FIJACIN ASIMBITICA DE NITRGENO: ASPECTOS

BIOQUMICOS, FISIOLGICOS Y GENTICOS

Objetivo:
Conocer los aspectos bioqumicos, fisiolgicos y
genticos de la fijacin de nitrgeno.
Resumen
La capacidad de fijacin del nitrgeno se encuentra en diversos grupos
fisiolgicos. Estos tienen en comn el hecho de ser procariticos.
El organismo mejor caracterizado en condiciones aerobias es el Azotobacter. En
condiciones anaerobias, el mejor caracterizado es el Clostridium.
Por su parte, diversas cianobacterias tambin han sido caracterizadas de forma
certera.
Son microorganismos libres, con capacidad de fijar nitrgeno, segn (Alexander)
pueden ser:
a)
b)
c)
d)

Bacterias heterotrficas: Azotobacter, aeorobacter, azotomonas, etc.

Bacterias quimioautotroficas: metano bacillus omelianskii.
Algas azules y verdes: anabaena colotrixnostoc tolopotrix.
Bacterias
fotosintticas:
rhodopseudomonas,
rodomicrobium,
rhodoesperillum.

La fijacin asimbitica tiene muy poca importancia a comparacin de la fijacin

simbitica, debido a que fija muy poco nitrgeno. Pero en la asimbitica el ms
importante es las algas verde azules. Fijacin no biolgica de nitrgeno Es de
menos importancia con respecto a la fijacin biolgica.
La bioqumica consiste en la reduccin de N por la enzima nitrogenasa presente
en los procariontes fijadores denitrgeno. La nitrogenasa est compuesta por dos
protenas solubles: la protena del hierro (dinitrogenasa reductasa) y la protena
del MoFe (dinitrogenasa).
La actividad fijadora de nitrgeno atmosfrico est codificada por los llamados
genes nif, que han podido transferirse por manipulacin gentica bajo forma de
plsmidos (material gentico extracromosmico) desde microorganismos fijadores
a otros que no lo son.
Palabras claves: fijacin de nitrgeno, nitrogenasa, microorganismos asimbitica.

INTRODUCCIN
Por fijacin de nitrgeno se entiende la combinacin de nitrgeno molecular
o dinitrgeno con oxgeno o hidrgeno para
dar xidos o amonio que
pueden
incorporarse a la biosfera El nitrgeno molecular, que es el componente
mayoritario de la atmsfera, es inerte y no aprovechable directamente por la
mayora de los seres vivos. La fijacin de nitrgeno puede ocurrir de manera
abitica
(sin
intervencin
de
los
seres
vivos)
o
por
accin
de microorganismos (fijacin biolgica de nitrgeno). La fijacin en general supone
la incorporacin a la biosfera de una importante cantidad de nitrgeno, que a nivel
global puede alcanzar unos 250 millones de toneladas al ao, de las que 150
corresponden a la fijacin biolgica.

Asociaciones no simbiticas
Bacterias-Filsfera: Varias bacterias fijadoras de nitrgeno pueden colonizar la
filsfera, trmino usado por algunos investigadores para referirse a la superficie
adaxial y abaxial de la hoja, y por otros a la hoja completa, incluyendo el ambiente
interno. Se ha observado que las bacterias ms abundantes en las hojas son las
pigmentadas (e. j. Methylobacterium mesophilicum, Pseudomonas syringae), a las
cuales se les ha atribuido una mejor adaptacin a los rayos solares (Sundin y
Jacobs, 1999; Hirano y Upper, 2000). Las especies de Beijerinckia y Azotobacter
son comnmente encontradas en cultivos; y se ha reportado su efecto benfico en
el crecimiento de las plantas (Ching-Hong, 2001; Lindow y Brandl, 2003). Sin
embargo, no est clara la forma en que las plantas se benefician y posiblemente
se ha atribuido el beneficio a la absorcin radical de compuestos nitrogenados, los
cuales una vez excretados por las bacterias en las hojas, llegan a la raz por
lavado.
Bacterias-Rizfera: Hiltner en 1904 observ por primera vez la acumulacin de
microorganismos en la zona radical y propuso el trmino rizsfera. Los exudados
radicales, conformados por substancias diversas crean alrededor de las races
(rizsfera) un ambiente nutricional enriquecido que favorece el crecimiento
bacteriano. Smith (1976) y Martin y Kemp (1980) reportan la presencia de
carbohidratos y aminocidos, y sealan que la composicin y cantidad de
exudados vara con la especie presente y las condiciones abiticas, tales como
agua y temperatura. La relacin que se establece entre las bacterias y las plantas
puede ser favorable, perjudicial o neutra. Dentro de las relaciones favorables se
encuentra la asociacin con bacterias fijadoras de nitrgeno; entre estas, especies
de Azospirillum1, Enterobacter, Klebsiella, Pseudomonas y Burkholderia. Las
bacterias Identificado en suelos de la Gran Sabana por Andrade y Cuenca (1998).
Mayz-Figueroa. Fijacin biolgica de nitrgeno 4 Revista UDO Agrcola 4 (1): 1-20.

2004 fijadoras de nitrgeno pueden ser categorizadas dentro del grupo de las
rizobacterias promotoras del crecimiento (PGPR, por sus siglas en ingls), al
ejercen un efecto benfico sobre el crecimiento de las plantas. La primera especie
aislada fue Azospirillum lipoferum (para entonces nombrada como Spirillum
lipoferum) en Holanda en 1925 (BeijerincK, 1925) y de la cual en la actualidad se
reconocen 7 especies: A. brasilense, A. lipoferum, A. amazonense, A.
halopraeferans, A. irakense, A. largimobile y A. doebereinerae (Tarrand et al.,1978;
Magelhaes et al., 1983; Reinhold et al., 1987; Khammas et al., 1989; Sly y
Stackebrandt, 1999; Eckert et al., 2001); desde entonces ha sido aislada de varias
especies cultivadas y silvestres y de varios tipos de suelo. Por muchos aos se
consider que el efecto benfico de las bacterias fijadoras de nitrgeno slo
provena de la utilizacin por las plantas del amonio excretado; as existen
numerosas publicaciones que prueban tal efecto (Mirza et al., 2001; Becker et al.,
2002); sin embargo, se ha encontrado que esta bacterias tambin producen
fitohormonas (auxinas, giberelinas y citocininas) que afectan favorablemente el
desarrollo de las plantas, particularmente de la raz (Persello-Cartieaux et al.,
2003). Ms recientemente se ha reportado que las bacterias fijadoras de nitrgeno
incrementan la capacidad radical de absorcin de nitrato, indirectamente como
una consecuencia de la estimulacin del desarrollo radical y directamente por
estimulacin del sistema transportador del compuesto (Mantelin y Touraine, 2004).
ASPECTO BIOQUIMICO
Dos fenmenos biolgicos fundamentales aseguran la disponibilidad del carbono
y del nitrgeno en los organismos vivos a partir del gas carbnico y del nitrgeno
molecular del aire: la fotosntesis y la fijacin biolgica de nitrgeno. La fijacin
biolgica del nitrgeno atmosfrico, consiste en la reduccin de N por la enzima
nitrogenasa presente en los procariontes fijadores dinitrgeno. La nitrogenasa est
compuesta por dos protenas solubles: la protena del hierro (dinitrogenasa
reductasa) y la protena del MoFe (dinitrogenasa). El MoFe es un cofactor esencial
en la dinitrogenasa. Las dos enzimas del complejo funcionan conjuntamente: la
dinitrogenasa reductasa reduce la dinitrogenasa, mientras que esta ltima reduce
el nitrgeno. Ambas enzimas son necesarias para que se produzca la fijacin. La
ecuacin general para la fijacin catalizada por la nitrogenasa es: N
N2+ 16ATP + 8e- + 8H+ Mg+2

2NH3 + H2+ 16ADP + 16Pi + Mg

El complejo enzimtico adems puede reducir otros sustratos como el acetileno,

propiedad que ha permitido en desarrollo de una tcnica para estimar la actividad
nitrogenasa por cromatografa de gases y que se conoce como reduccin del
acetileno (ARA). El complejo enzimtico adems puede reducir otros sustratos
como el acetileno, propiedad que ha permitido en desarrollo de una tcnica para

estimar la actividad nitrogenasa por cromatografa de gases y que se conoce

como reduccin del acetileno (ARA)Dichas bacterias comprenden organismos
fototrofos, como bacterias pertenecientes a la familia Rhodospirillaceae,
Clorobiaceae y Cianobacteriae;organismos quimioautotrofos, como bacterias de
los gneros Thiobacillus,Xanthobacter Y Desulfovibrio y organismos heterotrofos
como las bacteriaspetenecientes a la familia Frankiaceae, al grupo Rhizobiaceae y
a los gneros Azotobacter ,Enterobacter ,Klebsiella Y Clostridium.
Estos organismos pueden realizar la fijacin biolgica de nitrgeno ya sea
independientemente (a excepcin de las rizobiceas) o estableciendo relaciones
simbiticas con otros organismos

Generalidades del gnero Azotobacter

La familia Azotobacteriaceae comprende a las bacterias del gnero Azotobacter,
las cuales son Eubacterias Gram-negativas que tienen una pared celular compleja
que consiste de una membrana externa y una capa interna de peptidoglicano que
contiene cido murmico y murena. Se reproducen por fisin binaria, viven en
suelos y en aguas frescas, son clulas ovoides y grandes de 1.5 a 2.0 m de
dimetro. Son pleomrficas, variando su morfologa desde bacilos hasta clulas en
forma de cocos. Se les observa como clulas individuales, como pares o formando
agregados irregulares, y algunas veces formando cadenas de tamao variable.
Algunas especies como A. vinelandii y A. chrocoocum sufren un proceso de
diferenciacin para formar quistes resistentes a la desecacin. Se mueven por
flagelos pertricos, son aerobios, pero pueden crecer en concentraciones de
oxgeno bajas. Algunas cepas producen pigmentos solubles o insolubles en agua.

Son quimioorganotrficas, utilizan azcares, alcoholes y sales inorgnicas para

crecer. Son fijadores de nitrgeno; en vida libre fijan al menos 10 mg de N 2 por
gramo de carbohidrato (glucosa) consumido. Requieren molibdeno para fijar
nitrgeno que puede ser parcialmente reemplazado por vanadio. Utilizan nitrato y
sales de amonio y ciertos aminocidos como fuentes de nitrgeno. Son catalasa
positivos. El rango de pH en el que crecen en presencia de nitrgeno combinado
es 4.8-8.5 el pH ptimo para crecer cuando fijan nitrgeno es 7.0-7.5.
Azotobacter vinelandii :Es una bacteria poliploide, es decir posee varias copias
de su cromosoma, se calcula que pueden tener hasta 80 copias. El nmero de
copias vara dependiendo del medio y las condiciones de cultivo as como de la
fase de crecimiento. Es de tamao muy grande de 2x5 nm de dimetro es decir de
5 a10 veces el volumen de E. coli. Se ha asociado el tamao con la poliploida.
Las capacidades metablicas y genticas por las que A. vinelandii ha sido y es
objeto de estudio son principalmente:
1. Fija nitrgeno en presencia de oxgeno por tres sistemas diferentes de
nitrogenasa.
2. Posee mecanismos de proteccin de la nitrogenasa
3. Posee una alta capacidad respiratoria que en condiciones diazotrficas o de
fijacin de nitrgeno es hasta 10 veces ms alta que la de Escherichia coli.
4. Produce dos polmeros de uso industrial: el polisacrido extracelular alginato y
el polister intracelular polihdroxibutirato.
5. Sufre un proceso de diferenciacin morfolgica para formar quistes resistentes
a la desecacin.
Fijacin de nitrgeno
La fijacin biolgica de nitrgeno o reduccin de N 2 a NH4, es un proceso que
pueden llevar a cabo solo algunos procariotas gracias a que poseen el complejo
enzimtico conocido como nitrogenasa, la cual est formada por dos protenas:
una protena que contiene fierro (protena-Fe) y otra que contiene molibdeno y
fierro (protena Mo-Fe). La nitrogenasa que contiene molibdeno Mo es la ms
ampliamente distribuida.
Las bacterias fijadoras de nitrgeno o diaztrofas, ocupan un nicho ecolgico
indispensable ya que suplen de nitrgeno fijado al ciclo global del nitrgeno.

Gracias a este papel los diaztrofos estn presentes en virtualmente todos los
ecosistemas, con representantes en ambientes tan variados como la superficie de
los ocanos (Tricodesmiun), los ndulos de las races de las plantas (Rhizobium),
y en suelos aerbicos como es el caso de Azotobacter.
En cualquier ecosistema los diaztrofos responden a condiciones variadas del
ambiente para regular el muy caro proceso de fijacin de nitrgeno. Todos los
diaztrofos regulan la nitrogenasa a nivel transcripcional. Algunos tambin poseen
sistemas rpidos de regulacin postranscripcional.
La fijacin de nitrgeno reduccin de N 2 a NH4 requiere 8 electrones, por lo tanto
se requiere un mnimo de 16 ATP para reducir una molcula de N 2 atmosfrico.
Adems la reduccin de N2 est siempre acoplada a la reduccin de H + a H2. Bajo
condiciones fisiolgicas normales el requerimiento de ATP es de 20 a 30
molculas de MgATP, en consecuencia la fijacin de nitrgeno puede consumir
una fraccin significativa de la poza celular de ATP. El ATP utilizado en la fijacin
de nitrgeno lo provee la respiracin aerbica. Por lo tanto la fijacin de nitrgeno
aerbica requiere una concentracin de O 2 mnima.
La nitrogenasa un complejo enzimtico sensible al oxgeno
La nitrogenasa purificada es inactivada rpida e irreversiblemente por el O 2 .La
protena Fe es mucho ms sensible que la protena MoFe con una vida media en
presencia de aire de 45 segundos y 10 minutos respectivamente. El efecto de
O2 sobre la nitrogenasa restringe la fijacin de N 2 en la mayora de las especies de
Eubacterias a condiciones anaerbicas o de microaerobiosis.
La fijacin de nitrgeno en bacterias aerbicas como Azotobacter es un proceso
que demanda gran cantidad de energa, por lo que requiere una eficiente
fosforilacin oxidativa. Debido a que el O 2 es txico para el complejo de la
nitrogenasa, las bacterias aerbicas fijadoras de nitrgeno han evolucionado una
variedad de estrategias para contender con esta paradoja aparente.
A. vinelandii fija nitrgeno en aerobiosis
A. vinelandii era hasta hace poco la nica bacteria reconocida capaz de fijar
nitrgeno en condiciones de total aerobiosis recientemente se describi otro
sistema de fijacin de nitrgeno tolerante a O 2 en Streptomyces
thermoaututrophicus. Azotobacter fija nitrgeno en aerobiosis gracias a que posee
un sistema bien integrado de proteccin de su nitrogenasa que comprende:
proteccin conformacional, proteccin respiratoria, autoproteccin y otros cambios

morfolgicos y fisiolgicos que le permiten crecer diazotrficamente en

condiciones totalmente aerbicas
Autoproteccin. Si la concentracin de nitrogenasa es lo suficientemente alta en
relacin a la concentracin de O2 celular, la nitrogenasa reductasa puede reducir
O2 a H2O2 y posiblemente a H2O y por lo tanto reducira el O2 en la vecindad de la
nitrogenasa. Adems el flujo constante de equivalentes reductores a travs de la
nitrogenasa puede ayudar a mantenerla en un estado reducido. Este proceso
conocido como autoproteccin requiere grandes cantidades de equivalentes
reductores y ATP que son los provistos por la rama cytab de la cadena respiratoria.
Es todava motivo de controversia si la alta tasa respiratoria reduce la
concentracin intracelular de O2 (proteccin respiratoria) o solo funciona para
proveer equivalentes reductores y ATP a la nitrogenasa consumidora de
O2 (autoproteccin). Sin embargo se ha comprobado que las altas tasas
respiratorias son esenciales para la fijacin de nitrgeno tolerante a
O2 en Azotobacter vinelandii. Mutantes en la oxidasa terminal cytab son incapaces
de fijar nitrgeno aerbicamente.
Nitrogenasas alternativas
Adems de la extensivamente caracterizada nitogenasa que requiere
molibdeno, Azotobacter vinelandi posee otras dos nitrogenasas alternativas: una
que contienen vanadio y otra que contiene Fe.
Mtodos:
Determinacin del in amonio:
la cuantificacin del in amonio llevada a cabo por el mtodo de Berthelot (fenolhipoclorito) se
basa en la formacin de un compuesto azul intenso de indofenol, el cual se
observ tanto en los patrones como en las muestras analizadas,y que resulta de la
reaccin de inamonio (NH4+) con compuestos fenlicos en presencia de un
agente oxidante.

Bacterias aisladas de la rizosfera de San Carlos: se aislaron diversas

poblaciones microbianas a partir del suelo de la rizsfera de cultivos de pltano,
pastos, maz y de rastrojos (zonas sin cultivar) del Valle del Sinu medio en el
municipio de San Carlos, Crdoba (Colombia). Los microorganismos fueron
transferidos sucesivamente a medios de cultivo slidos para lograr su aislamiento
y purificacin; los gneros Azotobacter sp y Azospirillum sp fueron identificados
utilizando medios selectivos libres de nitrgeno,respuestas a pruebas bioqumicas
y observaciones microscpicas para confirmar sus caractersticas, los cuales
morfolgicamente
Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. IX No. 2 Diciembre 2007 6-14
correspondieron a bacilos Gram negativos
de tamao variado (Holt et l,1994; Buchanan
et l, 1994). De un total de 55 microorganismos
aislados, 21 correspondieron al
gnero Azotobacter y 15 al gnero Azospirillum;
la existencia y distribucin ecolgica de
estas bacterias en un suelo especfico est
condicionada a diversos factores los cuales
determinan su presencia o ausencia; ha sido
demostrado que las caractersticas fsicas y
qumicas incluyendo contenido de materia
orgnica, humedad, relacin carbono nitrgeno
y pH, las condiciones climticas y exudados
de las races de las plantas que sirven
de nutrientes para estas poblaciones, afectan
la distribucin de estos microorganismos
(Vessey, 2003).

Discusin:

Conclusin

Se lleg a conocer los aspectos bioqumicos, fisiolgicos y genticos en la

fijacin de nitrgeno asimbitica encontrando microorganismos como el
Azotobacter vinelandii en condiciones aerobias y otros microorganismos
anaerobios con luz.

REFERENCIA BIBLIOGRFICA
http://www.redalyc.org/pdf/776/77690202.pdf