Determinacin de hemoglobina: mtodo de la cianmetahemoglobina

FUNDAMENTO Este mtodo tiene como fundamento la transformacin previa de la hemoglobina en cianmetahemoglobina (HiCN), que es muy estable y posee un color caracterstico cuya absorbancia a 540 nm puede ser cuantificada comparndola con la de varias soluciones de concentraciones conocidas de hemoglobina preparadas a partir del patrn de referencia (curva de calibracin). Los distintos compuestos de hemoglobina, excepto la sulfohemoglobina que casi nunca es significativa, se transforman en HiCN segn el siguiente proceso: Hemoglobina + Ferricianuro potsico metahemoglobina Metahemoglobina + Cianuro potsico cianmetahemoglobina MATERIAL 1. Espectrofotmetro o fotocolormetro: Estos instrumentos deben ser calibrados peridicamente mediante la solucin patrn de HiCN, preparada de acuerdo a las especificaciones del International Committee for Standardization in Haematology (ICSH) 2. Tubos: 12 x 100 mm. 3. Sangre venosa total: anticoagulada con EDTA-K3 (1,5 mg/ml) o con heparina (10 UI/ml). Puede emplearse sangre capilar. 4. Pipetas volumtricas: de vidrio y de 5 ml. 5. Pipetas automticas: de 20 l, debidamente calibradas. 6. Reactivo de Cianmetahemoglobina: Composicin (pH 7-7,4) Ferricianuro potsico [K3 Fe(CN) 6] Cianuro potsico [CNK] Fosfato monopotsico [KH2PO4] Detergente no inico* Agua destilada hasta 200 mg 50 mg 140 mg 1 ml 1000 ml

Detergentes no inicos: Tritn X-100, Nonic 218, Nonidet/40, Quolac Nic 218. El detergente no inico facilita la solubilizacin de protenas insolubles y acelera la transformacin de la hemoglobina en HiCN, de forma que aquella se completa en 3 min. Este reactivo debe tener un color amarillo plido, ser completamente transparente y tener un pH entre 7 y 7,4. La lectura de absorbancia a 540 nm utilizando agua destilada como blanco debe ser igual a cero. Para su conservacin utilizar botellas de vidrio de borosilicato opacas y mantener a temperatura ambiente (el fro modifica el color del reactivo).

7. Patrn de referencia (solucin comercial): Es una solucin de HiCN cuya absorbancia corresponde a una determinada concentracin de hemoglobina. Todo patrn de HiCN debe cumplir las especificaciones del llamado patrn primario de HiCN. 8. Patrn primario de HiCN: Se suministra a centros o personas relacionadas con programas oficiales reconocidos para la estandarizacin y el control de calidad. Este patrn, es una solucin muy estable de cianmetahemoglobina cuyas propiedades y caractersticas fisicoqumicas han sido definidas por el ICSH en base al peso molecular (64,458) y el coeficiente de extincin (44,0) de la hemoglobina ( por ej. la absorbancia de una solucin que contenga 4 x 55,8 mg de hierro hemoglobnico por litro a 540 nm). El patrn primario de HiCN se suministra en ampollas cerradas al vaco que contienen 10 ml de una solucin de HiCN correspondiente a una concentracin de hemoglobina entre 550 y 850 mg/l. La concentracin exacta de hemoglobina de cada lote se indica siempre en la ampolla.- El valor correspondiente en gramos de hemoglobina por litro se refiere al que tendra una muestra de sangre diluida y preparada convenientemente para realizar la lectura fotocolorimtrica. As, si en el frasco se indica una concentracin de 572 mg/l, significa que dicha solucin patrn posee la misma absorbancia que la de una solucin de hemoglobina de 143 g/l, si la sangre total se ha diluido 250 veces, o de 114 g/l, si la dilucin ha sido de 200 veces. El patrn primario posee un espectro de absorcin caracterstico con un pico de mxima absorbancia (A) a 540 nm y una inflexin a 504 nm. La curva de longitud de onda versus A desde =750 nm a =460 nm se observa en la Fig.1 , donde tambin se incluye la curva del reactivo. El valor de la A a 540 nm vara entre 0,400 y 0,404, y a 504 nm entre 0,248 y 0,251, segn el lote y el instrumento de lectura utilizados. El cociente A540/A504 oscila generalmente entre 1,60 y 1,62. METODO Por un lado, se efectuar el espectro de absorcin de la solucin de referencia internacional y del reactivo de Drabkin en un rango de 400 a 700 nm (Fig.1). Por otro lado se determinar la concentracin de Hemoglobina de una muestra problema siguiendo los pasos detallados a continuacin: 1. Conectar el espectrofotmetro. 2. Homogeneizar bien la sangre mediante agitacin suave con un sistema automtico (rodillos/disco giratorio) durante un tiempo mnimo de 5 min o manualmente por inversin del tubo 20 veces. 3. Pipetear 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo de ensayo limpio. 4. Mediante la micropipeta aadir 20 l de sangre homogeneizada al tubo que contiene 5 ml de reactivo de Drabkin. Al realizar esta operacin, es fundamental eliminar el exceso de sangre que pueda quedar en las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo y procurar asimismo que no quede sangre adherida a las paredes internas de la pipeta.