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2.1.

Tincin: Es el proceso por el cual las molculas de un colorante se adsorben a una


superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las clulas de los microorganismos
y poder realizar la observacin en microscopio ptico. Dado que las bacterias son casi
incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no
pueden observarse claramente sin algn tratamiento previo. De acuerdo a la reaccin que
ocurre, existen diferentes tipos de tincin:

a) Tincin simple: El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfologa celular.

b) Tincin diferencial: El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre clulas


bacterianas o entre partes de una misma clula. Estas tcnicas utilizan mas de un colorante o
bien ciertos reactivos complementarios para la tincin. Ejemplos: Tincin de Gram, Tincin de
Ziehl-Neelsen, etc.

2.2. Colorantes Los colorantes ms utilizados: azul de metileno, cristal violeta, safranina, son
catinicos y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente,
como los cidos nucleicos y los polisacaridos cidos (las envueltas externas de los
microorganismos estn por lo general cargadas negativamente).

2.3. Tincin diferencial de Gram: Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans
Christian Gram, quien la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram,
las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los
trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente
designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias).

Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis fijado con calor se
tie 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada durante 1 - 2
min. y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y
cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 2 min. Lavar y secar.

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula bacteriana sirve
para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material
de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula
gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como
algo de cido teicoico.

Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de


la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de
peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos,
lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es
peptidoglicano

Descripcin de la tincin de GRAM: Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien,
primero con una solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son
lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las
grampositivas como las gramnegativas, estn teidas de azul. El portaobjetos se cubre
entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente activo es aqu el I2; el KI
simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo
insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas grampositivas como las
gramnegativas se encuentran en la misma situacin. Se lleva a cabo despus la decoloracin,
usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal
violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros
(gramnegativos) lo hacen.

La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la
decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias
gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana
exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se
une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo
cristal violeta-yodo y la clula se decolora.
Las clulas Gram positivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms
peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente, provocando que el de
complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Despus de la
decoloracin las clulas Gram positivas son todava azules, pero las gramnegativos son
incoloras. Para poner de manifiesto las clulas gramnegativos se utiliza una coloracin de
contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica.
Despus de la coloracin de contraste las clulas gramnegativos son rojas, mientras que las
Gram positivas permanecen azules.

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