Materiales y mtodos Medios reactivos: TBA y HIB procedentes de Difco, el HIB de color rojo se utiliz para la pigmentacin del

fenotipo de Y.pestis. La ampicilina, cloranfenicol y L-arabinosa fueron de sigma. Los oligonucletidos fueron de IDT. Las endonucleasas de restriccin eran de New England Biolabs al igual que el Taq ADN polimerasa la cual se utiliz en todas las pruebas de PCR.vent ADN polimerasa se us para amplificar los fragmentos para la clonacin. Producto de Qiagen vinieron de Alemania se usaron para aislar el ADN de plsmidos, fragmentos de gel purificar los productos de PCR.Ligasa de T4, ADN polimerasa de T4 y fosfatasa alcalina de camarn fueron de Prometa. Cepas Bacterianas, plsmidos y condiciones de cultivo:
Colar E. coliTOP10 Genotipo Relevante o anotacin F - MCRA ( MRR - hsdRMS - McrBC ) 80 lac Z M15 lacX74 recA1 araD139 ( ara - leu )7697 Galu galK rpsL endA1 nupG Asd - derivado DH5a Pgm + , LCR - , pMT1, pPCP1 Pgm + , pMT1, pPCP1, pCD1Ap Pgm - , pMT1, pPCP1, pCD1Ap Delta P crp21 :: TT araC P BAD crp Y. pestis KIM6 + lpxP32 P lpxL lpxL Y. pestis KIM6 + Pgm - lpxP32 P lpxL lpxL KIM5 lpxP32 P lpxL lpxL ? P crp21 :: TT araC P BAD crp Y. pestis KIM6 + lpxP32 P lpxL lpxL con pCD1Ap Delta P crp21 :: TT araC P BAD crp con pCD1Ap Pgm - lpxP32 P lpxL lpxL con pCD1Ap lpxP32 P lpxL lpxL ? P crp21 :: TT araC P BAD crp con pCD1Ap Fuente o derivacin Invitrogen

6212 Y. pestisKIM6 + Y. pestisKIM6 + (pCD1Ap) Y. pestisKIM6 (pCD1Ap) 10017 10015 10028 10030 10015 (pCD1Ap) 10017 (pCD1Ap) 10028 (pCD1Ap) 10030 (pCD1Ap) Plsmido pKD46 pYA4373 pYA4576

[58] [59] [59] [48] [31] Este estudio Este estudio Este estudio 10015 [31] 10028 10030 Fuente

pYA4577 pYA4578

Red recombinado plsmido El gato - sacB casete en el Pst I y Sac I sitios de pUC18 Los lpxP -U- lpxP fragmentos-D ligados por la superposicin de sitios de endonucleasas de restriccin que contienen PCR ( Pst I y Sac I) cerca del centro del fragmento fueron clonados enEco RI y Hin dIII sitios de pUC18 El P lpxL :: lpxL fragmento de gen cortado de pYA4455 se clon en el Pst I y Sac I sitios de pYA4576 El gato - sacB casete de pYA4373 se lig en Pst I sitio de

[60] [39] pUC18

pYA4576 pYA4577

Colar

Genotipo Relevante o anotacin pYA4577

Fuente o derivacin

En la anterior tabla se manifiestan el nmero de bacterias, las cuales se almacenan a -70 C en glicerol tamponado con fosfato. La clulas de Y.pestis se cultivaron rutinariamente a 28 C en agar de rojo Congo de las existencias de glicerol y luego se cultivaron en caldo de infusin de corazn (HIB, Difco) o en base de agar sangre triptosa-(TBA,Difco). Construccin de Plsmidos: Todos los primers que se utilizaron se resumen en la siguiente tabla:
Plsmido pKD46 pYA4373 pYA4576 Fuente [60] [39] pUC18

Red recombinado plsmido El gato - sacB casete en el Pst I y Sac I sitios de pUC18 Los lpxP -U- lpxP fragmentos-D ligados por la superposicin de sitios de endonucleasas de restriccin que contienen PCR ( Pst I y Sac I) cerca del centro del fragmento fueron clonados enEco RI y Hin dIII sitios de pUC18 El P lpxL :: lpxL fragmento de gen cortado de pYA4455 se clon en el Pst I y Sac I sitios de pYA4576 El gato - sacB casete de pYA4373 se lig en Pst I sitio de pYA4577

pYA4577 pYA4578

pYA4576 pYA4577

Opciones de tabla

Primer conjuntos de lpxP-U1/lpxP-U2 y lpxP-D1/lpxP-D2 se utilizaron para amplificar lpxP -U (upstream secuencia gentica de lpxP, -330 a -843 pb) y lpxP (downstream secuencia genticaD de lpxP , desde 1.028 hasta 1.517 pb) respectivamente. Los lpxP -U y lpxP fragmentos-D se ligaron mediante la superposicin de PCR usando primers lpxP-U1 y lpxP-D2, que contienen regiones de complementariedad. El producto de PCR resultante contena diseado Pst I y Sac I, sitios de restriccin cerca del centro del fragmento. El producto de PCR se digiri con Eco RI y Hin dIII y se lig en pUC18 digerido con las mismas enzimas para construir el plsmido Pya4576. El P lpxL lpxL fragmento del gen se amplific a partir 6212 usando lpxL primer1 y lpxL primer2. Entonces, la P lpxL lpxL fragmento se lig con Eco RI y Hin dIII digerido pYA4576 para construir el plsmido pYA4577. El gato sacB fragmento en el plsmido pYA4373 fue amplificado utilizando primers cat-sacB 1 y el gato-sacB 2. PYA4577 plsmido fue digerido con Pst I, desfosforilado por la fosfatasa alcalina de camarn y se lig con el gato-sacB casete para formar el plsmido pYA4578. La secuencia de ADN del inserto en pYA4578 se confirm por secuenciacin del ADN. Construcciones de Strain: La mutacin de El lpxP32 se introdujo en Y. Pestis para construir cepas x10015,x10028 y x10030 utilizando el mtodo de recombinacin de dos paso como se ha descrito previamente.

Lpido A aislamiento y anlisis estructural:

Las cepas se sembraron a cabo en Bacto HIB en placas de agar suplementadas con rojo congo y galactosa, las cepas se cultivaron en Bacto HIB a 26-37 grados en cultivos de una noche donde se mira variables en el tamao, acto seguido se procedi a la sedimentacin por centrifugacin. El sobrenadante se aspir para dejar solo la sedimentacin. El resultado se resuspendieron en 20 ml de PBS y se transfirieron a botellas de Nalgene de Cloroformoseguras, se aadi cloroformo y metanol. Las suspensiones de clulas se agitaron a temperatura ambiente, luego se procedi por centrifugacin, los sobrenadantes que contienen fosfolpidos se descartaron y se resuspendieron con mezcla de Bligh/Dyer. Al final se obtiene el Lipido A y el anlisis se realiz utilizando el software Analyst QS (ABI / MDS Sciex). Anlisis de virulencia en ratones: Los estudios con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Gua para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto Nacional de Salud y los protocolos fueron aprobados por la Universidad Estatal de Arizona Cuidado de Animales y el empleo Comisin. Las colonias individuales de cada cepa se utilizaron para inocular cultivos de HIB y se hicieron crecer durante la noche a 26 C. Para seleccionar para el plsmido pCD1Ap, se aadi ampicilina al medio a una concentracin de 25 g / ml. Las bacterias se diluyeron en 10 ml de HIB fresca enriquecida con 0,2% de xilosa y 2,5 mM CaCl 2 para obtener un OD 620 de 0,1 y se incubaron a 26 C para las infecciones sc (peste bubnica) o a 37 C en las infecciones (peste neumnica ). Ambos cultivos se hicieron crecer a un OD 620 de 0,6. Las clulas se recogieron a continuacin y el sedimento se resuspendi en 1 ml de PBS isotnico. Hembra de 7 semanas de edad, ratones Swiss Webster de Charles River Laboratories se inocularon mediante inyeccin sc con 100 l de suspensin bacteriana o con 20 l de suspensin bacteriana. El nmero real de unidades formadoras de colonias (UFC) inoculados se determinaron mediante siembra de diluciones en serie sobre agar de TBA. Para determinar el 50% de la dosis letal (LD 50 ), cinco grupos de seis ratones se infectaron con diluciones en serie de bacterias. Los ratones se controlaron dos veces al da durante 21 das, y la LD 50 se calcul como se describe. Para el anlisis de la colonizacin / difusin, grupos de ratones se inocularon sc o ya sea en A los tiempos indicados despus de la infeccin, 3 ratones para cada punto de tiempo se sacrificaron, y se recogieron y pesaron muestras de sangre, los pulmones, el bazo y el hgado. La carga bacteriana para cada rgano se determin mediante diluciones en placas de los tejidos homogeneizados sobre las placas que contienen TBA 25 mg / ml de ampicilina y se reporta como UFC por gramo de tejido o UFC por ml de sangre. Las infecciones se realizaron en al menos dos experimentos independientes. En el anlisis de citoquinas in vivo: Muestras de bazo de pulmn y Y. pestis ratones infectados fueron recogidos en varios puntos de tiempo y se fijaron por inmersin en 10% formalina tamponada neutra en recipientes con tapn de rosca.Despus de 3 das, los tejidos fueron trasladados a nuevos recipientes con formol fresca, procesada, se seccionaron a 5 micras, montados en portaobjetos de vidrio y se tieron con hematoxilina y eosina (HE).La esterilidad de los tejidos fijados se confirm mediante recuento por placa antes del examen histopatolgico. Se analizaron los tejidos de los tres animales por grupo para histopatologa, y se presentan los datos de los tejidos representativos.

En el anlisis de citoquinas in vivo: Ratones Swiss-Webster se inocularon sc con 1,35 x 10 3 UFC de Y. pestis KIM6 + (pCD1Ap) o 1,61 107 UFC de 10030 (pCD1Ap) o con 1,67 10 4 UFC de Y. pestis KIM6 + (pCD1Ap) o 1,93 10 4 UFC de 10030 (pCD1Ap). Un grupo de ratones no infectados sirvieron como controles. Se tomaron muestras de los ratones inoculados sc en los das 2, 4 y 6 despus de la inoculacin y de los ratones inoculados en al 12, 24, y 48 h despus de la inoculacin, tres ratones de cada punto de tiempo y el grupo fueron sacrificados y se recogi la sangre. Los sueros se filtr a travs de filtros de jeringa de 0,22-micras y se cultivaron en placas de TBA para confirmar su esterilidad. Se midieron los niveles de citocinas y quimiocinas usando un ensayo multiplex con BioPlex (Bio-Rad). Determinacin de la eficacia protectora: Y. pestis cepas se cultivaron como se describi anteriormente. Dos grupos de ratones SwissWebster (10/grupo) se vacunaron sc con 1,4 10 7 UFC de 10030 (pCD1Ap) clulas en 100 l de PBS y otros dos grupos de ratones (10/grupo) fueron vacunados con 2,5 10 5 CFU de 10030 (pCD1Ap) clulas en 20 l de PBS en el da 0. Otros dos grupos de ratones (4/group) fueron inyectados con 100 l de PBS como controles. La sangre se recogi para la medicin de anticuerpos por sangrado submandibular en 2 y 4 semanas despus de la inmunizacin. Los ratones se anestesiaron ligeramente con una mezcla de ketamina y xilazina va intramuscular antes del sangrado. El da 35, los animales fueron desafiados sc conY. pestis KIM6 + (pCD1Ap) a 3,57 10 7 ufc en 100 l de PBS o ligeramente anestesiados con una 1:05 xilazina / mezcla de ketamina y desafiados con 1,24 10 4 UFC en 20 l de PBS. Los grupos de control fueron desafiados con 1,3 10 3 UFC por ambas vas. Se observaron todos los animales infectados durante un perodo de 15 das para el desarrollo de los signos de la infeccin por la peste. Inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA): Se utiliz ELISA para anticuerpos de ensayo de IgG en suero contra Yersinia lisados de clulas enteras (YPL) de Y. pestis KIM6 + (pCD1Ap). Poliestireno de 96 pocillos de placas de microtitulacin de fondo plano (Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA) se revistieron con 200 ng / pocillo de antgeno YPL. Los procedimientos fueron los mismos que los descritos anteriormente. El anlisis estadstico: Prueba de log-rank se utiliz para el anlisis de las curvas de supervivencia. Los datos se expresan como media desviacin estndar. Un anlisis ANOVA (software SAS) se utiliz para evaluar las diferencias en el ttulo de anticuerpos. Un P -valor <0,05 fue considerado significativo.