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Espectrofotometría de absorción UV-Visible

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Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
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Tema 8: Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible

Tabla de contenido
1.- Fundamento de la técnica ........................................................................................................2 1.2.- Tipos de transiciones electrónicas .....................................................................................2 2.- Instrumentación ......................................................................................................................6 2.1.- Fuentes de radiación .........................................................................................................6 2.2.- Monocromadores .............................................................................................................7 2.2.1.- Filtros .........................................................................................................................7 2.2.2.- Monocromadores.......................................................................................................8 2.3.- Recipientes para muestras ................................................................................................9 2.4.- Detectores ...................................................................................................................... 10 2.4.1.-Células fotovoltaicas. ................................................................................................ 10 2.4.2.- Fototubo .................................................................................................................. 11 2.4.3.- Tubos fotomultiplicadores. ....................................................................................... 11 2.5.- Instrumentos de haz sencillo y de haz doble.................................................................... 12 3.- Aplicaciones analíticas ........................................................................................................... 12 3.1.- Análisis cualitativo .......................................................................................................... 12 4.2.- Análisis cuantitativo ........................................................................................................ 13 Análisis de mezclas de sustancias absorbentes ........................................................................ 14

Análisis Instrumental

Tema 8: Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible

1.- Fundamento de la técnica
La absorción de radiación ultravioleta y visible origina transiciones entre distintos niveles de energía electrónicos, así como simultáneamente transiciones vibracionales y rotacionales, de forma que el cambio en la energía molecular de una determinada especie como consecuencia de la absorción de energía radiante puede representarse así: E = Eelectrónica + Evibracional + Erotacional + Etraslacional De todos los términos que figuran en la expresión anterior, el más importante es Eelectrónica, pués la diferencia de energía entre dos estados vibracionales es unas 10 veces menos, y Erotacional es, a su vez, entre 10 y 100 veces menor que Evibracional. Por otro lado, el último término es tan pequeño que prácticamente puede prescindirse de su influencia. Debido a lo anteriormente expuesto puede ser de utilidad clasificar las especies absorbentes en base al tipo de transiciones electrónicas que pueden tener lugar. Asimismo, esto permite correlacionar el comportamiento espectral de una determinada especie con sus características químicas, lo cual es importante en orden a determinar estructuras moleculares y para la identificación de ciertos grupos funcionales.

1.2.- Tipos de transiciones electrónicas
Las moléculas orgánicas, y una gran cantidad de aniones inorgánicos, contienen electrones en orbitales moleculares  y π, así como en orbitales no enlazantes, n, por lo que cuando estas especies absorben fotones de contenido energético adecuado se pueden producir transiciones a los correspondientes orbitales moleculares antienlazantes, * y π*, tal como se indica en la figura 1, donde se muestra la estructura de Lewis para una molécula orgánica sencilla y las transiciones electrónicas correspondientes.

Figura 1: Transiciones electrónicas entre niveles de energía moleculares

Como se representa en la figura 1., pueden tener lugar cuatro tipos de transiciones: —>*. 𝜋—>π*. n—>* y n— >π*. Asimismo, también pueden producirse transiciones denominadas de transferencia de carga y de campo ligando. Seguidamente se comentarán algunas peculiaridades de cada una de las transiciones mencionadas.  Transiciones   *. Estas transiciones entre orbitales moleculares sigma enlazantes y antienlazantes implican energías relativamente grandes, de forma que las bandas de absorción se observan en el ultravioleta lejano, a longitudes de onda inferiores a 200 nm (Figura 2). Esta región del espectro se denomina ultravioleta de vacío, debido a que los constituyentes normales del aire,m nitrógeno y oxígeno, absorben fuertemente a 160 y 200 nm respectivamente, por lo que los espectros en esta zona deben obtenerse operando en el “vacío”.

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Análisis Instrumental

Tema 8: Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible

Figura 2: Bandas de absorción originadas por diferentes transiciones electrónicas

En los hidrocarburos saturados, en los que solamente hay enlaces sencillos C-H se producen estas transiciones; así el metano presenta máximos de absorción a 125 nm y el etano a 135 nm. Desde el punto de vista analítico, estas bandas tienen poco interés, debido a dificultades de tipo instrumental.  Transiciones n*. Las especies químicas saturadas que contengan átomos con pares electrónicos en orbitales no enlazantes pueden dar lugar a que se produzcan transiciones n*. Esto sucede, por ejemplo, en compuestos saturados conteniendo heteroátomos de oxígeno, azufre y halógenos. Estas transiciones requieren bastante energía, si bien en menor grado que las — >*, por lo que las bandas correspondientes se presentan fundamentalmente en el ultravioleta lejano. Por otra parte, la intensidad de las absorciones asociadas con estas bandas suelen ser de pequeña magnitud. Los máximos de absorción correspondientes a esta transiciones n—>* tienden a desplazarse hacia longitudes de onda menores al aumentar la electronegatividad del heteroátomo. De hecho, la mayor parte de los compuestos saturados que contienen oxígeno absorben a longitudes de onda inferiores a 200 nm, lo cual hace posible que compuestos tales como el agua, o los alcoholes, puedan utilizarse como disolventes en el ultravioleta próximo.  Transiciones n—>π* y π — >π*. Estas transiciones se consideran juntas debido a que muchos grupos químicos contienen electrones en orbitales π y no enlazantes. Como se aprecia en la Figura 1. las transiciones n—>π* requieren la absorción de una cantidad de energía relativamente grande, por lo que suelen aparecer en el ultravioleta lejano, mientras que las π—>π* necesitan menor cantidad de energía, como consecuencia de lo cual se originan bandas en las zonas ultravioleta próximo y visible. En lo que respecta a la intensidad de la absorción, las absortividades molares de los picos asociados a las transiciones n—>π* son generalmente bajos, mientras que los correspondientes a los π—>π * son considerablemente mayores. De cualquier forma, el comportamiento mencionado puede alterarse, como se verá posteriormente, por la presencia de determinadas agrupaciones atómicas, o por el tipo de disolvente. Para que tengan lugar Para que tengan lugar las transiciones consideradas en este apartado, es evidente que la especie química tendrá que contener algún grupo funcional con enlaces π, esto es, la estructura molecular deberá presentar centros absorbentes no saturados. A estos grupos de átomos responsables de la absorción en las regiones ultravioleta y visible se les denomina grupos cromóforos (por extensión, se considera que los sistemas con electrones s son cromóforos en el ultravioleta lejano). En la tabla 1. se muestran algunos grupos cromóforos y las transiciones implicadas en espectrofotometría ultravioleta-visible. Por otra parte, existen determinadas agrupaciones atómicas que por sí mismas no comunican color a la molécula que pertenecen, pero son capaces de reforzar la acción de un cromóforo. Estos qrupos se denominan auxocromos.

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Tabla 1: Grupos cromóforos y transiciones electrónicas

Los grupos auxocromos suelen contener grupos funcionales con electrones en orbitales no enlazantes y que, en consecuencia, pueden absorber únicamente en el ultravioleta lejano, como consecuencia de transiciones n*. Sin embargo, si un auxocromo y un cromóforo se encuentran en la misma molécula, la absorción del cromóforo se desplaza hacia longitudes de onda más largas, a la vez que se produce un incremento en la intensidad de absorción. Este efecto se agribuye normalmente a la posibilidad de que se den transiciones nπ*. En relación a las modificaciones de las intensidades de absorción se definen los siguientes términos: efecto hipercrómico (aumento de la intensidad de absorción) y efecto hipocrómico (disminución de la intensidad de absorción). Cuando una molécula contiene dos o más grupos cromóforos pueden darse las siguientes posibilidades: a) Si los cromóforos están separados por dos o más enlaces sencillos se dice que están aislados y, en estos casos, la absorción es la suma de todos los grupos cromóforos presentes: λmax (nm) εmax CH3-CH2-CH2-CH=CH2 184 10000 CH2=CH-CH2-CH2-CH-=CH2 185 20000 b) Cuando los cromóforos están conjugados, esto es, separados por un enlace sencillo, se produce un desplazamiento batocrómico acompañado de un efecto hipercrómico. λmax (nm) εmax -C=C170 16000 -C=C-C=C220 21000 -C=C-C=C-C=C260 35000 La razón de estos desplazamientos se considera que es debido a que la conjugación hace que se produzca una deslocalización de los electrones π sobre, al menos, cuatro átomos, como consecuencia de lo cual se rebaja el nivel de energía del orbital π*, con lo que al ser menor la energía requerida para las transiciones, los máximos de absorción se desplazan hacia mayores longitudes de onda, aumentado además las probabilidades de que tengan lugar las mencionadas transiciones, lo que origina un aumento simultáneo en la intensidad de la absorción. Sin embargo, cuando existe algún enlace triple, se observa una disminución de la intensidad de absorción (efecto hipocrómico) λmax (nm) εmax CH2=CH-CH-CH2 219 21000 CH2=CH-C=CH 219 6500 c) Cuando los cromóforos están unidos directamente, el espectro resultante normalmente es distinto del que presentan ambos cromóforos cuando están aislados, ya que en realidad se forma un nuevo cromóforo. 4

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Tema 8: Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible λmax (nm) 170 225 εmax 10000 500

CH2=CH2 CH2=C=CH2

En cuanto a la influencia del disolvente, puede decirse que al aumentar la polaridad del disolvente se produce un desplazamiento hipsocrómico (hacia menor longitud de onda) de las bandas nπ* y un desplazamiento batocrómico (hacia menor longitudes de onda mayores) de las bandas ππ*. Esto puede explicarse teniendo en cuenta que el estado excitado es más polar que el estado fundamental, por lo cual, la presencia de un disolvente polar tiende a estabilizar los estados excitados, rebajando su nivel energético. De todas formas, si únicamente tuviera lugar este efecto, en ambas transiciones ocurrirían desplazamientos batocrómicos. Sin embargo, en el caso de las transiciones nπ* se produce un aumento de solvatación del par de electrones no enlazados, lo cual rebaja la energía del orbital no enlazante en mayor medida que lo que disminuye la energía del orbital π*. En consecuencia, se produce un aumento de la energía requerida para la transición nπ* y el consiguiente desplazamiento hipsocrómico.  Bandas de transferencia de carga. Estas bandas se originan cuando se produce transferencia de electrones de una parte a otra de un sistema. Para ello es necesario que uno de sus componentes tenga características de dador de electrones y otro de aceptor. Como consecuencia de esta transferencia se origina un estado excitado que es el resultado de un proceso de oxidación-reducción interna. Así, por ejemplo, la absorción de un fotón por el complejo Fe(III)-SCN- da lugar a la transferencia de un electrón desde el tiocianato hasta uno de los orbitales del hierro, originándose una especie excitada consistente en Fe(II) y SCN neutro. Fe(III)-SCN- + hν  Fe(II)-SCN Lo mismo sucede con otros tipos de excitación electrónica, el electrón que ha experimentado la transferencia vuelve a su estado original, si bien, ocasionalmente puede tener lugar la disociación del estado excitado, teniendo lugar, en este caso, una reacción fotoquímica. Las bandas de absorción originadas por estos procesos de transferencia de carga son particularmente importantes en análisis químico, ya que muchos compuestos orgánicos e inorgánicos las presentan en el ultravioleta (a veces también en el visible) y las absortividades molares suelen ser muy altas (superiores a10000), por lo cual se obtienen límites de detección muy bajos para estas especies.  Bandas de campo ligando. El color que presentan muchos iones y compuestos de metales de transición normalmente se deben a absorciones denominadas de campo ligando (junto a éstas, suelen presentarse las intensas bandas de transferencia de carga anteriormente mencionadas). Estas absorciones suelen ser de baja intensidad y aparecen en la región del visible, llegando en ocasiones hasta el ultravioleta próximo y el infrarrojo próximo. El origen de las bandas de campo ligando puede explicarse del siguiente modo: los cinco orbitales d de un átomo o un ión de un elemento de transición en ausencia de un campo magnético o eléctrico externo están degenerados, no siendo necesaria la absorción de radiación para promover un electrón de un orbital a otro. Al formarse un complejo entre el ión metálico y el agua, o algún otro ligando, los átomos dadores de los ligandos se aproximan al ión metálico central. Como consecuencia de la aproximación los átomos dadores (cargas puntuales) se origina un campo eléctrico que elimina la degeneración existente en el grupo de orbitales d y los divide en dos grupos. La energía de separación entre los dos grupos depende de las características del ión metálico (carga y número cuántico principal del orbital d) y del,ligando (distribución de su densidad de carga y polarizabilidad). En este sentido, es posible ordenar los ligando más comunes en orden creciente de E (serie espectroquímica) I- < Br- < l- < F- < OH- < C2O42- < H2O < SCN- < NH3 < etilendiamina < NO2- < CN-

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Ejemplo: Las disoluciones acuosas de Cu2+, Cu(H2O)42+ son de color azul pálido, mientras que en medio amoniacal, Cu(NH3)42+, el color es azul violeta muy intenso. Esto es debido al aumento que experimenta el campo ligando cuando se sustituye el H2O por NH3.

2.- Instrumentación
El instrumento que normalmente se utiliza para medir la transmitancia o la absorbancia de una muestra en función de la longitud de onda es el espectrofotómetro. Los componentes básicos de un espectrofotómetro son: una fuente de radiación, un monocromador, que seleccione una banda estrecha de longitudes de onda , una cubeta, o recipiente que contenga la muestra, un detector de radiación y un sistema de tratamiento y lectura de la señal detectada.

Figura 3: Espectrofotómetro de doble haz

2.1.- Fuentes de radiación
Las fuentes de radiación utilizadas en espectrofotometría ultravioleta y visible deben ser continuas en una amplia zona del espectro, de intensidad elevada y ser esencialmente constante con la longitud de onda. En la zona ultravioleta y visible, las fuentes más utilizadas son de dos tipos: fuentes térmicas, basadas en la emisión de radiación por efecto de la temperatura, y fuentes cuya radiación se debe a descargas eléctricas producidas en el seno de gases. Entre las primeras, la más común es la lámpara de filamento de wolframio. En condiciones ordinarias de operación, esta lámpara resulta útil entre unos 350 nm y unos 3000 nm.

Figura 4: Curva de distribución espectral de las lámparas de deuterio y wolframio.

Como puede observarse en la figura 4, la mayor parte de la energía emitida corresponde a la zona infrarroja. La distribución de la energía depende de la temperatura del filamento, la cual 6

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depende, a su vez, del voltaje; un incremento en la temperatura de operación aumenta la energía total emitida y desplaza el máximo de intensidad hacia longitudes de onda más cortas. Debido a que la radiación emitida depende únicamente del voltaje suministrado, éste tiene que ser muy estable, por lo cual los instrumentos llevan incorporado un sistema para la estabilización de la corriente. Por otra parte, el calor producido por la lámpara puede constituir un problema, por lo que, con frecuencia, en el lugar donde se coloca la lámpara se instala un ventilador con objeto de evitar el calentamiento de la muestra y de los demás componentes del instrumento. Por debajo de 350 nm, la potencia de una lámpara de wolframio es inadecuada, debiéndose emplear una fuente diferente. La más común es la laámpara de descarga de hidrógeno, o de deuterio. Cuando se produce una descarga eléctrica entre dos electrodos e el seno de un gas, como hidrógeno, las colisiones entre los electrones de la descarga y las moléculas gaseosas probocasn la excitación eléctronica, vibracional y rotacional de dichas moléculas, con lo que se obtiene un espectro de líneas que es característico del gas, siempre que la presión sea baja. Al aumentar la presión, las líneas se ensanchan, llegando a superponerse, hasta que, a presiones relativamente altas (0,2-5 mm) se produce un espectro continuo. Tanto la lámpara de hidrógeno como la de deuterio tienen un intervalo de utilización comprendido entre 175 y350 mm. También se utilizan con la misma finalidad la lámpara de descarga de xenón y la de vapor de mercurio. Finalmente, indicar que, puesto que el vidrio absorbe fuertemente a longitudes de onda inferiores a unos 350 nm, las lámparas de ultravioleta deben utilizar ventanas de cuarzo.

2.2.- Monocromadores
La misión de los filtros y de los monocromadores es seleccionar un haz de radiación “monocromática”.

2.2.1.- Filtros
Los filtros de absorción se utilizan en la región visible y se basan en la absorción selectiva de ciertas longitudes de onda. Normalmente consisten en un vidrio coloreado o una suspensión de un colorante en gelatina que se coloca entre dos placas de vidrio. Los filtros de banda se caracterizan por su anchura de banda que puede oscilar entre 30 y 250 nm. Los filtros de corte tienen transmitancias de casi el 100% en una zona del espectro visible, pero luego disminuye rápidamente hasta un valor de transmitancia cero. Por combinación de diferentes filtros pueden seleccionarse bandas espectrales relativamente estrechas. Los filtros de interferencia consisten en un dieléctrico transparente (frecuentemente, fluoruro cálcico o magnésico) recubierto en ambos lados con dos finas capas de plata semirreflectante.

Figura 5: Filtro de interferencia

Cuando un haz de radiación incide sobre este dispositivo, una fracción atraviesa la primera capa metálica, mientras que la restante se refleja. La parte que ha pasado sufre una escisión similar al llegar a la segunda capa metálica. Si la parte reflejada en la segunda interacción es de longitud de 7

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onda adecuada, se refleja, en parte, desde la cara interior de la primera capa en fase con la radiación incidente de la misma longitud de onda, mientras que la mayoría de las otras, fuera de fase, sufren una interferencia destructiva. Estos filtros proporcionan anchuras de banda menores y transmitancias de pico mayores que los filtros de absorción.

2.2.2.- Monocromadores
Un monocromador se caracteriza por producir un haz de radiación de gran pureza espectral y permitir variar, de forma continua y en un amplio intervalo la longitud de onda de la radiación, Los componentes básicos de un monocromador son una rendija de entrada, que selecciona un haz de radiación policromática entrante, un elemento dispersante, prisma o red, que dispersa la radiación en sus longitudes de onda individuales, y una rendija de salida, que aísla la banda espectral deseada (Figura 6). La dispersión de radiación por un prisma se basa en el fenómeno de la refracción; esto es, el cambio de dirección que experimenta un haz de radiación al pasar de un medio a otro con distinto índice de refracción. El grado de desviación depende de la longitud de onda; así, los azules se desvían más que los rojos.

Figura 6: Dispersión de la radiación por un prisma

El material de que está contruido el prisma depende del tipo de radiación a dispersar; en la región visible se usan prismas de vidrio, mientras que en el ultravioleta es necesario usarlos de cuarzo. Los prismas presentan las ventajas de su gran pureza espectral (no hay órdenes de dispersión superiores, como en las redes), mientras que el principal inconveniente reside en que la dispersión no es lineal; esto es, las longitudes de onda no se dispersan de manera uniforme: es mayor para las longitudes de onda más cortas. Las redes de difracción, que son más utilizadas, consisten en una superficie dura, pulida, sobre la que se ha grabado un gran número de surcos paralelos y muy próximos entre sí (entre 300 y 2000 surcos por milímetro para las regiones ultravioleta y visible).

Figura 7:Difracción de radiación por una red de refracción

Cuando un haz de radiación incide sobre una red de refracción con un ángulo i (Figura 7) se refleja según un angulo , diferente del incidente. En la figura 7 se muestran los haces paralelos 1 y 2. La máxima interferencia constructiva entre ambos se produce cuando la diferencia de caminos recorridos por ellos sea un múltiplo entero de la longitud de onda, y esta diferencia es AB – CD. Los segmentos AB y CD pueden expresarse en función de d y de los ángulos i y . 8

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Tema 8: Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible AB = d sen i CD = d sen 

por lo cual, nλ = d (sen I + sen ) donde n, número entero, se denomina orden de difracción. Según la ecuación anterior, existen distintos valores de λ para unos determinados ángulos i y , por lo que junto con la línea de primer orden (n=1) aparecen líneas de órdenes superiores. Ordinariamente, la línea de primer orden es la más intensa. Las líneas de órdenes superiores pueden eliminarse mediante filtros. El fenómeno de la difracción de una radiación policromática por una red se representa esquemáticamente en la figura 8. Para seleccionar la readiación de una determinada longitud de onda, se hace girar la red hasta hacer que la radiación que interesa coincida con la rendija de salida, eliminando los órdenes superiores mediante filtros.

Figura 8: Difracción de la radiación policromática por una red

En resumen, y comparando con los prismas, las redes de difracción presentan las ventajas de su elevada resolución, dispersión lineal y pocas pérdidas de radiación por absorción. Posiblemente, el mayor inconveniente esté relacionado con la presencia de órdenes de difracción superiores.

2.3.- Recipientes para muestras
En espectrofotometría analítica, casi siempre se trabaja con disoluciones, por lo cual la mayoría de los recipientes para la muestras son celdas o cubetas para colocar líquidos en el haz del espectrofotómetro. Estos recipientes deben estar fabricados con un material que permita el paso de radiación de la región espectral de interés. Así, el vidrio puede emplearse entre 350 y 2000 nm, mientras que en la región ultravioleta se necesita cuarzo o sílice fundida (ambas sustancias también son transparentes en la región visible). En algunos instrumentos baratos se utilizan a veces tubos de ensayo cilíndricos como recipientes para las muestras. Es importante que estos tubos siempre se coloquen igual, para lo que se marcan en un lado, y la marca siempre se pone en la misma dirección cuando se coloca el tubo en el compartimento de cuberas del instrumento. Las celdas se deben llenar de tal forma que el haz de radiación pase a través de la disolución, con el menisco por encima del haz. Las celdas típicas para las regiones ultravioleta y visible tienen 1 cm de paso óptico, si bien existe una gran variedad en cuanto a tamaño, forma y otras peculiaridades, como se muestra en la figura 9.

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Figura 9: Celdas para espectrofotometría

2.4.- Detectores
Los detectores usados en espectrofotometría ultravioleta y visible son transductores que convierten la energía radiante en una señal eléctrica. Un detector ideal deberá presentar las características siguientes:        Sensibilidad elevada en la región espectral de interés. Respuesta lineal para la energía radiante. Tiempo de respuesta pequeño. Utilizable en un amplio intervalo de longitudes de onda. Elevada relación señal/ruido. Mínima señal de salida en ausencia de radiación. Buena disponibilidad para la amplificación.

Sin embargo, no existe el detector ideal, por lo que en la práctica, se evalúan todos los factores anteriores y se selecciona algún detector que resulte adecuado al caso. Los más utilizados son: células fotovoltaicas, fototubos, y tubos fotomultiplicadores.

2.4.1.-Células fotovoltaicas.
Consisten en una placa de hierro, que actúa de electrodo positivo, sobre la que se deposita una fina capa de un material semiconductor, como selenio, y éste se recubre de una capa muy fina de oro o plata, que actúa como segundo electrodo o electrodo colector (Figura 10)

Figura 10: Célula fotovoltaica

Cuando la radiación electromagnética incide sobre el selenio, se promocionan electrones a las bandas de conducción, haciendo que pasen electrones desde la superficie del selenio hasta el electodo colector de plata, produciéndose un aumento de la conductividad proporcional al número de fotones que inciden sobre la superficie del semiconductor. Las células fotovoltaicas presentan las siguientes características: son sencillas de construir, relativamente baratas y no requieren una fuente de energía externa, por lo que pueden conectarse directamente a un galvanómetro o un amperímetro. En cuanto a los inconvenientes, su uso limitado a la región visible (su máxima sensibilidad se presenta hacia los 550 nm, mientras que la respuesta a 350 ya 750 disminuye hasta un 10% de la máxima), presentan dificultados para la amplificación, y fenómenos de fatiga de forma que la corriente de salida disminuye gradualmente con el tiempo.

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2.4.2.- Fototubo
Consisten en un cátodo semicilíndrico recubierto interiormente de un material fotosensible, y un ánodo, en el interior de un recipiente en el que se ha hecho el vacío. (Figura 11)

Figura 11: Fototubo

Cuando la radiación incide sobre el cátodo, se produce una emisión de fotoelectrones que se dirigen al ánodo, originándose una corriente que posteriormente se amplifica. La emisión de electrones depende de la naturaleza de la superficie del cátodo y de la frecuencia de la radiación. En el comercio existen fototubos que difieren en el material con el que está construida la superficie del cátodo, siendo, por tanto, diferente su respuesta a la radiación de diversas frecuencias. Muchos espectrofotómetros están provistos de detectores intercambiables que permiten mantener una buena respuesta en un amplio margen de longitudes de onda. En general, puede concluirse que los fototubos son más sensibles que las células fotovoltaicas, por la posibilidad de poder amplificar la corriente inicialmente generada.

2.4.3.- Tubos fotomultiplicadores.
Este tipo de detector consiste en un cátodo fotosensible y una serie de electrodos (dínodos), cada uno a un potencial menos negativo que el que le precede (figura 12).

Figura 12: Tubo fotomultiplicador

La radiación que llega al fotocátodo provoca la emisión de electrones primarios, que son acelerados hasta el primer dínodo. Al incidir en él, cada fotoelectrón origina la emisión de varios electrones adicionales; éstos, a su vez, son acelerados hasta el dínodo 2, y así sucesivamente, hasta que al final, la corriente así producida se recoge en el ánodo, se amplifica electrónicamente y se mide. Normalmente, los tubos fotomultiplicadores contienen 9 ó 10 dínodos, los cuales originan de 106 a 107 electrones por cada fotón. Este sistema de detección se caracteriza por su respuesta rápida y elevada sensibilidad. El límite de detección viene condicionado por el ruido de fondo que se origina como consecuencia de la emisión termoiónica, la cual puede reducirse enfriando. De hecho, estas corrientes pueden eliminarse virtualmente enfriando el detector a -30 °C, si bien esto no se lleva a cabo en el trabajo espectrofotométrico ordinario,

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2.5.- Instrumentos de haz sencillo y de haz doble
Las medidas de absorción de radiación ultravioleta y visible son, por su propia naturaleza, de carácter relativo; debe de compararse, continuamente, la absorción de la muestra, conteniendo el analito, con la de una referencia o blanco conteniendo las mismas especies que la muestra, excepto el analito. En los instrumentos de haz sencillo hay solamente un haz de radiación que, después de pasar a través de la muestra llega al detector. De esta forma, para comparar la absorción del blanco, debe sustituir éste a la muestra en cada lectura, lo cual implica varios segundos entre cada medida. Alternativamente, la muestra y la referencia pueden compararse varias veces por segundo usando un instrumento de doble haz. En él, (figura 3) la radiación pasa alternativamente a través de la muestra y de la referencia, lo cual se lleva a cabo mediante un motor que hace girar un espejo ("chopper") dentro y fuera de la trayectoria de la radiación. Cuando el espejo obturador intermitente no desvía el haz, éste pasa a través de la muestra y el detector mide la potencia radiante P. Cuando dicho espejo desvía el haz a través de la celda de referencia, el detector mide P 0. De esta forma la radiación es desviada varias veces por segundo, y el circuito compara automáticamente P y P0 para obtener la absorbancia. La operación con el sistema de doble haz presenta, fundamentalmente, las dos ventajas siguientes: la comparación muy rápida de muestra y referencia ayuda a eliminar errores debidos a fluctuaciones en la intensidad de la fuente y del detector, inestabilidad electrónica y cambios en el sistema óptico. Por otra parte, se facilita la posible automatización.

3.- Aplicaciones analíticas
En principio, cualquier especie química que absorba radiación electro magnética en las regiones ultravioleta o visible es susceptible de poder ser determinada por técnicas espectrofotométricas. El mayor campo de aplicación se encuentra en el análisis cuantitativo, siendo la espectrofotometría una de las herramientas más usadas.

3.1.- Análisis cualitativo
Los espectros de absorción ultravioleta y visible son, en general, menos útiles con fines cualitativos que los espectros en la región infrarroja, debido a que en aquellos las bandas son más anchas y, por consiguiente, menos características. La identificación de un compuesto puro requiere la comparación empírica de los detalles del espectro (máximos, mínimos y puntos de inflexión) de la sustancia problema con los del compuesto puro. Además, la intensidad de la absorción, expresada en términos de la absortividad molar, ε, se usa con frecuencia como criterio adicional para la identificación, sobre todo si ε tiene un valor elevado a determinadas longitudes de onda. Cuando se trata de identificar sustancias orgánicas, es conveniente operar en fase de vapor y a presión baja, ya que en estas condiciones, el espectro observado es debido a moléculas aisladas y, generalmente es posible resolver la estructura fina vibracional y rotacional, lo que proporciona detalles característicos para la identificación. En disolución y, sobre todo, en presencia de disolventes polares como el agua, alcoholes, esteres y cetonas, las moléculas no se encuentran aisladas, sino solvatadas, como consecuencia de lo cual se limita la rotación. Además, los campos del disolvente pueden modificar de forma irregular los niveles de energía vibracionales y, cuando el número de moléculas es grande, los niveles de energía son poco definidos, obteniéndose como resultado la aparición de una banda.

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Análisis Instrumental

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Una de las pocas sustancias orgánicas con espectro de absorción característico en disolución es el benceno. Su espectro se usa frecuentemente en test de especificaciones de pureza, donde el contenido en benceno debe ser cuidadosamente controlado, por ejemplo, en alcohol absoluto o en ciclohexano. Aun cuando la identificación de un compuesto orgánico de forma inequívoca con esta técnica, no es posible normalmente, el espectro de absorción en las regiones ultravioleta y visible puede ser de utilidad para la detección de ciertos grupos funcionales. Así, por ejemplo, la presencia de una banda débil entre 280 y 290 nm, que se desplaza hacia menores longitudes de onda al aumentar la polaridad del disolvente, indica la presencia de un grupo carbonilo. De cualquier forma, y para mayor seguridad, estos datos deben usarse siempre en combinación con los obtenidos a partir de espectros infrarrojos, de resonancia magnética nuclear o cualquier otra información analítica de que se disponga. En resumen, el espectro de absorción ultravioleta y visible no es una prueba infalible de la identidad de una especie química, pero sí representa otra herramienta disponible para aplicarla de forma inteligente. En cuanto a sustancias inorgánicas, casi las únicas que tienen espectro de absorción ultravioleta y visible característico son los iones trivalentes de las tierras raras. De hecho, el Ho2O3 se utiliza en ocasiones para comprobar el calibrado de la longitud de onda de algunos instrumentos.

4.2.- Análisis cuantitativo
Ya se ha comentado que la espectrofotometría de absorción ultravioleta y visible es una de las técnicas más usadas en análisis cuantitativo. Se ha estimado que solo en el campo biosanitario un 95% de las determinaciones analíticas se llevan a cabo por espectrofotometría. En relación con los métodos clásicos de análisis (gravimétricos y volumétricos), los métodos espectrofotométricos son menos exactos, si bien su mayor sensibilidad (10-4-10-6 M) y rapidez los hace competir ventajosamente con aquellos en muchas ocasiones. La precisión puede considerarse aceptable, ya que, normalmente se obtienen incertidumbres relativas entre 1 y 2 % aunque con determinadas precauciones pueden reducirse considerablemente. La base de la aplicación de los métodos espectrofotométricos al análisis cuantitativo es la ley de Beer. El procedimiento a seguir para llevar a cabo una determinación analítica consta de una serie de etapas encaminadas a establecer las condiciones de trabajo y la preparación de la curva de calibrado. a) Selección de la longitud de onda. Las medidas de absorbancia se llevan a cabo normalmente a la longitud de onda correspondiente al máximo de absorción, ya que de esta forma se obtienen máximas sensibilidades. Por otra parte, en esa zona, la curva espectral suele ser bastante plana, por lo que el cumplimiento de la ley de Beer es normalmente satisfactorio. A veces no es posible operar a la longitud de onda del máximo de absorbancia cuando a esa longitud de onda absorbe apreciablemente alguna especie (distinta del analito) presente. Incluso, en ocasiones, el propio reactivo. b) Preparación de las muestras para el análisis. Muchos compuestos orgánicos absorben en la región ultravioleta y el tratamiento de la muestra solo implica la separación de las posibles interferencias. Por otra parte, algunos elementos inorgánicos absorben intensamente en la región visible, pero solo en ciertos estados de oxidación. En estos casos, una etapa previa (además de la disolución si se trata de muestras sólidas) debe incluir un proceso redox para llevar el elemento al estado de oxidación adecuado. Así, por ejemplo, el manganeso se determina frecuentemente en forma de permanganato. previa oxidación con persulfato: 2 Mn2+ + 5 S2082- + 8 H2O -> 2 Mn04- + 10 S042- + 16 H+ La disolución violeta de permanganato presenta un máximo de absorbancia a 525 nm. 13

Análisis Instrumental

Tema 8: Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible

En otras ocasiones es posible desarrollar un color por medio de reactivos orgánicos o inorgánicos. Así, por ejemplo, el Fe3+ puede determinarse mediante el color rojo de los complejos formados con SCN-; el Ni2+ por el color rosa de su quelato con dimetilglioxima, etc. c) Determinación de la relación absorbancia-concentración. Una vez conocida la absorbancia de una determinada especie, en principio, se podría obtener lo concentración a partir de la ley de Beer: A = ε b c. Sin embargo, no es prudente asumir el cumplimiento de dicha ley y utilizar un solo patrón para determinar la absortividad molar, ε. Asimismo, tampoco es conveniente basar los resultados de un análisis en un valor de la bibliografía para obtener ε. Por ello, el método normal de trabajo consiste en la preparación de un calibrado a partir de una serie de disoluciones patrón, preparadas en las mismas condiciones que la muestra y obtener los resultados por interpolación. Cuando se trata de analizar materiales complejos, es muy difícil, si no imposible, reproducir en los patrones las condiciones de las muestras. En estas ocasiones suele ser de utilidad el método de adición estándar, con objeto de contrarrestar los efectos de la matriz. Este método, en análisis espectrofotométrico, se suele aplicar de la siguiente manera: a varias alícuotas idénticas de la muestra se adicionan volúmenes variables de una disolución estándar del analito de concentración conocida. Se añaden entonces los reactivos correspondientes al método empleado y cada disolución se enrasa a un volumen fijo, antes de medir la absorbancia. Si se cumple lo ley de Beer, los datos se representan como en la figura 13 a partir de la cual se obtiene el punto de corte de la recta (obtenida, si es necesario, por ajuste por mínimos cuadrados) con el eje horizontal y, a partir de ahí, la concentración de la muestra original.

Figura 13: Método de adición estándar para análisis espectrofotométrico

Análisis de mezclas de sustancias absorbentes Cuando en una disolución hay varias sustancias que absorben radiación, es posible, en muchos casos. Ilevar a cabo su determinación sin necesidad de separar previamente los distintos componentes. Se va a considerar el caso de que la muestra esté constituida por los componentes M y N. La forma de proceder depende de los espectros de absorción de ambas especies, y pueden presentarse los siguientes casos: Espectros no superpuestos. En estas ocasiones, como se muestra en la figura 14 es posible encontrar algunas longitudes de onda a las que absorba solo una de las especies; λ1 para determinar M y λ2 para determinar N.

Figura 14: Análisis de mezclas. Espectros no superpuestos.

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Análisis Instrumental

Tema 8: Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible

Espectros superpuestos parcialmente. Cuando la situación es como se muestra en la figura 15, la especie N no interfiere en la medida de M a la longitud de onda λ1, por lo que la determinación de esta especie puede hacerse directamente a λ1. A continuación se determina la absorbancia de M a la longitud de onda λ2 a partir de la absortividad molar (en una experiencia previa) y finalmente, se resta esta contribución de la absorbancia medida a λ2. Con ello se obtiene la absorbancia del componente N. cuya concentración se calcula posteriormente de

Figura 15: Análisis de mezclas. Superposición parcial de espectros

Espectros completamente superpuestos. Como se indica en la figura 16 no es posible encontrar una longitud de onda en la que M y N absorban de forma exclusiva.

Figura 16: Análisis de mezclas. Espectros superpuestos.

En este caso, el problema se resuelve midiendo las absorbancias A1 y A2 a las longitudes de onda λ1 y λ2 respectivamente, y planteando las ecuaciones siguientes: A1 = εM1 b CM + εN1 b CN (a λ1) A2 = εM2 b CM + εN2 b CN (a λ2) Esto es posible porque la ley de Beer establece que la absorbancia es una propiedad aditiva, de forma que la absorbancia total de una disolución a una longitud de onda dada es igual a la suma de las absorbancias de los componentes individuales presentes. En las ecuaciones anteriores, b representa el camino óptico y εM1, εM2, εN1 Y εN2 los absortividades molares de M y N a las longitudes de onda λ1 y λ2 que deben ser determinadas previamente a partir de disoluciones patrón, o mejor, a partir de las pendientes de sus representaciones de la ley de Beer. Esta forma de proceder es válida solo si se cumple la ley de Beer y si los dos componentes se comportan independientemente uno del otro. La mayor precisión se alcanza cuando se eligen longitudes de onda en las que las diferencias entre las absortividades molares sean grandes: a λ1 ε1 grande y ε2 pequeña, y a λ2 ε1 pequeña y ε2 grande. Sin embargo, no todos los sistemas se comportan de este modo. Puede ocurrir que exista solapamiento a todas las longitudes de onda y que, para cada λ, εM > εN. Un procedimiento alternativo para analizar estas muestras consiste en un método gráfico, cuyo fundamento es el siguiente; la primera de las ecuaciones anteriores puede escribirse asi: 15

Análisis Instrumental

Tema 8: Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 𝐴1 𝜀𝑀1 𝑏 𝜀𝑁1 𝐶 𝜀𝑀1 𝑁

= 𝐶𝑀 +

En lugar de medir A, εM y εN solamente a dos longitudes de onda, se miden estas magnitudes a varias, para lo cual es necesario disponer de los espectros correspondientes a los componentes puros y a la mezcla desconocida. Para un cierto número de medidas, se representan gráficamente los valores de A/εM b frente a εN/εM, obteniéndose una línea recta. La pendiente de la recta permite obtener CN y la ordenada en el origen. CM. El método puede extenderse con facilidad a sistemas de tres componentes. La principal ventaja del método es que el uso de múltiples puntos a lo largo de todo el espectro, en lugar de utilizar solamente dos permite alcanzar un grado superior de precisión y exactitud.

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