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INTRODUCCION

A causa del tamao tan pequeo del tema de estudio, la biologa celular y
molecular depende ms del desarrollo de nuevos instrumentos y tecnologas.
Por consiguiente, es difcil aprender acerca de la biologa celular y molecular
sin aprender tambin respecto a la tecnologa que se requiere para agrupar
datos.
En el presente trabajo se revisan los mtodos que se emplean ms a menudo
en este campo. Los objetivos son los siguientes:
Describir las formas en que se utilizan las diversas tcnicas.
Presentar ejemplos de los tipos de informacin que puedan obtenerse
mediante tales tcnicas.
Se comienza con el instrumento que permiti a los bilogos descubrir la
existencia de clulas, con el que se establece un punto partida para toda
informacin que est presente en este trabajo.

MICROSCOPA
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Tcnica empleada para producir imgenes visibles de estructuras o detalles


demasiado pequeos para ser percibidos a simple vista.
La microscopa generalmente implica la difraccin, reflexin o refraccin de
radiacin incidente en el sujeto de estudio

EL MICROSCOPIO PTICO
Una fuente de luz, que puede ser externa al microscopio o estar incluida en su
base, ilumina la muestra. La lente condensadora subyacente rene los rayos
difusos de la fuente de luz e ilumina la muestra con un pequeo cono de luz
brillante que permite ver las partes muy pequeas de ste despus de la
magnificacin. Los rayos de luz enfocados en la muestra por la lente
condensadora se reciben en la lente del objetivo del microscopio. A partir de
este punto es necesario considerar dos conjuntos de rayos lumnicos que
entran a la lente del objetivo: los que ya alter la muestra y los que no modific.
Permite ver objetos tan pequeos como 0.5 m (bacterias y mitocondrias)

Preparacin de muestras para microscopia de luz de campo claro


Las muestras al observar en el microscopio ptico se dividen en dos categoras
amplias: monturas completas y cortes. La mayor parte de los tejidos de plantas
y animales son demasiado opacos para su anlisis microscpico, a menos que
stos se examinen como una rebanada muy delgada, o corte. Para preparar un
corte, primero se matan las clulas mediante inmersin del tejido en alguna
solucin qumica llamada fijador.
Un buen fijador penetra rpido en la membrana celular e inmoviliza todo su
material macromolecular, de modo que la estructura de la clula se mantiene lo
ms similar posible a la de la clula viva. Los fijadores ms usuales para la
microscopia ptica son soluciones de formaldehdo, alcohol o cido actico.

MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE


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Las muestras pequeas y no teidas, como una clula viva, pueden ser difciles
de observar con un microscopio de campo brillante. El microscopio de
contraste de fase hace ms visibles los objetos muy transparentes
Los microscopios de contraste de fase son ms tiles para examinar
componentes intracelulares de clulas vivas con una resolucin hasta cierto
punto alta. Por ejemplo: la movilidad dinmica de las mitocondrias, los
cromosomas mitticos y las vacuolas pueden seguirse y filmarse con este
sistema ptico.
El mayor beneficio aportado por la invencin del microscopio de contraste de
fase no fue el descubrimiento de nuevas estructuras, sino su empleo diario en
laboratorios de investigacin y enseanza para observar clulas de manera
ms reveladora.

MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA
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Los avances en la visualizacin de clulas vivas han sido posibles gracias a


innovaciones en la microscopia de fluorescencia ya que permite observar la
localizacin de determinados compuestos (llamados fluorocromos o fluorforos)
que absorben radiacin ultravioleta invisible y emiten porciones de la energa
en las longitudes de onda visibles, ms largas, un fenmeno que se conoce
como fluorescencia.
En biologa celular y molecular existen diversas formas de utilizar los
compuestos fluorescentes. En una de sus aplicaciones ms usuales, un
fluorocromo (como la rodamina o la fluorescena) se une en forma covalente
(conjugada) con un anticuerpo para producir un anticuerpo fluorescente que
puede emplearse para localizar una protena especfica dentro de la clula.
Esta tcnica se denomina inmunofluorescencia.
Los humanos desde hace miles de aos se han preguntado por qu las
medusas y otros animales marinos emiten luz en la oscuridad. Fue apenas en
el comienzo en el decenio de 1960 cuando Osamu Shimomura descubri que
algunas especies de dichos organismos emiten luminosidad por la presencia de
protenas fluorescentes como la aequorina y la protena fluorescente verde y
las pudo purificar y analizar.

MICROSCOPIA ELECTRONICA DE TRANSMISION

Las micrografas electrnicas que se muestran, fueron tomadas con dos tipos
distintos de microscopios electrnicos. Los microscopios electrnicos de
transmisin (TEM) forman imgenes con los electrones que se transmiten a
travs de una muestra, mientras que los microscopios electrnicos de barrido
(SEM) utilizan electrones que rebotan en la superficie de la muestra.

El microscopio electrnico de transmisin puede proporcionar mucha mayor


resolucin que el microscopio ptico. Esto se ilustra con la comparacin de las
siguientes dos fotografas:

MICROSCOPIA ELECTRONICA DE BARRIDO

El microscopio electrnico de barrido (SEM) se emplea sobre todo para


examinar las superficies de los objetos cuyo tamao vara desde un virus hasta
la cabeza de un animal. El objetivo de la preparacin de la muestra para el
SEM es producir un objeto que tenga las mismas propiedades de forma y
superficie que en el estado vivo, pero que carezca de lquido, ya que esto es
necesario para observar la muestra al vaco.
El SEM tambin proporciona una profundidad de enfoque notable, unas 500
veces ms que el microscopio ptico con una magnificacin correspondiente.
Esta propiedad da a las imgenes del SEM su calidad tridimensional. A nivel
celular, el SEM permite al observador apreciar la estructura de la superficie
externa de las clulas y todos los procesos, extensiones y materiales
extracelulares diversos que interactan con el ambiente.

Micrografas electrnicas de barrido de (a) un bacterifago y (b) la cabeza de


un insecto.

CULTIVO CELULAR
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El aprendizaje de cmo cultivar clulas fuera de un organismo es uno de los


logros tcnicos ms valiosos en todo el estudio de la biologa.
Las clulas cultivadas pueden obtenerse en grandes cantidades; casi todos los
cultivos contienen slo un tipo de clula; muchas actividades celulares
distintas, como la endocitosis, el movimiento celular, la divisin celular, el trfico
de membrana y la sntesis de macromolculas, pueden estudiarse en un cultivo
celular y las clulas cultivadas responden al tratamiento con frmacos,
hormonas, factores de crecimiento y otras sustancias activas.
Los primeros investigadores en cultivar clulas empleaban medios que
contenan una gran variedad de sustancias desconocidas. El crecimiento
celular se lograba con la adicin de lquidos obtenidos de sistemas vivos, como
linfa, suero sanguneo, u homogeneizados de embrin. Se descubri que las
clulas necesitaban una variedad considerable de nutrimentos, hormonas,
factores de crecimiento y cofactores para mantenerse sanas y proliferar. Aun
ahora la mayor parte de los medios de cultivo contiene grandes cantidades de
suero.

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA

Tcnica que se utiliza con frecuencia para fraccionar protenas; depende de la


capacidad de molculas cargadas para migrar cuando se colocan en un campo
elctrico. La separacin electrofortica de protenas casi siempre se realiza por
electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), en la que las protenas son
impulsadas por una corriente que se aplica a travs de una matriz gelatinosa.
La matriz se compone de polmeros de una pequea molcula orgnica
(acrilamida) que establece enlaces cruzados para formar un tamiz molecular.
El movimiento relativo de las protenas por un gel de poliacrilamida depende de
la densidad de carga de las molculas. Mientras mayor sea la densidad de
carga, la protena se impulsa con ms fuerza por el gel y por lo tanto, la
migracin es ms rpida.

SEPARACIN DE DNA POR ELECTROFORESIS EN


GEL

Se usa mucho para separar cidos nucleicos con masa molecular diferente (o
sea, longitud del nucletido). Las molculas pequeas de RNA o DNA de unos
cuantos cientos de nucletidos o menos casi siempre se separan por
electroforesis en gel de poliacrilamida. Despus de la electroforesis, los
fragmentos de DNA en el gel se visualizan empapando el gel en una solucin
de colorante como bromuro de etidio. ste se intercala en la doble hlice y
hace que las bandas de DNA presenten fluorescencia cuando se observan con
radiacin ultravioleta.

AMPLIFICACIN ENZIMTICA DE DNA POR


REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR)

En 1983 Kary Mullis de Cetus Corporation concibi una nueva tcnica que
ahora se emplea mucho para amplificar fragmentos especficos de DNA sin la
necesidad de clulas bacterianas. Esta reaccin se conoce como reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction). Muchos protocolos
diferentes de PCR se usan para una multitud de aplicaciones en las que es
posible amplificar desde uno hasta una gran poblacin de DNA relacionados.

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GENOTECAS DE DNA

A menudo la clonacin de DNA se usa para producir genotecas de DNA, que


son colecciones de fragmentos de DNA clonados. Pueden crearse dos tipos
bsicos de genotecas de DNA: genotecas genmicas y genotecas de cDNA.
Las primeras se producen de un DNA total extrado de ncleos y contienen
todas las secuencias de DNA de la especie.

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TRANSFERENCIA DE DNA A CLULAS


EUCARIOTAS

Una de las estrategias ms usuales para alcanzar este objetivo es incorporar el


DNA en el genoma de un virus que no est en replicacin y permitir que el virus
infecte una clula. La transferencia de genes mediada por virus se conoce
como transduccin. Segn el tipo de virus que se utilice, el gen de inters
puede expresarse en forma transitoria durante un periodo de horas o das, o
integrarse de modo estable en el genoma de la clula hospedadora.
La copia del DNA se inserta despus en el DNA de los cromosomas del
hospedador. Los retrovirus se utilizan en muchos de los intentos recientes de
teraputica gnica para transferir un gen a las clulas de un paciente que
carece de ese gen.

Micro inyeccin de DNA en el ncleo de un huevo de ratn recin fertilizado. El


huevo se mantiene en su sitio con una pipeta de succin que se muestra a la derecha,
mientras que la pipeta de inyeccin que penetra el huevo se muestra a la izquierda.

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USO DE ANTICUERPOS

Una de las propiedades ms atractivas de los anticuerpos y que los hace tan
tiles para los investigadores en biologa es su especificidad notable. Una
clula puede contener miles de protenas diferentes y aun as una preparacin
de anticuerpos se une slo con las molculas seleccionadas dentro de la clula
que tienen una pequea parte que se adapta a los sitios para unin de
antgeno de las molculas de anticuerpo.
En la estrategia tradicional, un animal (por lo general un conejo o una cabra) se
inyecta varias veces con el antgeno y tras un periodo de varias semanas se
extrae sangre que contiene los anticuerpos deseados. La sangre entera se
trata para eliminar las clulas y los factores de coagulacin a fin de producir un
antisuero, que puede someterse a prueba para cuantificar su ttulo de
anticuerpos y del que pueden purificarse las inmunoglobulinas.

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BIBLIOGRAFIA

Gerald Karp, sexta edicin. Biologa celular y molecular.


Csar Eduardo Montalvo Arenas, 2010
Jimenez L. Felipe, Merchant Horacio. Mxico 2003. Biologa celular y

molecular.
http://es.slideshare.net/frank1280/1-2-tecnicas-empleadas-en-bc

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