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LABORATORIO DE BIOQUMICA UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO INFORME DE RESULTADOS PRACTICA # 2.

- DESNATURALIZACIN Y RECONOCIMIENTO DE AMINOCIDOS

CRISTIAN BAQUERO- DARLIN GARCA INGENIERIA QUMICA TABLA DE RESULTADOS: Mtodo de Desnaturalizacin Muestra Leche No Clara No Reactivo Observaciones/Resultados (+) desnaturalizacin, descenso de solubilidad presentando una pequea precipitacin al fondo del tubo. (+) desnaturalizacin, presentando coagulacin y color blanco; prdida de solubilidad. (+) desnaturalizacin, se presenta una fuerte precipitacin y una fase liquida blanca translucida. (+) desnaturalizacin, se presenta precipitacin y una fase liquida blanca translucida. (+) desnaturalizacin, se presenta una fuerte precipitacin y una fase liquida blanca translucida. (+) desnaturalizacin, se observa una precipitacin y una fase liquida blanca translucida. (+) se presenta poca precipitacin de color blanco y un lquido totalmente transparente (+) se presenta poca precipitacin, liquido totalmente blanco difcil observacin de la precipitacin. (+) se present un gran volumen de precipitacin de color blanco intenso, la fase liquida tenia color blanco translucido (+) se presenta poca precipitacin de color blanco y un lquido blanco translucido, (+) se presenta poca precipitacin, liquido totalmente blanco difcil observacin de la precipitacin. (+) se present un gran volumen de precipitacin de color blanco intenso, la fase liquida no presenta coloracin (transparencia)

Desnaturalizacin trmica

leche Desnaturalizacin por pH extremo Clara

HCL NaOH HCL

NaOH NaCl MgCL2

Leche

(NH4)2SO4 Precipitacin por sales NaCl MgCL2

Clara

(NH4)2SO4

Etanol Leche Acetona Etanol + Acetona Desnaturalizacin por presencia de solventes orgnicos Clara Acetona Etanol + Acetona Etanol

(+) desnaturalizacin, presenta precipitado total. (+) desnaturalizacin, presenta precipitado total. (+) desnaturalizacin, formacin de precipitado en la primera fase del solvente como tal. (+) desnaturalizacin, formacin de precipitado en la segunda fase como parte flotante en el solvente. (+) desnaturalizacin, formacin de precipitado en la segunda fase como parte flotante en el solvente. (+) desnaturalizacin, formacin de precipitado en la segunda fase como parte flotante en el solvente. (+) desnaturalizacin, formacin de sales en preciptacin y coagulacin de protenas. Formacin de dos capas: Inferior, color transparente y superior color amarillo (color del reactivo) con sales. (+) desnaturalizacin, formacin de sales en precipitacin y coagulacin de protenas. Se hace una capa inferior de color amarillo turbio y una capa superior de aspecto viscoso de color transparente (+) desnaturalizacin, formacin de sales en precipitacin y coagulacin de protenas, color blanco. (+) Desnaturalizacin, formacin de sales en precipitacin y coagulacin de protenas. Formacin de dos capas: Inferior, color transparente y superior color amarillo (color del reactivo) con sales. (+) Desnaturalizacin, formacin de sales en precipitacin y coagulacin de protenas. Se hace una capa inferior de color amarillo turbio y una capa superior de aspecto viscoso de color transparente (+) Desnaturalizacin, formacin de sales en precipitacin y coagulacin de protenas, color blanco. (+) Desnaturalizacin, presencia de precipitado en alto volumen de color amarillo, la fase liquida del material estudiado toma coloracin naranja intensa

cido pcrico

Leche cido ntrico

Desnaturalizacin por formacin de sales

cido tricloroactico

cido pcrico

Clara

cido ntrico cido tricloroactico Desnaturalizacin por metales pesados Nitrato de mercurio

Leche

Acetato de plomo

Sulfato cprico

Nitrato de mercurio

Clara

Acetato de plomo

Sulfato cprico

(+) Desnaturalizacin, formacin de precipitado de color gris intenso, la muestra total presenta variabilidad en los tonos de color gris. (+) Desnaturalizacin, presencia de capas protenicas en la mezcla las cuales quedan inmersas en el material estudiado y poco precipitado. Se presenta una coloracin azul en la baja del tubo de ensayo por consecuencia del sulfato. (+) Desnaturalizacin, presencia de precipitado en alto volumen de color amarillo, la fase liquida del material estudiado toma coloracin naranja intensa (+) Desnaturalizacin, formacin de precipitado de color gris intenso, la muestra total presenta variabilidad en los tonos de color gris. (+) Desnaturalizacin, presencia de capas protenicas en la mezcla las cuales quedan inmersas en el material estudiado. Se presenta una coloracin azul en la baja del tubo de ensayo por consecuencia del sulfato.

ANLISIS DE RESULTADOS: PROCEDIMIENTOS DE DESNATURALIZACIN: Desnaturalizacin trmica: Al tener las dos muestras (3ml de leche y 3ml de clara de huevo) en bao de mara se presentaron cambios de precipitacin en cada una de las muestras. La muestra que contena clara de huevo se desnaturaliz totalmente tornndose a un color blanco, con prdida de solubilidad y tom una forma coagulada (forma cocida). Por sobre 40C a 50C la mayor parte de las protenas son cada vez ms inestables y comienzan a desnaturalizarse, por lo comn con prdida de solubilidad (1). Desde el tipo de temperatura mencionado anteriormente, empez la desnaturalizacin en el caso de la clara de huevo teniendo como resultado una menos estabilidad, pues la albumina (protena mayoritaria en la clara) es un tipo protena globular que se encuentra enrollada adoptando una forma
esfrica; el calor hizo que las cadenas de protena se desenrollen y formen enlaces que unan unas cadenas con otras, de esta manera se pudo observar la formacin de coccin y color blanco en la clara al ser sometida a temperaturas altas.

Por otra parte, en el caso de la leche, la desnaturalizacin fue un poco menos inestable. Segn su composicin en protenas la leche contiene protenas globulares y entre ellas la Casena que precipita cuando se acidifica la leche a a pH 4,6 y debido a esto, a la casena se le suele calificar como protena insoluble de la leche. A disimilitud de gran cantidad de protenas, hasta la de la leche, la protena de casena no precipita por el acto de calor (2). Sin embargo, la leche present desnaturalizacin pues otras protenas como la lactoalbmina contenidas en la leche, son de tipo soluble y se precipitan fcilmente con el calor, por lo tanto dio prueba positiva.

Figura 1. Desnaturalizacin trmica con leche

Figura 2. Desnaturalizacin trmica con clara

Desnaturalizacin por pH extremo:

En este proceso se tomaron 6 ml de la muestra (leche y clara de huevo) para cada ensayo se introdujeron en 2 tubos con una proporcin de 3ml a cada tubo, luego se agregaron 0.5 ml de cido clorhdrico y al otro se le agrego 0.5 ml de hidrxido de sodio. Los 2 tubos se colocaron a bao mara durante 20 minutos. Tras verificar la prueba con HCl y NaOH que fue calentada se observ un precipitado color blanco y una fase liquida la cual es HCl o NaOH con agua la cual compone en gran proporcin a la clara de huevo y a la leche. La desnaturalizacin de la protena se da porque al inducir un pH acido extremo (HCl) en el medio donde se encuentra la protena esta se ionizara agregando iones cidos (H+) a los aminocidos que la constituyen y estos restablecen su forma activa acida rompiendo las interacciones estructurales que existen para dar forma a la protena. En el pH bsico extremo (NaOH) la protena se desprotona an ms ya que la solucin bsica tiende a quitar los iones hidrogeno de los aminocidos que forman la protena destruyendo las interacciones no covalentes entre los hidrgenos (puentes de hidrogeno) y se desnaturaliza. El calor al que fue expuesta la mezcla de la leche y la clara de huevo con los diferentes reactivos (bsico y acido) ayuda a elevar la energa de vibracin de las molculas y rompen junto al PH extremo las interacciones covalentes (uniones di sulfuro) que existen as dando ms efectividad al proceso desnaturalizante y precipitando el esqueleto de aminocidos que constituye la protena. (3) Precipitacin por sales:

En este proceso se tomaron 15 ml de cada muestra (leche y clara de huevo) y se tomaron para cada una 3 tubos de ensayo a los cuales se les agrego estas soluciones en una proporcin de 5 ml a cada uno. En la primera prueba se agreg gota a gota cloruro de sodio agitando suavemente, en la segunda prueba se agreg gota a gota cloruro de magnesio y en la ltima prueba se agreg gota a

gota sulfato de amonio. Se le agregaron los reactivos gota a gota hasta que las muestras presentaran algn cambio (precipitado). En este proceso tras agregar en las muestras de clara de huevo y leche las concentraciones salinas presentan dos procesos llamados salting-in y salting-out. Donde el salting-in es la poca concentracin salina en la solucin, las molculas de sal se adhieren a las cadenas polipeptidicas de la protena y las van separando para que as toda su estructura sea hidrosoluble. En el proceso de salting-out hay exceso en la concentracin de molculas salinas lo que hace que por esta concentracin las cadenas polipeptidicas se unan de nuevo estableciendo la protena con su centro hidrofbico y quede encapsulada por la sal la cual se precipita junto con la protena. En las dos pruebas con cloruro de sodio y cloruro de magnesio el proceso de salting-out tomo un mayor tiempo ya que las concentraciones salinas eran pocas para la cantidad de protena existente en la muestra, al final se detall un precipitado salino escaso. En la tercera prueba con sulfato de amonio se presento una precipitacin grande y detallada el proceso de salting-out tomo poco tiempo. (4) Desnaturalizacin por presencia de solventes orgnicos: Los solventes orgnicos utilizados para la desnaturalizacin de la clara de huevo y la leche fueron etanol y acetona de 5ml cada uno por cada muestra, individualmente. Como se pueden observar en las imgenes (figura,) la clara de huevo en los solventes orgnicos de etanol, acetona y mezcla de estos dos solventes present desnaturalizacin un poco menos inestable, a comparacin de la leche (totalmente disuelta y precipitada), trastornndose a precipitado en una capa superior con aspecto viscoso (protenas desnaturalizadas). Por otra parte, a desnaturalizacin con presencia de estos solvente con respecto a la muestra con leche fue inestable pues se precipit totalmente en los dos solventes presentando una solucin ms trasnparentosa y con coagulacin en las paredes. Se puede tambin observar (), que en el caso del precipitado en las solucin de la combinacin de los dos solventes orgnicos (etanol + acetona) las protenas que fueron desnaturalizadas, se precipitaron yndose hacia una capa inferior del solvente. Qumicamente y fsicamente, al cambiar las protenas a un sistema con disolventes orgnicos se logra un desdoblamiento o desplegamiento parcial por el rompimiento de las interacciones hidrofbicas y puentes de H que se mantienen, pero en una estructura distinta de la nativa( 5). Una molcula de protena en un solvente acuoso logra disolverse mejor si tiene una distribucin de las cargas ms uniformes y en un menor momento dipolo. Los cambios de constante dielctrica al cambiar de solvente a la protena modifican necesariamente las fuerza de atraccin entre los residuos de las protenas y esto explica la precipitacin que sufren las protenas cuando se aaden solventes miscibles, como acetona o etanol, a las soluciones acuosas de protenas( 6),

pues estos tienen constantes dielctricos bajas de modo que al agregarlos a una solucin acuosa de protenas baja la constante dielctrica del medio, lo que favorece la interaccin de los grupos con carga elctrica de la protenas y por lo tanto de su precipitacin. Los solventes pueden llegar a distorsionar la estructura de las protenas, posiblemente por accin a nivel de los enlaces hidrofbicos, determinando la desnaturalizacin de las protenas.
Desnaturalizacin por formacin de sales:

En este procedimiento, a cada muestra de 5ml se le aadieron 2ml de cido ntrico, cido tricloroactico y cido pcrico, individualmente. Teniendo

las dos muestras con los diferentes cidos aplicados (individualmente cada uno), se pudo observar previamente las desnaturalizaciones que se presentaron en los diferentes cidos. Con las dos muestras que se tenan (clara de huevo y leche), al ser aplicado el cido pcrico las muestras tornaron a color amarillo (color del reactivo) y se formaron precipitaciones dando forma de coagulacin y presentando formacin de sales en la capa inferior de los tubos. Lo mismo ocurri con el cido ntrico, hubo formacin de precipitado en la capa inferior vindose la separacin de protenas y coagulacin de las protenas, se pudo observar un color amarillo pastel en la capa inferior de los tubos. Por ltimo, con el cido tricloroactico las muestras formaron precipitacin desnaturalizndose totalmente en una fase medio viscosa y formando sales.
Todos estos cidos hicieron precipitar las protenas por que forman con ellas sales insolubles. El mecanismo de accin de estos agentes es la siguiente: los precipitantes cidos forman sales insolubles con las formas catinicas (+) de la protena, siendo necesario efectuar el proceso de un pH ms cido que el punto isoelctrico (1) el q no tiene), de tal forma que hace que las protenas puedan precipitarse de la solucin acuosa por la adicion de ciertos cidos, como los que se trabajaron en el laboratorio, produciendo cambios en el pH, efecto de acidez que hace que la protena precipite con un pH menos o igual al de 4.6 (casena). Desnaturalizacin por metales pesados:

En este ensayo se tomaron 9 ml de clara de huevo y 9 ml de leche los cuales fueron adicionados en 6 tubos de ensayo en proporcin de 3 ml cada uno. En el primer ensayo se tomaron un tubo de leche y de clara de huevo y se agregaron 10 gotas de nitrato de mercurio. En el segundo ensayo se tom un tubo de leche y otro de clara y se agregaron 3 gotas de acetato de plomo ya que el reactivo estaba muy concentrado y para finalizar en la ltima prueba con los ltimos 2 tubos de agrego 10 gotas de sulfuro cprico a todas la pruebas se les agito suavemente y se dejo reposar. En este ensayo se identific por coloracin y precipitacin la desnaturalizacin de las protenas presentes en las 2 muestras. Los metales pesados deben estar en una solucin la cual tenga un pH optimo ya sea acido o bsico para que los metales se unan a la protena creando las unidades insolubles que la precipiten, estos metales al unirse a la cadena polipeptdicas pueden llegar a romper enlaces estructurales lo que hace que la protena se desnaturalice. (7)

TABLA DE DATOS:

Reaccin Acetato de Plomo alcalino

Muestra Leche Clara

Observaciones/ Resultados (+) Formacin precipitado caf (+) Formacin precipitado caf oscuro (+) Formacin precipitada amarillo claro en la capa superior. Color amarillo en la capa inferior. Formacin precipitado blanco en la capa superior. Color naranja en la capa inferior (+) Formacin ms o menos definida de anillo violeta en la interface (+) Formacin definida de anillo violeta en la interface (+) Formacin precipitado color amarillo claro en la capa superior (+) Formacin precipitado color amarillo claro en la capa superior

Leche

Clara Xantoprotica Leche Clara Leche Clara

Hopkins Cole

Ehlrich

ANALISIS DE RESULTADOS: PROCEDIMIENTO PARA EL RECONOCIMIENTO DE AMINOCIDOS:

Reaccin con acetato de plomo alcalino: En esta prueba se tomaron 3 ml de solucin acuosa de la muestras y se le aplicaron 2 ml de NaOH ms 2 ml de acetato de plomo dejando es bao de mara. En esta reaccin se pudo observar el cambio de coloracin, de un color blanco precipitado a un color caf oscuro despus de ponerlos en bao de mara. Esta reaccin reconoce los aminocidos azufrados como Metionina, Cistena y Cistina; se reconocen por la formacin de precipitados de Sulfuro de Plomo de color gris oscuro o negro que se forman cuando reacciona con Acetato de Plomo en medio alcalino (8). Reaccin Xantoproteica: En esta prueba se tomaron 3 ml de cada muestra (clara de huevo y leche) las cuales se agregaron en tubos de ensayo respectivamente. Se agrego 1 ml de HNO3 a cada muestra la cual se introdujo a bao Maria por 15 minutos y luego se les dio un bao de hielo hasta que se enfriara el materia para finalizar se les agrego a cada muestra gota a gota una solucin de NaOH al 40 % hasta que se presento el cambio. En el ensayo los aminocidos que se identificaron fueron la tirosina, el triptfano y la fenilalanina los cuales son aromticos y reaccionan con acido ntrico que es un constituyente del reactivo para la prueba Xantoproteica el cual forma nitro derivados identificados por una formacin de color amarillo en la segunda fase liquida de la muestra.(9)

Reaccin de Hopkins Cole: En esta prueba se tomaron 2 ml de cada muestra las cuales se agregaron en 2 tubos de ensayo por separado, se agregaron 2 ml del reactivo de Hopkins cole en cada tubo se mezclo medianamente fuerte el contenido y se agreg 1 ml de cido sulfrico concentrado y agitar suavemente para generar la reaccin y se presente la interface. En este ensayo, tras agregar el reactivo de Hopkins cole, se une al anillo indolico del triptfano y se introduce el cido sulfrico concentrado reaccionando rpidamente con el reactivo que est unido al aminocido formando un anillo de color violeta. (9)

Reaccin de Ehrlich: Para esta prueba se inicia agregando los reactivos en 2 tubos de ensayo, primero 1 ml de cido sulfanilico al 0.5 % en cada tubo y 1 ml de nitrito de sodio se deja reposar por 15 minutos. Luego se agregan 1 ml de las muestras por separado a los tubos y para finalizar se adicionan 0.5 ml de NH4OH 10% a cada tubo y se deja reposar para detallar la veracidad de la prueba. En este ensayo se identifico por coloracin la presencia de tirosina e histidina los cuales tienen en su estructura anillos aromticos y/o nitrogenados. Esta coloracin se da porque el nitrito de sodio

y el cido sulfanilico se unen a el residuo o anillo aromtico y/o nitrogenado y por accin del NH4OH se presenta la identificacin coloreada para la tirosina e histidina. (9)

Reacciones: Reaccin de Ehrlich (10)

Reaccin Xantoproteica (11)

Reaccin de Hopkins cole (12)

Reaccin de acetato de plomo (12)

CONCLUSIONES: Desnaturalizacin de protenas: Desnaturalizacin Trmica: Para concluir esta prueba se pudo observa e identificar como una protena se puede coagular y desnaturalizar por su vibracin y rotacin la cual es realizada en accin del calor. Desnaturalizacin por pH extremo: en esta prueba se pudo concluir como una protena por accin de pH extremadamente cido y bsico se puede desnaturalizar ya que esta se llega a protonar o desprotonar y romper las uniones no covalentes que existen en sus estructura y por accin del calor se rompen las uniones covalentes. Desnaturalizacin por precipitacin de sales: se pudo concluir tras esta prueba que al agregar soluciones salinas en un medio acuoso donde se encuentra la protena esta se solubilizara parcialmente y luego se precipitara por accin de las altas cantidades de sal. Desnaturalizacin por presencia de solventes orgnicos: En esta prueba, las protenas se desnaturalizaron debido al rompimiento de las interacciones hidrofbicas y puentes de hidrgeno logrando distorsionar la estructura de las protenas, por lo tanto, su precipitacin. Desnaturalizacin por formacin de sales: Las protenas forman sales insolubles con los cidos, presentando precipitacin por el pH cido que contiene las protenas y los reactivos por el efecto de acidez haciendo de este modo que precipite la protena.

Desnaturalizacin por metales pesados: se pudo observar la precipitacin de las protenas desnaturalizadas por accin de los iones metlicos los cuales rompen las uniones covalentes de la protena y el pH de la solucin donde estn inmersos los metales y la protena rompe los enlaces no covalentes dejando as a la protena desnaturalizada y precipitada.

Identificacin de aminocidos: Reaccin con acetato de plomo alcalino: Reconoce los aminocidos que contienen grupos sulfato, de manera que las protenas contenidas en la leche y la clara de huevo contienen aminocidos azufrados como la metionina, cistena y cistina, reaccionando con el sulfuro de plomo formando precipitados de color caf. Reaccin xantoproteica: se pudo concluir tras esta reaccin los los anillos aromticos presentes en aminocidos que constituyen protenas por accin del acido ntrico dando concentrados de color amarillo. Reaccin de Hopkins cole: tras este ensayo qumico se concluy el reconocimiento del triptfano por accin del cido glioxilico el cual forma complejos o anillos de color violeta. Reaccin de Ehrlich: se pudo concluir en este ensayo la presencia de aminocidos con anillos aromticos (tirosina) tras sufrir la reaccin de cido sulfanilico con nitrito de sodio el cual forma sales de diazonio que se encargan de dar la forma coloreada y precipitada al aminocido que se busca.

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