Tcnicas de toma y preparacin de la muestra. Homogenizacin y dilucin.

INDICE 1. INTRODUCCION. 2. MUESTREO. 2.1. Definicin de muestreo. 2.2. Condiciones que deben cumplirse en la toma de muestras. 3 TCNICAS DE TOMA DE MUESTRAS 3.1 Toma de muestras de alimentos envasados 3.2 Toma de muestras de productos a granel slidos 3.3 Toma de muestras de productos a granel lquidos 3.4 Toma de muestras de productos slidos 3.5 Toma de muestras de aguas 3.6 Concepto de muestra nica 3.6 tiles empleados en la toma de muestras 3.7. Identificacin de las muestras. 4. TRANSPORTE Y CONSERVACIN DE LAS MUESTRAS. 5. PREPARACIN DE MUESTRAS PARA SU ANLISIS. 5.1 Introduccin 5.2 Muestras slidas o pastosas que es necesario licuar. 5.3. Muestras con una elevada carga bacteriana.

1. Introduccin.
En esta unidad de trabajo nos ocuparemos de un conjunto de aspectos previos al anlisis microbiolgico en s. Nos referimos a las tcnicas de seleccin, toma y preparacin de las muestras, as como a su transporte y conservacin. La importancia de estas tcnicas no debe ser subestimada, pues un defecto en cualquiera de ellas puede invalidar los resultados del anlisis microbiolgico. Dentro del proceso analtico, la influencia del muestreo es la ms crucial, ya que de nada sirve un anlisis riguroso de nuestra muestra, si esta no representa para nada al sistema que se quiere medir. Por ejemplo, es obvio que si quiero analizar el contenido de un recipiente, debo de agitar el mismo antes de tomar la muestra, ya que de no hacerlo, parte del contenido del mismo puede haber sedimentado. Si lo que yo busco se encuentra sobre todo en esa fraccin, el resultado del anlisis, por preciso y exacto que fuera, nos informar sobre una cantidad muy inferior. Adems para el caso de la microbiologa, se da la circunstancia de que es relativamente fcil que el proceso de muestreo contamine la muestra (si los recipientes, utensilios no son estriles) aportndole microorganismos que no estaban presentes. Tambin puede ocurrir que el proceso de muestreo favorezca el crecimiento de un microorganismo frente a otros. Por ejemplo, para realizar un recuento de bacterias en el agua corriente hay que dejar el grifo abierto durante un tiempo largo antes de tomar la muestra. Si se toma la muestra nada ms abrir el grifo y este lleva varios das sin abrirse, el agua del ltimo tramo de caera llevar estancada all el tiempo suficiente para que pueda haber habido crecimiento bacteriano. Por lo tanto, la muestra contendr muchas ms bacterias que el agua corriente de la red general y los resultados del anlisis no sern ciertos para el agua corriente.

2. Muestreo.
2.1. Definicin de muestreo.

Cuando se pretende conocer el estado microbiolgico de un sistema, como alimentos envasados en porciones individuales (botellas de leche, latas de conserva, tripas de embutidos, etc.), no envasados (como canales de carnes), sistemas naturales (como un ro, un lago), etc. solo podemos analizar una pequea parte del mismo. Esta fraccin del sistema, que denominamos muestra, debe representar plenamente las propiedades a estudio del sistema. El muestreo consiste en tomar esa fraccin del sistema, de manera que la muestra recogida sea representativa.

En el caso de alimentos envasados, el muestreo consiste en tomar un pequeo nmero de muestras de 2

cada lote o remesa, elegidas de modo que estas muestras sean representativas del total. El muestreo se basa en la suposicin de que todas las muestras del mismo lote son similares por haber sufrido un trato igual. Sin embargo, hay que tener presente que a veces una unidad estropeada puede escapar al muestreo, aunque esto sucede slo en muy pocos casos. En el caso de alimentos no envasados, consistir en tomar un porcin de una manera asptica y en el caso de aguas, tomar un volumen determinado, tambin de forma asptica. 2.2. Condiciones que deben cumplirse en la toma de muestras.

Las condiciones que se deben cumplir para realizar una toma de muestras adecuada son:

a) El operador debe poseer unos conocimientos microbiolgicos generales y usar estos conocimientos aplicando el sentido comn b) Se deben conocer las caractersticas fisico-qumicas y microbiolgicas del material que se va a analizar. c) La muestra debe ser representativa del alimento que se analiza. Para ello es necesario realizar el muestreo con el procedimiento adecuado para cada caso. d) La cantidad de muestra tomada debe ser suficiente para realizar todo el proceso analtico. Es conveniente tomar al menos el doble de la cantidad mnima para tener una reserva de muestra en previsin de algn error que pueda obligar a repetir el anlisis. e) Las operaciones de toma de muestra deben preservar la identidad de la misma. Esto significa que deben evitarse contaminaciones de la muestra, lo que obliga a trabajar con instrumentos y recipientes estriles. Si por descuido del operador se produce contaminacin de una muestra con los resto de otra decimos que es una contaminacin cruzada.

3. Tcnicas de toma de muestra.

3.1 Toma de muestras de alimentos envasados

Cuando se va a hacer un muestreo de alimentos envasados de modo individual, las muestras pueden ser elegidas de manera aleatoria para ser representativas. Esto se consigue con mtodos tales como el empleo de la tabla de nmeros al azar. Este mtodo consiste en separar del lote un nmero de muestras calculado previamente, utilizando la tabla de nmeros al azar. Dicha tabla est integrada por columnas y filas de dgitos obtenidos mediante clculos estadsticos. 3

Una vez establecido el nmero de muestras que se deben tomar del lote, se numeran ordenadamente cada uno de los paquetes, contenedores o unidades del producto por muestrear. Si, por ejemplo, el lote est integrado por 200 unidades, su numeracin se marcar del 1 al 200, correlativamente. Con un lpiz se seala un lugar cualquiera en la tabla de nmeros al azar, coincidiendo con un dgito o su proximidad. Este dgito sirve de punto de partida para la separacin del nmero de muestras destinadas al anlisis.

Supongamos que se ha punteado con el lpiz un lugar que corresponde a la fila 15 y a la columna 10. Este nmero es el 1 y los que le siguen en las columnas 11 y 12 son el 4 y el 6. En este caso, la unidad que se tiene que separar del lote es la marcada con el nmero 146. A continuacin se pasa a la fila 16 y a las mismas columnas 10, 11 y 12, a las que corresponde el nmero 078, una nueva unidad que se separa del lote. Pasando a la fila 17, columnas 10, 11 y 12, figura el nmero 152, que ser tambin separado del lote. Se procede de la misma forma hasta obtener el nmero de muestras sealado previamente.

3.2 Toma de muestras de productos a granel slidos

Cuando se trata de muestrear productos a granel, si se trata de slidos lo que se hace es tomar varias 4

muestras en partes diferentes del material slido que estn alejadas entre s. Deben tomarse muestras tanto con zonas aireadas del slido como con material profundo. En los alimentos constituidos por componentes diferentes hay que asegurarse de que la proporcin de cada componente en la muestra tomada es similar a la original. 3.3 Toma de muestras de productos a granel lquidos

En los productos a granel lquidos basta con mezclar bien y tomar una muestra del lquido bien homogeneizado. Si el producto por muestrear tiene salida por un conducto, se desechan las primeras porciones antes de tomar la muestra. Si la toma es de agua de un grifo, se desinfecta ste con alcohol. Luego se abre y se desecha el agua que sale en las primeras porciones. Se cierra de nuevo el grifo y se flamea la gota que queda pendiente hasta que emita vapores. A continuacin se vuelve a abrir el grifo, dejando fluir el agua durante 1-2 minutos antes de recogerla en el recipiente estril de la toma de muestras. Este ser cerrado convenientemente en condiciones aspticas. 3.4 Toma de muestras de productos slidos

Para productos slidos (queso, jamn serrano o cocido, y similares) se tomarn las muestras en varias zonas con cuchillos, taladros, sierras, etc., estriles. Las muestras se introducirn, aspticamente, en recipientes estriles. 3.5 Toma de muestras de aguas Las muestras sern recogidas en un recipiente estril en un punto de muestreo representativo. Este apartado ser desarrollado en la unidad de trabajo correspondiente. 3.6 Concepto de muestra nica

En ocasiones, las muestras que se deben recoger son nicas, circunstancia frecuente cuando se trata de alimentos sospechosos de toxiinfeccin alimentaria. Las muestras nicas en muchos casos son irreemplazables y entonces hay que tratarlas con un cuidado especial porque su prdida o deterioro puede suponer un problema serio. 3.6 tiles empleados en la toma de muestras

En la toma de muestras de alimentos se utilizan tiles de diversos tipos:

Frascos de boca ancha y bolsas de plstico estriles. Instrumentos esterilizados para abrir envases: tijeras, cuchillos, abrelatas, sondas, etc. Sacabocados estril: para uso en alimentos slidos. Etiquetas, rotuladores y bolgrafos. Lquido desinfectante: etanol 70. Termmetro. 3.7. Identificacin de las muestras.

Las muestras recin tomadas deben ser identificadas adecuadamente y de modo inmediato. En muestras de alimentos se anotar el tipo de muestra, la fecha, el nmero de lote, el lugar de procedencia y otros datos que puedan ser interesantes en cada caso: temperatura de almacenamiento del alimento, mtodo de muestreo, precauciones para el transporte de la muestra, etc.. Estos datos se anotarn en etiquetas adhesivas que no puedan despegarse o rotuladas sobre el envase de modo que no pueda borrarse accidentalmente. Adems, las anotaciones deben ser perfectamente legibles sin que haya posibilidad de confusin.

4. Transporte y conservacin de las muestras.

El adecuado transporte y conservacin de las muestras se consigue cumpliendo una serie de requisitos:

a) El espacio de tiempo transcurrido entre la toma de muestra y el comienzo del anlisis en el laboratorio debe ser lo ms corto posible.

b) Toda muestra debe estar correctamente identificada.

c) Deben seguirse todas las precauciones necesarias para preservar la representatividad de la muestra. Esto significa que:

deben evitarse contaminaciones de las muestras durante su transporte y almacenamiento; deben evitarse sobrecrecimientos de microorganismos; esto es especialmente importante en aquellas muestras destinadas a realizar recuentos de grmenes (orina, agua, leche, etc.). La refrigeracin es un mtodo til, pero slo por tiempo limitado. 6

d)

Deben conocerse las caractersticas de la muestra para evitar su transporte y conservacin inadecuados.

e) Los envases utilizados y su manipulacin deben evitar derrames que pueden llegar a ser muy peligrosos. Los recipientes deben, por tanto, ser hermticos y mecnicamente resistentes. Debe evitarse cuando sea posible el empleo de envases de vidrio.

5. Preparacin de muestras para su anlisis.

5.1 Introduccin

Hay muestras que pueden ser cultivadas o sometidas a pruebas de identificacin tal y como se reciben en el laboratorio. Sin embargo, muchas otras deben ser preparadas (modificadas) antes del anlisis microbiolgico. Esto sucede cuando se presenta una de estas situaciones:

a) La muestra es slida o pastosa y se hace necesario licuarla. b) La muestra contiene una elevada carga de bacterias y hay que diluirla.

A continuacin estudiaremos las tcnicas utilizadas en cada una de estas situaciones, pero antes tenemos que advertir que en las operaciones de preparacin de muestras hay que guardar todas las reglas de asepsia que permitan evitar la contaminacin de la muestra.

5.2 Muestras slidas o pastosas que es necesario licuar.

En el anlisis microbiolgico de alimentos slidos o de elevada viscosidad es necesario transformar la muestra en una suspensin lquida que contenga los microorganismos repartidos de forma homognea. Esto se consigue agregando un volumen medido de diluyente estril a una cantidad pesada de muestra slida y utilizando despus algn procedimiento de trituracin y homogeneizacin.

Procedimiento. 1 Separacin de la muestra analtica.

Llamamos muestra analtica a la porcin de la muestra total (la cantidad llevada al laboratorio) que va a ser usada en el anlisis. El resto de la muestra, utilizada como reserva, no es muestra analtica. La cantidad de muestra analtica tomada para homogeneizarla debe ser suficientemente grande como para que sea representativa, como ya se mencion antes. En algunas situaciones la cantidad de muestra a homogeneizar est establecida por la legislacin sanitaria. Cuando el alimento est formado por distintos componentes (por ejemplo: una lata de cocido que contiene garbanzos, caldo y trozos de carne), la muestra analtica debe contener todos los componentes de la muestra completa y adems mantener las mismas proporciones. 2 Pesada de la muestra. Se har en condiciones aspticas. Puede operarse de dos formas:

a) Se pesa la cantidad exacta de muestra y despus se agrega un volumen previamente medido de diluyente. b) Cuando resulta difcil pesar una cantidad exacta de muestra, se pesa una cantidad aproximada y despus se mide el diluyente necesario en una probeta estril. 3 Diluyente. La principal caracterstica que debe tener un diluyente es no producir modificaciones cualitativas ni cuantitativas en la flora de la muestra, es decir, debe mantener lo ms fielmente posible la flora de la muestra sin suprimirla ni favorecer su desarrollo. En microbiologa alimentaria se utilizan varios diluyentes. Entre los ms usados se encuentran:

agua de triptona con sal disolucin de Ringer 1/4 agua de peptona tamponada.

El mismo diluyente empleado en preparar la suspensin madre es el empleado en preparar la serie de diluciones decimales. 4. Homogeneizacin de la muestra. 8

En la homogenizacin hay que evitar la destruccin de los grmenes por rotura de su membrana o por calentamiento excesivo. Adems de la perfecta trituracin de la muestra es necesario obtener una mezcla homognea que tenga una distribucin uniforme de los grmenes y de sus toxinas. Hay varios tipos de homogenizadores y dentro de cada tipo puede haberlos de capacidades diversas:

a) Homogeneizadores de jarra: consisten en un vaso de vidrio o acero con una hlice en su base que funciona cuando se acopla a un motor.

b) Homogeneizadores de vstago con hlice: el vstago se introduce en un vaso con la mezcla que se va homogeneizar. Funciona como una batidora clsica de cocina.

Estos dos tipos de homogeneizadores tienen el inconveniente de que necesitan una limpieza exhaustiva y una esterilizacin antes de cada homogeneizacin. Esto supone un engorro. Otro inconveniente es que producen aerosoles que pueden contener microorganismos patgenos. Adems, por el tipo de homogenizacin tan agresiva que realizan, pueden destruir los microorganismos que queremos estudiar. Los inconvenientes de estos homogeneizadores no estn presentes en los:

c) Homogeneizadores de paletas: la mezcla de muestra y diluyente se introduce en una bolsa de plstico estril. Esta bolsa se sita en el homogenizador, que est provisto de paletas que golpean rtmicamente la bolsa. Esto dilacera (desmenuza) el alimento y pone los grmenes en suspensin. Para homogeneizar una nueva muestra no hay que limpiar nada: se utiliza una nueva bolsa. Modelos comerciales conocidos son: Stomacher y Masticator.

En la homogeneizacin de alimentos slidos es frecuente que la suspensin se prepare al 10 % peso/volumen. De este modo, la cantidad de alimento pesada expresada en gramos se multiplica por 9 y el nmero obtenido es el volumen en centmetros cbicos de diluyente a agregar. A la suspensin obtenida se le llama suspensin madre, dilucin 1/10 o dilucin -1, porque:

1/10 = 10

-1

Las muestras de alimentos lquidos no es necesario licuarlas, pero puede ser necesario homogeneizarlas. Esto puede conseguirse simplemente agitando bien el envase antes de abrirlo.

5.3. Muestras con una elevada carga bacteriana.

Las muestras con una carga bacteriana elevada no deben cultivarse directamente, pues las colonias de bacterias creceran demasiado juntas. Es necesario entonces diluir la muestra. El procedimiento de dilucin depende de los fines perseguidos. Diluciones decimales seriadas.

Se hacen para realizar recuentos microbianos. Una serie de diluciones decimales suele prepararse as:

1. La muestra se homogeneiza al 10 % (p/v), obtenindose la dilucin -1. 2. A un tubo que contenga 9 cc de diluyente estril se le agrega 1 cc de la dilucin -1. Tras mezclar muy bien se obtiene la dilucin -2 (1/100). 3. Puede obtenerse la dilucin -3 agregando 1 cc de la dilucin -2 a un tubo de ensayo que contenga 9 cc de diluyente y mezclando bien despus. 4. Las diluciones sucesivas que sean necesarias (-4, -5, -6, etc.) se preparan de modo similar.

Para preparar cada una de las diluciones debe utilizarse una pipeta limpia y estril. La serie decimal as preparada debe inocularse en el medio de cultivo de inmediato o, como mximo, dos horas despus de haberla preparado. Siempre que su uso se retrase ms de 10 minutos deben refrigerarse los tubos. De no respetar estas limitaciones probablemente haya crecimiento bacteriano que invalide las diluciones preparadas. 10