UNIVERSIDAD RICARDO PALMA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE BIOLOGIA

Induccin del callo y cultivo in vitro en Nicotiana Tabacum L., 1753 Tabaco
INVESTIGADORES Castro San Miguel, Delia Ciriaco ngeles, Cristian Gmez Castro, Pamela ASESOR Mauro M. Quiones A.

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA VEGETAL

2010 -II

Induccin del callo y cultivo in vitro en Nicotiana Tabacum L., 1753 Tabaco
Castro, D(1);Ciriaco, C(1); Gomez, N(1); Quiones,M(2)
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Estudiantes del taller de biotecnologa vegetal, Profesor del taller de biotecnologa vegetal Laboratorio de Biotecnologa vegetal Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Ricardo Palma. Av. Benavides 5440, Lima 33-Peru.

Resumen:
El cultivo de callo in vitro surge para contribuir al mejoramiento de especies de importancia alimenticia o agrcola consiste en el cultivo bajo condiciones aspticas, aislando fragmentos de tejidos de una planta para promoverlos a crecer en un medio ambiente apropiado que permita expresar su capacidad morfogentica; el callo es un tejido formado por clulas en continua divisin y se obtiene a partir de cualquier tipo de tejido vegetal en constante proliferacin celular. Para la realizacin de este trabajo se utilizaron tallos de Lycopersicon esculentum tomate los cuales fueron desinfectados y se cultivaron en medio Murashige y Skoog (MS) suplementado con 2,4D para la induccin de callos y races en condiciones in-vitro y se realizaron 2 repeticiones obteniendo as un total de 8 tubos. Un 50% de de callos obtenidos en la primera etapa se multiplicaron satisfactoriamente , mientras que un 25% se contamin y otro 25% no creci, motivo por el cual se efectu la segunda repetin la cual resulto satisfactoriamente en un 100%, obtenindose as callos nodulares y blanquecinos de y 4mm, 5mm, 6mm, 7mm, 10mm y 11mm. (Pamelita ya sabes, cheka otros paper ) Palabras claves: callo, Nicotiana Tabacum L, medio ms

I. Introduccin:
El tomate (Lycopersicum esculentum) es una hortaliza, de la familia de las solanceas y debido a su vulnerabilidad ante agentes nocivos origina una baja productividad. En la actualidad, la ciencia experimental sumada a los conocimientos tericos, han logrado la obtencin de tcnicas avanzadas para su mejoramiento en cultivo y desarrollo. Es la biotecnologa quien aporta las tcnicas de cultivo in vitro, fundamentndose en un marco terico que atribuye a las plantas la propiedad de totipotencialidad celular para la induccin de una nueva variabilidad gentica y su utilizacin en los programas de mejoramiento. En el presente trabajo se desarrollo la induccin de callo in vitro de Lycopersicon esculentum el cual se obtuvo de el aislamiento de tejidos diferenciados que se desdiferenciaron ante la presencia de una auxina exgena en el medio de cultivo

II. Materiales y Mtodos:

1.- Materiales
Los materiales que se utilizaron para esta experiencia fueron los siguientes; en el caso del material biolgico fue Planta de Nicotiana tabacum Tabaco, el material de vidrio fue beackers 50 mL, placas Petri, tubos de ensayo y bagueta, en caso de los reactivos fueron el medio de cultivo Murashige-Skoog, 2,4-diclorofenoxiactico, etanol 96%, hipoclorito de sodio 2.5 %. Se utilizaron como equipos un Autoclave, una cmara de flujo laminar, la cmara de cultivoCmara Sony DSC- W170 Super Steady Shot.

2.- Metodologa
La plata de Nicotiana Tabacum Tabaco, se obtuvo del cactario de la Universidad Ricardo Palma, encontrndose en buen estado, se transport en un envase con agua del grifo al laboratorio de biotecnologa vegetal. Se utiliz el medio M-S simple enriquecido 2,4-D, 1.5g de Gelrite, agua de coco, a pH 6.5. El medio se servi en tubos de ensayo, sellados con papel platino,y finalmente se autoclavaron. Los explantes se obtuvieron de segmentos del tallo, aproximadamente entre 1 a 1.5 cm que fueron colocados en un beaker con agua de grifo y detergente, con la ayuda de un cepillo se removi muchas veces, hasta disolver el detergente. Se decant tantas veces, hasta no tener restos del detergente, finalmente se enjuag con agua destilada. Seguidamente los segmentos del tallo se desinfectaro mediante una inmersin en etanol 96%, durante 30seg, luego se mantuvo en una solucin de hipoclorito de sodio 2.5% por una periodo de 15 minutos, enjuagndose 4 veces de enjuague a enjuague con agua destilada previamente esterilizada por intervalo de 5 minutos, Inmediatamente se elimin el tejido muerto exterior del explante, haciendo corte, y se sembr los explantes en tubos de ensayo con medio M-S debidamente esterilizado, luego se sell los tubos con papel platino. Esta operacin se realizo bajo la cmara de flujo lamimar. Finalmente los explantes sembrados en tubos sern llevados a incubar en el cuarto de cultivo a una temperatura entre 18-22C.

III.Resultados:

Al realizar esta experiencia que se dio con dos oportunidades con ms de 6 repeticiones

N De Explante

Posicin Del Explante En El Medio De Cultivo

Observaciones

1a

vertical

Callo transparentes y blanquecino a la tercera semana Callo transparentes y blanquecino a la cuarta semana Presencia de vestigios callo a apartir de la tercera semana Se contamino

2a 3a 4a 5a 6a 1b 2b 3b 4b 5b 6b 7b 8b 5.Discusin y

Vertical vertical Vertical

Se contamino Vertical Vertical Vertical Vertical Vertical Vertical Vertical Vertical Vertical Vertical . Presencia de vestigios callo a apartir de la tercera semana Ausencia de callo Se contamino Ausencia de callo Presencia de vestigios callo a apartir de la segunda semana Presencia de vestigios callo a apartir de la tercera semana Presencia de vestigios callo a apartir de la tercera semana Presencia de vestigios callo a apartir de la tercera semana Presencia de vestigios callo a a partir de la tercera semana

Snchez 2005 estudi la obtencin callo a partir de explantes de mesofilo de hoja de papa utilizando el medio MS 2,4D, complementados con vitaminas, carbohidratos y antioxidantes, incubndose en oscuridad durante 8 semanas (1344 horas) seguidamente a luz durante 16 h luz con una temperatura de 26 C, obtenindose as los primeros inicios de callo. En nuestro trabajo se logro obtener callos a partir del explante de tallo del tomate en un tiempo menor de 252 h (1.5 semanas) en el mismo medio base MS 2,4D. A dems Roca y Mroginski 1991 concluyeron que el cultivo in vitro presenta ciertas limitantes como: la contaminacin bacteriana y fungosa, fenolizacin u oxidacin del material vegetal, siendo las primeras dos dependendientes directamente del material vegetal y manipulacin al momento de la siembra

in vitro y la tercera dependiente de la composicin gentica del material, la etapa fisiolgica y del tipo de explante con que se trabaje. Esto fue observado debido que el 50% de la 1era siembra se contamino y fenoliz, mostrando que las limitante se encontraron en la falta de prctica y en la manipulacin al momento de la siembra.

Primera siembra del callo de Nicotiana Tabacum L., 1753 Tabaco

contaminacion 33%

vestigios de callo 34%

presencia de callo 33%

Segunda siembra del callo de Nicotiana Tabacum L., 1753 Tabaco

contaminacion 13% presencia de callo 0%

ausencia de callo 25%

vestigios de callo 62%

Promedio de desarrollo de callo de Nicotiana Tabacum L., 1753 Tabaco

14 12 10 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 semana semana semana semana semana

ausencia de callo vestigios de callo

contaminacion

Desarrollo 6. Conclusiones: y y y y Se logr obtener y cultivar in vitro el callo de Lycopersicum esculentum. El uso del medio MS enriquecido con 2.4D demostr ser un buen medio base para la induccin de callos de Lycopersicum esculentum. Se determin que el cultivo in vitro de callo de Lycopersicum esculentum tuvo un crecimiento entre las 168 y 240 horas. Los resultados obtenidos muestran que para el caso de los tratamientos con 2,4-D la mejor respuesta fue obtenida en los tubos 1b, 2b, 3a ,4a ,3b y 4b, siendo el 1b y 4a los que mayor crecimiento y capacidad de regeneracin; mostraron bajos niveles de oxidacin, alta friabilidad y crecimiento. Con la metodologa a seguir se logr obtener en 1 semana 1/2 (252 h) 4 frascos de callo de los explantes de tallo de lycopersicom esculentum tomate.

7. Recomendaciones: y y Para realizar el cultivo de callo in vitro se deber seguir el protocolo establecido. Para obtener el cultivo de callo in vitro es necesario trabajar en ambientes adecuados y aspticos, esterilizar los medios de cultivo, desinfectar superficialmente los explantes; para liberarlos de microorganismos exgenos. Para realizar el cultivo de callo es muy importante conocer la cantidad de fitohormona que se empleara y cual.

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