Pruebas bioqumicas

Rojo metilo
Bioqumica: Prueba basada en el uso de un indicador de pH, el rojo metilo, para determinar la concentracin de H+, cuando un organismo fermenta la glucosa. La familia Enterobacteriaceae fermenta la glucosa en el caldo MR/Voges Proskauer, despus de 18-24h de incubacin, fermentan a cidos, dando un pH bajo. (RM positivos)

 Los RM negativos en cambio, fermentan demasiado formando acetona, lo que eleva el pH hasta la neutralidad. Reaccin producida por E. coli (RM positiva)

 Reaccin negativa de Kleisella y Enterobacter:

La validez de la prueba consta en incubar al menos durante 2 das a 37C, lo que hace que los microorganismos muestren su pH terminal alto o bajo.

 El medio empleado para la prueba Clark y Lubs (caldo rojo de metilo/voges proskauer, caldo RM/VP) pH 6,9

Reactivo utilizado: indicador de pH Rojo de metilo

 Microorganismos utilizados para el control de calidad: MR-positivo, VP negativo: Escherichia coli MR-negativo, VP positivo: Enterobacter aerogenes

 Interpretacin:
MR positivo (+): tiene un pH bajo, 4,4 o menos, da un color rojo brillante. MR negativo (-): pH alto 6 o mayor, da un color amarillo. Reaccin tarda (+/-): color naranja rojizo, microorganismo produce menos acido, esperar 4 das en incubacin y repetir la prueba.

Interpretacin

Voges-Proskauer
Detecta la acetona (precursor de 2,3 butanodiol), producto final del metabolismo de la glucosa.

 El medio empleado para la prueba Clark y Lubs (caldo rojo de metilo/voges proskauer, caldo RM/VP) pH 6,9

Reactivos utilizados: 1. Reactivos VP de Barrit 2. Reactivos VP de Coblentz 3. Reactivo VP nico de OMeara

 Microorganismos usados para control: VP positivo (+): Enterobacter cloacae VP negativo (-): Escherichia coli

 Interpretacin: VP positivo (+): color rosado-rojo en la superficie del medio (acetona presente) VP negativo (-): color amarillo en la superficie del medio (igual color que el reactivo )

Interpretacin

Pruebas en agar con hierro de Klinger/azcar triple y hierro

Se determina la capacidad de un microorganismo de atacar un hidrato de carbono, con o sin produccin de gas, junto con la produccin de H2S. La familia Enterobacteriaceae es productora de H2S.

 Bioqumica: El agar con hierro de klinger (KIA) y el agar con azcar triple y hierro (TSI) son medios que cumple con dos funciones:
Determinacin de fermentaciones de hidratos de carbono Determinacin de la produccin de H2S

Determinacin de fermentaciones de hidratos de carbono

Fermentacin de lactosa y de glucosa
Pico de flauta cido y fondo cido (cido/cido) despus de 18 a 24 h de incubacin

Ausencia de fermentacin de lactosa y de glucosa

Pico de flauta alcalino y fondo alcalino, degrada la peptona aerbica y anaerbicamente Pico de flauta alcalino y fondo sin cambio, degrada la peptona solo aerbicamente

Cuando las peptonas se degradan producen NH3 produce un pH alcalino

 En esta reaccin se puede interpretarse de 4 maneras: 1. Alcalino/cido: solo la glucosa es degradada 2. cido/cido: glucosa y lactosa degradadas 3. Alcalino/alcalino: ni la glucosa ni la lactosa son degradadas, uso de peptonas 4. Alcalino/sin cambios

 En los tubos de prueba se hace una comprobacin de gases CO2 y O2. Un productor de gas se llama aergeno, se evidencia por fragmentacin del medio Los microorganismos que no producen gas se llaman anaergenos.

Determinacin de la produccin de H2S

Diferenciacin es aportado por los indicadores de H2S presentes en el medio:
Citrato de amonio frrico Tiosulfato de sodio

Medios de cultivos empleados

Agar con hierro de Klinger (KIA)

 Agar con triple azucar y hierro

Los ingredientes son los mismos que el KIA, pero se agrega lo siguiente:
Sacarosa 10g/l (1%) Indicadores de H2S: sulfato de amonio ferroso,

Interpretacin

Prueba de indol
Capacidad de un microorganismo de separar indol a partir de triptfano Bioqumica:
El triptfano es un aminocido que puede ser oxidado por varias bacterias para formar 3 metabolitos indlicos: indol, escatol y cido indolactico.

Medios de cultivo
Caldo triptfano o peptona

Incubacin 35C de 24 a 48h Agregar el reactivo de Kovacs o de Ehrlich directamente al tubo antes de interpretar

Medios de cultivo
Medio de casena
Digerido pancretico de casena Cloruro de sodio, NaCl Agua desionizada 2g 0,5g 100 ml

Reactivos usados
Prueba de indol de Ehrlich
p, Dimetilaminobenzaldehdo Alcohol etlico (absoluto) HCl (concentrado) 1g 95 ml 20 ml

Prueba de indol de kovacs

Alcohol amlico o isoamlico (tambien alcohol butlico) 150 ml p, Dimetilaminobenzaldehdo 10g HCl (concentrado) 50 ml

Microorganismos usados para el control de calidad

Positivo (+): Escherichia coli Negativo (-): Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa

Interpretacin
Positivo (+): en segundos, aparece un anillo rojo (fucsia brillante) sobre el medio. Negativo (-): no hay ningn color o aparece un anillo turbio de color amarillo.

Interpretacin

Prueba de citrato
Determina si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de metabolismo y el crecimiento con alcalinidad resultante. Ayuda a diferenciar Escherichia coli de Shigella

 Bioqumica:
La energa es proporcionada para las bacterias por el citrato, siendo la nica fuente de carbono.

 Los productos del metabolismo del citrato depende del pH del medio, a un pH alcalino:

A un pH cido en cambio se produce:

Medios de cultivo
Medios de citrato de Simmons

Azul de bromotimol es indicador de pH

 Distribuir en tubos de pico de flauta Incubacin a 35C por 24 a 48h, hasta 4 dias

Microorganismos usados para el control

Interpretacin
Medio de Citrato de Simmons
Positivo (+): crecimiento con un intenso color azul en el pico de flauta Negativo (+): ausencia de crecimiento y ningn cambio en el color, sigue verde

Interpretacin

Prueba de ureasa
Determina la capacidad de un microorganismo de hidrolizar la urea en dos molculas de amonaco por la accin de la enzima ureasa, con resultante alcalino.

 Bioqumica El sustrato urea, es carbamida, se hidroliza para formar:

Medios de cultivo
Caldo con urea de Rustigian y Stuart
BBL (urease test broth), caldo para prueba de ureasa y Urea Agar Base (Difco) Incubacin a 35C por 48 horas Indicador de pH rojo fenol

Agar con urea de Christensen

Incubacin a 35C hasta por 6 das

Microorganismos utilizados para el control de calidad

Positivo (+): rpido e intenso
Proteus mirabilis Proteus vulgaris

Positivo (+): dbil

Klebsiella pneumoniae

Negativo (-):
Escherichia coli

Interpretacin
Caldo con urea de Stuart
Positivo (+)
Color rosa-rojo intenso en todo el caldo

Negativo (-)
Sin cambios de color (amarillo - naranja)

Interpretacin
Agar con urea de Christensen
Positivo (+): color rosa-rojo, rojo violeta en pico de flauta. Negativo (-): sin cambios de color (color piel a amarillo plido)

Interpretacin

Prueba de descarboxilasa lisina

Determinar la capacidad enzimtica de un microorganismo de descarboxilar un aminocido para formar una amina con resultante alcalinidad Se utiliza para determinar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

 Ayuda a diferenciar:
Escherichia coli (+) de las especies de Shigella (-) Salmonella (+) de las especies de Citrobacter (-) Pseudomonas cepacia (+) de otras especies de Pseudomonas (-) Klebsiella pneumoniae (-) de otras especies de Klebsiella Burkholderia cepacia (+) de otras especies de Burkholderia (-)

 Bioqumica: La descarboxilacin es el proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas especficas atacan los aminocidos en su carboxilo terminal (COOH) para formar una amina o una diamina y CO2.

 El aminocido L-lisina es descarboxilado para formar cadaverina (una diamina) y CO2, por la accin de la enzima especfica lisina descarboxilasa.

Medios de cultivo empelados

Caldo para lisina descarboxilasa de Falkow
Incubacin: 35C, hasta 4 das

Agar con lisina y hierro (LIA)

Indicador de pH: prpura de bromocresol

Microorganismos utilizados para el control de calidad

Positivo (+): Klebsiella pneumoniae Negativo (+): Enterobacter cloacae

Interpretacin
Positivo: (+): color prpura turbio a amarilloprpura apagado (el microorganismo produjo cadaverina) Negativo (-): color amarillo brillante, claro (el microorganismo solo fermento la glucosa) Tubo control no inoculado (sin sustrato de aminocido): permanece amarillo (el microorganismo solo fermento la glucosa)

Pruebas de catalasa y peroxidasa

Prueba la presencia de las enzimas catalasa o peroxidasa o de ambas. Prueba de catalasa; H2O2 al 3%
Diferencia entre los generos
Streptococcus (-), Micrococcus (+), Staphylococcus (+) Bacillus (+), Clostridium (-), Staphylococcus aureus (-) Listeria monocytogenes (+), Lactobacillus (-), Enterococcus (-) Neisseria elongata (-), otras especies de Neisseria (+)

 Bioqumica Se forman dos compuestos al reducir las flavoprotenas o protenas con azufre: perxido de hidrgeno H2O2 y el radical superxido O2 Las catalasas, peroxidasas y superxido dismutasa eliminan el O2- y el H2O2.

 El H2O2, si se acumula, es txico para las bacterias y produce su muerte, la catalasa ayuda a descomponer el H2O2 u oxidar sustratos secundarios.

Microorganismos utilizados para el control

Pruebas de catalasa rutinarias
Staphylococcus aureus (+) Streptococcus pyogenes (-)

Pruebas de catalasa para Mycobacterium

Mycobacterium kansasii (+) Mycobacterium tuberculosis (+) Mycobacterium avium (-)

Procedimientos
Pruebas de catalasa rutinarias, temperatura ambiente (22-25C)
En portaobjeto
con una aguja de inoculacion, recoger el centro de una colonia pura de un cultivo de 18 a 24 h y colocar sobre un portaobjeto de vidrio limpio. Colocar una gota de H2O2 al 30% en los microorganismos colocados en el portaobjeto con un gotero Observar la produccin inmediata de burbujeo (liberacin de gas)

Interpretacin
Pruebas de catalasa rutinarias (portaobjeto) Positivo (+): burbujeo inmediato, observado con facilidad; formacin de O2 Negativo (-): ausencia de burbujas; ausencia de O2

Prueba SIM
Se emplea para la identificacin y diferenciacin de Enterobactericeas en funcin de la produccin de Hidrgeno sulfuro, Indol y la Movilidad. Se utiliza para identificar especialmente Salmonella y Shigella, y se utiliza despues de la prueba KIA/TSI.

Fundamento
La mezcla de peptonas constituye el elemento nutritivo del medio. La movilidad se manifiesta mediante una turbidez que se forma alrededor de la lnea de siembra.

Fundamento
El Sodio Tiosulfato y el Amonio Hierro(III) Sulfato permiten poner de manifiesto la formacin de Hidrgeno de Sulfuro por el precipitado negro que se forma. La produccin del Indol es fcilmente detectable al aadir unas gotas de reactivo de Kovacs al cultivo.

Medio de cultivo
Agar SIM Amonio Hierro(III) Sulfato............................. 0,2 g Peptona de Carne ...................................... 6,1 g Peptona de Casena ................................... 20,0 g Sodio Tiosulfato.......................................... 0,2 g Agar............................................................ 3,5 g pH final: 7,3 0,2

Microorganismos para el control de calidad

Microorganismos Escherichia coli ATCC 25922 Salmonella typhimurium ATCC 14028 Shigella flexneri ATCC 12022 Desarrollo Bueno Bueno Bueno H2S + Movilidad + + Indol +

Reactivos y modo de empleo

Reactivo de Kovacs Modo de empleo
Sembrar a partir de un cultivo puro por picadura. Incubar a 37C de 18 a 24 horas. Si el microorganismo es mvil se observa turbidez en todo el medio, mientras que si es inmvil slo hay crecimiento en la lnea de siembra. La presencia de Indol da lugar a una coloracin rojo-prpura al aadir el reactivo de Kovacs

Identificacin
A. Indol positivo y sulfuro de hidrgeno positivo B. Sulfuro de hidrgeno positivo C. Indol positivo y movilidad positiva (crecimiento difuso) D. Control negativo

Prueba de oxidasa
Pone de manifiesto la presencia de enzima oxidasa en ciertos microorganismos. La oxidasa o citocromo oxidasa en una enzima que cede electrones (H2), de un sustrato al oxgeno, en el tren de transporte electrnico.

Reactivos
Pueden utilizarse muchos reactivos, que son colorantes aceptores de electrones, pasando de incolora a colorida. El reactivo mas utilizado es el reactivo de kovaks. Tambin existen discos o tiras de papel impregnadas de reactivos para el diagnstico de oxidasa.

Microorganismos para el control de calidad

Positivo (+):
Neisseria mucosa Pseudomonas aeruginosa

Negativo (-):
Escherichia coli

Interpretacion
Aparicin de una coloracin prpura sobre la linea de inoculacion es positiva. Si no hay cambio de coloracin, la prueba es negativa.

Interpretacin

Pruebas IMVIC
La prueba de IMVIC, es usada para diferenciar bacterias entricas, de la familia Enterobacteriaceae. Pruebas IMViC (Indol, Rojo metilo, Voges Proskauer y Citrato)

Microorganismos controles

Controles Escherica coli Enterobacter aerogenes

indol + -

RM + -

VP +

Citrato +

Escherichia Rojo metilo Voges Proskauer Produccion indol Utilizacion citrato Produccion de H2S Ureasa -Galactosidasa Gas a partir de glucosa Acido a partir de lactosa Fenilalanina desaminasa Lisina descarboxilasa Ornitina Descarboxilasa Licuefaccion de gelatina Movilidad + (+) (+) + + (+) (+) d

Shigella + d d d -

Salmonella + (+) (+) d (+) (-) (+) (+) (+)

Citrobacter + d + d (+) + + d (+) +

Proteus + d d d (+) + + + d + +

d= depende de la cepa o especie

Yersinia Rojo metilo Voges Proskauer Produccion indol Utilizacion citrato Produccion de H2S Ureasa -Galactosidasa Gas a partir de glucosa Acido a partir de lactosa Fenilalanina desaminasa Lisina descarboxilasa Ornitina Descarboxilasa Licuefaccion de gelatina Movilidad + - (37C) d (-) d + (-) (-) (-) d (-) -(37C)

Klebsiella (+) (+) d (+) (+) (+) (+) (+) (+) -

Enterobacter (-) + + (-) + (+) (+) (-) d (+) d +

Erwinia + (+) (-) (+) (+) + (-) d (-) d +

Serratia d + (-) + + d d d d (+) +

d= depende de la cepa o especie

Test API 20E

Kit bioquimico para identificacion de miembros de la familia Enterobacteriaceae, y otras bacterias Gram negativas. Consta de 20 microtubos con sustancias bioquimicas deshidratadas.

Test API 20E

Despues de 5 horas o de 12 horas de incubacion se tienen resultados. Mediante las reacciones se construyen codigos de 7 a 9 cifras. Se tiene un numero que representa a una especie, y el codigo se lo puede encontrar en el libro INDICE DE PERFIL API.

Codigo normal de 7 digitos 5 144 572 = Escherichia coli

Codigo de 9 digitos 2 212 004 63= Pseudomonas aeruginosa