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DETERMINACION DE CLOROFILA
INTRODUCCIN
La fotosntesis es un proceso de suma importancia para la biosfera porque convierte la
energa de la radiacin solar en energa qumica que puede ser usada por todas las
formas de vida. La fotosntesis comprende dos reacciones globales diferenciadas. En la
primera se realiza la transduccin de energa, y en la segunda la reduccin y fijacin del
carbono. Los pigmentos fotosintticos son los nicos que tienen la capacidad de
absorber la energa de la luz solar y hacerla disponible para el aparato fotosinttico. Los
cloroplastos de las plantas superiores contienen siempre varios pigmentos, clorofila a,
clorofila b, algunas xantofilas y carotinas. Todos estos pigmentos son insolubles en agua,
pero se disuelven fcilmente en algunos solventes orgnicos. Adems de las clorofilas y
carotenoides, muchas plantas poseen otros pigmentos, tales como antocianos,
flavonoles, etc.
Los Pigmentos biolgicos, tambin conocidos como pigmentos o biocromos son
sustancias producidas por microorganismos que tienen un color resultante de la
absorcin selectiva de la luz. Los pigmentos biolgicos incluyen pigmentos vegetales y
animales. Muchas estructuras biolgicas, como la piel, ojos, plumas y cabello contienen
pigmentos como la melanina en las clulas especializadas llamadas cromatforos.
Los colores pigmentarios difieren del color estructural ya que los primeros son los
mismos indistintamente del ngulo de visin mientras que el color estructural es el
resultado de la reflexin selectiva de la luz o iridiscencia.
PIGMENTOS EN PLANTAS
La funcin principal de los pigmentos en las plantas es la fotosntesis, que utiliza la
clorofila, pigmento verde junto con varios pigmentos rojos y amarillos los que ayudan a
captar la mayor cantidad de energa de luz como sea posible. Otras funciones de los
pigmentos en las plantas incluyen la atraccin de los insectos a las flores que fomentan
la polinizacin. Los pigmentos vegetales incluyen una variedad de diferentes tipos de
molculas, incluyendo porfirinas, carotenoides, antocianinas y betalanas. Todos los
pigmentos biolgicos absorben selectivamente ciertas longitudes de onda de la luz
mientras que reflejan otras. La luz que es absorbida puede ser utilizada por la planta

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para alimentar las reacciones qumicas, mientras que las longitudes de onda reflejadas
de la luz determinan el color del pigmento que aparecer a la vista.
LOS PRINCIPALES PIGMENTOS SON:
La clorofila es el pigmento principal en las plantas; es una clorina que absorbe
longitudes de onda amarillas y azules de la luz mientras que refleja verde. Es la
presencia y abundancia relativa de clorofila la que da a las plantas su color verde.
Todas las plantas terrestres y las algas verdes poseen dos formas de este
pigmento: clorofila a y la clorofila b. Laminarias, diatomeas, y otros organismos
fotosintticos contienen clorofila c en lugar de b, mientras que las algas rojas slo
poseen clorofila a. Todas las clorofilas sirven como medio principal que las
plantas utilizan para interceptar la luz con el fin de impulsar la fotosntesis.
Los carotenoides son de color rojo, naranja o amarillo.
Las antocianinas (literalmente

"flor

azul")

son

pigmentos

flavonoides

hidrosolubles que aparecen de color rojo a azul, de acuerdo con el pH.

Disponible.
Las betalanas son pigmentos rojos o amarillos.

METODOS PARA DETERMINAR CLOROFILA

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DETERMINACIN CUANTITATIVA DE LAS CLOROFILAS

INTRODUCCION
La fotosntesis, consiste en la reduccin de C02 atmosfrico por medio de los protones
del agua obtenidos con la energa proveniente del sol. As la planta almacena energa
electromagntica como energa potencial en los compuestos orgnicos.
Los compuestos carbonados ricos en energa, obtenidos de esta manera, son usados
despus como fuente de energa por la propia planta y por otros organismos que son
incapaces de fabricar sus propios alimentos, pero que si pueden aprovechar
la materia vegetal.
El organismo vegetal ha desarrollado un sistema para capturar un fotn de luz y utilizar
la energa para elevar el nivel energtico de un electrn determinado que
posteriormente regresa a su nivel basal; cuando esto sucede, el exceso de energa es
liberada en diferentes formas.
Los organismos fotosintticos atrapan la luz solar formando ATP y NADH, que utilizan
como fuente de energa para formar lcidos y otros componentes orgnicos a partir de
bixido de carbono y agua de forma simultnea liberan oxigeno molecular. El bixido de
carbono formado en la respiracin de los hetertrofos regresa a la atmsfera para volver
a ser utilizado por los organismos fotosintticos. De este modo la energa solar
proporciona la fuerza motriz para la circulacin continua del bixido de carbono y
oxigeno molecular atmosfricos a travs de la biosfera y proporciona los substratos
reducidos (combustible).
La evolucin de la vida vegetal ha logrado a travs de mecanismos bioqumicos, desviar
del retorno del electrn a su nivel primitivo y utilizar el exceso de energa para
sintetizar carbohidratos. Las plantas superiores contienen tambin un complemento de
enzima,

semejante

los

de

la

levadura,

que

son

capaces

de

convertir

la glucosa en alcohol etlico y bixido de carbono. Esta conversin, se produce cuando

las plantas estn privadas de oxgeno.

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Permanecen vivas durante periodos variables de tiempo que dependen del tipo de
planta, el grado de crecimiento. Etc.
En estas condiciones invariablemente producen bixido de carbono y forma alcohol
etlico en sus tejidos. Un gran nmero de productos intermedios o fragmentos
carbohidratos se producen en el proceso principal de oxidacin (respiracin aerbica)
de

la

glucosa

bixido

de

carbono

agua,

en

el

proceso

alternativo, fermentacin alcohlica (respiracin anaerobia).

La capacidad de capturar el fotn y convertir en la energa luminosa en
energa qumica es propiedad exclusiva de las plantas verdes.
Las substancias que absorben la energa radiante, que incide en la planta, es la clorofila.
Una molcula de clorofila se compone de una cabeza y una cola. La cabeza contiene
cuatro anillos de carbono nitrgeno unidos formando un anillo mayor en el centro de
este

anillo

hay

un tomo de

magnesio

tiene

un

pigmento color verde

con estructuras policiclicas planas. La cola es una cadena de carbonos enlazados unidos
a la cabeza.
En todos los casos la fotosntesis est asociada con corpsculos verdes aislados,
llamados cloroplastos, que estn suspendidos en el citoplasma de la clula. Es posible
romper la clula de la hoja en varias fracciones triturndolas con una solucin
amortiguadora.
Este tratamiento rompe los cloroplastos en fragmentos ms pequeos llamados grana.
Se recuperan tres fracciones principales: A) el citoplasma, una solucin transparente de
color caf rojizo, B)los grana slidos (verde) y C)las paredes celulares mezcladas
con clulas integras.

Los granas, que son todava capaces de llevar a cabo la fotosntesis contienen, referido al
residuo seco aproximadamente, el 40% de protenas, 35% de lpidos, el 7%
de minerales y el 5% de pigmento verde llamado clorofila. Esta molcula de pigmento se
encuentra incluida en la unidad estructural fotosinttica llamada cuantosoma que

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corresponde a una parte del tilacoide. Los pigmentos ms importantes que

absorben luz en las membranas de los tilacoides son las clorotila.
Adems en el cloroplasto de las plantas superiores, hay otros grupos de pigmentos que
son los carotenoides y de las xanttilas. La clorofila a es de color verde debido a que
absorbe preferentemente la luz roja y azul y transmite la verde. Y se distingue de la
clorofila B ya que esta tiene un grupo CH3.
OBJETIVO
Calcular la cantidad de clorofila que se encuentra en una determinada porcin de
extracto por una determinacin cuantitativa.
MATERIALES
1 Mortero
1 Embudo de Buchner
1 Matraz de filtracin
1 Matraz aforado de 50 mil
Probeta de 100 ml
Vaso de precipitados de 200ml.
Tubos de ensayo
1 Pipeta de 5ml.
1 Embudo
Pipeta Pasteur, mechero, tripie y rejilla
Espectrofotmetro y celdas
2 Discos de papel filtro
Gradilla
1 gr de hojas frescas de espinacas.
Arena
REACTIVOS
Acetona al 80% (v/v)
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METODOLOGIA
1.- Coloque en el mortero 1 g de hojas de espinacas, sin las venas grandes, cortadas en
pequeos tamaos.
2.-Agregue arena y 4 ml de acetona al mortero, para moler el tejido y obtener una pasta
fina. Adicione 20ml ms de acetona.
3.-Transfiera cuidadosamente el extracto resultante al embudo de Buchner provisto de
papel filtro, y filtre al vaco.
4.- Agregue otros 50ml de acetona a la pulpa de las hojas y reanude la molienda y el
filtrado. Este segundo extracto agrguelo al primero. El tejido debe de quedar sin
clorofila, de lo contrario repita el proceso con otros 20ml de acetona y rena todos los
filtrados.
5.- Lave el mortero y el embudo con 50ml de acetona que se incorporara al filtrado. En
todo el proceso no debe de usar ms de 100ml de acetona se aconseja aforar a 50ml en
un matraz.
6.- Lea la densidad ptica (D) a 645. 652.663 nm del extracto. Usando como blanco el
acetona. Anota las densidades medidas.
DISCUSIN

La fotosntesis es un proceso que transforma en carbono orgnico el gas carbnico

tomado del aire o disuelto en el agua. En el proceso interviene un pigmento,
la clorofila, que es una sustancia capaz de absorber las radiaciones luminosas. Esta
captacin de energa luminosa se realiza en una primera etapa en la fotosntesis, en la
cual se produce energa qumica en forma de molculas de adenosintrifosfato (ATP) y se
desprende oxgeno, que produce de la escisin de una molcula de agua. En una
segunda etapa, que se denomina fase obscura porque puede tener lugar en ausencia de
luz, el dixido de carbono se combina con una pentosa para formar glucosa a travs de
una serie de reacciones qumicas. La clorofila absorbe sobre todo la luz roja, violeta y
azul, y refleja la verde.
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La luz roja es la de mayor eficacia para la fotosntesis, ya que el espectro de absorcin de

la clorofila es ms amplio en la zona del rojo. En cambio la luz verde carece
de accin sobre este proceso.
Lo anterior nos explica porque cuando llevbamos la solucin de clorofila a la luz del sol
esta cambiaba a un color rojo.
Cabe mencionar que no todas las soluciones obtenidas en la prctica por los dems
equipos tenan la misma tonalidad de verde, esto es porque no todas las hojas de
espinacas tenan la misma frescura, esto es que entre ms frescas se encuentren las
hojas mayor contenido de clorofila.

CONCLUSIN

Sabemos que la clorofila es un factor importante en la fotosntesis y que es capaz de

absorber la energa luminosa y gracias a ello puede promover la serie de reacciones que
conducen al almacenamiento de dicha energa en un compuesto de alto poder calrico.
La luz roja es la de mayor eficacia para la fotosntesis, ya que el espectro de absorcin de
la clorofila es ms amplio en la zona del rojo. En cambio la luz verde carece de
activacin sobre este proceso.

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EFECTO TIEMPOS Y PROCESOS DE COCCIN EN EL CONTENIDO DE

CLOROFILA DE VARIOS VEGETALES
INTRODUCCION
El propsito del presente trabajo, fue evaluar la posible prdida de este pigmento
presente naturalmente el los vegetales de hoja verde por efecto de diferentes tiempos y
procesos de coccin mediante la tcnica colorimtrica de Goodwin. Los resultados
mostraron que el mayor contenido de clorofila total as como el de sus componentes y
se presenta en la espinaca al registrarse valores de 62.78, 49.68 y 20.83 mg/g
respectivamente. El salteado fue el proceso de coccin que mejor conserva el contenido
de clorofila en los vegetales de hoja verde. Combinando tiempos y procesos, los valores
de clorofila total ms altos se presentaron en espinaca procesada al vapor.
MATERIALES
Se adquirieron muestras de acelga, espinaca, verdolaga y berro directamente del sper
mercado, se separ la lmina foliar libre de nervaduras de cada vegetal y se sometieron a
los diferentes procesos y tiempo de coccin.
METODO
1.- Cuantificacin de clorofila , y total acelgas, espinacas, verdolagas y
berros, cocinados a vapor a 1,3 y 5 minutos.
Se tom una muestra de material vegetal fresco.
Se cocin a vapor a 100 C durante 1, 3 y 5 minutos para cada tratamiento
respectivamente, utilizando una estufa con control de temperatura.
Al finalizar el tiempo establecido se pasaron inmediatamente a un bao con agua
helada por 30 segundos para cortar la coccin.
Se colocaron sobre papel secante para eliminar el exceso de lquido.
Se determinaron clorofila , y total.

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2.- Anlisis del contenido de clorofila , y total acelgas, espinacas,

verdolagas y berros, cocinados mediante salteado a 1,3 y 5 minutos.
Se tom una muestra de material vegetal fresco.
Se cocin mediante salteado en una plancha elctrica con control de temperatura,
durante 1, 3 y 5 minutos a 200 C para cada tratamiento respectivamente.
Al finalizar el tiempo establecido se pasaron inmediatamente a un bao en agua
helada por 30 segundos para cortar la coccin.
Se colocaron sobre papel secante para eliminar el exceso de agua.
Se determin clorofila , y total.
3.- Determinacin de la cantidad de clorofila , y total en acelgas,
espinacas, verdolagas y berros, cocidos mediante el hervido a 1,3 y 5
minutos.
Se tom una muestra de material vegetal fresco.
Se cocin en agua hirviendo durante 1, 3 y 5 minutos para cada tratamiento
respectivamente.
Al finalizar el tiempo establecido se pasaron inmediatamente a un bao con agua
helada por 30 segundos para cortar la coccin.
Se colocaron sobre papel secante para eliminar el exceso de lquido.
Se determinaron clorofila , y total.
4.- Determinacin del contenido de clorofila , y total en acelgas,
espinacas, berros, y verdolagas mediante la tcnica de Goodwin.
Se pes por triplicado 0.5 g de cada una de las muestras sometidas a los
diferentes procesos de coccin y se maceraron en una solucin de acetona-agua al
80% v/v.
El extracto obtenido se pas a travs de un embudo buchner con papel filtro
Whatman No. 1.
El filtrado se aforo a 10 mL con la misma solucin.
Se ley absorbancia en un espectrofotmetro SEQUOIA-TURNER 690 a una
longitud de onda de 648 y 663 nm.

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La cuantificacin de clorofila , y total se realiz de acuerdo a las siguientes

ecuaciones.

mg/g peso fresco de CLOROFILA TOTAL = (20.2) (A 648) + (8.02) (A

663)
mg/g peso fresco de CLOROFILA = (12.7) (A 663) + (2.69) (A 648)
mg/g peso fresco de CLOROFILA = (22.9) (A 648) - (4.68) (A 663)
A= Absorbancia a 648 y 663 nm segn corresponda.
RESULTADOS Y DISCUSIN
La comparacin mltiple de medias entre las muestras y los diferentes procesos
aplicados nos demuestra que los valores de clorofila total ms altos se presentan en
espinaca procesada al vapor registrando 67.58 mg/g cifra que es estadsticamente
diferente a la obtenida con los otros procesos. Por el contrario en berro y verdolaga el
valor ms alto se present con el proceso de salteado obtenindose 62.62 mg/g y 28.89
mg/g respectivamente, siendo estos contenidos diferentes estadsticamente a los valores
obtenidos en vapor y hervido, un estudio de las prdidas de clorofila durante el
escaldado y el secado de okra realizado por Shivhare et al. (2000), report que el
mtodo de escaldado influye ms que la temperatura de secado en la misma. Asimismo,
Schmalko y Alzamora (2001) estudiaron la prdida de color y clorofilas en el
procesamiento industrial de hojas de yerba mate encontrando que el 80% de la prdida
de las clorofilas tena lugar en el hervido, mientras que con coccin seca se tena una
prdida menor (10%). El calor hmedo hace que la clorofila se pierda mayormente que
el calor seco, figura 1.

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La comparacin de medias para cada una de las muestras en relacin al tiempo de

aplicacin de los diferentes procesos nos demuestra que en acelga y verdolaga el mayor
contenido de clorofila se presenta en el control con 67.60 mg/g y 23.88 mg/g cifras
estadsticamente diferentes a las obtenidas en el resto de los tiempos. Por el contrario en
espinaca y berro la mayor cantidad de clorofila se presenta a los 5 minutos con 67.19
mg/g en espinaca y 60.26 en berro; lo cual concuerda con el estudio realizado por
Ahmed et al., (2002), en el cual concluye que el color de las espinacas, hoja de mostaza y
el pur de ambas hojas, definitivamente se fue degradando durante el proceso trmico,
siendo mayormente afectado el pur. El comportamiento general de estos resultados se
presenta en la Figura 2.

En la tabla 1 se presentan los resultados obtenidos al analizar la interaccin de procesos

y tiempos para cada una de las muestras. De acuerdo a estos tenemos que existen
diferencias estadsticamente significativas con la formacin de al menos dos grupos
estadsticamente diferentes para cada conjunto de datos. En acelga con el proceso de
vapor se forman dos grupos estadsticamente diferentes siendo con el control el valor
mas alto (76.53 mg/g) y es el que marca estas diferencias; con el proceso de hervido se
presentan tres grupos estadsticamente por un lado el control con 77.86 mg/g y por otra
parte los tratamientos de 3 y 5 minutos con 50.04 mg/g y 38.64 mg/g respectivamente.
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CONCLUSIONES
En conclusin, el mayor contenido de clorofila total as como el de sus componentes y
se presenta en la espinaca al registrarse valores de 62.78, 49.68 y 20.83 mg/g
respectivamente. El salteado fue el proceso de coccin que mejor conserva el contenido
de clorofila en los vegetales de hoja verde. El tratamiento de 5 minutos de coccin,
mantuvo la mxima concentracin de clorofila, siendo ligeramente menor a la cantidad
obtenida en el control. Combinando tiempos y procesos, los valores de clorofila total
ms altos se presentaron en espinaca procesada al vapor.

BIBLIOGRAFA
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TCNICAS ANALTICAS BSICAS EN FISIOLOGA VEGETAL

DETERMINACIN DE PIGMENTOS FOTOSINTTICOS

La fotosntesis, proceso que permite a los vegetales obtener la materia y la energa que
necesitan para desarrollar sus funciones vitales, se lleva a cabo gracias a la presencia en
las hojas y en los tallos jvenes de pigmentos, capaces de captar la energa lumnica.
Entre los distintos mtodos que existen para separar y obtener esos pigmentos se
encuentra el de la cromatografa, que es una tcnica que permite la separacin de las
sustancias de una mezcla y que tienen una afinidad diferente por el disolvente en que se
encuentran. De tal manera que al introducir una tira de papel en esa mezcla el
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disolvente arrastra con distinta velocidad a los pigmentos segn la solubilidad que
tengan y los separa, permitiendo identificarlos perfectamente segn su color.

PIGMENTO
Clorofila A
Clorofila B
Carotenos
Xantofilas

COLOR
Verde azulado
Verde amarillento
Naranja
Amarillo

La tcnica que se describe a continuacin se puede realizar sin ningn problema.

MATERIALES

Hojas de espinaca o de cualquier planta cortadas en porciones.

Alcohol de 96 (sirve el que utilizamos para desinfectar las heridas)
Un mortero
Dos filtros de caf
Un embudo
Un vaso
Una pinza de la ropa

PROCEDIMIENTO
Se coloca en el mortero las hojas que se hayan elegido, se aade un poco de
alcohol y se trituran hasta que el alcohol adquiera un tinte verde intenso.
Se filtra el lquido utilizando el embudo en el que se ha puesto el filtro de caf.
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Se recortan unas tiras de papel del otro filtro y se introducen en el vaso hasta que
toquen su fondo procurando que se mantengan verticales con la ayuda de la pinza
Se esperan 30 minutos y aparecern en la parte superior de la tira de papel unas
bandas de colores que sealan a los distintos pigmentos.
OTROS MTODOS
MEDIDA DE PIGMENTOS FOTOSINTTICOS EN DUNANIELLA VIRIDIS
Extraccin de acetona a partir de precipitados y medida espectrofotomtrica.
Materiales:
Espectrofotmetro
Centrfuga de mesa
Tubos
Acetona

MTODO DE EXTRACCIN Y MEDIDA

1. Tomar 5ml de muestra y centrifugar durante 5min
2. Guardar sobrenadante para medir fosfato con mtodo verde malaquita
3. Resuspender el precipitado en 4ml de acetona para extraer pigmentos
4. Mezclar y enrasar a 5ml con H2O destilada
5. Centrifugar 1min
6. Medir la absorbancia del sobrenadante resultante
7. Posibles resultados:
-750nm turbidez
-664nm mximo de absorcin de la clorofila A
8. Clculos:
-para clorofila A: multiplicar resultados por factor de 10,3 (mg /ml)
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MTODO DE LICHTENTHALER Y WELBURN (1983)

MATERIALES

1gr de hojas
ter dietilico
Crisoles
Kitasato
Espectrofotmetro Perkin Elmer 550 SE de doble haz
Placas Petri
Embudo
Matraz

PROCEDIMIENTO
1. En un mortero se homogeniza 1 gr de hojas con ter dietlico en fro.
2. El homogeneizado obtenido se filtra a travs de un crisol con placa filtrante n 3
(Pobel), acoplado, mediante una junta de goma, a un embudo con filtro de vidrio
poroso n 3 (Pobel).
3. El conjunto va encajado a su vez, en un kitasato con un tubo de ensayo sumergido
en hielo, donde se recogi el filtrado.
4. Sobre la placa del primer crisol se coloc una capa de celulosa nativa en polvo de
1 cm de espesor, para eliminar el agua del extracto.
5. A este sistema se le conecta una corriente de nitrgeno que se adapta mediante
un embudo invertido a la boca del crisol.
6. En el interior del kitasato se realiza vaco para acelerar la filtracin y evaporar el
disolvente, con lo que se arrastra el nitrgeno y se crea una atmsfera inerte que
evita la oxidacin de los pigmentos.
7. El homogeneizado se lava con ter dietlico hasta que ste sale incoloro y,
finalmente, se enrasa a un volumen de 25 ml. Durante todo el proceso la muestra
se mantuvo en penumbra y sumergida en hielo, para evitar la destruccin de los
pigmentos fotosintticos.
A continuacin se midi la absorbancia de la muestra a 600, 644 y 662 nm en un
espectrofotmetro Perkin Elmer 550 SE de doble haz. El contenido en clorofilas se
determin segn las frmulas:
Cl

a: 10, 5 x Abs (662) 0,166x Abs (644)

Cl

b: 16, 37 x Abs (644) 3, 14 x Abs (662)

Cl

total: 100,5 x Abs (600)

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Los resultados se expresan en mg de clorofila /gr

COMPARACIN DE LA ESTIMACIN DE LA CLOROFILA-a MEDIANTE

LOS MTODOS ESPECTROFOTOMTRICO Y FLUOROMTRICO
RESUMEN
En cuatro ecosistemas acuticos de montaa del altiplano Cundiboyacense, Colom- bia,
se compararon mediante un anlisis de regresin los datos de clorofila-a obteni- dos a
partir de los mtodos espectrofotomtrico (frmula tricromtica) y fluoromtri- co
(mtodo de Welschmeyer). El anlisis demostr que el mtodo espectrofotomtrico
sobreestim la concentracin de clorofila-a, pero se puede utilizar con precaucin en
ambientes de baja trofia. Se hall una ecuacin que permite relacionar las medidas de
clorofila-a obtenidas con las dos metodologas.
MATERIALES Y MTODOS
Las muestras se tomaron en el lago Guatavita, Colombia, (L. Guatavita), y en tres humedales del altiplano Cundiboyacense, Colombia, (H. Llano Grande, H. Briceo y H. Siberia), durante campaas realizadas entre abril y agosto de 2003 (Tabla 1). El lago de
Guatavita est ubicado en el municipio de Sesquil, presenta un dimetro de 400 m,
una profundidad mxima de 30 m, es monomctico, no tiene afluentes ni efluentes superficiales, y la cuenca hace parte de una pequea reserva forestal.

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Ubicacin geogrfica

L.
45850
N

H.
Llano
45928 N
740606 W

734743
Municipio

W
Sesquil

Tenjo

H.
44340

H.
45814

741140

735710

W
Briceo

W
Facatativ

Cond. (S cm-1)

9,7

23,9

170,6

658,6

O2 (mg l-1)

16%
6,2

11%
2,7

42%
1,4

53%
0,5

NH4 (mol l-1)

5,9

44,4

1471,9

2508,9

NT (mol l-1)

22,3

1747,2

7632,0

3883,0

PRS (mol l-1)

95%
1,1

166%
0,26

137%
15,4

73%
27,6

Cl. a (mg m-3)

10,6

8,1

151,6

132,2

Fluorometra

45%

144%

129%

148%

Cl. a (mg m-3)

12,8

9,9

376,1

363,3

Espectrofotometra

49%

151%

230%

280%

Tabla 1. Ubicacin geogrfica, valores promedio y coeficiente de variacin de las

variables fsicas, qumicas y de la clorofila-a de los ecosistemas acuticos estudiados.

NT: nitrgeno total; O2: oxgeno; NH4: amonio disuelto; PRS: fsforo reactivo
soluble; Cl: cloro.

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RESULTADOS
La Cl.a present un promedio de 30,1 mg m-3 con el mtodo fluoromtrico y 66,2 mg
m-3 con el mtodo espectrofotomtrico. De las 200 muestras incluidas en el anlisis,
el 76% presentaron registros ms altos con el mtodo espectrofotomtrico. Los valores
obtenidos con el mtodo fluoromtrico oscilaron entre 0,6 y 845,1 mg m-3 y con

el

mtodo espectrofotomtrico entre 0,9 y 4158,8 mg m-3. Los datos promedio de Cl.a
para cada ecosistema se presentan en la tabla 1. Al establecer la diferencia entre los
datos hallados por espectrofotometra y fluorometra, se observaron promedios de la
diferencia ms bajos para el H. Llano Grande (1,8 mg m-3) y la L. Guatavita (2,6 mg m3), mientras que en los otros humedales el promedio de la diferencia fue superior

40 mg m-3. El porcentaje de diferencia absoluta con respecto al mtodo fluoro- mtrico

fue de 66% en H. Siberia, 36% en H. Briceo, 27% en L. Guatavita y 22% en
H. Llano Grande. Al calcular el porcentaje del nmero de muestras cuya medicin de
clorofila por el mtodo espectrofotomtrico presenta un valor ms alto (sobreestimacin) o ms bajo (subestimacin) que el obtenido por el mtodo fluoromtrico, se
encontr que en el 100% de los datos espectrofotomtricos de H. Llano Grande sobrestimaron el valor de clorofila. En L. Guatavita y H. Briceo el porcentaje de sobreestimacin fue aproximadamente del 70%, mientras en H. Siberia el porcentaje de
sobreestimacin fue igual al de subestimacin (50%).
Los modelos de regresin lineal simple (con excepcin del modelo para H. Siberia),
presentaron relaciones significativas con r > 0,87 (Tabla 2). Los humedales Llano
Grande y Briceo presentaron el r ms alto y el valor ms bajo se obtuvo con los da- tos
de Guatavita. El modelo desarrollado con todos los datos present un r = 0,93 (Fig. 1).
Cuando se excluyeron los datos de H. Siberia la correlacin del modelo se increment (r
= 0,96) y la relacin de las dos variables se describi mediante la ecuacin:
arcoseno H (log10 Cl.aespectro.) = 0.1338 + 0.9192 x arcoseno H (log10 Cl.afluorom.)
(E.1)
La DS fue baja y no super 0,1 en los modelos significativos. El valor ms bajo se present en el grupo de datos de la L. Guatavita que no incluyeron las muestras del hipolimnio y en el modelo para el H. Llano Grande. El valor ms alto se present en el

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modelo que incluy los datos de todos los ecosistemas. La m de los modelos significativos oscil entre 0,63 y 1,04. Una m > 1 solo se present en el H. Briceo (Tabla
2). Tabla 2. Principales parmetros obtenidos en modelos de regresin lineal simple
realizados entre la clorofila-a estimada mediante los mtodos espectrofotomtrico y
fluoromtrico.

Grupo de

Coeficiente

Desviaci

Pendie

datos

de

nte (m)

incluidos

correlacin

estndar

(r)

(DS)

0,900*

0,052

0,750*

15

0,870*

0,042

0,630*

12
5,

0,020 n.s.

0,267

0,020 n.s.

14,7,

H. Briceo

0,980*

0,066

1,040*

14,
00

H. Llano Grande

0,990*

0,045

0,940*

00
13,

Todos

0,930*

0,097

0,870*

00
20

Todos sin H.

0,960*

0,059

0,910*

0,
18

L. Guatavita
Guatavita sin
H. hipolimnio
Siberia

Siberia

4,

El modelo realizado para establecer en qu concentraciones de nutrientes se cuantifican con mayor exactitud los valores de Cl.a estimados espectrofotomtricamente
present un r = 0,93 (n = 172; DS = 0,1; p < 0,0001). Al utilizar el procedimiento
grfico con los residuales del modelo y la concentracin de nutrientes (Fig. 2), se
estableci que la dispersin de los datos de Cl.a fue menor cuando el NH4

<

2000
mol L-1, el NT < 1400 mol L -1
como

y el PRS < 2,6 mol L -1. Es decir, en ambientes

la L. Guatavita y el H. Llano Grande, los residuales no superaron dos veces la

DS del modelo. Estas condiciones de nutrientes ocurrieron cuando la concentracin de

Cl.a fue generalmente < 60 mg m-3 (este criterio se cumple en todos los casos para el
H. Llano Grande y la L.

Guatavita).

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DISCUSIN

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La sobreestimacin de los valores de Cl.a por el mtodo espectrofotomtrico ha sido

ampliamente documentada en la literatura (Rowan, 1989). Los valores de sobreestimacin por la aplicacin de la frmula tricromtica presentaron diferentes amplitudes,
segn la concentracin de nutrientes del ecosistema. An as, no se puede descartar el
uso de este mtodo debido a que en los sistemas que tuvieron baja concentracin

de

nutrientes, la sobreestimacin fue en promedio del 27%. Este valor es bajo si se compara
con valores > 100% descritos por Sartory (1985). Los modelos de regresin mostraron
una tendencia a tener coeficientes de correlacin altos y desviaciones estndares bajas,
especialmente en sistemas acuticos con bajas concentraciones de nutrientes, como es el
caso del H. Llano Grande y de la L. Guatavita. El anlisis de los modelos de regresin
indic que la tendencia de los resultados espectrofotomtricos (independientemente de
la sobreestimacin) fue altamente coherente con los datos obtenidos por el mtodo
fluoromtrico para el H. Llano Grande, la L. Guatavita y el
H. Briceo. En concordancia con estos resultados, el anlisis de los residuales del
modelo y los valores de nutrientes seal que en el H. Llano Grande y la L. Guatavita la
estimacin de Cl.a fue ms adecuada. En H. Briceo algunas de las muestras presentaron valores de clorofila y nutrientes por encima del lmite establecido mediante el
anlisis de los residuales, por lo que la cuantificacin por medio del mtodo espectrofotomtrico estuvo posiblemente sesgada en algunos casos.
Los H. Siberia y Briceo presentaron una alta mineralizacin, elevadas concentraciones de nutrientes y bajas concentraciones de oxgeno debido a la acumulacin de
materia orgnica (inferido a partir de la concentracin de nutrientes y observaciones de
campo). En ambientes altamente enriquecidos y productivos como el de H. Sibe- ria, la
acumulacin y descomposicin de materia orgnica permite el aumento de algunos
pigmentos que pueden interferir con la cuantificacin de la Cl.a. Los feofor- bidos y
feofitinas son dos productos comunes de la degradacin de la Cl.a que, al igual que los
carotenoides,

podran

interferir

fuertemente

con

su

determinacin

es-

pectrofotomtrica (APHA, 1998). Estos pigmentos no fueron cuantificados en este

trabajo, y por esta razn solo es posible establecer que existe un factor asociado a la alta
concentracin de nutrientes que interfiere con el mtodo. Si bien otros com- ponentes
orgnicos e inorgnicos pueden ser tambin los causantes de interferir con el mtodo
espectrofotomtrico, el estudio de los pigmentos degradados merece espe- cial atencin

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en futuras investigaciones para establecer el papel de tales sustancias en las

determinaciones de la Cl.a.
En el caso de la L. Guatavita, la inclusin de los datos del hipolimnio en el modelo incrementaron la DS debido a la mayor dispersin de los datos; no obstante, tambin se
increment la correlacin entre los dos mtodos porque la amplitud en la estimacin de
la variable aument. Estos resultados sugieren que para L. Guatavita el mtodo espectrofotomtrico utilizado puede ser conveniente para describir los patrones verticales de
distribucin de la Cl.a, a pesar de los valores ms sesgados hallados en el hipolimnio.
CONCLUSIONES
Los coeficientes de correlacin obtenidos demostraron que los dos mtodos pre- sentan
una tendencia semejante con el tipo de muestras analizadas, y que el mtodo
espectrofotomtrico puede utilizarse con precaucin en ecosistemas acuticos con baja
concentracin de nutrientes. La pendiente de los modelos indica que en estos
ecosistemas el mtodo espectrofotomtrico sobreestima la clorofila con respecto al
mtodo fluoromtrico. Sin embargo, este mtodo es til para describir patrones espaciales y temporales, ante la dificultad de utilizar en forma rutinaria metodologas ms
exactas pero costosas. El mtodo espectrofotomtrico puede utilizarse en sistemas
acuticos con baja concentracin de nutrientes y con concentraciones de clorofila-a
inferiores a 60 mg m-3.
BIBLIOGRAFA
APHA, American Public Health Association, American Waterworks, Association
(AWWA), Water Pollution Control Federation (WPCF). Standard Methods for
Examination of Water and Sewage and Wastewater. 20a ed. New York; 1998.
BANDERAS A, GONZLEZ R, LANZA G. Limnological Aspects of a HighMountain Lake in Mexico. Hydrobiologia. 1991;224:1-10.
BHRER H. Problems in Estimation of Pheophytine. Verh Internat Verein
Limnol. 1991;24:1259.
DETERMINACIN DE CLOROFILA A Y FEOPIGMENTOS RAMN VARELA
INTRODUCCIN

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La determinacin de clorofila a se emplea para estimar la biomasa de los productores

primarios (fitoplancton) que se encuentran como partculas en suspensin en el agua. El
procedimiento que se describe a continuacin cuantifica la concentracin de clorofila a y
feopigmentos presentes en una muestra utilizando tcnicas fluoromtricas. El
procedimiento sigue los lineamientos propuestos por Holm-Hansen et al. (1965), y los
clculos se efectan como se indican en Lorenzen (1966). Entre las modificaciones se
encuentran el uso de metanol en vez de acetona como un disolvente de extraccin
debido a su mayor eficiencia (Holm-Hansen y Riemann, 1978) y el empleo de un
sonificador (Wright et al., 1997). Este mtodo se puede aplicar en todos los rangos de
concentracin de clorofila a que se encuentran en el mar. El lmite de deteccin del
mtodo es de 0,01 g L-1 para aguas naturales (muestra de 0,5 L). Los resultados se
expresan en g L-1 mg m-3.
FUNDAMENTOS DEL MTODO
Una muestra de agua de mar se filtra a travs de un filtro de fibra de vidrio sobre el cual
se retienen las partculas en suspensin. Entre estas partculas se encuentran
organismos del fitoplancton los cuales poseen pigmentos cloroflicos como clorofila a y
feopigmentos. La extraccin de estos pigmentos de las clulas se efecta usando
metanol como disolvente, y el ultrasonido (sonificacin) se usa para romper el filtro y
las clulas. Luego de aclarar el extracto por centrifugacin se coloca en un fluormetro
donde los pigmentos de las algas se excitan con luz de longitud de onda azul, emitiendo
fluorescencia con longitud de onda roja. La fluorescencia se detecta por medio de un
fotomultiplicador. Seguidamente, la muestra se acidifica para convertir toda la clorofila
a en feopigmentos y se mide en el fluormetro nuevamente.
ADVERTENCIAS ANALTICAS
1. La presencia de clorofila b, clorofila c y/o divinil clorofila a en la muestra pueden
acarrear error en la medicin. Concentraciones elevadas de clorofila b, especialmente en
la zona del mximo de clorofila, interfieren en forma negativa con la clorofila a y
positiva con los feopigmentos (Knap et al., 1997). Esta interferencia es importante si son
abundantes algas pertenecientes a la clase clorofceas y/o proclorofitas.
2. El lmite de deteccin del equipo se sobrepasa cuando el nivel de los pigmentos en los
extractos es muy alto. El fluormetro siempre se mantiene en su mxima sensibilidad;
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por lo tanto, las mediciones tienden a subestimar concentraciones elevadas,

posiblemente por efecto de la extincin (quenching). Para solventar este problema,
existen varias alternativas. Una alternativa no muy recomendable es diluir la muestra lo
cual aumenta la incertidumbre del mtodo. Si el filtro se encuentra saturado de material
despus de la filtracin, otra opcion es cortar el filtro en fracciones ms peque- as y
realizar el anlisis por separado a cada fraccin. La alternativa ms recomendable en
aguas muy productivas con una concentracin elevada de fitoplancton es filtrar un
volumen menor de agua (250 mL o menos) de manera de evitar cortar el filtro o diluir la
muestra.
3. La fluorescencia depende de la temperatura. Por lo tanto, realizar la calibracin del
equipo as como el anlisis de muestras a una temperatura ambiental constante entre
20-25 C. El coeficiente de temperatura para la fluorescencia de la clorofila es 0,3%/C.
4. La luz intensa puede degradar con rapidez la clorofila. Realizar todo el anlisis en un
ambiente con luz tenue.
5. Tanto el material que se emplea en el anlisis como el metanol deben permanecer
libres de residuos de cido.
MATERIALES
Filtros de fibra de vidrio (Whatman grado GF/F o su equivalente, 0,7 m, 25

mm).
Unidad de filtracin y bomba de vaco.
Embudos para filtros de 25 mm, 200 mL de capacidad.
Tubos de centrfuga de polipropileno con tapa, de 15 mL.
Celdas de 13-mm especficas para el fluormetro.
Pipetas automticas monocanal con capacidad de 200 y 1000 L.
Pipetas de 5 y 10 mL.
Esptulas pequeas.
Guantes de vinilo.

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EQUIPOS
1. Fluormetro Turner Designs (10-AU-005), con fotomultiplicador sensitivo al rojo (
185-870 nm), lmpara F4T5/d, filtro azul ( 340 500 nm CS 5-60) y filtro rojo ( >
665 nm CS 2-64).
2. Sonificador, Fisher Scientific modelo 100.
3. Centrfuga, 0 - 3900 r.p.m.
4. Unidad de filtracin y bomba de vaco.
REACTIVOS
1. Metanol (CH3 OH).
2. cido clorhdrico (HCl, 0,48 N).
3. Solucin concentrada de clorofila a. Se emplea una ampolla de solucin estndar
comercialmente disponible de clorofila a pura (Anacystis nidulans Sigma C-6144, 1 mg)
libre de clorofila b. Disolver el contenido de una ampolla con cristales de clorofila a en
15 mL de metanol. Los cristales de clorofila se disuelven muy lentamente; por lo tanto,
realizar la dilucin dos das antes de la calibracin. Una vez disuelta, mantener esta
solucin almacenada a - 20 C.
4. Solucin de trabajo para la calibracin. Diluir 1 mL de la solucin concentrada de
clorofila a en 49 mL de metanol. La concentracin de esta solucin debe ser
aproximadamente de 1 g L-1. Para determinar la concentracin precisa, medir la
absorcin a cada nanmetro entre 660 y 670 nm empleando un espectrofotmetro
recin calibrado y ubicar la longitud de onda con absorcin mxima (Amax).
Determinar la concentracin de clorofila a en la solucin aplicando la siguiente formula:

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DONDE:
Amax = absorcin mxima (entre 660 - 670 nm).
A750nm = absorbancia a 750 nm.
E = coeficiente de absorcin especfica de la clorofila en metanol, 79,81 g-1 cm-1
(Jeffrey y Welschmeyer, 1997).
L = longitud de la celda en cm, 10-cm.
CAPTACIN DE MUESTRAS
1. Captar las muestras de agua en botellas oscuras de polietileno de 1 L lavando tres
veces con la muestra antes de llenar.
2. Filtrar la muestra inmediatamente a travs de filtros de fibra de vidrio. Anotar el
volumen filtrado. El volumen a filtrar depende de la cantidad de clorofila presente en el
agua, lo cual se puede estimar a travs del fluormetro del CTD. Para las aguas con
biomasa baja (< 1 mg m-3) se filtran 500 mL por duplicado. Filtrar 250 mL por
triplicado si la biomasa es > 1 mg m-3.
3. Mantener el nivel de vaco de la bomba entre 400- 500 mm Hg para no romper las
clulas.
4. Al finalizar la filtracin, sacar el filtro con una pinza plana y doblarlo por la mitad o
enrollarlo con el lado que contiene las partculas hacia adentro. Introducir el filtro en un
tubo de centrfuga debidamente identificado.
5. Congelar a - 20 C. Realizar el anlisis antes de un mes.

ANLISIS DEL BLANCO

Antes de realizar el anlisis de clorofila a es imprescindible evaluar el funcionamiento
del fluormetro as como la calidad analtica del metanol con un anlisis del blanco. El
metanol debe estar libre de contaminantes o de algn otro elemento que pueda alterar
los resultados del anlisis.
1. Colocar 5 mL de metanol con una pipeta limpia en una celda del fluormetro.

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2. Realizar una lectura en el fluormetro. Una lectura mayor de cero indica posible
contaminacin del reactivo o un equipo descalibrado; por lo tanto, NO SE DEBE realizar
el anlisis hasta calibrar el equipo o cambiar de reactivo.
3. Es conveniente verificar la estabilidad del equipo antes del anlisis utilizando un
estndar slido suministrado por el fabricante. Este estndar se ajusta durante la
calibracin.
ANLISIS DE MUESTRAS
Se recomienda comenzar el anlisis a partir de las muestras con menor concentracin y
terminar con las que posean la mayor concentracin (usualmente las superficiales).
Realizar los duplicados en forma consecutiva. Usar guantes en todo momento durante el
anlisis y atender las medidas de seguridad para el manejo del metanol.
1. Preparacin de las muestras antes del anlisis. Sonificacin.
a. Sacar los tubos de centrfuga con los filtros del congelador y descongelar a
temperatura ambiente a resguardo de la luz.
b. Agregar a cada tubo 10 mL de metanol puro sin formar burbujas. Verificar que todos
los tubos contengan la misma cantidad del lquido y que el filtro quede totalmente
sumergido.
c. Romper el filtro dentro del tubo con una peque- a esptula para homogenizar la
muestra. Esto favorece la ruptura de las clulas del fitoplancton e incrementa la
eficiencia de extraccin del solvente. Colocar los tubos en una gradilla cubrindolos con
papel de aluminio para protegerlos de la luz.
d. Introducir la punta del sonificador en el metanol sin tocar el fondo del tubo de
centrfuga. La sonda debe estar lo ms perpendicular posible y no tocar las paredes del
tubo.
e. Prender el sonificador y aumentar gradualmente la potencia hasta la posicin 15.
f. Mantener en esta lectura por 30 segundos, apagar el equipo y retirar la punta del
sonificador, tapar el tubo de centrfuga y guardarlo protegido de la luz.
g. Entre muestra y muestra, lavar la punta del sonificador con metanol puro y secar.
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h. Colocar los tubos en una gradilla y almacenar a 4 C (no congelar) por 24 horas para
permitir que el metanol extraiga los pigmentos. Es recomendable agitar ligeramente los
tubos tres o cuatro veces durante este periodo.
2. Medicin de clorofila a y feopigmentos con el fluormetro.
Encender el fluormetro una hora antes de comenzar el anlisis para permitir que
estabilice.
a. Colocar los tubos en una centrifugadora por 30 minutos a 3000 r.p.m. para clarificar
el extracto.
b. Transferir los tubos a una gradilla y ordenarlos por rplicas, protegindolos de la luz.
c. Con una pipeta, extraer cuidadosamente 5 mL de metanol de la mitad superior del
lquido en el tubo, sin tocar las partculas del filtro ni producir turbulencia y
transvasarlo a la celda del fluor- metro.
d. Colocar la celda en el fluormetro previamente calibrado, y realizar la lectura una vez
que el equipo estabilice (~ 8 s). Esta lectura corresponde a la fluorescencia inicial (Fo).
e. Agregar 100 L de HCl 0,48 N y agitar levemente. Esperar tres minutos como mnimo
para que se complete la reaccin.
f. Colocar la celda en el fluormetro y esperar que el equipo estabilice, realizar la lectura
de la muestra acidificada. Esta lectura corresponde a la fluorescencia acidificada (Fa).
g. Entre muestra y muestra, lavar la pipeta y las celdas del fluormetro un mnimo de
tres veces con metanol puro.
CALIBRACIN DEL FLUORMETRO
El fluormetro se calibra, siguiendo las instrucciones del fabricante, cada seis meses con
un estndar, comercialmente disponible, de clorofila a pura (Anacystis nidulans Sigma
C-6144, 1 mg) libre de clorofila b. Realizar cinco diluciones con la solucin de trabajo de
clorofila a para alcanzar concentraciones entre 0 y 130 g L-1 con lo cual se puede
calibrar el equipo para una escala de valores de 0 a 150 g L-1. Una vez finalizada la
calibracin, medir el estndar slido que suministra el fabricante, y utilizar esta lectura
para verificar la estabilidad del equipo en anlisis sucesivos. Una deriva mayor de un
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10% indica la necesidad de una nueva calibracin. Las mismas diluciones se pueden
emplear para determinar la razn de acidificacin mxima (R) despus de la calibracin.
Tomar las lecturas de varias diluciones (Fomax) y acidificar con 100 L de HCl 0,48 N.
Medir las muestras nuevamente en el fluormetro (Famax). R es la razn mxima de
fluorescencia, antes y despus de acidificar, calculada a partir del estndar de clorofila a
pura usada para calibrar el fluormetro. Para el metanol, R vara entre 2,4 y 2,7. Cuando
se utiliza metanol, el valor de R es ms variable que cuando se emplea acetona. La
cantidad de cido aadido a la celda debe ser fijo, igual en la calibracion como para las
muestras. Un incremento pequeo en el volumen produce valores de R anmalos.

DONDE:
Fomax = lectura antes de la acidificacin.
Famax = fluorescencia acidificada mxima.

CLCULO Y EXPRESIN DE RESULTADOS

La frmula basada en Lorenzen (1966) empleada para el clculo de la concentracin de
clorofila a y los feopigmentos en el agua de mar es:

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Ve = volumen de metanol (10 mL).

Vm = volumen de muestra filtrada.
Fo = lectura antes de la acidificacin.
Fa = lectura despus de la acidificacin.

CUANTIFICACIN DE CLOROFILAS
OBJETIVO Y DESARROLLO DE LA PRCTICA
El objetivo de esta parte de la prctica es extraer los de pigmentos de cloroplastos de un
material vegetal y determinar la cantidad de clorofila contenida en el mismo.
EXTRACCIN DE PIGMENTOS:
PROTOCOLO 1: Extraccin con acetona
Extraer los pigmentos de cloroplastos de 0.5 g de hojas frescas de espinacas o de
cualquier otro material verde, con 5 ml de acetona al 80%, disgregando el tejido vegetal
en un mortero, de modo que los pigmentos salgan al exterior y se disuelvan en acetona.
Cuando la acetona est bien verde, el macerado se introduce en un tubo de centrfuga de
plstico y se centrfuga a 2000 rpm durante 10 minutos. Despus de centrifugar se
obtiene un sobrenadante verde que contiene los pigmentos. Ajustar el volumen final a 6
ml con acetona al 80%.
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PROTOCOLO 2: Extraccin con etanol

Extraer los pigmentos de cloroplastos de 0.5 g de hojas frescas de espinacas o de
cualquier otro material verde cortando las hojas en segmentos de aproximadamente 0.5
cm que se introducen en un tubo de ensayo con 6 ml de etanol al 80% de modo que los
segmentos queden bien sumergidos en el etanol. Incubar durante 20 minutos en un
bao a 80 para que las clorofilas salgan al exterior y se disuelvan en el etanol. Al cabo
de este tiempo los segmentos debern quedar totalmente decolorados y el etanol queda
de color verde.
MEDIDA DE CLOROFILA:
Se toman 0.5 ml del sobrenadante de cada uno de los extractos y se diluye hasta 5 ml
con acetona al 80% en la extraccin con acetona (protocolo 1) y con etanol al 80% en la
extraccin con etanol (protocolo 2). Despus se mide en un espectrofotmetro a
longitudes de onda de 645 y 663 nm.
Para calcular las clorofilas totales aplicaremos la siguiente frmula:

DETERMINACIN DE CLOROFILA EN FRUTOS DE CUATRO VARIEDADES

DE CHILE (Capsicum sp)
RESUMEN
La importancia del chile (Capsicum sp.) es por su amplia distribucin, gran diversidad
de tipos de chiles cultivados y silvestres, y los diversos usos que se le da a los frutos. Es
una fuente excelente de colorantes naturales, vitaminas y minerales que representan
una importante materia prima en la elaboracin de alimentos y en la industria. El
objetivo del presente estudio fue cuantificar el contenido del color extractable, clorofila
total, y , y carotenoides de los grupos rojos (R) y amarillonaranja (A) en cuatro
variedades de chile (Capsicum sp.). La determinacin de carotenos y clorofilas se realiz
por dos mtodos de extraccin y la determinacin de color extractable por el mtodo
ASTA 20-1. El mayor contenido de clorofila total as como el de sus componentes y se
presentan en la muestra seca de chile chilaca despus de 4h de extraccin. La mayor
concentracin de carotenoides totales y grupos carotenoides (R) y (A) se obtuvo en la
muestra fresca de chile habanero despus de una hora de extraccin. En la variedad
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habanero en muestra fresca se present el mayor contenido de unidades ASTA y en las

muestras secas el mayor contenido de estas se obtuvo en la variedad de chile chilaca.
INTRODUCCIN
En Mxico, la importancia econmica del chile (Capsicum sp.) es evidente por su amplia
distribucin y los diversos usos que se da a los frutos. El inters por este cultivo se ha
incrementado por la presencia de otros compuestos, conocidos como fitoqumicos, que
tienen un efecto benfico sobre la salud humana (GuzmnMaldonado y Paredes-Lpez,
1998). Dentro de este grupo de compuestos se encuentran los cidos fenlicos, de los
cuales se sabe que reducen el riesgo de contraer cncer, problemas cardiovasculares y
otras enfermedades crnico degenerativas (Dillard y German, 2000). Los frutos de
Capsicum se han utilizado en forma de concentrados, oleorresinas y como especias en
colorantes alimenticios. Los frutos presentan carotenoides, como ceto-carotenoides,
capsantina, capsorubina contribuyendo a la coloracin roja del fruto (Philip et al., 1971),
mientras que -caroteno, zeaxantina, lutena y - criptoxantina son responsables del
color amarillo-naranja. Los pigmentos y precursores de color de frutas y hortalizas
desde el punto de vista qumico, pertenecen a la familia de los terpenos, es decir estn
formados por unidades de isopreno y su biosntesis se produce a partir de isopentil
pirofosfato. La clorofila ayuda a la fijacin del hierro en casos de anemia, la clorofila y la
clorofilina poseen actividad antimutagnica y anticarcinognica, posee accin
antioxidante, nutre y fortalece el sistema circulatorio e intestinal, tiene actividad
desintoxicante contra metales pesados, aflatoxinas, accin deodorizante (ayuda a
neutralizar el olor corporal) (Breinholt et al. 1995, Chermonosky et al. 1999). Desde el
punto de vista de la tecnologa de los alimentos, el inters por clorofilas se centra en las
reacciones poscocecha que degradan a estos pigmentos, incluso los que ocurren durante
el procesamiento y almacenamiento. Paralelamente se reconoce que la clorofila tiene
efectos sobre la salud, tales como la reduccin de algn tipo de tumores en animales de
laboratorio. Existen varias clorofilas reportadas, las clorofilas y estn presentes en el
tejido fotosinttico en una relacin 3:1. Las clorofilas se emplean poco como aditivos
alimentarios, con excepcin de algunas gomas de mascar y pastillas, junto con sales
cpricas. En estados Unidos se emplean como aditivos a travs del uso de jugos de
vegetales. De acuerdo con Almeda et al. (1991), el contenido total de carotenoides en el
fruto varia de acuerdo al tipo de cultivar, estado de madurez y condiciones de
crecimiento. Adems, la temperatura, iluminacin y tiempo de secado para almacenar
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y/o elaborar subproductos pueden generar incrementos o decrementos en la

concentracin de los carotenoides (Gmez-Ladron y Pardo-Gonzlez, 1996). Los
procesos de secado, fabricacin y extraccin de pigmentos deben estar eventualmente
resueltos para evitar prdidas de color y conservar en forma ms natural estos
pigmentos (Minguez-Mosquera et al., 1994). Hornero-Mndez et al. (2002), determin
el contenido de carotenoides en el chile pimiento cv. MA1, reportando 12607.58 mg.kg-1
de peso fresco. Por otra parte Arjona et al. (2003), reportaron valores de 150 y 214
unidades ASTA en carotenoides de pimentn (Capsicum annuum) var. trompa de
elefante., superando el valor mnimo exigido por la Federal Specification que es de 120
unidades, adems observaron que la materia prima influye en el contenido total de
carotenoides.
El conocer el contenido de pigmentos en frutos frescos y secos, es de gran importancia
ya que debido a los efectos antitumorales que se le atribuyen a los pigmentos podr
recomendarse su consumo. Por lo que el objetivo del presente estudio fue cuantificar el
contenido del color extractable, clorofila

y , y carotenoides rojos (R) y amarillo-

naranja (A) en cuatro variedades de chile (Capsicum sp.).

METODOLOGIA:
Material biolgico y procesamiento de muestras

Se obtuvieron 200 g de frutos frescos de chile de cada una de las variedades

(serrano, habanero, chilaca y jalapeo) y se refrigeraron a 5C por 24 horas.
Posteriormente, los frutos se desinfectaron con cloro 10% v/v y se enjuagaron con

agua destilada, se desvenaron y se elimin la semilla.

Una vez eliminadas las semillas se dividieron las muestras en partes iguales, una
de las cuales se refriger hasta su posterior uso (muestra fresca) y la otra se
coloc en papel aluminio para efectuar el secado de las muestras el cual se realiz
en un horno elctrico durante tres das a 60oC. Determinacin de color
extractable, carotenos y clorofilas Las muestras frescas y secas de cada una de las
variedades fueron sometidas a dos mtodos de extraccin:

MTODO DE EXTRACCIN 1.

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Se colocaron 0.5g de cada muestra (fresca y seca) por variedad en seis repeticiones, se
colocaron en vasos de precipitado de 100mL, se agregaron 50mL de acetona y se
agitaron durante 4 h; se filtr dos veces con papel Whatman No. 4, a la muestra se le
adicionaron otros 50mL de acetona y se agitaron nuevamente (estos pasos podrn
repetirse hasta obtener la decoloracin total de la muestra). El volumen total de acetona
fue de 100mL.
MTODO DE EXTRACCIN 2.
Se tomaron 0.5g de cada una de las muestras y se molieron en mortero evitando la
incidencia de luz, el polvo as obtenido se transfiri a un vaso de precipitado de 200mL
y se adicionaron 400mL de acetona y se mantuvieron en reposo durante 1h,
posteriormente se filtr dos veces en papel Whatman No. 4 y se afor a 100mL con
acetona.
La determinacin de color extractable se realiz por el mtodo ASTA 20-1 (Annimo,
1986) para lo cual se tomaron 5mL de la solucin final y se determin por seis
repeticiones la absorbancia a 460nm en un espectrofotmetro (Spectrphotometer
BioMate TM 3). ste se determin solamente de las muestras procesadas por el
mtodo1. A partir de las soluciones obtenidas mediante los mtodos de extraccin 1 y 2,
se tomaron 5mL de cada una de las muestras y se realizaron lecturas de absorbancia en
el espectrofotmetro a diferentes longitudes de onda; 648nm-663nm para clorofila
(Godwing, 1976), 480nm-750nm para carotenos totales (Strickland & Parsons, 1972;
Britton, 1985), 450nm-508nm para carotenos amarillos y rojos respectivamente (Fekete
et al., 1976; Haspel-Horvatovic y Horickova, 1976). Los resultados obtenidos fueron
analizados mediante un Anlisis de Varianza para detectar diferencias significativas
entre las variedades, y mediante comparacin mltiple de medias (Tukey).
RESULTADOS Y DISCUSION
En relacin al contenido de pigmentos en frutos de cuatro variedades de chile
(Capsicum annuum L.) se encontr con base en el Anlisis de Varianza, que existen
diferencias altamente significativas (P<0.01) entre variedades y entre tratamientos, as
como en la interaccin de las diferentes fuentes de variacin, demostrndose una amplia
variabilidad. En cuanto a la clorofila el ms alto contenido de este pigmento se presento
en las muestras secas de los frutos de la variedad chilaca independientemente del
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tiempo de extraccin, alcanzado valores de hasta 8.34mg/g de muestra. Por otra parte
en las muestras secas de chile habanero se registraron los valores mas bajo con 0.3mg/g
(Figura 1). En cuanto a los resultados obtenidos de clorofila y se reporta que para
ambos mtodos la muestra de chile chilaca (tanto muestra fresca, como seca) presentan
valores relativamente altos comparados con los dems variedades evaluadas. Respecto
al contenido de carotenoides totales en las muestras de las cuatro variedades se
encontr que la mayor concentracin se presenta en las muestras frescas de los frutos de
habanero registrndose 93.25g/L cuando el tiempo de extraccin en acetona fue de 1h,
cuyo contenido se increment a 116.92g/L cuando el tiempo de extraccin fue de 4h.
Este comportamiento se observ tambin en la muestras de las variedades de chilaca y
jalapeo. De manera general se observa un drstico decremento en este pigmento
cuando los frutos fueron deshidratados a 60oC durante 72h (Figura 2). El contenido de
grupos carotenoides reporta que para ambos grupos (A y R) las muestras frescas de chile
habanero del mtodo de extraccin 2 (1h) registran una mayor cantidad de grupos
carotenoides en relacin a las dems variedades estudiadas (Tabla 1). Para el color
extractable, se reporta un alto ndice de 35.05 unidades ASTA para muestra fresca de
chile habanero, mientras que la muestra seca de chile chilaca da como reportado 22.49
unidades ASTA, esta misma tendencia se observa para la muestra seca de chile serrano
dando 2.65 unidades ASTA por encima de su contraparte fresca.

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CONCLUSIONES
El mayor contenido de clorofila total as como el de sus componentes y se presentan
en la muestra seca de chile chilaca del primer mtodo (4h). El contenido de carotenoides
totales y grupos carotenoides se obtuvo la mayor cantidad de la variedad chile habanero
muestra fresca del segundo mtodo de extraccin (1h). La variedad chile habanero en
muestra fresca present el mayor contenido de unidades ASTA, en cambio por parte de
la muestra seca el mayor contenido de unidades ASTA lo obtuvieron la variedad de chile
chilaca (uso del mtodo de extraccin 1, 4h).

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