferentes tiempos de
prueba.
La robustez de un mtodo analtico se determina analizando
submuestras de una muestra homognea, en diferentes
laboratorios y con equipos distintos. Estos tests deben
realizarlos diferentes analistas bajo condiciones
operacionales y medioambientales que pueden variar, pero
que estarn dentro de los parmetros especificados para el
mtodo. El grado de reproducibilidad de los resultados se
calcula, entonces, como una funcin de las variables del
ensayo. Este valor puede compararse con la precisin del
mtodo en condiciones normales para obtener una medida
de su robustez.
93
Requisitos En el desarrollo de un mtodo analtico, son valiosos los

instrumentales datos espectrales completos, aunque no esenciales, para la
evaluacin de todas las opciones posibles. La
reproducibilidad de longitud de onda del instrumento
tambin debe ser excelente para no restringir la eleccin de
la longitud o longitudes de onda. Un espectrofotmetro que
mide automticamente espectros mltiples y calcula los
valores medio y de desviacin estndar para cada
absorbancia, puede mejorar la productividad en gran
medida. Finalmente, el software instrumental debe ser
capaz de procesar una gran cantidad de datos y utilizar las
herramientas estadsticas apropiadas. Los clculos
manuales o la transferencia de los datos desde el
espectrofotmetro a otras aplicaciones para su evaluacin,
limitan seriamente la productividad.
Validacin del
mtodo
Cualquier mtodo analtico diseado para ser utilizado en

un entorno que cumpla las normativas, como un laboratorio
de control de calidad farmacutico, debe ser validado. La
validacin del mtodo es el proceso para determinar si las
caractersticas de rendimiento son adecuadas para el
propsito que se pretende.
La Farmacopea de Estados Unidos (USP) contiene guas
para la validacin del mtodo.17 Esta validacin es similar
al desarrollo del mtodo que incluye estudios sobre
especificidad, linealidad, exactitud o recuperacin,
sensibilidad y precisin o reproducibilidad. Sin embargo, la
validacin debe realizarse separadamente del desarrollo y
la validacin del mtodo.16 Mientras que el desarrollo del
mtodo implica la seleccin de parmetros y condiciones
especficos, la validacin se utiliza para confirmar que las
caractersticas de rendimiento del mtodo estn de acuerdo
con la aplicacin pretendida de los estudios del laboratorio.
94
captulo 5
captulo 5
Operacin de
rutina
95
Operacin de rutina
La espectroscopa UV-visible se considera una tcnica

de rutina y ampliamente utilizada en QA/QC y laboratorios similares. Sin embargo, ni las consideraciones
tratadas en los captulos previos ni el mejor
desarrollo de mtodo, garantiza buenos resultados.
Este captulo revisa las etapas para asegurar
resultados exactos y precisos regularmente y, quizs
ms importante, para detectar resultados errneos.
Verificacin del
rendimiento del
instrumento
En los ltimos aos, las normas de calidad indicadas por la

ISO 9000 (BS 5750), las Buenas Prcticas de Laboratorio
(GLP), las Buenas Practicas de Fabricacin (GMP) y el
United Kingdom National Measurement Accreditation
Service (NAMAS) han cobrado una gran importancia. Como
consecuencia, en la industria farmacutica, las recomendaciones contenidas en las farmacopeas tambin han
alcanzado mayor influencia. La verificacin del rendimiento
continuo y apropiado de los espectrofotmetros UV-visible,
es un elemento clave de estos requisitos de calidad.
Parmetros de test Aunque no hay una definicin clara sobre qu parmetros

deben probarse para verificar el rendimiento del
instrumento, los fabricantes y usuarios, generalmente,
estn de acuerdo en que deben incluirse los criterios
descritos a continuacin.
96
Operacin de rutina
La exactitud de longitud de onda es el criterio de rendimiento ms importante para diferenciar espectros, cuando
se miden en instrumentos distintos. Tambin es importante
en el anlisis cuantitativo cuando se utilizan coeficientes de
extincin o factores. Debido a que estos factores dependen
de la longitud de onda, las medidas deben realizarse a
exactamente la misma a la que los factores se determinaron originalmente. Cuando se comparan espectros o
valores de absorbancia medidos en el mismo instrumento
(como en la mayora de los anlisis cuantitativos en los que
se mide un patrn), sin embargo, la precisin de longitud de
onda es el parmetro crtico (vea Exactitud y precisin de
longitud de onda en la pgina 50).
Para medir la exactitud y precisin de longitud de onda, se
requiere un patrn de referencia. Idealmente, este patrn
debera tener picos bien definidos y muy estrechos, a una
serie de longitudes de onda a lo largo de los rangos UV y
visible, como se muestra en la Figura 63. Este patrn ideal
no existe, aunque algunos se aproximan. Para los patrones
actuales de exactitud de longitud de onda, como los picos
no son idealmente simtricos, los cambios en la anchura de
la rendija del instrumento afectarn ligeramente a la
posicin medida de los picos.
Patrn de absorbancia
Absorbancia [UA]
Exactitud y precisin de
longitud de onda
Patrn de
longitud de onda

Figura 63
Espectros ideales de patrones de absorbancia y longitud de onda
97
Operacin de rutina
Exactitud y precisin
fotomtrica
La exactitud fotomtrica es el criterio ms importante para

el anlisis cuantitativo cuando se utilizan coeficientes de
extincin o factores. Sin embargo, para medidas
comparativas (como las anteriores), la precisin
fotomtrica es el parmetro crtico (vea Exactitud y
precisin fotomtrica en la pgina 51).
Es necesario un patrn de referencia para medir la
exactitud y la precisin fotomtrica. Idealmente, este
patrn tendra absorbancia constante a todas las longitudes
de onda a lo largo de los rangos UV y visible (Figura 63), de
manera que un error de exactitud de longitud de onda no
afecta a los resultados. En la prctica, no existe tal patrn,
aunque los cristales de densidad neutra se aproximan al
ideal en el rango de longitud de onda visible. Los patrones
utilizados, tpicamente, tienen picos anchos y valles.
Luz dispersa
La luz dispersa es el factor que ms afecta a la relacin

lineal entre la absorbancia y la concentracin a
absorbancias elevadas. Introduce una predisposicin
sistemtica a menores absorbancias en concentraciones
crecientes. La luz dispersa es tambin la influencia principal
en el lmite superior del rango dinmico lineal para un
anlisis (vea Luz dispersa en la pgina 51).
Para medir la luz dispersa, es necesario un filtro.
Idealmente, este filtro absorbera toda la luz de la longitud
de onda a la que que se va a realizar la medida y transmitira
las longitudes de onda superiores o inferiores (los orgenes
de la luz dispersa, como se muestra en la Figura 64). En la
prctica, sin embargo, este filtro no existe. En su lugar se
utilizan filtros de corte que transmiten toda la luz por
encima o por debajo de una determinada longitud de onda y
que bloquean toda la luz en un rango particular de .
98
Transmitancia [%]
Operacin de rutina

Figura 64
Espectro ideal de un filtro de luz dispersa
Resolucin
La resolucin es un factor crtico en la determinacin de la

forma de los picos. En general, la resolucin instrumental
debe ser aproximadamente 10 veces mejor que la anchura
de banda del pico medido. Si la resolucin instrumental no
es suficiente, la absorbancia medida en el mximo de
longitud de onda ser demasiado baja. Por consiguiente, la
exactitud fotomtrica tiene una predisposicin sistemtica.
Esta predisposicin juega un papel clave si es esencial la
exactitud absoluta pero, como se trata en Resolucin
espectral en la pgina 46, es menos importante para
medidas relativas como las de cuantificacin.
Medir la resolucin es difcil y, a menudo, se utilizan
mtodos empricos como la medida de alturas relativas de
picos y valles, para una muestra con una banda estrecha
(vea Resolucin en la pgina 110).
Ruido
El ruido es el factor principal que afecta a la precisin de las

medidas de absorbancia. Es especialmente significativo a
bajas absorbancias, a las que suele determinarse el lmite de
deteccin (vea Ruido en la pgina 52).
El ruido se mide, normalmente, a absorbancia cero, es
decir, sin muestra en el paso de luz.
99
Operacin de rutina
LLanura de la lnea de base
Medir el ruido a todas las longitudes de onda, normalmente,

no es practicable. Sin embargo, la llanura de la lnea de base
indica el ruido relativo a todas las longitudes de onda y
revela aquellas con problemas instrumentales resultantes
del cambio de filtro o fuente, por ejemplo.
La llanura de lnea de base se mide, normalmente, a
absorbancia cero.
Estabilidad
La estabilidad afecta a la exactitud de las medidas de

absorbancia en funcin del tiempo. La deriva de las
medidas de absorbancia introduce errores sistemticos en
la exactitud fotomtrica (vea Deriva en la pgina 55).
La estabilidad se mide, normalmente, a absorbancia cero.
Linealidad
La linealidad a menudo se considera importante para

verificar el rendimiento. Pero debido a que depende mucho
de la muestra, creemos que se mide mejor durante un test
de idoneidad del sistema, como se describe posteriormente.
El problema principal en la verificacin del rendimiento es
que todos los parmetros listados anteriormente dependen
de la longitud de onda y, en el caso de la luz dispersa, de la
muestra. Como no es prctico realizar todos los tests a
todas las , deben seleccionarse algunas representativas
para el propsito pretendido. Los resultados de estos tests
deben compararse con las especificaciones absolutas de
rendimiento para los mtodos en uso. La verificacin
demostrar, entonces, eficazmente, si las caractersticas de
rendimiento han cambiado de manera que pudiera afectar a
la bondad de los resultados analticos.
Cumplir los criterios anteriores (determinados utilizando
patrones de referencia) no garantiza, sin embargo, que un
deteminado anlisis pueda realizarse con la exactitud y
linealidad requeridas. Debido a que muchos parmetros
dependen de la muestra, la exactitud y linealidad deseadas
slo pueden lograrse con un test apropiado de idoneidad
del sistema, realizado sobre la propia muestra.
100
Operacin de rutina
Patrones Una discusin detallada sobre todos los patrones y sus

ventajas y desventajas relativas, est fuera del objetivo de
este libro. Existen varias publicaciones excelentes que
cubren estos temas en profundidad.18,19 A continuacin
encontrar algunos comentarios generales sobre los
mritos relativos de los tres tipos principales de patrones.
Patrones de emisin
Ciertas fuentes de emisin, como las lmparas de mercurio

y deuterio, exhiben lneas agudas a longitudes de onda
especficas que son ideales para los test de exactitud y
precisin de longitud de onda. De hecho, en muchos
espectrofotmetros modernos, se utilizan las lneas de
deuterio a 486.0 y 656.1 nm de la fuente incorporada, para
comprobar y recalibrar la exactitud de longitud de onda. Sin
embargo, las fuentes de emisin requieren alimentacin
elctrica y, si el instrumento ha sido auto-calibrado
utilizando su lmpara de deuterio, debe utilizarse otro
patrn para verificacin. Adems, debido a que las fuentes
de emisin no son muestras tpicas, no prueban el sistema
completo.
Patrones slidos de
absorcin
Los patrones slidos no requieren ninguna preparacin, son

fciles de usar y mantener, son relativamente insensibles a
la temperatura y tienen una buena estabilidad con el
tiempo. Sin embargo, con patrones slidos no puede
asegurarse la homogeneidad de un patrn a otro o entre
lotes. Por lo tanto, debe calibrarse cada patrn individualmente en un espectrofotmetro de referencia. Debido a
que este proceso implica cierto tiempo, los patrones slidos
tienden a ser caros. Adems, como los patrones slidos no
son absolutamente estables, deben devolverse para ser
recalibrados, con regularidad. Por ltimo, estas muestras
deben mantenerse escrupulosamente limpias y no pueden
utilizarse para probar sistemas de flujo.
101
Operacin de rutina
La Tabla 5 resume algunos de los patrones slidos ms

conocidos, sus usos, sus ventajas y desventajas.
Tabla 5
Algunos patrones slidos
Patrn
Uso
Ventajas
Desventajas
Cristal de xido de
holmio
Patrn de longitud de
onda
Picos a muchas longitudes de onda de

280 a 2000 nm
La posicin de los picos vara de lote a lote
Cristal de xido de
didimio
onda

400 a 1920 nm
La posicin de los picos vara de lote a lote

No hay picos por debajo de 400 nm
Granate de neodimio
ytrio aluminio
onda

350 a 1000 nm
No hay picos por debajo de 350 nm
Cristal de densidad
neutra
Patrn fotomtrico
Perfil de absorbancia muy llano en el

rango visible de longitud de onda
No es adecuado para el rango UV

No es absolutamente estable; debe
recalibrarse regularmente
Metal sobre cuarzo
Patrn fotomtrico
Perfil de absorbancia muy llano en los

rangos UV y visible de longitud de onda
Problemas frecuentes por error de

interreflexin
Sensible a la temperatura
No es muy estable; debe recalibrarse
regularmente
Patrones lquidos de
absorcin
Estos normalmente son patrones fsicos absolutos. En otras

palabras, si se preparan patrones lquidos utilizando materiales puros apropiadamente, poseern de modo inherente
las propiedades de absortividad, mximos de picos, etc.
requeridos para comprobar la exactitud. Debido a que la
calibracin de las disoluciones no es necesaria, los patrones
lquidos pueden ser relativamente baratos. Estos patrones
pueden utilizarse tambin para comprobar sistemas de
flujo. Adems, el proceso de utilizar una disolucin como
patrn, es muy similar al de una muestra normal.
La desventaja principal de los patrones lquidos es que, en
general, deben haberse preparado recientemente. Esto
implica tiempo y requiere una razonable habilidad del
operador. Algunos proveedores han intentado solventar
este problema suministrando patrones sellados en cubetas.
Sin embargo, debido a que la propia cubeta contribuye con
102
Operacin de rutina
algo de absorbancia, estos patrones deben calibrarse y

recalibrarse individualmente, lo que incrementa los costes.
Ms an, como los patrones lquidos son menos estables
que los slidos, deben recalibrarse ms a menudo. Ahora
puede disponerse de disoluciones preparadas selladas en
ampollas, para utilizar en cubetas normales, fciles de
utilizar y de coste adecuado.20
La Tabla 6 resume algunos de los patrones lquidos ms
conocidos, sus usos, sus ventajas y sus desventajas.
Tabla 6
Algunos patrones lquidos
Patrn
Uso
Ventajas
Desventajas
Oxido de holmio en cido

perclrico
onda
Picos a muchas longitudes de onda

de 240 a 650 nm
No hay picos utilizables por encima de

650 nm
Oxido de samario en cido

perclrico
onda
Picos a muchas longitudes de onda

de 300 a 500 nm
No hay picos utilizables por encima de

500 nm
Benceno (vapor)
onda
Picos muy estrechos de 230 a 260 nm Rango muy limitado de longitud de

onda
Dicromato potsico en cido

perclrico o sulfrico
Patrn fotomtrico
Picos anchos a 257 y 350 nm y valles No absorbancia en el rango visible

anchos a 235 y 313 nm
Muy sensible al pH y, como agente
oxidante potente, puede ser inestable
Mezcla de sales de cobalto y

nquel
Patrn fotomtrico
Picos a 302, 395, 512 y 678 nm que

cubren las regiones UV y visible
Bandas ms bien estrechas, la exactitud de puede afectar a los resultados
Disolucin de nitrito sdico (50 g/l) Luz dispersa
Cortes a 390 nm
Usado para medir luz dispersa a
340 nm o inferior
Ninguna
Disolucin de ioduro potsico o

sdico (10 g/l)
Cortes a 260 nm
200 nm o inferior
Tendencia a descomponerse
Luz dispersa
103
Operacin de rutina
Tabla 6
Algunos patrones lquidos
Patrn
Uso
Ventajas
Desventajas
Disolucin de cloruro potsico

(12 g/l)
Luz dispersa
Cortes a 200 nm
220 nm o inferior
Como la medida se realiza en el lateral

de la pendiente de corte, los errores de
exactitud de pueden afectar a la
medida de luz dispersa
Tolueno en hexano
Resolucin
Fcil mtodo emprico usando pico

(269 nm) y valle (266 nm) del
espectro del tolueno
Slo puede usarse para determinar la

resolucin en un punto del espectro.
Puede variar con
Requisitos de las En la seccin siguiente se revisan algunos de los requisitos

normas ms importantes de las normativas que regulan el uso de los
espectrofotmetros UV-visible.
GLP/GMP
Los requisitos de las GLP y GMP para la validacin de

instrumentos, puede resumirse como sigue:
Verificacin documentada de que el sistema o subsistema
funciona como se pretende en rangos operativos
representativos o anticipados.21
Para espectroscopa, se indica la siguente recomendacin:
Donde sea apropiado, deben llevarse a cabo controles
peridicos del rendimiento (por ejemplo, ... la resolucin,
alineamiento y exactitud de longitud de onda de los
espectrofotmetros, etc.).22
Farmacopea europea
Los requisitos que regulan los espectrofotmetros

UV-visible utilizados para anlisis farmacutico en Europa,
estn contenidos en la Farmacopea Europea (EP).23 Estos
requisitos se basan y prcticamente son idnticos a aquellos
listados en las farmacopeas nacionales como la Britnica
(BP) y la Alemana (DAB):
Control de longitudes de ondaVerificar la escala de
utilizando los mximos de absorcin de una disolucin de
perclorato de holmio, la lnea de una lmpara de descarga
104
Operacin de rutina
de hidrgeno o deuterio o las de arco de vapor de mercurio, mostradas a continuacin. La tolerancia permitida es
1 nm para el ultravioleta y 3 nm para el visible.
241.15 nm (Ho)
404.66 nm (Hg)
253.70 nm (Hg)
435.83 nm (Hg)
287.15 nm (Ho)
486.00 nm (D)
302.25 nm (Hg)
486.10 nm (H)
313.16 nm (Hg)
536.30 nm (Ho)
334.15 nm (Hg)
546.07 nm (Hg)
361.50 nm (Ho)
576.96 nm (Hg)
365.48 nm (Hg)
579.07 nm (Hg)
Control de absorbanciaComprobar la absorbancia

utilizando disolucin de dicromato potsico R a las
longitudes de onda indicadas en la siguiente tabla, que
muestra para cada longitud de onda el valor exacto de A
(1 por ciento, 1 cm) y los lmites permitidos.
Longitud de onda
(nm)
A (1 por ciento, 1 cm) Tolerancia mxima
235
124.5
122.9 a 126.2
257
144.0
142.4 a 145.7
313
48.6
47.0 a 50.3
350
106.6
104.9 a 108.2
Lmite de luz dispersaLa luz dispersa puede

detectarse a una longitud de onda dada, con filtros o
disoluciones adecuados: por ejemplo la absorbancia de
una disolucin de cloruro potsico R del 1.2 por ciento
m/V en una cubeta de 1 cm, debe ser mayor de 2 a 200 nm
al compararla con agua como lquido de compensacin.
Poder de resolucinCuando se indique en una
monografa, mida la resolucin del aparato como sigue:
105
Operacin de rutina
registrar el espectro de una disolucin de tolueno R al

0.02 % V/V en hexano R. La relacin mnima de la
absorbancia en el mximo a 269 nm, a aquella en el
mnimo a 266 nm, se indica en la monografa.
NOTA: La BP indica que la relacin debe ... no ser inferior
a 1.5 a no ser que se indique lo contrario en la monografa.
Farmacopea de
Estados Unidos
En los Estados Unidos, los requisitos para los

espectrofotmetros UV-visible no estn tan claramente
definidos como en Europa. La Farmacopea24 de Estados
Unidos (USP) XII, Seccin 831 (Espectrofotometra y
dispersin de luz) dice:
Comprobar la exactitud de la calibracin del instrumento.
... La escala de longitud de onda puede calibrarse tambin
por medio de filtros adecuados de cristal, con bandas de
absorcin tiles en las regiones visible y ultravioleta. Han
sido ampliamente utilizados cristales patrn con didimio
(una mezcla de praseodimio y neodimio). El cristal con
contenido de holmio se considera superior.
Para comprobar una escala fotomtrica, puede disponerse
de varios filtros patrn de cristal inorgnico, as como
disoluciones patrn de transmitancia conocida, como
cromato o dicromato potsico.
Este ltimo contiene una referencia cruzada:
Para ms detalles relativos a los controles de las escalas de
longitud de onda y fotomtricas de un espectrofotmetro,
pueden consultarse las siguientes publicaciones del
National Institute of Standards and Technology ...
El National Institute of Standards and Technology (NIST)
indica varios patrones slidos y lquidos para determinar la
106
Operacin de rutina
exactitud de longitud de onda, exactitud fotomtrica y luz

dispersa.25 La Tabla 7 resume los ms importantes.
Tabla 7
Patrones NIST
SRM #
Tipo
Descripcin NIST
930
Filtros de cristal de densidad

neutra
Este SRM es para la verificacin y calibracin de las escalas de transmitancia y absorbancia de

espectrofotmetros de absorcin visible.
931
Disolucin de cobalto y nquel en Este SRM es para la verificacin y calibracin de las escalas de absorbancia de
espectrofotmetros de absorcin ultravioleta y visible con pasos de banda estrechos.
mezcla de cido ntrico y
perclrico
935
Dicromato potsico slido para

preparar la disolucin de test
Este SRM es para la verificacin y calibracin de las escalas de absorbancia de

espectrofotmetros de absorcin ultravioleta.
2031
Metal sobre cuarzo
Este SRM es para la verificacin y calibracin de las escalas de transmitancia y absorbancia de

espectrofotmetros de absorcin ultravioleta y visible.
2034
Disolucin de xido de holmio en Este SRM es para utilizar en la verificacin y calibracin de la escala de longitud de onda de
cido perclrico
espectrofotmetros de absorcin ultravioleta y visible con anchuras de banda espectral
nominal que no exceden 3 nm.
2032
Ioduro potsico slido para

preparar la disolucin de test
Este SRM se utiliza en la valoracin de la energa radiante dispersa heterocrmica (luz dispersa)
en espectrofotmetros de absorcin ultravioleta.
Mtodos americanos de test

estndar
La American Standard Testing Methods (ASTM)26 publica

mtodos de test para medir las caractersticas clave del
rendimiento, de los espectrofotmetros UV-visible:
Exactitud y precisin de longitud de onda: determinada
utilizando una lmpara de descarga de vapor de mercurio
(regin UV), una lmpara de arco de deuterio o hidrgeno
(regin visible), vapor de benceno (regin UV), o cristal de
xido de holmio o disolucin de perclorato de holmio
(regiones UV y visible). La ASTM recomienda que las
longitudes de onda de calibracin utilizadas, encierren a
la longitud de onda analtica.
Linealidad: determinada preparando una curva de trabajo
analtica con el analito de inters (vea Idoneidad del
sistema en la pgina 115).
107
Operacin de rutina
Exactitud fotomtrica: determinada utilizando patrones

NIST 930, 2031 o 935.
Precisin fotomtrica: determinada utilizando una
pantalla metlica o un filtro adecuado de cristal.
La importancia de la anchura de la rendija y la resolucin se
menciona en la documentacin ASTM, pero no se indica
ningn mtodo prctico para medir estos parmetros. Una
publicacin ASTM adicional27 describe los patrones y
procedimientos para medir la luz dispersa.
La Tabla 8 resume los requisitos y recomendaciones de
varios estamentos reguladores.
Tabla 8
Parmetros de test y patrones usados por las principales agencias reguladoras
Tipo de test
Patrn
Exactitud de
Solucin de perclorato de holmio
longitud de onda
Cristal de xido de holmio
Exactitud
fotomtrica y
linealidad
Luz dispersa
Resolucin
EP ASTM
2034
Lmpara de arco de deuterio
Lmpara de arco de mercurio
Vapor de benceno
Disolucin de dicromato potsico
935
Cristal de densidad neutra
930
Solucin sales de cobalto y nquel
931
Metal sobre cuarzo
2031
Disolucin de cloruro potsico
Disolucin de ioduro potsico
2032
Disolucin de ioduro sdico
Disolucin de nitrito sdico
Tolueno en disolucin de hexano
USP: Slo mtodo de test
108
NIST
USP SRM
Operacin de rutina
NIST SRM: Material patrn y mtodo de test

EP: Mtodo de test y especificacin de rendimiento mnimo
ASTM: Slo mtodo de test
La eleccin de patrones depende de los anlisis a realizar en

el instrumento. Est condicin est sealada en los
requisitos GLP, de manera que la verificacin debe
realizarse para los rangos de operacin pretendido y
anticipado; en las recomendaciones ASTM, de manera que
las longitudes de onda utilizadas para calibracin encierren
la longitud de onda analtica; y en las normas NIST. As por
ejemplo, si el propsito es medir la absorbancia en la regin
UV (como en la mayora de los anlisis farmacuticos), la
exactitud fotomtrica debe verificarse no en el rango visible
sino en el UV, preferiblemente a varias longitudes de onda.
De modo similar, no es apropiado verificar la exactitud de
longitud de onda slo en la lnea del deuterio 656.1 nm, ya
que ste no es un indicador fiable de la exactitud de
longitud de onda en la regin UV.
Recomendaciones Aunque no hay un grupo definitivo de patrones para

verificar el rendimiento de un espectrofotmetro, se
recomiendan los siguientes tests para aquellos usuarios que
analizan, principalmente, muestras lquidas y que necesitan
cumplir con los requisitos generales de las normas.
Exactitud de longitud de onda: disolucin de perclorato
de holmio (40 g/l xido de holmio en cido perclrico al
10 % v/v). La Figura 65 muestra el espectro de esta
disolucin, medido en un espectrofotmetro Agilent 8453.
109
Absorbancia [UA]
Operacin de rutina

Figura 65
Espectro de disolucin de perclorato de holmio
La Tabla 9 muestra los valores especificados por el NIST

para los picos de referencia utilizables para tres anchuras
de banda espectral instrumental (SBWs) diferentes. Estos
valores son preferibles a los EP ya que stos no especifican
110
Operacin de rutina
la SBW ni la temperatura utilizada y porque los valores EP y

NIST exhiben una discrepancia significativa.
Tabla 9
Valores NIST para picos de disolucin de perclorato de holmio28

SBW
0.5 nm
1.0 nm
2.0 nm
241.01
241.08
240.90
249.79
249.87
249.98
278.13
278.10
278.03
287.01
287.18
287.47
333.43
333.44
333.40
345.52
345.47
345.49
361.33
361.31
361.16
385.50
385.66
385.86
416.09
416.28
416.62
451.30
451.30
467.80
467.83
467.94
485.27
485.29
485.33
536.54
536.64
536.97
640.49
640.52
640.48
Exactitud fotomtrica: disolucin de dicromato potsico

(aproximadamente 60 mg/l en cido sulfrico 0.01N). La
Figura 66 muestra el espectro del dicromato potsico. Los
valores EP para este patrn, se presentan en la pgina 104.
111
Absorbancia [UA]
Operacin de rutina

Figura 66
Espectro del dicromato potsico
Si las medidas van a realizarse en la regin visible, se

aconseja realizar test adicionales con filtros de cristal de
densidad neutra, como el NIST SRM 930.
Luz dispersa: disoluciones de nitrito sdico (50 g/l), ioduro
sdico (10 g/l) y cloruro potsico (12 g/l) en agua. Estas tres
disoluciones permiten la medida de luz dispersa a tres
longitudes de onda diferentes. La Figura 67 muestra los
espectros de estas disoluciones. En general, se
recomiendan nitrito sdico e ioduro sdico o potsico, pero
para aquellos usuarios que necesiten cumplir con los
requisitos de la EP, tambin puede ser necesario cloruro
potsico.
112
Transmitancia [%]
Operacin de rutina

Figura 67
Espectros de disoluciones patrn de luz dispersa
Absorbancia [UA]
Resolucin: disolucin de tolueno en hexano (0.02 % v/v),

segn se especifica en la EP. La Figura 68 representa el
espectro de esta disolucin.

Figura 68
Espectro de tolueno en hexano
La resolucin se estima tomando la relacin de la absorbancia en el mximo cercano a 269 nm, a aquella en el
mnimo prximo a 266 nm. Esta relacin est empri-
113
Operacin de rutina
camente relacionada con la SBW, como se muestra en la

Tabla 10.29
Tabla 10
SBW y relacin 269/266 nm (tolueno)
SBW (nm)
Relacin de la absorbancia a
269 nm a la absorbancia a
266 nm
0.25
2.30
0.50
2.20
1.00
2.00
2.00
1.40
3.00
1.10
4.00
1.00
Tambin deben medirse con el rea de muestra limpia, el

ruido, llanura de la lnea base y deriva. No se requieren
patrones.
Autotest del
instrumento
La verificacin completa del rendimiento de un

espectrofotmetro, necesita tiempo y por consiguiente,
normalmente slo se realiza a intervalos peridicos. Estos
intervalos se determinan de acuerdo con la estabilidad del
instrumento. Para asegurar que se detecta cualquier
desviacin del rendimiento que ocurra entre verificaciones
regulares, el instrumento debe estar equipado con rutinas
auto-test que puedan ejecutarse diariamente. Estas rutinas
deben incluir un control de la operacin electrnica y
ptica del espectrofotmetro, as como controles de
exactitud de longitud de onda con una o ambas lneas de la
lmpara de deuterio.
114
Operacin de rutina
Idoneidad del
sistema
La idoneidad del sistema est diseada para evaluar los

componentes del sistema analtico, para verificar que el
rendimiento del sistema cumple los estndares requeridos
por el mtodo. La idoneidad del sistema no debe
confundirse con la validacin del mtodo. Mientras la
validacin se realiza una vez al finalizar el desarrollo del
mtodo, los tests de idoneidad del sistema se ejecutan
peridicamente para determinar si todo es adecuado y/o su
eficacia. Los requisitos de idoneidad del sistema estn bien
definidos para los sistemas cromatogrficos pero no para
los sistemas de espectroscopa UV-visible.
En la prctica, los analistas han desarrollado sus propias
estrategias para realizar los test de idoneidad del sistema en
instrumentos UV-visible. Dos ejemplos son:
A. Medir y calibrar utilizando un patrn de concentracin
igual al 100 % de la concentracin del componente
esperado. Entonces, medir y cuantificar el patrn diluido
por un factor de dos. Los resultados de ambas muestras
deben caer dentro de un porcentaje especificado de la
concentracin conocida. Volver a medir el patrn confirma
la exactitud de la medida inicial.
B. Primero medir el patrn y a continuacin, una serie de
diluciones del mismo y calcular el coeficiente de extincin
(absorbancia dividida por concentracin) para cada
concentracin. Los valores de los coeficientes de extincin
no deben variar ms de un porcentaje especificado.
Operacin
apropiada
Sin embargo, buenas medidas del control de calidad, como

test de verificacin del rendimiento del instrumento y
validacin del mtodo, as como resultados exactos y
precisos, dependen en gran medida del factor humano.
Aunque este factor no puede eliminarse nunca, pueden
tomarse ciertas medidas para reducir el error humano.
115
Operacin de rutina
Almacn electrnico Los espectrofotmetros modernos estn casi todos

controlados por microprocesador u ordenador y ofrecen un
almacenaje electrnico de los parmetros de mtodos.
Idealmente, todos los parmetros importantes deben
almacenarse en un solo fichero de mtodo, con un nombre
nico. Cuando el operador introduce el nombre del mtodo,
todos los parmetros deben fijarse automticamente,
eliminando errores potenciales. En particular los entornos
regulados, se beneficiarn de un sistema que evita que los
operadores cambien parmetros de los mtodos o que
mantienen un seguimiento e informan de cualquier cambio.
Procedimientos Aunque los espectrofotmetros pueden almacenar y, autoestndar de operacin mticamente, fijar parmetros, algunos procesos (como
vaciar, enjuagar y llenar cubetas) debe realizarlas el
operador, pudiendo introducir errores. Los operadores
deben estar entrenados en estos procesos y todos los pasos
deben estar documentados con las instrucciones de trabajo.
En un entorno regulado, estos pasos se conocen como
procedimientos estndar de operacin (SOP).
Datos colaterales
Pueden obtenerse errores o resultados incorrectos, a pesar

de usar la mejor instrumentacin, del desarrollo y validacin del mtodo y del entrenamiento del operador. Por
ejemplo, la muestra puede estar contaminada. Mientras un
resultado incorrecto no es necesariamente problemtico,
puede tener serias consecuencias el no darse cuenta. La
mayora de los resultados analticos obtenidos por
UV-visible se basan en una medida a una longitud de onda.
Con un punto, prcticamente no hay modo de detectar si un
resultado es sospechoso, a menos que sea un resultado
tpico y que el actual se desve significativamente del valor
conocido. Datos colaterales y medidas mltiples a una o
(preferiblemente) a mltiples, puede ayudar a asegurar que
un resultado es correcto. Los datos tambin pueden
utilizarse para investigar la razn del error.
116
Operacin de rutina
Longitudes de onda de Un modo sencillo de verificar resultados analticos

confirmacin cuantitativos es a travs del anlisis de confirmacin. En
este, se mide la absorbancia a una o ms longitudes de
onda, adems de a la analtica, tanto de patrones como de
muestras. Se realiza la cuantificacin a todas las longitudes
de onda analticas. Si la muestra es pura, los resultados a la
analtica y a la longitud o longitudes de onda de
confirmacin, ser idntica. Si la muestra est
contaminada, es muy probable que el contaminante
contribuya de modo diferente a la absorbancia a las
longitudes de onda analtica y de confirmacin, difiriendo
los resultados. En la Figura 69 se muestra un ejemplo. El
anlisis de confirmacin tambin puede utilizarse para
detectar si se ha medido la muestra correcta y si las
medidas estn fuera del rango dinmico lineal del
instrumento.
Absorbancia [UA]
Cafena
Acido saliclico

Figura 69
Anlisis de confirmacin
Espectros completos Para resultados ptimos, deben adquirirse los espectros

completos de la muestra. Estos espectros pueden
superponerse con los del patrn para comprobar las
117
Operacin de rutina
diferencias, o pueden utilizarse mtodos matemticos para

obtener un factor de coincidencia, que indicar la similitud
entre muestras y patrones. El factor de coincidencia se
obtiene representando los valores de absorbancia a cada
longitud de onda de la muestra, frente a los del patrn. Si
los espectros son idnticos, los puntos representados
estarn sobre una lnea recta. La pendiente de esta lnea es
la relacin de la concentracin de la muestra a la del patrn.
Si los espectros no son idnticos, los puntos no estarn en
una lnea recta, sino que mostrarn cierta dispersin. La
Figura 70 muestra grficos de ambos casos. En los dos,
puede utilizarse regresin lineal para ajustar la mejor lnea y
puede calcularse el coeficiente de correlacin. Este
coeficiente es una medida de la similitud de los espectros
de muestra y patrn. Si son exactamente iguales, el
coeficiente de correlacin ser 1, mientras que si son
completamente distintos, ser prximo a 0.
Normalizado
Correlacin = 0.999
Patrn
Desconocido
Desconocido [mUA]
Normalizado
Desconocido
Correlacin = 0.056
Patrn
Desconocido [UA]
Figura 70
Grficos comparativos de espectros similares y distintos
118
Operacin de rutina
Si se utilizan espectros completos, se dispondr de toda la

informacin analtica para reevaluar los resultados y para
determinar por qu un resultado es incorrecto.
Estadsticas Una sola medida no tiene un alto grado de validez. Todas las
medidas incluyen cierta predisposicin y variacin aleatoria
debidas al ruido. Aunque esta predisposicin puede
detectarse utilizando tcnicas como las descritas
anteriormente, el ruido tambin puede dar lugar a errores
significativos. Siempre debe estimarse la precisin de los
resultados realizando mltiples medidas y calculando la
media y la desviacin estndar de sta. La desviacin
estndar es un indicador de la validez de una medida.
Controlar los cambios de la desviacin estndar con el
tiempo, puede ser til para diagnosticar muchos problemas
de medida.
119
Operacin de rutina
120
apndice A
apndice A
Exactitud y
precisin
121
Exactitud y precisin
Definicin de los
trminos
Los trminos exactitud y precisin se utilizan a lo largo de

esta publicacin, pero no pueden ser intercambiados. Por lo
tanto, es importante comprender perfectamente la
diferencia entre ellos. Como analoga, la Figura 71 muestra
el resultado de varios disparos de un rifle sobre una diana.
Figura 71
Ejemplo de precisin y exactitud
En (a), los disparos no son ni exactos ni precisos. En (b),

son precisos pero inexactos; el tirador dispara bien, pero es
evidente una desviacin constante. En (c), los disparos son
exactos pero imprecisos: la media de los disparos estara
justo en el centro de la diana, pero cada uno de los tiros se
desva significativamente. En (d), los disparos son exactos y
precisos.
122
apndice B
apndice B
Caractersticas
de los
espectrofotmetros
de diodos
123
Caractersticas de los espectrofotmetros de diodos
Ventajas de la
espectroscopa de
diodos
Como fabricante lder de espectrofotmetros de diodos,

sabemos que esta tecnologa ofrece considerables ventajas
sobre los instrumentos convencionales de barrido. En las
secciones siguientes se revisan las ventajas de la tecnologa
de diodos y se comentan algunas de las desventajas.
Rpida adquisicin La rpida adquisicin espectral hace de los espectrofotmeespectral tros de diodos la mejor opcin para la medida de sistemas
Absorbancia [UA]
dinmicos, como detectores en el anlisis por inyeccin en

flujo, en control de procesos y medidas cinticas. Por
ejemplo, la Figura 72 muestra los espectros medidos a
intervalos de 1 s durante una hidrlisis de sultona. Con
estos datos, puede monitorizarse simultneamente la
desaparicin de reactivo y la aparicin de producto.

Figura 72
Espectros de la hidrlisis de sultona
Para la mayora de los usuarios de espectrofotmetros

UV-visible que no trabajan con sistemas dinmicos, la
rpida adquisicin espectral ofrece tambin ventajas.
Debido a su rapidez, este mtodo permite la adquisicin de
espectros completos incluso cuando el anlisis requiere
slo una longitud de onda. Los datos espectrales completos
124
pueden utilizarse para corregir errores (Modelar el fondo,

pgina 73 y Espectroscopa derivada, pgina 75) y como
informacin colateral para confirmar la calidad de los datos
(Espectros completos, pgina 117).
Finalmente, pueden obtenerse espectros completos con
alta productividad para el desarrollo de mtodos (vea
Desarrollo del mtodo, pgina 82) y para anlisis multicomponente (vea Anlisis multicomponente, pgina 21).
Medida multilongitud La mayora de los equipos convencionales pueden realizar

de onda simultnea medidas multilongitud de onda, pero deben moverse fsicamente de un punto a otro del espectro, lo que necesita
tiempo. Con un espectrofotmetro de diodos, todos los
puntos del espectro pueden medirse simultneamente. Por
consiguiente, las medidas multilongitud de onda se realizan
en el tiempo que un instrumento convencional requiere para
medir a una nica . Esto facilita el uso de varias tcnicas
para eliminar errores (vea Isoabsorbancia, pgina 72,
Referencia interna, pgina 74 y Correccin de tres
puntos, pgina 74). Adems, proporciona informacin
colateral para confirmar la calidad de datos (Longitudes de
onda de confirmacin, pgina 117) y mejorar la productividad del mtodo de ecuaciones simultneas simples
(Anlisis multicomponente, pgina 21). En medidas
multilongitud de onda, es necesario almacenar menos datos
que en medidas espectrales completas. Sin embargo, las
tcnicas de eliminacin de errores son algo menos eficaces
que las que pueden utilizarse con espectros completos.
Utilizando longitudes de onda alternativas para rangos de
concentracin alta y baja, puede maximizarse el rango
dinmico con espectrofotmetros de diodos. Los mximos
de absorcin pueden utilizarse para medidas de alta
sensibilidad y una longitud de onda con menor absorcin,
en el lateral de la banda de absorcin, previene de los
errores debidos a la luz dispersa.
Finalmente, un espectrofotmetro de diodos puede
utilizarse en muchas aplicaciones en las que antes se
125
requeran los costosos equipos de doble (Diseo de doble

longitud de onda, pgina 45).
Reseleccin de longitud Los equipos convencionales de barrido mecnico tienen un

de onda error inherente de reseleccin de (Exactitud y precisin
de longitud de onda, pgina 50) que aumenta con el tiempo
segn se desgastan las uniones. Tambin son susceptibles
de deriva de longitud de onda en largos periodos de tiempo.
Como en los instrumentos de diodos no se mueve ninguna
pieza en el cambio de o en el barrido, no ocurren errores
mecnicos significativos, con el tiempo.
Datos de todas las zonas del espectro, no afectados por
errores de reseleccin de , son una ventaja para el analista.
Permiten seleccionar la longitud de onda ptima para el
mejor rango dinmico, sensibilidad y selectividad en el
desarrollo del mtodo (Desarrollo del mtodo, pgina 82).
Adems, es esencial en tcnicas de mejora de sensibilidad
que utilizan promedio de (Promedio de longitud de
onda, pgina 67), para disminuir la sensibilidad de compuestos muy absorbentes (Absorbancia fuerte, pgina 68)
y para verificar la calidad de datos con de confirmacin
(Longitudes de onda de confirmacin, pgina 117). Otras
tcnicas que utilizan datos espectrales completos son
anlisis multicomponente (Anlisis multicomponente,
pgina 72), desarrollo de mtodos (Desarrollo del mtodo,
pgina 82), confirmacin de calidad de datos (Longitudes
de onda de confirmacin, pgina 117) y espectroscopa
derivada (Derivadas de espectros, pgina 6 y
Espectroscopa derivada, pgina 75).
Una excelente reseleccin de longitud de onda tambin
asegura que las diferencias entre medidas se deben a la
muestra y no a errores del instrumento. Por tanto, es
posible la identificacin incluso cuando los espectros son
prcticamente idnticos pero exhiben una pequea
variacin de .
Adems, pueden medirse espectros de patrones, almacenarlos en disco y recuperarlos das, semanas o incluso
126
meses ms tarde, para usarlos en anlisis cuantitativo sin

tener que volver a medirlos. Esto mejora la productividad,
especialmente es el caso de compuestos caros, difciles de
obtener o inestables, que no pueden usarse rutinariamente.
Sensibilidad El rango dinmico de un espectrofotmetro de diodos

puede ampliarse a bajos niveles de absorcin. Estos
instrumentos son menos complejos y tienen menos
superficies pticas que los convencionales. Por ello, la
salida de luz es mayor y los niveles de ruido son inferiores.
La capacidad de adquirir espectros completos rpidamente
tambin ayuda a mejorar la sensibilidad espectral utilizando
tcnicas de promedio de tiempo (Promedio de tiempo,
pgina 67) y promedio de (ver Promedio de longitud de
onda, pgina 67).
Estadsticas de las Los espectrofotmetros de diodos barren tan rpidamente

medidas que normalmente se realizan mltiples medidas y se
promedian a la vez. Se calcula la media y la desviacin
estndar para cada dato. La desviacin estndar es una
medida de la fiabilidad de los datos y se obtiene para cada
valor de absorbancia del espectro. Se suele decir que una
sola medida no tiene significado estadstico.12 Sin embargo,
con espectrofotmetros convencionales, obtener mltiples
medidas requiere mucho tiempo.
Los datos estadsticos son una valiosa herramienta para
evaluar la calidad de los resultados analticos
(Estadsticas, pgina 119) y pueden tambin utilizarse en
el desarrollo de mtodos (el software de los espectrofotmetros Agilent Technologies utiliza automticamente estos
datos).
Robustez y Los espectrofotmetros de diodos son mecnicamente

fiabilidad simples y no tienen, prcticamente, partes mviles. Como
se desgastan o rompen pocas piezas, estos instrumentos
son muy fiables. El usuario se beneficia del mnimo tiempo
sin utilizar. Adems, el coste de mantenimiento es menor
127
que en los instrumentos convencionales, ya que los

espectrofotmetros de diodos no requieren mantenimiento
ni recalibracin regular. Se estima que los instrumentos
modernos tienen slo un fallo cada 10 aos (excluyendo
cambios de lmpara).
Area abierta de muestra Debido al diseo de ptica inversa (El espectrofotmetro

de diodos, pgina 39) el rea de muestra de un espectrofotmetro de diodos no necesita estar cubierta, ya que el
instrumento no es susceptible de interferencias de la luz
ambiental. Adems, este diseo aumenta la productividad
facilitando el cambio de muestra y permite medir un amplio
rango de tipos de muestra, ya que son menores las
restricciones de tamao. Tambin es ms fcil cambiar o
aadir accesorios especiales de muestreo.
Desventajas de la
espectroscopa de
diodos
Como los espectrofotmetros de diodos difieren de los

convencionales de barrido, han surgido muchas objeciones
relativas a su rendimiento. En esta seccin, se comentan.
Resolucin En un espectrofotmetro convencional, la resolucin puede

cambiarse fcilmente variando la anchura de rendija. Sin
embargo, en un espectrofotmetro de diodos, depende de
un factor adicional: el intervalo de muestreo de la matriz de
diodos. De hecho, este intervalo depende del nmero de
diodos en la matriz y del rango de longitud de onda medido.
Hasta hace poco, los equipos de diodos tenan algunas
limitaciones al compararlos con instrumentos de 2 nm de
resolucin. Este problema se ha corregido en las matrices
modernas, como la del Agilent 8453 (Diseo de doble haz,
pgina 42), que contiene ms elementos. Aunque los
instrumentos de diodos no pueden alcanzar resoluciones de
0.5 nm o menos, como los convencionales, en muchos
anlisis puede no ser necesaria tanta resolucin
(Resolucin espectral, pgina 46). Adems, con una
128
resolucin tan elevada, menos luz alcanza al detector y la

sensibilidad es menor. Por ejemplo, si un espectro se barre
con una resolucin de 0.1 nm, puede llevar mucho ms de
una hora obtener un espectro con buen S/N.
Luz dispersa En un instrumento de barrido secuencial, se reduce la luz

dispersa colocando filtros en el paso de luz, delante del
monocromador (vea Luz dispersa, pgina 51). Estos filtros
deben cambiarse segn la longitud de onda incidente. En un
espectrofotmetro de diodos, utilizar filtros de esta manera,
normalmente, lmita el rango de longitudes de onda que
pueden medirse simultneamente. Por ello, los filtros se
colocan sobre la propia matriz para reducir la luz dispersa.
Sin embargo, como todas las de luz estn siempre en el
rea del detector, la luz dispersa es ms problemtica que
en los equipos convencionales.
Hasta hace poco, los espectrofotmetros de diodos exhiban niveles ms altos de luz dispersa que los convencionales. Sin embargo, el Agilent 8453 est basado en un
proceso patentado que usa la capacidad de barrido rpido
completo de la tecnologa de diodos, para reducir
significativamente la luz dispersa. Primero, se barre el
espectro completo. A continuacin, se coloca en el paso de
luz un filtro que bloquea toda la luz por debajo de 430 nm, y
se mide el espectro en la regin por encima de 430 nm. La
nica luz detectada es la dispersa, que se resta de la primera
medida, obtenindose un espectro con la luz dispersa
corregida. El proceso completo slo dura 1.5 s (con dos
medidas de 0.5 s) y reduce la luz dispersa a niveles
equivalentes o mejores a aquellos obtenidos con
instrumentos de barrido convencional, con un
monocromador.
Descomposicin de Debido a que los espectrofotmetros de diodos irradian la

la muestra muestra con luz de todas las longitudes de onda, se ha
argumentado que la muestra se degradar. Sin embargo, las
intensidades de luz utilizadas en un instrumento de diodos
129
no son mayores que las de uno convencional. Por ello,

cuando se barre un espectro completo, secuencialmente,
con un espectrofotmetro convencional, la cantidad total
de luz (la suma de la luz a todas las longitudes de onda) a la
que se somete a la muestra, es la misma que en un
instrumento de diodos. Si la muestra es fotosensible, ambos
instrumentos la descompondrn en la misma extensin.
Alguna evidencia circunstancial indica que, en algunos
casos, un instrumento de diodos puede adquirir espectros
de compuestos de mayor fotosensibilidad, que no pueden
obtenerse en espectrofotmetros convencionales.
Cuando se mide a una longitud de onda, un instrumento
convencional debera tener clara ventaja sobre un
espectrofotmetro de diodos, ya que somete a la muestra a
mucha menos irradiacin. Sin embargo, en la prctica, los
problemas de fotodegradacin son extramadamente raros.
En el momento de la publicacin de este libro, no se
conoca ningn caso documentado.
Complejidad Algunos usuarios estn intimidados por los instrumentos de

diodos porque creen que son muy complicados. Pero
aunque el proceso interno de datos asociado con los
espectrofotmetros de diodos es, por supuesto, mucho ms
complejo que en los instrumentos convencionales, el
usuario nunca es consciente de esta diferencia. Y, mientras
los espectrofotmetros de diodos generan muchos ms
datos que los convencionales, estos datos se manejan
fcilmente con los modernos softwares. Adems, los datos
adicionales tienen numerosas ventajas, como se ha tratado
a lo largo de este libro.
Errores en la medida de Aunque los espectrofotmetros de diodos pueden producir

muestras fluorescentes resultados incorrectos cuando se miden muestras
fluorescentes, los instrumentos convencionales de barrido
tambin estn sujetos a error (en Fluorescencia, pgina 79
se ofrece una explicacin).
130
apndice C
apndice C
Referencias
131
Referencias
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19. Nowicka-Jankowska, T.; Gorczynska, A.; Michalik, A.;
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Technologies, publication number 5965-7438E, 2000.
21. Alford, J.S.; Cline, F.L. PMAs computer system
validation committee, computer system validation
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Technol., 1990, 14, 88104.
22. EURACHEM Guidance Document No. 1/WELAC
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of the EN 45000 series of standards and ISO/IEC Guide
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133
Referencias
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United States Pharmacopoeial Convention, Inc.,
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MD, 1995, 104106.
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Performance of Ultraviolet, Visible, and Near-Infrared
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Power Ratio of Spectrophotometers by the Opaque Filter
Method, ASTM Standard E-387, 1990.
28. SRM 2034 Certificate, National Institute of Standards and
Technology: Gaithersburg, MD, 1992.
29. Pharmeuropa, Special Edition, Technical Guide,
Council of Europe: Strasbourg, 1993.
134
indice
indice
135
Indice
aberracin cromtica, 38
absorbancia, 3, 6, 21, 83, 105
bandas, 7, 11, 76, 77
errores de medida en, 5354, 60
61, 79
interferencias, 69, 70, 74
medida de errores en, 65
y color, 13
absorbancia dbil, 6668
absorbancia fuerte, 6869, 126
cido ntrico, 107
cido perclrico, 103, 107, 109
cido sulfrico, 103
actividad enzimtica, 1516, 29
aditividad, 21, 86
Agilent 8453
espectrofotmetro, 41, 42, 109, 129
aminocidos, 14
anlisis cualitativo, 1016
anlisis cuantitativo, 1627, 58, 64,
97, 98, 127
anlisis multicomponente, 14, 21
26, 125, 126
e isoabsorbancia, 72
anchura
de
banda
espectral
instrumental (SBW), 4749,
110, 111, 114
anchura de banda espectral natural
(NBW), 4849
anchura de rendija, 66, 128
ngulo de aceptacin, 80
arco de deuterio
lmpara, 101, 107, 108
arco de mercurio
lmpara, 101, 108
ASTM (American Standard Testing
Methods), 107109
autotest, 114
cloruro potsico, 104, 108, 112

coeficiente de correlacin, 84, 85,
86, 118
coeficiente de extincin, 1819, 21,
97, 98, 115
color, 1314
confirmacin
longitud de onda, 117
controlador de temperatura Peltier,
64
convencional
ptica, 79
correccin de tres puntos, 74
correccin Morton-Stubbs. Ver
correccin de tres puntos
cristal
xido de holmio, 108
cristal de densidad neutra, 98, 102,
108
filtros, 107, 112
cristal de xido de didimio, 102
cromforo, 1011, 62
cuantificacin
de
un
solo
componente, 20
Cubetas, 58
cubetas, 5861
cuidado de, 61
material, 5859
cubetas con apertura, 60, 61
cubetas de flujo, 60
cubetas rectangulares abiertas, 59
cubetas sin cubrir, 61
curva de calibracin, 19, 8385
curva de trabajo. Ver curva de
calibracin
D
B
benceno (vapor), 103, 107, 108
blanco, 38, 41, 42, 44, 46, 64, 65
britnica
farmacopea, 104, 106
datos colaterales, 116119, 125

dbil
absorbancia, 6668
deriva, 42, 44, 55, 68, 100, 114, 126
derivatizacin qumica, 28
desarrollo de mtodos, 125
desarrollo del mtodo, 8294
descarga de vapor de mercurio
lmpara, 107
136
descomposicin de la muestra, 80,

129130
desviacin estndar, 8687, 88, 89,
90, 119, 127
detector
fotodiodo, 3536
matriz de diodos, 3637
tubo fotomultiplicador, 35
detector de matriz de diodos, 3637
detector fotodiodo, 3536
detector tubo fotomultiplicador, 35
dicromato potsico, 107, 108
en cido perclrico, 103
en cido sulfrico, 103
diodos
espectrofotmetro, 3940
disolucin de perclorato de holmio,
107, 108, 109, 111
disolvente
efecto del, 6264
eleccin de, 6162
dispersin, 84, 89, 118
dispersin Rayleigh, 70
dispersin Tyndall, 70
dispersin (scattering), 3, 9, 7071
dispersin Rayleigh, 70
dispersin Tyndall, 70
dispositivos de dispersin, 3435
divisin de haz
DNA (cido desoxirribonuclico),
1415
doble haz
doble longitud de onda
E
efecto Schlieren, 63, 64
electromagntica
radiacin, 3, 32
electromagntico
espectro, 2
electrnica
energa, 4
energa electrnica, 4
energa rotacional, 4
energa vibracional, 4
Indice
ensayos cinticos enzimticos, 28

error estndar de regresin, 84
espectral
resolucin, 4649
espectrofotmetro
convencional, 3839
espectrofotmetro Agilent 8453, 41,
42, 109, 129
espectrofotmetro con divisin de
haz, 44
espectrofotmetro
convencional,
3839
espectrofotmetro de diodos, 3940
espectrofotmetro de doble haz,
4243
espectrofotmetro
de
doble
longitud de onda, 45
espectrofotmetro de haz simple, 41
espectrofotmetro HP 8450A, 43, 44
espectros derivados, ??10, 1112,
20
espectroscopa derivada, 7578
espejos cncavos, 38
estabilidad, 33, 43, 45, 100
estadsticas, 119, 127
Estados Unidos
farmacopea, 94, 106107, 108
europea
farmacopea, 104106, 108, 110,
113
exactitud, 8788, 100
longitud de onda, 5051, 97, 101,
103, 107, 108
exactitud fotomtrica, 5154, 98,
99, 100, 108, 111
exatitud fotomtrica, 108
fosforescencia, 3
fotomtrica
exactitud, 5154, 98, 99, 100, 108,
111
precisin, 5154, 98, 108
fotoqumica
reaccin, 3, 80
frecuencia, 3
fuentes de luz, 3334
fuerte
absorbancia, 6869, 126
G
geometra de la muestra, 65
GLP
(Buenas
prcticas
de
laboratorio), 96, 104, 109
GMP
(Buenas
prcticas
de
fabricacin), 96, 104
Golay. Ver Tcnica polinmica
Savitzky-Golay
granate de neodimio ytrio aluminio,
102
H
haz simple
HP 8450A
espectrofotmetro, 43, 44
I
F
Farmacopea Alemana (DAB), 104
Farmacopea Britnica (BP), 104, 106
Farmacopea de Estados Unidos
(USP), 94, 106107, 108
Farmacopea Europea (EP), 104
106, 108, 110, 113
filtros, 35, 80, 98
cristal de densidad neutra, 107,
112
fluorescencia, 3, 7980
identificacin, 1011, 12, 16

idoneidad del sistema, 115
incertidumbre, 84
ndice de refraccin, 65
interferencia, 9, 20, 28
tipos de, 6978
intervalo de confianza, 89
inversa
ptica, 40, 79, 80, 128
ioduro potsico, 103, 107, 108, 112
ioduro sdico, 103, 108, 112
ISO 9000, 96
isoabsorbancia, 72, 92
y anlisis multicomponente, 72
L
Lambert. Ver ley de Bouger-Lambert
lmpara
arco de deuterio, 33
halgena de wolframio, 33
xenon, 34
lmpara de arco de deuterio, 33, 101,
107, 108
lmpara de arco de mercurio, 101,
108
lmpara de descarga de vapor de
mercurio, 107
lmpara de xenon, 34
lmpara halgena de wolframio, 33
lentes, 38
ley de Beer, 1620, 21, 83
ley de BeerBouguer-Lambert, 18
19
ley de Bouguer-Lambert, 17
lmite de cuantificacin (LOQ), 89
90
lmite de deteccin (LOD), 8990
linealidad, 8387, 100, 100, 107, 108
llanura de lnea de base, 100, 114
longitud de onda
confirmacin, 126
exactitud, 5051, 97, 101, 103,
107, 108
precisin, 5051, 97, 101, 107
promedio, 67, 89, 126, 127
referencia, 64, 72, 74, 86
repetitividad, 50, 51
reproducibilidad, 10, 41, 51, 69, 94
reseleccin, 126127
longitud de onda de confirmacin,
117, 126
luz dispersa, 5152, 9899, 103, 105,
108, 112113, 129
M
matriz, 9, 64, 70, 78
medida de balance, 46
metal sobre cuarzo, 102, 107, 108
137
Indice
mtodo de ecuaciones simultneas

simples, 2124, 25, 27, 91
mtodo de mnimos cuadrados, 8,
2425, 27, 84, 91
mtodo de mnimos cuadrados
mltiples (MLS), 26
mtodo de mnimos cuadrados
parciales (PLS), 26
mtodos estadsticos, 26, 84
coeficiente de correlacin, 84, 85,
86, 118
ecuaciones simultneas simples,
2124, 25, 27, 91
error estndar de regresin, 84
incertidumbre, 84
mnimos cuadrados, 8, 2425, 27,
84, 91
mnimos cuadrados mltiples
(MLS), 26
mnimos cuadrados parciales
(PLS), 26
regresin
del
componente
principal (PCR), 26
microcubetas, 60
monocromador, 35
N
NAMAS (Servicio Nacional de
Acreditacin de Medidas), 96
NIST
(National
Institute
of
Standards and Technology), 41,
106107, 108, 110, 111
nitrito sdico, 103, 112
NPL (National Physical Laboratory),
41
P
patrones de emisin, 101
patrones slidos de absorcin, 101
pH, 11, 15, 29, 6263
policromador, 39
precisin, 60, 66, 8889, 94, 119
longitud de onda, 5051, 97, 101,
107
precisin fotomtrica, 5154, 98,
108
prismas, 34
promedio de tiempo, 67, 89, 127
protenas, 14
R
rango, 91
rango dinmico lineal, 5354, 58, 68,
125, 126
reaccin de hidrlisis
de sultona, 124
reaccin fotoqumica, 3, 80
redes hologrficas, 3435
referencia
longitud de onda, 64, 72, 74, 86
patrn, 97, 98
valores, 46
referencia interna, 41, 55, 64, 74, 89
reflexin, 3
regresin del componente principal
(PCR), 26
resolucin, 105, 108, 128129
resolucin espectral, 4649
robustez, 93, 127128
rotacional
energa, 4
ruido, 52, 66, 88, 99, 114, 119
ruido Schott, 52
O
ptica, 38, 61
ptica convencional, 79
ptica inversa, 40, 79, 80, 128
xido de holmio, 109
cristal, 102, 107
en cido perclrico, 103, 107
xido de samario
en cido perclrico, 103
S
sales de cobalto, 103, 108
en cido ntrico/perclrico, 107
sales de nquel, 103, 108
en cido ntrico/perclrico, 107
selectividad, 28, 9193, 126
seal-ruido (S/N), 910, 27, 67
138
sensibilidad, 28, 60, 71, 8991, 126,

127
sultona, 124
T
tcnica polinmica Savitzky-Golay,
9
tcnicas de correccin, 78, 92, 125
anlisis multicomponente, 14, 21
26, 72, 125, 126
correccin de tres puntos, 74
espectroscopa derivada, 7578
isoabsorbancia, 72, 92
referencia interna, 41, 55, 64, 74,
89
temperatura, 11, 1415, 19, 29, 62
64
tipos de cubetas, 5860
con apertura, 60, 61
de flujo, 60
microcubetas, 60
rectangulares abiertas, 59
sin cubrir, 61
ultramicrocubetas, 60
tolueno
en hexano, 104, 108, 113
transmitancia, 6, 18, 51
U
ultramicrocubetas, 60
V
validacin del mtodo, 94
valoraciones espectrofotomtricas,
28
vibracional
energa, 4
s1
Copyright Agilent Technologies 2000

Todos los derechos reservados. Esta
prohibida la reproduccin, adaptacin o
traduccin, sin el permiso previo y por
escrito, excepto aquello permitido por la
ley de Derechos de Autor.
Impreso en Alemania 06/00
Nmero de publicacin 5980-1397ES

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En 1988 publicamos un libro titulado The Diode-Array

Dispositivos de dispersin .............................................................. 34

captulo 3 Tratamiento y medida de muestra

captulo 4 Desarrollo y validacin del mtodo

captulo 5 Operacin de rutina

Recomendaciones ................................................................................... 109

apndice A Exactitud y precisin

apndice B Caractersticas de los

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Este captulo presenta la teora bsica y los principios

Longitud de onda [m]

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

La energa asociada con la radiacin electromagntica se

Longitud de onda y La radiacin electromagntica puede considerarse una

Origen de los espectros Cuando la radiacin interacciona con la materia, pueden

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

una molcula, generalmente se representa como la suma de

E total = E electronica + E vibracional + E rotacional

E electronica > E vibracional > E rotacional

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Estas transiciones deben resultar en bandas de absorbancia

Sin embargo en las molculas, los niveles de energa

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

niveles de energa electrnica

Transmitancia y Cuando la luz atraviesa o se refleja en la muestra, la

Derivadas de espectros Si un espectro se expresa en absorbancia (A) como una

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

La Figura 5 de la pgina siguiente muestra los efectos de la

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Obtener las derivadas de los

Pueden utilizarse mtodos pticos, electrnicos y

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

cuadrados. Los coeficientes a0 al a cada longitud de onda

Las derivadas de los espectros pueden utilizarse para

Un efecto no deseado de la derivacin es la disminucin de

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

debe tenerse cuidado ya que un grado demasiado alto de

Cromforos seleccionados y sus mximos de absorbancia

Carbonilo (aldehdo) RHC=O

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Cromforos seleccionados y sus mximos de absorbancia

La presencia de una banda de absorbancia a una

Confirmacin de la Aunque los espectros UV-visible no permiten una

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

nmero de bandas aumenta con el orden de derivada. Este

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Color El color es una propiedad importante de una sustancia. El

Long. de onda [nm]

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

En la prctica, tanto la generacin como la sensacin de

Los espectros de absorbancia de las protenas resultan

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

absorbancia UV del DNA, con un mximo a 260 nm. Como

A DNA = A adenina + A guanina + A cito sin a + Atimina

La actividad de una enzima es una medida de su eficacia

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

temperatura, las condiciones bajo las que se determina la

Consideraciones La exactitud de longitud de onda absoluta y la exactitud

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Generalmente se piensa que Lambert (1760) formul la

donde Io es la intensidad incidente, I es la intensidad

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible