Aumento de la produccin de inosina y guanosina por

medio de la ingeniera metablica de la va de las

purinas en Ashbya gossypii
Los nucletidos de purina son de inters econmico significativo para la
industria de la biotecnologa aplicada porque son utilizados como
aditivos alimenticios porque contienen saborizantes,
propiedades
nutricionales y farmacuticas. El monofosfato de Inosina (IMP) y el
monofosfato de guanosina (GMP) tienen capacidades como
potenciadores del sabor que, en combinacin con glutamato
monosdico, aumentan el sabor umami sinrgicamente. Adems, tanto
la inosina y guanosina tienen efectos beneficiosos para la salud, en
relacin con sus propiedades antioxidantes, neuroprotectoras,
cardiotnicas e inmunomoduladoras.
Actualmente, los nucletidos de purina se obtienen a nivel industrial
principalmente por fermentacin microbiana, ya sea por la extraccin de
RNA y posterior descomposicin en los nucletidos libres o por la mejora
de la biosntesis metablica, seguido de la excrecin de los nuclesidos
en el medio de cultivo, y ms adelante fosforilacin qumica o
enzimtica. En los ltimos aos, la mejora significativa de la produccin
de nuclesidos a travs de enfoques de ingeniera metablica en
diferentes microorganismos ha demostrado que este proceso tiene la
produccin ms eficiente.
La mayora de los microorganismos sintetizan los nucletidos de purina
en dos vas distintas. En primer lugar, las purinas se sintetizan por la va
de novo, a partir de materiales de partida simples, tales como
aminocidos y bicarbonato. Alternativamente, las bases de purina,
pueden ser liberadas por la degradacin hidroltica de cidos nucleicos y
nucletidos o tomadas del medio de cultivo, pueden ser recicladas
despus de la ruta de recuperacin.
En la va de novo de purina, una molcula de ribosa 5-fosfato se
convierte primero a travs de diez reacciones secuenciales catalticas en
IMP y es el primer compuesto en la va que tiene un sistema de anillo de
purina completamente formado. El IMP a continuacin puede ser
convertido en ya sea AMP o GMP a travs de las acciones de enzimas
especficas. Adems, a travs de la accin de nucleotidasas, los
nuclesidos pueden ser degradados en nuclesidos que son o bien

secretados al medio de cultivo o ms tarde en nucleobases que pueden

entrar en la ruta de recuperacin
Ashbya gossypii es un hongo filamentoso considerado ser un paradigma
de la ambientalmente amigable "Biotecnologa Blanca" y es
probablemente el ejemplo ms representativo que ilustra la importancia
de la ingeniera metablica microbiana para sustituir la sntesis qumica
mediante una produccin microbiana mucho ms conveniente. Contrario
a lo que sola ser el caso hace varias dcadas, por lo que en la
actualidad la mayor parte de la produccin de riboflavina del mundo se
basa en la fermentacin de A. gossypii. Adems, este tiene uno de los
genomas ms pequeos de eucariotas en vida libre y un alto grado de
similitud en el orden de genes de conservacin con el genoma de la
levadura ampliamente estudiada Saccharomyces cerevisiae. La
existencia de mtodos de manipulacin gentica ms eficientes que
permite la generacin de cepas estables y una amplia variedad de
herramientas moleculares significan que A. gossypii es un organismo
eucaritico unicelular ideal que se adapta muy bien para la
manipulacin gentica y la ingeniera metablica. En trminos de
idoneidad industrial, se ha encontrado que A. gossypii puede escalarse
fcilmente para metabolitos de produccin a gran escala.
Los procesos downstream en A. gossypii son ms baratos que en varias
levaduras y bacterias debido a que este organismo sufre una autolisis a
baja temperatura y los micelios pueden ser removidos por simple
filtracin. Por otra parte, A. gossypii es capaz de utilizar los productos de
desecho no muy caros de otros procesos industriales como la nica
fuente de carbono. Curiosamente, el hecho de que A. gossypii es un
sobre-productor natural de riboflavina, denota un flujo metablico fuerte
a travs de la va de purina (dado que es el GTP el precursor limitante de
riboflavina) que podra ser redirigido a acumular nucletidos y
nuclesidos finales.
El objetivo se centr en generar cepas que tengan un mayor nivel de
produccin de nuclesidos de inters potencial para la industria
biotecnolgica de alimentos.
Se demostr que A. gossypii de tipo salvaje excreta altos niveles de
nuclesidos de guanosina e inosina al medio de cultivo, mientras que
sus respectivas concentraciones intracelulares siguen siendo menores.
Adems, despus de la manipulacin de los genes que codifican para las
enzimas en la va de purinas de novo, se generaron cepas con 27 veces

un mayor concentracin de inosina excretada que en el medio de tipo

silvestre, demostrando que A. gossypii es un candidato eucariota
prometedor para la produccin industrial de nuclesidos.
Los nuclesidos de inosina y guanosina son excretados al medio de
crecimiento de A. gossypii. Por tanto crearon un modelo metablico a
escala del genoma de A. gossypii y fue utilizado para investigar la
transicin desde la fase inicial de crecimiento hasta la ltima fase de
produccin de riboflavina.
Todas las cepas de tipo salvaje probadas excretaron cantidades en mg/L
de nuclesidos al medio de cultivo y estos fueron exclusivamente de
inosina y guanosina. Basndose, en estos resultados, se decidi utilizar
A4 (ATCC 10895) como la cepa original para modificaciones posteriores
debido a que: i) es la cepa que en la que se excretan los niveles ms
altos de nuclesidos para el medio y ii) es la mejor cepa de tipo salvaje
caracterizado de A. gossypii.
Un anlisis de la evolucin temporal de la cepa A4 revel un mximo en
la excrecin de nuclesidos en el 5 da, que rpidamente cay
alrededor del 7 da de cultivo. Esto sugiere que los nuclesidos
excretados durante las etapas iniciales de crecimiento pueden ser
incorporados de nuevo a la clula, y luego reciclados a los nucletidos a
travs de la va de recuperacin, para apoyar la sntesis de riboflavina
fuertemente activa que se produce durante las ltimas etapas de
crecimiento.
Con el fin de determinar las enzimas que intervienen en la produccin de
nuclesidos, se utiliz un modelo metablico computacional a escala
del genoma para simular situaciones con tres diferentes funciones
objetivas; es decir, para optimizar la produccin de sntesis de biomasa,
inosina o guanosina. Un total de 303 reacciones estn involucradas en la
produccin de biomasa, mientras que slo 76 y 78, respectivamente, se
predice para maximizar la produccin de inosina y de guanosina.
Como primera aproximacin, se probaron los niveles de excrecin de
nuclesidos de una cepa diseada por ingeniera (I0) en la cual el flujo
metablico a travs de la va de purina se haba aumentado
sobrepasando la represin transcripcional de adenina mediada del gen
ADE4 mediante la eliminacin de la inhibicin por retroalimentacin
ATP/GTP de la enzima que la codifica, PRPP amidotransferasa.

De hecho, el aumento de los niveles de produccin de nuclesidos

provocados por la desregulacin de esta enzima tambin se ha
informado en E. coli, C. glutamicum y B. subtilis. Por ello, se utiliz esta
cepa (I0) como el punto de partida para modificaciones genticas
posteriores. I0 excreta inosina y guanosina en niveles similares a A4, lo
que indica que la mayor parte del exceso de flujo metablico a travs de
la va de purina se refiere a riboflavina.
Con la va de purina mejorada en la cepa de I0, posteriormente
intentaron elevar an ms el flujo a travs de la va de guanina en
disminucin de la va de adenina. Para lograr esto, se agot el gen que
codifica para ADE12 adenilosuccinato sintasa, la primera enzima de la
va de nucletidos de adenina despus de que el punto de ramificacin
entre las vas GMP y AMP. La cepa resultante (I1) result auxotrfica
para adenina, pero fue capaz de crecer a tasas normales en medio rico y
se excreta aproximadamente 13 veces ms inosina y guanosina 1,2
veces mayor que A4.
Por ltimo, se gener I5, una cepa en el que el gen que codifica la
enzima ISN1 especfica para IMP 5'-nucleotidasa se sobre-expresa con el
fin de mejorar la produccin de nuclesidos de la respectiva de
nucletidos. Sin embargo, no mostr ningn aumento significativo en la
excrecin de nuclesidos, lo que indica que el gen ISN1 no limita la
produccin de nuclesidos en A. gossypii.
Posteriormente se introdujeron las tres modificaciones que ms
aumentaron los niveles de nuclesidos en el medio de cultivo en I0, es
decir ADE12, IMD3 y PNP1, para generar la cepa I6.
I6 mostr los mejores concentraciones de produccin por peso de clulas
secas (85 y 3 veces ms inosina y guanosina que A4, respectivamente).
De hecho, cuando hipoxantina, guanina y adenina se aadieron al medio
de cultivo, I6 casi recuper tasas de crecimiento como las de tipo salvaje
y se excretaron altas cantidades de nuclesidos; a pesar de ello, estas
cantidades eran todava por debajo de aquellos observados para I4
En suma, mediante el uso de un enfoque de ingeniera metablica
clsica que dirige la biosntesis de nucletidos de purina se obtuvieron
cepas de A. gossypii en el que la excrecin de inosina al medio de
cultivo se mejor significativamente, y el aumento fue de 25 veces con
respecto a la cepa A4 de tipo salvaje. Las modificaciones ms favorables
incluyen la sobreexpresin de un gen mutante ADE4 desregulado y la

supresin de ADE12 ms ya sea IMD3 (I2) o PNP1 (I4). Las

combinaciones
de
las
cuatro
mutaciones
proporcionaron
simultneamente cepas con la viabilidad celular comprometida, y por lo
tanto no eran tiles para su uso industrial.
El aumento del flujo metablico a travs de la va de nucletidos de
purina de novo se dirige sobre todo a la excrecin inosina en las cepas
mutantes. Adems, se determinaron los niveles intracelulares de los
nucletidos, nuclesidos y nucleobases que participan en la va
biosinttica de purinas de A4, I1, I2 e I4, ya que estos son los de tipo
salvaje y las cepas con mayor potencial biotecnolgico.
Por lo tanto, la concentracin de inosina en el medio de cultivo de las
fermentaciones en matraz de A. gossypii es proporcional al flujo
metablico a travs de la va de purina, que representa una regulacin
estricta en este nivel o una baja eficiencia de la enzima GMP sintasa.
Para superar esto, se utiliz I1 como la cepa original para construir I7, en
la que el gen que codifica la enzima GUA1 GMP sintasa se sobre-expresa
colocndolo bajo el control del promotor constitutivo fuerte de GPD. Sin
embargo, I7 no mostr mayores niveles de guanosina excretada, pero en
su lugar aumenta la produccin de riboflavina lo que indica que la mayor
parte del flujo metablico en exceso a travs de la va de nucletidos de
guanina fue dirigido ms all de GMP / GTP a la sntesis de riboflavina.
Por lo tanto decidieron regular por disminucin la sntesis de riboflavina
colocando el gen RIB1 (que cataliza la primera y uno de los pasos
limitantes de la biosntesis de riboflavina) bajo el control del promotor de
RIB7, generando la cepa I8.
Los datos mostraron que el exceso de flujo metablico a travs de la va
de las purinas en A. gossypii es principalmente derivado de producir ya
sea riboflavina (en la fase de crecimiento tarda) o de inosina (en la fase
de crecimiento a medio temprana), la excrecin de inosina podra actuar
como un mecanismo para evitar un desbordamiento a travs de la va
de nucletidos de guanina que alterara la piscina de nucletidos de
guanina y comprometer la viabilidad celular.
Finalmente se lograron crear cepas de A. gossypii con una mejora en los
niveles de excrecin de inosina hasta 0,27 g / L en un medio de cultivo
que contiene 20 g / l de glucosa.
A. gossypii presenta varias ventajas con respecto a los sistemas
bacterianos que se utilizan actualmente en la industria: la conveniencia

de los procesos de filtracin / centrifugacin para separar la biomasa del

medio de cultivo debido al tamao mucho mayor de los micelios con
respecto a las clulas bacterianas, A. gossypii apenas excreta cualquier
subproducto fermentativo extracelular; en consecuencia, el medio
enriquecido con nuclesidos podra separarse fcilmente del micelio por
procedimientos de centrifugacin o filtracin simples y no costosos, lo
que facilita el procesamiento posterior en un grado considerable y la
disponibilidad de los protocolos para la fermentacin a gran escala ya
implementado para la produccin de riboflavina.