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U.T. 2 El Laboratorio de Microbiología.Normas de Seguridad

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El laboratorio de microbiología. Normas de seguridad. Material y equipos necesarios. Limpieza, desinfección y esterilización del material de vidrio o instrumentos.

Preparación de reactivos.
1. Clasificación de los microorganismos basándose en el riesgo. 2. Vías de infección 3. Normas de seguridad. 4. Materiales y aparatos del laboratorio de microbiología. 5. Limpieza, desinfección y esterilización. Definición de términos. 6. Modo de acción de los agentes antimicrobianos control microbiano mediante agentes físicos. 7. Control microbiano mediante agentes químicos. 8. Clasificación de los microorganismos basándose en el riesgo.

1 CLASIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS BASÁNDOSE EN EL RIESGO.
Los microorganismos varían en su capacidad para producir enfermedades. Hay varia clasificaciones, pero la que vamos a utilizar nosotros esta basado en la Directiva 90/679/CEE sobre la protección de los trabajadores contra riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos. Dicha clasificación utiliza cuatro grupos de riesgo según su diferente índice de riesgo o infección. Estos grupos son: • • Agente biológico del grupo 1: aquél que resulta poco probable que cause una enfermedad en el hombre. Agente biológico del grupo 2: aquél que puede causar una enfermedad en el hombre y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a la colectividad y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz • Agente biológico del grupo 3: aquél que puede causar una enfermedad grave en el hombre y presenta un serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que se propague a la colectividad y existiendo generalmente una profilaxis o tratamiento eficaz; • Agente biológico del grupo 4: aquél que causando una enfermedad grave en el hombre supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propague a la colectividad y sin que exista generalmente una profilaxis o un tratamiento eficaz.

2 VÍAS DE INFECCIÓN
Los microorganismos pueden penetrar en el organismo mediante: La boca (ingestión). Los pulmones (inhalación). A través de la piel (inyección). Por los ojos. Pueden ser ingeridos;

• •

Cuando se pipetea con la boca. Mediante los dedos.

Mediante artículos contaminados en las mesas de laboratorio. Esta contaminación se puede deber a derrames y salpicaduras.

Pueden ser inhalados;

Cuando se generan aerosoles en algún procedimiento de trabajo como:

• • • •

Trabajo con asas y jeringas. Pipeteado. Trituración y Homogenización Apertura de tubos y placas de cultivo.

Es la principal causa de enfermedades relacionadas con el laboratorio de microbiología Por Inyección:

• •

Consecuencia de heridas accidentales con; agujas hipodérmicas, pipetas o material de vidrio roto. También a través de cortes y abrasiones de la piel, que pueden ser minúsculas.

Por los ojos:

Debido a salpicaduras.

3 NORMAS DE SEGURIDAD
Como consecuencia a lo anteriormente dicho;

• • • • • • • •

Utilizamos siempre guantes. Nos lavamos las manos después de trabajar y las desinfectamos, aunque utilicemos guantes. No debemos dejar el la mesa de trabajo objetos personales. La mesa de trabajo debe ser desinfectada prácticas. No tocaremos con los guantes objetos personales o a otros compañeros. No nos llevaremos a la boca lapiceros, rotuladores etc. Nunca pipeteamos con la boca. Utilizaremos siempre la bata y esta estará cerrada, incluso en verano. cada vez que termine una sesión de

• •

Siempre que haya peligro de salpicaduras, se utilizarán gafas de seguridad. Todos los desechos biológicos, sean líquidos o sólidos, tienen que ser

descontaminados antes de su eliminación. Después, el material que los contiene puede ser lavado. • Se evitarán manipulaciones tales como la inserción de asas calientes en un cultivo y, la inyección violenta de fluidos a partir de pipetas o jeringas, ya que todas estas técnicas pueden generar aerosoles • Todos los desechos biológicos, ya sean líquidos o sólidos, tienen que ser descontaminados antes de su eliminación y se seguirán las normas existentes sobre la gestión de residuos contenidos en las reglamentaciones referentes a residuos sanitarios. • Todos los desechos biológicos, ya sean líquidos o sólidos, tienen que ser descontaminados antes de su eliminación y se seguirán las normas existentes sobre la gestión de residuos contenidos en las reglamentaciones referentes a residuos sanitarios.

4 MATERIALES Y APARATOS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA.

5 LIMPIEZA, DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN. DEFINICIÓN DE TÉRMINOS.
Esterilización: es el proceso de destruir todas las formas de vida microbiana. Un objeto esterilizado está libre de microorganismos vivos. Desinfección: es el proceso de destruir las formas de vida vegetativa (activa), pero no necesariamente las esporas. Antiséptico: es un agente que impide el desarrollo de los microorganismos, ya sea por impedir su crecimiento o por matarlos. Generalmente se refiere a sustancias aplicadas al cuerpo humano o de animales domésticos. Llamamos condiciones de asepsia a aquellas en las que se impide el desarrollo y la contaminación por microorganismos. Pueden alcanzarse mediante el uso de un antiséptico o un agente físico. Saneamiento: consiste en reducir la población bacteriana a niveles aceptables. Por regla general es un agente químico que mata el 99'9 % de las bacterias.

Bactericida: es un agente que mata bacterias. De modo similar: fungicida es una sustancia que mata hongos. La sustancia que mata todos los tipos de microorganismos es un microbicida o germicida. Bacteriostático: es una sustancia que no mata bacterias pero impide su crecimiento. De modo similar, fungistático es una sustancia que impide el crecimiento de los hongos. Hay que tener en cuenta que hay sustancias que a una determinada concentración son bacteriostáticos mientras que a concentraciones más elevadas llegan a ser bactericidas. Agentes antimicrobianos: son los que impiden el crecimiento, la actividad o la vida de los microorganismos. De esta forma, tanto los bactericidas, fungicidas, bacteriostáticos y fungistáticos son agentes antimicrobianos.

5 MODO DE ACCION DE LOS AGENTES ANTIMICROBIANOS.

Los distintos procedimientos y agentes difieren mucho en su modo de acción. La formas más frecuentes de afectar a los microorganismos son: a) Dañando la pared celular: la consecuencia es que la célula termina lisándose.

b) Alterando la permeabilidad celular: la membrana deja de ejercer su función de permeabilidad selectiva de nutrientes y la célula entonces muere por falta de nutrientes, etc.. c) Alterando las macromoléculas de proteínas y ácidos nucleicos: algunos agentes, especialmente el calor, desnaturalizan estas macromoléculas celulares de modo que dejan de ejercer su papel imprescindible para el metabolismo microbiano. Por desnaturalización de una proteína o un ácido nucleico entendemos que la macromolécula ve alterada su estructura originaria de modo que se ve incapaz de ejercer sus funciones normales.

d) Inhibiendo determinados enzimas: esto altera algunas rutas metabólicas que son imprescindibles para la reproducción o para la vida de la célula.

e) Inhibiendo la síntesis de ácidos nucleicos: el metabolismo celular se ve alterado, de modo que se impide la reproducción del microorganismo y, más adelante, se produce su muerte.

6 CONTROL MICROBIANO MEDIANTE AGENTES FISICOS.
6.1 Temperatura elevada.

La temperatura elevada combinada con un alto grado de humedad es uno de los medios más eficaces de matar microorganismos. Estos mueren porque sus proteínas se desnaturalizan. El calor húmedo es más rápido y eficaz que el calor seco, que destruye los microorganismos al oxidar su materia orgánica en presencia de aire. Las células vegetativas son más sensibles al calor que las esporas. Las células vegetativas de la mayoría de las bacterias mueren en 5-10 minutos a 60-70 °C de calor húmedo. Sin embargo, sus esporas necesitan temperaturas superiores a 100 °C durante unos pocos o muchos minutos. Los hongos son más sensibles: sus células vegetativas mueren en 5-10 minutos a 50-60 °C de calor húmedo y sus esporas mueren en el mismo tiempo pero a 70-80 °C. Los virus tienen una resistencia similar a la de las células vegetativas bacterianas mesófilas.

Procedimientos de calor húmedo. I. Vapor a presión y autoclave.

El vapor a presión permite esterilizar con calor húmedo a temperaturas superiores a 100 °C. El fundamento es el siguiente: la temperatura de ebullición del agua depende de la presión externa, de modo que una presión elevada permite que la temperatura de ebullición también sea alta. Esto permite que a temperaturas superiores a 100 °C se pueda tener agua en fase líquida, lo que garantiza que la fase gaseosa estará saturada de vapor. El aparato de laboratorio que permite alcanzar esta situación se llama autoclave y funciona de modo similar a una olla a presión regulada. Al poner en marcha el autoclave, la primera porción del vapor producido se emplea en arrastrar el aire del interior hacia fuera (purga de aire), de modo que la atmósfera que llena el autoclave a la temperatura de esterilización es únicamente vapor de agua, sin aire. Si no fuese así, para alcanzar una temperatura de 121 °C la presión tendría que ser muy superior a la que normalmente se trabaja (1 atm = 1'033 kg/cm²). En el autoclave no es la presión lo que mata a los microorganismos, sino la temperatura elevada del vapor. De este modo, todos los recipientes que se introduzcan en el autoclave deben estar abiertos, al menos parcialmente, de modo que el vapor de agua pueda penetrar en ellos (el vapor atraviesa con facilidad los tapones de algodón).

Al utilizar el autoclave hay que guardar siempre una serie de precauciones: a) La tapa del autoclave debe cerrase con la suficiente fuerza como para asegurar que no haya escapes de vapor cuando la presión sea elevada. b) No abrir nunca el autoclave hasta que la presión no sea igual a la ambiente (el manómetro indicará P = 0 atm) y el termómetro indique que la temperatura ha bajado por debajo de 90 °C . De lo contrario, saldrá de golpe una gran cantidad de vapor de agua muy caliente que puede quemar a quienes se encuentren cerca. Además, los líquidos que haya dentro hervirán de repente, derramándose.

c) No introducir frascos ni tubos cerrados herméticamente, pues podrían estallar por el aumento de presión en su interior. Los que tengan tapones a rosca deben dejarse con el tapón puesto pero a medio roscar: se roscan primero y después se les quita una vuelta o dos.

d) Los frascos y tubos con líquido nunca deben llenarse hasta el borde, sino hasta 2/3 de su volumen máximo, pues al perder presión a veces hierven ligeramente y si estuviesen totalmente llenos se desbordarían con facilidad.

e) No tocar la tapa del autoclave, pues se calienta y puede ocasionar quemaduras. f) Antes de ponerlo en marcha hay que comprobar que tiene suficiente cantidad de agua.

g) La carga (la carga es el conjunto de matraces con medio, tubos, etc., que queremos esterilizar) debe repartirse en el interior del cestillo de modo equilibrado y procurando que queden espacios entre los distintos recipientes para que el vapor circule libremente entre ellos.

En cada ciclo de esterilización con el autoclave podemos distinguir cuatro tiempos: 1. Tiempo de calentamiento de la cámara: desde que se pone en marcha hasta que el interior de la cámara alcanza la temperatura programada (normalmente 121 °C). El agua es calentada normalmente por una resistencia eléctrica. Desde la temperatura inicial hasta poco después de comenzar a hervir el agua hay una válvula abierta y se produce la purga de aire, que en el autoclave de nuestro laboratorio es automática. Después la válvula se cierra y el vapor se acumula, aumentando la presión y elevándose la temperatura por encima de 100 °C. 2. Tiempo de penetración del calor al interior de la carga: a medida que la cámara se va calentando, el calor va atravesando las paredes de los recipientes y calentando su contenido. Sin embargo, esto requiere un tiempo, de modo que durante el calentamiento

la carga siempre va con retraso, estando algo más fría que la cámara. Cuando la cámara alcanza la temperatura de esterilización (normalmente 121 °C), la carga aún tardará unos minutos en alcanzar esta temperatura. El tiempo de retraso es tanto mayor cuanto más volumen de líquido contienen los recipientes. 3. Fase de esterilización: es el tiempo durante el cual la carga se mantiene a la temperatura elegida. A 121 °C suele ser de 15 minutos. 4. Tiempo de enfriamiento: la temperatura de la cámara va descendiendo lentamente hasta la temperatura elegida para abrirlo (90 °C). Al bajar hasta 100 °C la presión también habrá bajado a 0 atm..

Hay que tener en cuenta el siguiente fenómeno. El autoclave se programa como si sólo tuviese 3 fases: 1), 3) y 4), de modo que cuando la cámara alcanza 121 °C el reloj comienza a contar 15 minutos y después comienza a enfriarse. Sin embargo, hemos dicho que la carga se va calentando con retraso, de modo que una parte de los 15 minutos de la fase de esterilización en realidad son todavía tiempo de penetración del calor al interior de la cámara. En realidad, este tiempo perdido se gana en parte durante la fase 4; la carga va con retraso pero para enfriarse (ahora a mayor temperatura que la cámara), de modo que los primeros minutos de enfriamiento de la cámara aún son de esterilización para la carga. Lo que se ha descrito no sucede así de modo riguroso, pero esto no es un problema porque el tiempo de 15 minutos de esterilización ya incluye un margen de seguridad. Sin embargo, esto sólo es válido para recipientes de vidrio no muy grueso y que contengan menos de 1 litro de medio, ya que se calientan relativamente rápido. Aún así, en muchos laboratorios los 121 °C se mantienen durante 20 minutos en lugar de sólo 15 minutos. Cuando se esterilizan matraces con volúmenes superiores a 1 litro es conveniente alargar aún más el tiempo de esterilización.

El autoclave se usa en todo laboratorio de microbiología de modo rutinario. Se esterilizan aquí medios de cultivo sólidos y líquidos recién preparados, medios de cultivo ya usados antes de tirarlos a la basura para matar los microorganismos cultivados y que no se dispersen en el medio ambiente, diferentes disoluciones, tapones de caucho, etc.. Algunos autoclaves tienen ciclos de secado que permiten la esterilización de material de vidrio y metálico.

El ciclo de esterilización más usado es el de 121 °C durante 15 (o 20 minutos), con el que se alcanza una presión en el interior del autoclave de 1 atmósfera superior a la presión ambiente. Los autoclaves modernos tienen componentes electrónicos que permiten su fácil programación para realizar el ciclo deseado.

Existen distintas pruebas de eficiencia del autoclave para asegurar o comprobar su correcto funcionamiento: a) Revisiones periódicas del manómetro, termómetro, reloj, válvulas y demás componentes.

b) Tiras de esporas. Son unas tiras de papel impregnadas de esporas bacterianas envasadas en sobres permeables al vapor. El sobre se introduce en el autoclave, se somete a un ciclo de esterilización normal y después se cultiva la tira. Si el autoclave funciona bien no debe haber sobrevivido ninguna espora (el cultivo será negativo).

c) Indicadores químicos. Los hay de varios tipos. Los más comunes indican mediante un cambio de color si efectivamente se alcanza la temperatura deseada. II. Pasteurización.

Consiste en la exposición de un material (normalmente se usa para tratar la leche, cremas y algunos zumos de frutas) a una temperatura alta bien controlada durante un tiempo determinado. Se usan 62 °C durante 30 minutos o 72 °C durante 15 minutos. Algunos microorganismos sobreviven y por ello los alimentos pasteurizados hay que conservarlos refrigerados. 6.2 Calor seco.

a) Esterilización por aire caliente. Se consigue en estufa eléctrica con la puerta cerrada o con un chorro de aire caliente. Para esterilizar el material de vidrio de laboratorio es suficiente con dos horas a 160 °C. b) Incineración. La incineración mata los microorganismos. Se emplea en hornos para destruir esqueletos, animales de laboratorio infectados, material de laboratorios clínicos y otros materiales infectados por patógenos (gasas, vendas, jeringas, agujas, pus y líquidos corporales, etc.). La incineración a pequeña escala se lleva a cabo en el asa e hilo de nicrón al ponerlos al rojo en la llama del mechero Bunsen, pero hay que tener cuidado de no permitir chisporroteos que pueden diseminar gotitas de material con microorganismos viables.

6.3 Bajas temperaturas.

En la mayor parte de los casos detienen el metabolismo, actuando como microbiostáticas. No siempre es así: para microorganismos sensibles la refrigeración es microbicida y para organismos psicrófilos la refrigeración no detiene su crecimiento. Dependiendo del fin perseguido, se usan

desde la refrigeración normal (2 a 7 °C) hasta el nitrógeno líquido (-196 °C). En general, las altas temperaturas son microbicidas mientras que las bajas son microbiostáticas. 6.4 Desecación.

La desecación produce en un primer momento la detención del crecimiento y después, paulatinamente, la disminución de la población viable. Su efecto depende en gran medida de la especie microbiana tratada. Se utiliza para conservar algunos alimentos y también para conservar cultivos. 6.5 Presión osmótica.

La mayoría de las bacterias sobreviven en disoluciones de osmolaridad muy baja, debido a la elevada resistencia de su pared celular. Sin embargo, los medios muy hipertónicos inhiben el crecimiento de la mayoría de los microorganismos. Este es el fundamento de la conservación de alimentos en salazón (jamón serrano, mojama, huevas de maruca, bacalao salado) y también de los alimentos con elevadas concentraciones de azúcares (miel, mermeladas, etc.). 6.6 Radiaciones.

Las radiaciones electromagnéticas de alta energía (rayos gamma, rayos X y rayos ultravioleta) esterilizan la superficie de los materiales sobre los que inciden, aunque la radiación menos energética (UV) necesita actuar durante más tiempo que los rayos X o los rayos gamma. Las lámparas de ultravioleta se utilizan mucho en el saneamiento de quirófanos, cabinas de flujo laminar como la de nuestro laboratorio e industrias alimentaria y farmacéutica. 6.7 Otros procedimientos antibacterianos.

La filtración de disoluciones a través de filtros de tamaño de poro muy pequeño permite retener los microorganismos en el filtro. Los filtros bacteriológicos retienen todas las bacterias y también los hongos, pero dejan pasar los virus. Hay también filtros para el aire. Los llamados filtros HEPA permiten obtener aire limpio de polvo y bacterias. Nuestra cabina de flujo laminar tiene un filtro de este tipo.

Otros procedimientos antibacterianos que no vamos a describir se basan en el aprovechamiento de la electricidad o de la tensión superficial de los líquidos.

7 CONTROL MICROBIANO MEDIANTE AGENTES QUIMICOS.
Hay una gran cantidad de sustancias químicas que a determinadas concentraciones son capaces de matar o impedir el crecimiento de los microorganismos. Ninguna de ellas es óptima para todos los microorganismos en todas las situaciones medioambientales posibles. Para seleccionar la más adecuada hay que tener en cuenta:

a) Naturaleza del material que se va a tratar. b) Tipo de microorganismos que se quieren eliminar. c) Condiciones ambientales (temperatura, pH, presencia de materia orgánica extraña, etc.).

A continuación estudiaremos los más importantes y algunas de sus características. 7.1 Fenol y compuestos fenólicos. Son bactericidas o bacteriostáticos, dependiendo de la concentración a la que se usen. El fenol se emplea en disolución acuosa al 2-5- % para desinfectar mesas y material de laboratorio. Aún se usa, aunque otros desinfectantes son más eficaces a concentraciones más bajas. 7.2 Alcoholes. El alcohol etílico de 60-95° es un desinfectante eficaz contra células vegetativas, pero no actúa contra las esporas bacterianas. La concentración más eficaz es al 70 % v/v en agua (70°). Actúa en menos de 10 segundos. El alcohol metílico es menos eficaz y muy tóxico, por lo que apenas se usa. Los alcoholes de 3 o más carbonos son más eficaces que el etílico, pero se usan poco. El etanol se usa mucho en clínica como antiséptico de la piel. 7.3 Halógenos y sus compuestos. Son eficaces por su acción oxidante y parece ser que también por su acción halogenante de moléculas orgánicas. Iodo. Es uno de los germicidas más antiguos y eficaces. Actúa contra todas las bacterias. También tiene propiedades esporocidas, fungicidas y antivirales, aunque su actividad depende de las condiciones ambientales. Es poco soluble en agua, pero se usa desde hace tiempo en forma de tintura de yodo (disolución de yodo en alcohol y yoduro sódico o potásico). En la actualidad se utilizan también disoluciones de sustancias que forman complejos con el yodo, solubilizándolo. Es uno de los mejores desinfectantes de la piel humana y este es su principal uso.

Cloro y compuestos clorados. El cloro gaseoso es muy eficaz como desinfectante, pero su manipulación requiere equipo especial. Se usa principalmente para desinfectar agua en plantas purificadoras. Los hipocloritos más utilizados son el de sodio y el de calcio (NaClO y Ca(ClO)2). Se comercializan disoluciones de hipoclorito de sodio al 5-12 % para uso doméstico (lejía) que, diluyéndolas aún más, se usan como desinfectantes (de manos, de agua, etc.) y también como blanqueantes por su poder oxidante.Otros desinfectantes clorados son las cloraminas. 7.4 Metales pesados y sus compuestos. La mayoría de los metales pesados y sus compuestos dañan a los microorganismos. Los más eficaces son el mercurio, la plata y el cobre. Sin embargo, su uso está restringido a aplicaciones específicas debido principalmente a su toxicidad para el hombre y animales. Podemos citar el sulfato de cobre (II), que es especialmente activo contra algas (CuSO4 a 2 ppm) y hongos y se usa para tratar agua de albercas y piscinas. 7.5 Colorantes. Diferentes sustancias que actúan como colorantes tienen actividad germicida. Destacan el cristal violeta, el verde brillante y el verde malaquita. Por regla general, son más eficaces contra bacterias grampositivas que contra las gramnegativas. Actualmente se utilizan principalmente para preparar medios selectivos. 7.6 Detergentes.

Se usan para lavar y sanear la piel, cabello, superficies, instrumentos, etc., por facilitar el arrastre mecánico de las bacterias por un chorro de agua. Además, algunos tienen altas propiedades bactericidas. Destacan especialmente los detergentes catiónicos cuyo catión es un compuesto de amonio cuaternario : tienen un gran poder bactericida y también actúan como fungicidas y contra protozoos patógenos. Se usan como antisépticos de la piel y para sanear carnicerías, lecherías, plantas procesadoras de alimentos, etc. 7.7 Acidos y álcalis.

Los pH extremos son letales para la inmensa mayoría de los microorganismos. Son excepcionalmente resistentes las micobacterias y pocos microorganismos más. Los ácidos son, en general, más eficaces que los álcalis. Sin embargo, sus aplicaciones como desinfectantes son escasas debido a su capacidad corrosiva.

7.8 Esterilizadores gaseosos.

Hay una gran variedad de productos hechos con materiales que no se pueden esterilizar por medio de altas temperaturas o de esterilizadores líquidos. Con estos materiales se emplean los esterilizadores gaseosos. Oxido de etileno. Es un poderoso germicida utilizado para esterilizar salas en hospitales, industrias y laboratorios y también muchos productos entre los que se encuentran las placas de Petri desechables. Al ser un gas es muy penetrante. Su espectro de actividad es muy amplio e incluye también las esporas. Formaldehido. El HCHO es una gas que a temperatura ambiente se polimeriza formando un sólido. También se presenta en disolución acuosa al 37-40 %, llamándose entonces formol. De cualquiera de estas presentaciones puede vaporizarse mediante calor el formaldehido; manteniendo este gas en un recinto cerrado durante un cierto tiempo puede esterilizarse el mismo. Sin embargo, es menos penetrante que el óxido de etileno.

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