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Fundamento de tincin de Gram

La tcnica de la tincin de Gram se basa en las diferencias entre las paredes


celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
La pared celular es una cubierta rgida y porosa que le da a la bacteria su
forma caracterstica y proteccin fsica.
La pared celular de las bacterias Gram
positivas, tienen una gruesa capa de
peptidoglucano, las cuales retienen el
colorante cristal violeta. Adems contiene dos
clases de cidos teicoicos, anclado en la cara
interna de la pared celular y unido a la
membrana plasmtica, se encuentra el cido
lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido
teicoico que est anclado solamente en el
peptidoglucano (murena). Algunas de estas bacterias se rodean adems de una
cpsula o cubierta gruesa y viscosa de polisacridos, cuya funcin puede ser
adherencia.
Por el contrario, la capa de
peptidoglucano de las Gram negativas es
delgada, y se encuentra unida a una segunda
membrana plasmtica exterior (membrana
externa, hecha de protena, fosfolpido y
lipopolisacrido) por medio de lipoprotenas,
la cual no retiene el colorante cristal violeta.
Tiene una capa delgada de peptidoglicano
unida a una membrana exterior por
lipoprotenas.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a su
pared celular. Esta diferencia la hace el peptidoglicano, ya que es el material que le
da rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha
mayor proporcin que las Gram negativas. As que la diferencia que se observa en
la resistencia a la decoloracin, esto se debe a que la membrana externa de las
Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de
alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada
como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form
previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindo la coloracin azul-
violeta. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms
resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la
accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros
cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y
manteniendo la coloracin azul-violeta.

Tincin de Gram
Los pasos a seguir para realizar la tincin son los siguientes:

1. Fijamos la muestra mediante calor.

2. Se tien todas las bateras, Gram(+) y(-), con el Cristal Violeta (1min).
El cristal violeta es bsico y se une a componentes celulares de carga
negativa. Atraviesa la pared celular y se acumula en el citoplasma.

3. Fijamos con Lugol (1min).
Se aade el lugol, que deshidrata la membrana y cierra los poros, de esta
manera el colorante queda atrapado dentro de la pared de la bacteria y por
eso las bacterias Gram(+) se ven de color morado oscuro, el in del yodo-
lugol, funciona como fijacin y tambin acta sobre la pared de las bacterias
Gram(+) de tal manera que al agregar el decolorante (alcohol-cetona) no se
destian las bacterias.

4. Decoloramos con una mezcla alcohol-cetona (los negativos al Gram se
decoloran).
Cuando se aade el decolorante a una mezcla de clulas Gram(+) y Gram(-)
teidas con cristal violeta, las clulas Gram(+) quedan teidas de violeta, ya
que no puede atravesar la gruesa capa de murena. La pared de las
bacterias Gram(-) tienen una capa de murena ms delgada, a travs de la
cual el alcohol extrae el cristal violeta de estas clulas y su citoplasma
queda incoloro.
5. Colocamos Safranina un colorante de contraste que tie a los Gram(-),
(1min). Se coloca el colorante de
contraste para bacterias que
quedaron incoloras ya que no
resistieron la decoloracin con
alcohol-cetona, as pueden
quedar teidas de color rosa con
la safranina.
6. En la tincin se observarn de
color azul-violeta las Gram(+) y de
color rosa las Gram(-).