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PRINCIPIOS BASICOS DE CROMATOGRAFIA

Por: Blago Razmilic Merck Qumica Chilena Soc. Ltda.

5.1. FUNDAMENTOS
El fundamento de la mayora de las tcnicas cromatogrficas es un equilibrio de fases. El soluto se distribuye entre una fase mvil y una fase estacionaria.

[X]m = concentracin de soluto X en la fase mvil; [X]s = concentracin de soluto X en la fase estacionaria.

El coeficiente de distribucin Kx, para el soluto X, est dato por:

Si el coeficiente es independiente de la concentracin, un grfico de [X]m vs [X]m es lineal y el sistema cromatogrfico es lineal, en cambio si vara con las concentraciones el sistema es no lineal. La linealidad es un requisito para la eficiencia y los peak obtenidos corresponden a un peak agudo de tipo Gaussiano. La velocidad de migracin de un soluto est caracterizada por:
tiempo de retencin. Corresponde al tiempo transcurrido desde que se inyecta la muestra en el sistema, hasta la deteccin del mximo del peak de elucin; volumen de retencin. Corresponde al volumen total de eluyente que fluye por el sistema VR = durante el tiempo de retencin: VR = tR. Fc Fc = velocidad de flujo de la fase mvil (ml/minuto) a la temperatura de la columna; t'R = tR - tM Vm = tM Fc t'R = tiempo de retencin corregido; t'M = tiempo muerto (lo que demora en salir una especie no retenida,t0); Vm = volumen muerto o volumen intersticial de la columna; V'R = t'[Link] V'R = volumen de retencin corregido. tR =

El coeficiente de distribucin termodinmico Kx es una medida del grado de retencin del compuesto X. El factor de capacidad K'x es una medida ms prctica que puede ser determinada directamente del cromatograma. Est dado por:

La relacion entre el volumen de retencin y el factor de capacidad es:

VR = Vm(1 + K'x) = Vm + VmKx

Vs = volumen de fase estacionaria. En cromatografa de adsorcin Vs se reemplaza por el rea del adsorbente (Am).

Reemplazando los volmenes por los tiempos nos queda:

El tiempo de retencin tambin puede ser corregido por la temperatura y la presin. Esto no es necesario en cromatografa de gases es primordial. El volumen de retencin especfico VG, incorpora estas correcciones y constituye el volumen neto de eluyente a 0C necesario para transferir la mitad del soluto en un sistema normalizado a 1 gramo de fase estacionaria y sin presin en la gota.

Tc Wm j

= temperatura de la columna en grados Kelvin; = peso en gramos de fase estacionaria; = presin corregida dada por:

Pi Po

= =

presin interna; presin externa.

5.2. EFICIENCIA DE LA COLUMNA

La medida cuantitativa de la eficiencia es el nmero de platos tericos n, el cual en trminos de tiempos de retencin es:

Wh = anchura del peak a la altura media; o el volumen de retencin:

mientras que el nmero de platos tericos efectivos N, est en base del tiempo de retencin corregido:

w = anchura del peak. Por otra parte, el nmero de platos efectivos N, est relacionado con el nmero de platos tericos:

obviamente el nmero de platos tericos efectivos aumenta con la longitud de la columna, por lo tanto para comparar diferentes fases estacionarias es ms conveniente considerar la altura del plato equivalente (HEPT) h, o la altura del plato equivalente efectivo H, los cuales estn definidos por:

L = altura de la columna.

5.3. RESOLUCIN
Los solutos se separan en una columna cromatogrfica cuando sus velocidades de migracin son diferentes. La eficiencia de una columna se mide en trminos del nmero del platos tericos (n) o mejor an del nmero de platos tericos equivalentes (N), mientras que la eficiencia del solvente se cuantifica en trminos de retencin relativa () dos solutos A y B.

tRA tRB tRA tRB

= = = =

tiempo de retencin no corregido de A; tiempo de retencin no corregido de B; tiempo de retencin corregido de A; tiempo de retencin corregido de B.

El efecto combinado de la eficiencia de la columna y del solvente se expresa en trminos de la Resolucin (Rm) de la columna. Rm = 2(tRB - tRB) W A + WB
WA WB = = anchura de la base del peak A; anchura de la base del peak B.

Si W A = W B

En general la resolucin es funcin del factor de capacidad K'x y la retencin relativa y el nmero de platos tericos en funcin del segundo soluto (n B):

o en funcin del nmero de platos tericos efectivos (NB)

factor de selectividad factor de capacidad

= eficiencia

La resolucin puede modificarse alterando las propiedades termodinmicas del sistema (el cual cambia y K') o las condiciones de la columna (velocidad de flujo, tamao de partculas, etc) para cambiar N. Efecto de la temperatura: ecuacin de Van't Hoff:

5.4. ENSANCHAMIENTO DE LAS BANDAS. CONTRIBUCION A LA ALTURA EQUIVALENTE DEL PLATO TERICO.
Cuando un soluto pasa a travs de la columna, el ancho de banda aumenta y el soluto se diluye en la fase mvil. La contribucin al ensanchamiento depender fundamentalmente de la difusin de Eddy, la difusin molecular y la transferencia de masa. En general, la contribucin a la altura equivalente del planto terico (H) es:

Hed Hsp Hld Hsm Hmp dp Dm Ds v df

= Cedp (difusin de Eddy); = Cmdp2v/Dm (transferencia de masa en la fase mvil); = CdDm/V (difusin longitudinal); = Csmdp2v/Dm (transferencia de masa desde la fase mvil retenida a la fase mvil); = Csdf2v/Ds(transferencia de masa en la fase estacionaria); = dimetro de partcula; = coeficiente de difusin del soluto en la fase mvil; = coeficiente de difusin del soluto en la fase estacionaria; = velocidad lineal de la fase mvil; = Espesor del film de fase estacionaria (principalmente para LLC, para LSC se reemplaza

por dp).

5.5. CROMATOGRAFIA DE GASES

En la cromatografa de gases, la fase mvil se llama gas portador y la fase estacionaria es un slido con propiedades adsorbentes como el carbn vegetal, gel de slice y tamices moleculares en cromatografa gas-slido (GSC) la fase estacionaria es un lquido orgnico de alto punto de ebullicin que se adhiere como una pelcula delgada sobre un soporte slido (GLC). La cromatografa gas lquido (GLC, reparto) es muy similar a la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC). Las mayores diferencias se deben a las propiedades fsicas de la fase mvil como la viscosidad, acidez, basicidad y compresibilidad. La separacin depende del factor de separacin () y de la altura equivalente del plato terico (H). El ensanchamiento de las bandas depender de la introduccin de la muestra, de la columna y del sistema detector. En la columna el ensanchamiento se produce por: i. ii. iii. Velocidad de difusin del soluto en el gas a travs de lo largo de la columna. Equilibrio no instantneo del soluto con el solvente de la fase estacionaria. Empaquetamiento y geometra de la columna.

La contribucin a la altura equivalente del plato terico est descrita por la ecuacin de Van Deemter en funcin de la velocidad del gas portador (v).

A dp B Dg Cliq Cgas

= difusin de Eddy = 2dp = dimetro de las partculas; = factor geomtrico que indica la uniformidad de empaquetamiento de la columna; = difusin longitudinal o molecular = 2Dg = coeficiente de difusin del soluto en el gas portador; = factor de correccin que tiene que ver con el camino del gas por los canales tortuosos; es una funcin del factor de capacidad, del grosor de la pelcula y de la difusin del = soluto en la fase estacionaria lquida; est relacionado con el dimetro de las partculas (dp2/Dg) en columnas empaquetadas y = del radio (r2/Dg) en las columnas tubulares abiertas.

5.5.1 El gas portador

El gas portador debe transportar los componentes voltiles de la muestra a travs de la columna. Debe ser de alta pureza. Las impurezas, en especial oxgeno y agua pueden alterar qumicamente la fase lquida y modificar los tiempos de retencin. Debe ser inerte y no reaccionar con la muestra ni con la fase estacionaria. Los gases ms utilizados son: Ar, CO2, He, H2, N2, O2. Fases mviles de bajas velocidades se consiguen con gases cuyos coeficientes de difusin son

pequeos (Ar, N2, CO2), inversamente, gases con coeficientes de difusin grandes (H2, He) se utilizan para velocidades de flujo altas. Su eleccin tambin est condicionada al sistema detector. El detector de conductividad trmica usa helio, excepto cuando se va a medir hidrgeno o helio, entonces emplea argn o nitrgeno. El detector de ionizacin de llama usa helio o nitrgeno. El nitrgeno producir ms platos tericos para una determinada longitud de columna, pero el anlisis ser mucho ms lento. El helio producir menos platos, pero el anlisis ser ms rpido y es el gas recomendado para columnas larga. El nitrgeno tiene casi el doble de sensibilidad que el helio. El detector de captura de electrones usa nitrgeno muy seco con corriente continua y argn con 5% de metano con corriente pulsada.

5.5.2 Sistemas para introducir la muestra

La muestra ya sea slida (en solucin), lquida gaseosa debe inyectarse rpida y cuantitativamenteen el gas portador. Para evitar el ensanchamiento de las bandas debe usarse la mnima canti dad de muestra posible. Para la inyeccin de muestras gaseosas se utilizan jeringas de cierre hermtico para gases y vlvulas para muestrear gases. Mientras que para la inyeccin de lquidos se usan frecuentemente jeringas de 5, 10 y 25 l. Los slidos se manejan mejor disolvindolos en un disolvente apropiado y utilizando una jeringa para inyectar la solucin.

5.5.3 Horno para la columna

Para lograr el calentamiento y enfriamiento rpido de la columna se requiere un horno de baja inercia trmica. Adems la temperatura debe ser reproducible dentro de 1C y en todo el horno los gradientes deben ser como mnimo de 2C. Las temperaturas utilizadas estn en el rango de -50C a sobre 400C. El lmite superior depende de la tolerancia a la temperatura de los materiales utilizados. Si se utiliza material de tefln la temperatura no puede ser mayor que 220250C. Existen hornos de acero inoxidable con paredes delgadas, tapas bien ajustadas y ventiladores de alta velocidad. Debido a la gran diversidad de columnas, los hornos varan enormemente en tamao y forma.

5.5.4 Columnas
Las columnas ms utilizadas consisten en un tubo con partculas de tamao uniforme las cuales son impregnadas con el lquido que constituye la fase estacionaria. El soporte slido debe cumplir ciertos requisitos que son:

i. ii. iii. iv. v.

Una superficie especfica de 1 a 20 m 2/g. Un dimetro de poros uniforme del orden de 10 o menos. Inactividad. Un mnimo de interaccin qumica y adsortiva con la muestra. Partculas de forma regular, de tamao uniforme para un relleno eficiente. Resistencia mecnica, para que no se desmorone al manipularla.

Tabla 5.1. Soportes en Chromosorb ms utilizados Propiedades

Color Tipo Densidad g/cm3 Empaquetado Area (m2/g) Area (m /cm ) Mx. pH fase lq. Manipulacin
2 3

A
Rosado Flujo calcinado 0.40 0.48 2.7 25% 7.1 Buena

G
Blanco nacarado Flujo calcinado 0.47 0.58 0.5 5% 8.5 Buena

P
Rosado Calcinado 0.38 0.47 4.0 30% 6.5 Buena Blanco

W
Flujo calcinado 0.18 0.24 1.0 15% 8.5 Se triza

5.6. FASES ESTACIONARIAS

La seleccin de la fase estacionaria es muy importante. En primer lugar debe cumplir algunos requisitos fundamentales: i. ii. iii. iv. Debe ser inerte qumicamente con la fase mvil y los constituyentes de la mezcla. Debe tener estabilidad trmica en un amplio rango de temperatura para la existencia en el estado lquido. Baja presin de vapor y baja viscosidad en el rango de temperatura deseado. Habilidad para unirse al soporte slido o superficie inerte de una columna capilar.

Se han confeccionado muchas escalas en las cuales se determinan los ndices de retencin de una mezcla de solutos en una columna en particular y en una columna con fases estacionarias relativas: Rohrshneider utiliz: benceno, etanol, butanona, nitrometano y piridina como solutos en una columna con una temperatura de 100C. La fase estacionaria fue Escualeno. La diferencia entre los ndices de retencin para un soluto A est dado por: IA=Ib, A - Ia, A
Ib, A = es el ndice de retencin de un soluto A en una fase b Ia, A = es el ndice de retencin de un soluto A en una columna de Escualeno.

Una comparacin de los valores de IA de las dos fases es una indicacin de las polaridades relativas con respecto al soluto A en que el valor de I mximo es la fase estacionaria ms polar.

Tabla 5.2. Mezcla de 10 solutos (T = 120C) utilizada por McReynolds Simbolo Compuesto
X. Y. Z. U. S. H. J. K. L. M. benceno 1-butanol 2-pentanona 1-nitropropano piridina 2-metil2pentano 1-yodobutano 1-octino 1,4 dioxano cis-hidrindano

Grupo funcional
alquenos, aromticos alcoholes, nitrilos, cidos cetonas, teres, aldehidos, steres, epxidos, dimetilamino derivados. nitro y nitrilo derivados bases aromticas N-eterocclicas compuestos de cadena ramificada, especialmente alcoholes. compuestos halogenados alquinos teres, bases esteroides apolares, terpenos, estructuras naftnicas.

5.7. CROMATOGRAFA GAS-SLIDO

En muchos casos las columnas adsorbentes presentan mayor selectividad que los lquidos de separacin. Sin embargo, las desventajas principales son la larga duracin de los anlisis y los peaks con grandes colas que dificultan el anlisis cuantitativo. Ambos problemas se resuelven con la programacin de la temperatura.

5.8. ANLISIS CUALITATIVO

El ndice de Kovats relaciona el volumen de retencin VR ( el tiempo de retencin tR) de un compuesto desconocido con otro que contiene n-hidrocarburos y que eluye antes y despus que l. Para cada serie de parafinas existe un ndice dado por:
I = 100 n n = nmero de moles de tomos de carbono de una parafina dada.

El ndice de retencin de un compuesto desconocido es calculado de:

x Vnu Vnx Vnx+1 x+1

= = = = =

nmero de carbonos del compuesto eluido antes que el desconocido; volumen de retencin corregido del desconocido (u); volumen de retencin corregido del hidrocarburo eludo antes del desconocido; volumen de retencin corregido del hidrocarburo eludo despus del desconocido; nmero de carbonos del compuesto eludo despus que el desconocido;