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COLOMBIANA
NTC
5031
2002-02-20
E:
CORRESPONDENCIA:
DESCRIPTORES:
I.C.S.: 67.100.10
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC)
Apartado
14237
Bogot,
D.C.
Tel.
6078888
Fax
2221435
Prohibida su reproduccin
Editada 2002-03-01
PRLOGO
ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales.
DIRECCIN DE NORMALIZACIN
NTC 5031
OBJETO
Esta norma especifica dos mtodos para la determinacin de vitamina A en leche descremada
en polvo que contenga mnimo 10 UI de vitamina A/g, mediante el mtodo colorimtrico o por
cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).
2.
DEFINICIONES
2.1
3.
3.1
PRINCIPIO
REACTIVOS
Se deben usar slo reactivos de grado analtico conocido, a menos que se especifique de otra
forma, y agua destilada o desmineralizada o de pureza equivalente.
3.2.1 Etanol (CH3 CH2 0H), 95 % (en volumen), libre de aldehdo.
3.2.2 Solucin de ascorbato de sodio, 200 g/L. Si no est disponible lista para su uso, se
prepara disolviendo 3,5 g de cido ascrbico (C6 H8 O6) en 20 ml de solucin de hidrxido de
sodio (NaOH), de 1 mol/I y se mezcla. Se prepara esta solucin fresca diariamente.
NTC 5031
Se puede usar una solucin patrn secundaria, si se normaliza contra la solucin patrn
primaria o mediante la medicin de la absorbancia en la regin UV.
Se corta la punta de la cpsula de la solucin patrn de referencia de vitamina A y se vierte el
aceite en un matraz aforado de 100 ml, de color mbar. Se pesa el contenido, con una
precisin de 0,1 mg. Se diluye con cloroformo (vase el numeral 3.2.6) hasta la marca de 100 ml.
Se usa la solucin patrn de vitamina A, tan pronto como sea posible. Se desecha la solucin
patrn despus de 8 h.
1)
NTC 5031
3.3
EQUIPOS
TOMA DE MUESTRAS
La toma de muestras no hace parte de este mtodo. En la NTC 666 (ISO 707) se dan los
mtodos recomendados de muestreo.
Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea verdaderamente representativa y
que no haya sido deteriorada durante el transporte o almacenamiento.
NTC 5031
PROCEDIMIENTO
3.6.1 Generalidades
Nota. Si se requiere verificar el cumplimiento del lmite de repetibilidad (vase el numeral 3.11.2), se deben realizar
dos determinaciones sencillas de acuerdo con lo establecido en los numerales del 3.6.2 al 3.8.
Para todas las operaciones se debe trabajar con luz suave o usar recipientes de vidrio
antiactnico de baja transmisin de la luz.
3.6.2 Solucin para ensayo
Se pesan 20 g de la muestra para ensayo, con aproximacin de 0,001 g, en un vaso de
precipitado o matraz (vase el numeral 3.3.2) y se disuelven en 50 ml de agua a una
temperatura de al menos 80 C. Se deshace cualquier grumo presente, con una esptula, o
usando un bao ultrasnico (vase el numeral 3.3.10). Se deja enfriar hasta temperatura
ambiente. Se transfiere cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml. Se diluye con agua
hasta completar el aforo de 100 ml.
3.6.3 Saponificacin y extraccin
3.6.3.1 Se transfieren, por medio de una pipeta (vase el numeral 3.3.5), 25 ml de la solucin
para ensayo preparada (vase el numeral 3.6.2), a un matraz de saponificacin (vase el
numeral 3.3.3). Se adicionan 20 ml de solucin de hidrxido de potasio (vase el numeral 3.2.3) y
10 ml de solucin de ascorbato de sodio (vase el numeral 3.2.2). Se adicionan 50 ml de etanol
(vase el numeral 3.2.1) y se mezcla bien.
3.6.3.2 Se mantiene en reflujo por 30 min en un bao de vapor a 85 C (vase el numeral 3.3.7)
agitando de vez en cuando. Se pone a enfriar inmediatamente bajo el chorro de agua.
3.6.3.3 Se transfiere el lquido a un embudo de separacin (vase el numeral 3.3.9) usando dos
porciones de 30 ml de agua, dos porciones de 10 ml de etanol (vase el numeral 3.2.1) y dos
porciones de 40 ml de ter de petrleo (vase el numeral 3.2.5). Se agita vigorosamente
durante 30 s y se permite que permanezca en reposo hasta que las dos capas sean claras.
Se transfiere la fase acuosa (inferior) a un segundo embudo de separacin y se agita con una
mezcla de 10 ml de etanol (vase el numeral 3.2.1) y 40 ml de ter de petrleo (vase el
numeral 3.2.5). Se deja separar.
3.6.3.4 Se transfiere la fase acuosa a un tercer embudo de separacin y la fase que contiene
ter de petrleo al primer embudo de separacin. Se lava el segundo embudo de separacin
con dos porciones de 10 ml de ter de petrleo (vase el numeral 3.2.5). Se adiciona el lquido
de lavado al primer embudo de separacin.
NTC 5031
3.6.3.5 Se agita la fase acuosa con 40 ml de ter de petrleo (vase el numeral 3.2.5) y 10 ml
de etanol (vase el numeral 3.2.1). Se adiciona la fase que contiene ter de petrleo al primer
embudo de separacin. Se lavan los extractos combinados de ter de petrleo con tres
porciones de 40 ml de solucin alcohlica de hidrxido de potasio(vase el numeral 3.2.4),
agitando vigorosamente. Enseguida se lavan, con porciones de 40 ml de agua hasta que el
ltimo lavado sea neutro a la fenolftalena. Se dejan escurrir las ltimas gotas de agua, y se
adicionan al embudo de separacin dos hojas de papel filtro (vase el numeral 3.3.11) cortadas
en tiras y se agita.
Nota. En lugar de usar papel de filtro cortado en tiras, se sugiere hacer pasar los extractos etreos por un papel filtro
conteniendo sulfato de sodio anhidro; despus de pasar todo el extracto, este papel filtro se lava dos veces con
porciones de 10 ml de ter para recuperar algo de vitamina retenida en el filtro.
3.6.3.6 Se transfiere el extracto que contiene ter de petrleo, el cual se ha secado como se
describi en 3.6.3.5, a un matraz aforado de 200 ml (vase el numeral 3.3.4). Se enjuaga el
embudo de separacin y el papel con ter de petrleo (vase el numeral 3.2.5), se adicionan
los enjuagues al matraz, y en seguida se adicionan de 10 mg a 20 mg de BHT (vase el
numeral 3.2.10). Se diluye con ter de petrleo hasta el aforo de 200 ml y se mezcla bien.
3.7
Se pipetea una alcuota del extracto diluido (vase el numeral 3.6.3.6) en un matraz de fondo
redondo. Se evapora hasta sequedad, en vaco, con agitacin, en un bao de agua (vase el
numeral 3.3.8) hasta una temperatura que no exceda de 40 C. Se deja enfriar bajo un chorro
de agua y se restablece la presin atmosfrica, preferiblemente con nitrgeno. Inmediatamente
se disuelve el residuo en 10,0 ml de cloroformo (vase el numeral 3.2.6).
Nota. Una concentracin tpica de la solucin de ensayo es de 10 UI de vitamina A por mililitro de cloroformo. La
cantidad de alcuota se puede ajustar dependiendo del tamao y sensibilidad de la celda espectromtrica.
3.8
DETERMINACIN
NTC 5031
de vitamina A en microgramos. Si la curva es una lnea recta, se debe calcular un factor para el
contenido de vitamina A en las muestras.
3.10
w=
c . V1 . V3 . V4
V2 . V5 . m
Donde:
3.11
V1
V2
V3
V4
V5
de la solucin de
PRECISIN
NTC 5031
3.11.3 REPRODUCIBILIDAD
La diferencia absoluta entre dos resultados de pruebas sencillas e independientes, obtenidas
usando el mismo mtodo sobre muestras idnticas en diferentes laboratorios con diferentes
operarios, usando diferentes equipos no ser mayor del 42 % del promedio aritmtico de los
resultados en el 5 % de los casos.
3.12
4.
4.1
PRINCIPIO
REACTIVOS
Slo se deben emplear reactivos de grado analtico reconocido, a menos que se especifique de
otra manera y agua destilada o desmineralizada o agua de pureza equivalente.
4.2.1 Etanol, (CH3 CH2 OH), de 95 % (en volumen), libre de aldehdo.
4.2.2 Solucin de ascorbato de sodio, 200 g/l. Si no se encuentra disponible ya elaborada,
se puede preparar disolviendo 3,5 g de cido ascrbico (C6H8O6) en 20 ml de solucin de
hidrxido de sodio, 1 mol/l y se mezcla. Se prepara esta solucin fresca diariamente.
4.2.3 Solucin acuosa de hidrxido de potasio, 50 % (en masa). Se disuelven 50 g de
hidrxido de potasio, (KOH) en 50 ml de agua. Se mezcla y se deja enfriar, la solucin
obtenida, hasta temperatura ambiente. Se prepara la solucin fresca antes de usarse.
4.2.4 Solucin alcohlica acuosa de hidrxido de potasio, 30 g/l
Se disuelven 3 g de hidrxido de potasio (KOH), en agua, se le adicionan 10 ml de etanol
(vase el numeral vase el numeral 4.2.1) y se diluyen hasta 100 ml con agua, en un matraz
volumtrico. Se prepara una solucin fresca antes de usarse.
7
NTC 5031
EQUIPOS
1)
Temperatura ambiente;
Volumen de inyeccin de 20 l;
NTC 5031
Cuando se usa un detector fluorescente, se ajusta a 325 nm para la exitacin y a 450 nm para
la emisin.
4.3.2 Columna cromatogrfica, de acero inoxidable, 250 mm x 4,6 mm (di), empacada con
C8 o C18, de 10 m de tamao de partcula, ligada qumicamente a partculas de microsilicio o
una columna de desempeo equivalente.
4.3.3 Vaso de precipitado o matraz cnico, de 250 ml de capacidad.
4.3.4 Matraz de saponificacin, de aproximadamente 200 ml de capacidad, adaptado con
un condensador de reflujo.
4.3.5 Matraces volumtricos aforados, de 100 ml y 200 ml de capacidad.
4.3.6 Pipetas aforadas, de 10 ml, 25 ml y 50 ml.
4.3.7 Bao de vapor, bao de agua hirviendo o plancha de calentamiento elctrica
4.3.8 Bao de agua, capaz de operar a una temperatura hasta de 40 C 1 C.
4.3.9 Embudo de separacin, de 500 ml de capacidad, adaptado preferiblemente con un
tapn de politetrafluoetileno, (PTFE).
4.3.10 Bao ultrasnico
4.3.11 Papel de filtro, de 9 cm de dimetro.
4.4
TOMA DE MUESTRAS
La toma de muestras no hace parte del mtodo especificado en la presente norma. En la NTC 666
(ISO 707) se ofrece un mtodo de muestreo recomendado.
Es importante que el laboratorio reciba una muestra verdaderamente representativa y que no
se haya deteriorado o modificado durante el transporte o almacenamiento.
4.5
Se mezcla por completo la muestra para ensayo, rotndola varias veces, e invirtiendo el
recipiente con la muestra. Si para esto es necesario, se transfiere toda la muestra para ensayo
a un recipiente hermtico, de suficiente capacidad, para permitir la realizacin de esta
operacin.
4.6
PROCEDIMIENTO
4.6.1 Generalidades
Nota. Si se requiere verificar el lmite de repetibilidad encontrado (vase el numeral 4.11.2), se hacen dos corridas
de dos determinaciones simples de acuerdo con lo indicado en los numerales del 4.6.2.1 al 4.6.2.4.
NTC 5031
Para todas las operaciones, se trabaja con luz atenuada y se emplea material de vidrio
antiactnico de baja transmisin de la luz.
4.6.2 Solucin para ensayo
Se pesan, con aproximacin a 0,010 g, cerca de 20 g (m1) de leche en polvo en un vaso de
precipitado o en un matraz cnico (vase el numeral 4.3.3) y se disuelven en 50 ml de agua
caliente, por lo menos a 80 C. Se desbarata cualquier grumo con una esptula o usando un
bao ultrasnico (vase el numeral 4.3.10). Se deja enfriar hasta temperatura ambiente. Se
transfiere cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml, (vase el numeral 4.3.5) y se diluye
con agua hasta completar los 100 ml.
4.7
SAPONIFICACIN Y EXTRACCIN
4.7.1 Por medio de una pipeta, se adicionan al matraz de saponificacin (vase el numeral 4.3.4),
25 ml de muestra para ensayo preparada (vase el numeral 4.6.2). Se le adicionan 20 ml de
solucin de hidrxido de potasio (vase el numeral 4.2.3) y 10 ml de solucin de ascorbato de sodio
(vase el numeral 4.2.2), luego se le adicionan 50 ml de etanol (vase el numeral 4.2.1) y se
mezcla muy bien.
4.7.2 Se somete a reflujo durante 30 min en un bao de vapor a 85 C (vase el numeral 4.3.7), y
se agita de vez en cuando. Se deja enfriar de inmediato bajo agua corriente.
4.7.3 Se transfiere el lquido a un embudo separador (vase el numeral 4.3.9) empleando dos
porciones de 30 ml de agua, dos porciones de 10 ml de etanol (vase el numeral 4.2.1) y dos
porciones de 40 ml de ter de petrleo (vase el numeral 4.2.5). Se agita vigorosamente
durante 30 s y se permite que repose hasta que las dos capas se diferencien. Se transfiere la
fase acuosa (inferior) a un segundo embudo de separacin y se agita con una mezcla de 10 ml
de etanol (vase el numeral 4.2.1) y 40 ml de ter de petrleo (vase el numeral 4.2.5). Se
permite que se separen las fases.
4.7.4 Se transfiere la fase acuosa a un tercer embudo separador y la fase que contiene ter
de petrleo al primer embudo separador. Se lava el segundo embudo separador con dos
porciones de 10 ml de ter de petrleo (vase el numeral 4.2.5). Se adicionan los lavados al
primer embudo separador.
4.7.5 Se agita la fase acuosa con 40 ml de ter de petrleo (vase el numeral 4.2.5) y 10 ml
de etanol (vase el numeral 4.2.1). Se adiciona la fase que contiene ter de petrleo al primer
embudo separador. Se lavan los extractos de ter de petrleo combinada con tres porciones de
40 ml de solucin alcohlica de hidrxido de potasio preparada recientemente (vase el
numeral 4.2.4), se agita vigorosamente. A continuacin se lavan con porciones de 40 ml de
agua hasta que el ltimo lavado sea neutro a la fenolftalena. Se dejan escurrir las ltimas gotas
de agua, y se adicionan dos hojas de papel de filtro cortadas en tiras (vase el numeral 4.3.11) al
embudo de separacin y se agita.
4.7.6 Se transfiere el extracto de ter de petrleo, secado como se describi anteriormente, a
un a matraz volumrico de 200 ml (vase el numeral 4.3.5). se enjuaga el embudo de
separacin y el papel con ter de petrleo (vase el numeral 4.2.5), se adicionan los enjuagues
al matraz volumtrico y se adicionan de 10 mg a 20 mg de BHT (vase el numeral 4.9). Se
diluye con ter de petrleo hasta completar los 200 ml aforados.
10
NTC 5031
DETERMINACIN
4.10
w=
c . As . V1. V3 . V4
Ar . V2 . V 5 . m
Donde:
c
As
Ar
V1
es el volumen total, en mililitros, del extracto de ter de petrleo (V1 = 200 ml);
V2
11
NTC 5031
V3
V4
V5
4.11. PRECISIN
4.11.1 ENSAYO INTERLABORATORIO
Se han publicado los detalles de un ensayo interlaboratorio realizado de acuerdo con la
NTC 3529-1:1999 (ISO 5725-1:1994) y NTC 3529-2:1999 (ISO 5725-2:1994). Los valores
derivados de este ensayo interlaboratorio pueden no ser aplicables a otros rangos de
concentracin y matrices diferentes a aquellos dados.
4.11.2 REPETIBILIDAD
La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo, nicos, independientes, obtenida
empleando el mismo mtodo, sobre material de ensayo idntico, en el mismo laboratorio, por el
mismo operador, utilizando el mismo equipo, dentro de un intervalo corto de tiempo, no ser en
ms del 5 % de los casos superior al 14 % de la media aritmtica de los dos resultados.
4.11.3 REPRODUCIBILIDAD
La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo nicos, independientes, obtenida
empleando el mismo mtodo, sobre material de ensayo idntico, en diferentes laboratorios, con
diferentes operadores, usando diferentes equipos, no ser en ms del 5 % de los casos
superior al 17 % de la media aritmtica de los dos resultados.
4.12
INFORME DE ENSAYO
NTC 5031
Las siguientes normas contienen disposiciones que, a travs de la referencia en este texto,
constituyen disposiciones de la presente norma. Dichas publicaciones no se aplican para
referencias fechadas, subsecuentes enmiendas o actualizaciones. No obstante, se invita a las
partes que lleguen a acuerdos con base en la presente norma a indagar sobre la posibilidad de
aplicar las ediciones ms recientes de las normas indicadas a continuacin. Para referencias
no fechadas, se aplica la ltima edicin de la norma referenciada.
NTC 666:1996, Leche y productos lcteos. Gua para muestreo. (ISO 707:1997, Milk and Milk
products Guidance on sampling)
NTC 2175:1986, (Reaprobada 1999) Material de vidrio para laboratorio. Buretas. Requisitos
generales. (ISO 385-1:1984, Laboratory Glassware Burettes Part 1. General Requirements)
NTC 3529-1:1999, Precisin de los mtodos de medicin y de los resultados. Principios
generales y definiciones.
(ISO 5725-1:1994, Accuracy (trueness and precision) of
measurement methods and results. Part 1. General Principles and Definitions).
NTC 3529-2: Exactitud (veracidad y precisin) de mtodos de medicin y resultados. Parte 2.
Mtodo bsico para la determinacin de repetibilidad y reproducibilidad en un mtodo
normalizado de medicin. (ISO 5725-2:1994, Accuracy (trueness and precision) of
measurement methods and results. Part 2. A basic Method for the Determination of
Repeatability and Reproductibility of a Standard Measurement Method).
6.
DOCUMENTOS DE REFERENCIA
13
NTC 5031
Anexo A (Informativo)
A1.
ACTIVIDAD DE LA VITAMINA A
A2.
vitamina A acetato
vitamina A propionato
vitamina A palmitato
w=
Am . V . d
100 m
Donde:
Am
NTC 5031
15
NTC 5031
Anexo B (Informativo)
Otras normas internacionales sobre el mismo tema
Organismo
Nmero norma
Tema
internacional
INTERNATIONAL DIARY IDF
Standard Leche
en
polvo
FEDERATION, IDF
142: 1990
descremada.
Determinacin
del
contenido de vitamina A
Official
Methods
of AOAC 992.04
Leche y frmula infantil
Analysis of AOAC, 17 th Vitamina A
a base de leche
Edition 2000
(Retinol Isomers)
in Milk and MilkBased
Infant Formula
16
Principio
Norma ISO
relacionada
ISO 12080-1
Mtodo
colorimtrico
Mtodo
cromatografa
lquida
de