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DETERMINACIÓN DEL ANTÍGENO ESPECÍFICO DE PRÓSTATA (PSA)

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Realizar la determinación semi-cuantitativa del antígeno específico de la próstata (PSA) en el suero humano.
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Practica 7

Fátima Sarai López Hernández, Mónica Adriana Rodríguez Zavala, Sarai Zúñiga Estupiñan, Abraham López Arellano

29/10/2011

Universidad Auto noma de Zacatecas “Francisco Garcí a Salinas” Area de Ciencias de la Salud Unidad Academica de Ciencias Químicas Químico Farmaceutico Bio logo
LABORATORIO DE INMUNOLOGIA DIAGNOSTICA

PRACTICA 7

DETERMINACIÓN DEL ANTÍGENO ESPECÍFICO DE
PRÓSTATA

(PSA)

* Fátima Sarai López Hernández, Mónica Adriana Rodríguez Zavala, Sarai Zúñiga Estupiñan, Abraham López Arellano Docente: Aracely Gómez Corvera

*7°Semestre Grupo “C” Programa educativo Q.F.B. UACQ, ACS, Campus
UAZ Siglo XXI, carretera Zacatecas-Guadalajara Km 6 s/n ejido La Escondida Cp. 98160 Zacatecas Zac. Agosto-Diciembre 2011 OBJETIVO Realizar la determinación semi-cuantitativa del antígeno específico de la próstata (PSA) en el suero humano.

INTRODUCCIÓN Y FUNDAMENTO El antígeno prostático específico (PSA), también llamado calicreína III, seminina, semenogelasa, γ-seminoprotein y antígeno P30, es una glicoproteína de 34 kD producida casi exclusivamente por la glándula prostática. El PSA es producido con el fin de licuar el Campus UAZ Siglo XXI | ACS, UACQ, QFB, Séptimo Semestre grupo C Laboratorio de Inmunología Diagnostica

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semen eyaculado y permitir un medio para que los espermatozoides se movilicen libremente. También se cree que es útil para disolver la capa mucosa cervical, permitiendo la entrada a los espermatozoides. Bioquímicamente, el PSA es una enzima serín-proteasa el gen de la cual está localizado en el cromosoma 19 (19q13). Es una proteína cuya síntesis no es exclusiva de la próstata. Una pequeñísima parte de este PSA pasa a la circulación sanguínea de hombres enfermos, y es precisamente esta PSA que pasa a la sangre, la que se mide para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento del cáncer —tanto localizado como metastásico— y otros trastornos de la próstata, como la prostatitis. Los niveles normales en sangre de PSA en los varones sanos son muy bajos, del orden de millones de veces menos que el semen, y se elevan en la enfermedad prostática. Los valores de referencia para el PSA sérico varían según los distintos laboratorios, aunque el valor normal aceptado actualmente es de hasta 2,5 ng/ml. Su producción depende de la presencia de andrógenos y del tamaño de la glándula prostática. El PSA aumenta con el agrandamiento de la próstata, llamado también hiperplasia benigna de próstata o HBP, fenómeno que ocurre en muchos hombres conforme van avanzando en edad. También puede aumentar en caso de irritación, prostatitis —una inflamación de la glándula prostática— y en el infarto prostático. El PSA también puede aumentar normal y lentamente conforme avanza la edad del hombre, incluso si la próstata es normal. La eyaculación puede provocar un aumento temporal del PSA en la sangre, razón por la que se recomienda abstenerse de relaciones sexuales un mínimo de 2 días antes de la extracción de sangre para el estudio del PSA. Al contrario de lo que se ha creído durante años, el tacto rectal no altera significativamente los niveles del PSA. Utilizando conjuntamente el valor del PSA y el tacto rectal se puede descubrir más del 60% de los cánceres de próstata que todavía no están localizados. FUNDAMENTO La prueba PSA ELISA está basada en el principio de un ensayo inmunoabsorbente vinculado a las enzimas de fase sólida. El sistema de ensayo utiliza un anticuerpo Anti-PSA de ratón dirigido hacia el PSA intacto para la inmovilización de la fase sólida(en los pozos de la microplaca) un anticuerpo Anti-PSA monoclonal conjugado para peroxidasa de rábano (HRPO) se encuentra en la solución de conjugado de enzima-anticuerpo. La muestra de la prueba es permitida reaccionar primero con el anticuerpo de conejo inmovilizado a T °C ambiente por 60´los,pozos son lavados para remover cualquier Campus UAZ Siglo XXI | ACS, UACQ, QFB, Séptimo Semestre grupo C Laboratorio de Inmunología Diagnostica
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antígeno no adherido. El conjugado HRPO Anti-PSA monoclonal es entonces reaccionado con el antígeno inmovilizado por 60´a T °C ambiente provocando que las moléculas de PSA se encuentren entre la fase sólida y los anticuerpos vinculados a la enzima. Los pozos son lavados con agua para remover anticuerpos etiquetados no adheridos. Una solución de reactivo TMB es agregada e incubada a T °C ambiente por 20´provocando el desarrollo de un color azul. El desarrollo del color es frenado con la adición de solución de frenado cambiando el color a amarillo. La concentración de PSA es directamente proporcional a la intensidad del color de la muestra de prueba. La absorbancia es medida espectrofotométricamente a 450 nm. INTERPRETACIÓN En la hiperplasia benigna prostática, los valores de PSA son directamente proporcionales al tamaño de la glándula prostática. Un valor de PSA mayor de 10 ng/ ml siempre es patológico, y en un 50 % de los casos se diagnostica un cáncer prostático mediante biopsia. Trabajos de investigación han descripto que pacientes con hiperplasia benigna prostática tienen mayor proporción de PSA libre respecto a aquellos con cáncer prostático. La combinación de ambos ensayos y la expresión del resultado a través del índice de PSA libre/total permitiría utilizar el mismo para evaluar el riesgo relativo de CP .El valor de corte de este índice no ha sido claramente definido. Según la metodología utilizada el punto de corte seria de 0.15-0.25 (valores por debajo indicarían mayor probabilidad de cáncer). Se ha reportado su utilidad para valores de PSA total entre 4 -10 ng/ml Según el criterio establecido por Mayo Clinic (USA): PSA < 4 ng/ml el riesgo de Cancer de prostata(CP) es bajo PSA > 4ng/ml y PSAL/PSA total <0,25 indica aumenta del riesgo de CP PSA < 4ng/ml y PSAL/PSA total <0,18 indica aumenta del riesgo de CP

Nota: Los resultados de laboratorios pueden variar según la metodología utilizada.

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Figura 1 esquema del Método Elisa tipo sándwich

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Anti-PSA de ratón en fase sólida. Inmovilización del PSA en la placa Unión del anticuerpo anti-PSA monoclonal conjugado con HRPO Aplicación del reactivo TMB y desarrollo de color.

MATERIALES REQUERIDOS PARA LA PRUEBA 1. Placa de microvaloración revestida con anti-PSA de conejo 2 pozos 2. Micropipetas de precisión de 50-100µl 3.-Puntas de pipetas desechables 4. Recipiente para residuos 5. Gradilla 6. Papel absorbente 7. Piseta MATERIAL BIOLÓGICO.  Muestra de suero
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REACTIVOS

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1. Estándar de referencia, que contiene PSA 0, 2, 4, 15, 60,120 ng/ml, liofilizado, 1 juego. 2. Buffer Cero, 7ml. 3. Reactivo de conjugado de enzima, 12 ml 4. Reactivo TMB (1 paso) ,11ml. 5. Solución de frenado (1 N HCl), 11ml. 6. Agua destilada. Nota: Permitir que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente PROCEDIMIENTO Diagrama del método del ensayo

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1. Vertir 50µl de estandar 4 y 50µl muestra en los pozos apropiados.

2. Depositar en cada pozo 50µl de buffer cero.

3. Mezclar durante 30 s

6. Añadimos 50µl de reactivo conjugado

5. Lavamos 5 veces con agua

4. Incubamos a 25 °C 45´

7. Incubamos 45´a 25 °C

8. Lavamos 5 veces más con agua destilada

9. Agregamos 100µl de TMB

12. Mezclamos y observamos el color comparamos con un estandar.

11. Agregamos por ultimo 100µl de solución de frenado.

10. Incubamos 20´´

OBSERVACIONES Y RESULTADOS

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Se realizó la observación macroscópica de la placa para comparar el color desarrollado en el pocillo de muestra con el obtenido en las soluciones estándar de 2, 4 y 15 ng/ml de PSA. TABLA 1. Representación de la placa y la correlación con las concentraciones de PSA Contenido de pozo Estándar 15ng/ml Representación Estándar 4ng/ml Estándar Muestra 2ng/ml

Figura 2 fotografía de la placa en donde se muestra la coloración obtenida en cada caso. De izquierda a derecha std 15ng/ml , std 4ng/ml, std 2ng/ml y Muestra.

Se observa que la muestra desarrollo una coloración muy similar a la mostrada en el pocillo de estándar de 2ng/ml. INTERPRETACION Los hombres saludables se les espera tener valores de PSA debajo de 4ng/ml. La concentración mínima detectable de PSA en este ensayo es calculado ser 0.25ng/ml. Llevamos a cabo una interpretación semicuantitativa de PSA en la muestra de suero al comparar el color desarrollado en los estándares de concentración conocida de PSA con el color obtenido en pocillo de muestra con lo que pudimos determinar que el suero del paciente contenía una concentración de aproximadamente 2ng/ml, asentando este resultado en base a que tienen colores casi iguales. Campus UAZ Siglo XXI | ACS, UACQ, QFB, Séptimo Semestre grupo C Laboratorio de Inmunología Diagnostica

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PSA < 4 ng/ml el riesgo de cáncer de próstata es bajo

DISCUSIÓN  El principal tema de discusión en este método es la cuantificación del PSA ya que no se realizó conforme a lo establecido en el inserto del kit, esto debido a que no se cuenta en el laboratorio con un lector de microplaca, por lo que debió hacerse una consideración semicuantitativa de comparación visual del color desarrollado y correlacionarlo con la concentración aproximada de PSA en la muestra. CONCLUSIONES   El resultado aproximado de PSA < 4 ng/ml nos indica que el riesgo de cáncer de próstata es bajo en el paciente. Tiene que considerarse el resultado como una aproximación. Y utilizarse como una adición a otros procedimientos diagnósticos e información disponible por el medico al momento de descartar la presencia de un cáncer de próstata.

REFERENCIAS
 
Harrison Principios de Medicina Interna 16a edición. Parte V. Oncología y hematología. Sección1: Enfermedades neoplásicas. Mytrle JF (1989). «Normal Levels of Prostate-Specific Antigen (PSA)». Clinical Aspects of Prostate Cancer. Assessment of New Diagnostic and Management Procedures. Proceedings of a workshop of the Prostate Cancer Working Group of the National Cancer Institute's Organ Systems Program, held October 16-19, 1988 at Prout's Neck, Maine, U.S.A.. New York: Elsevier. pp. 183-9.

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