Fase de cultivo celular

Pregunta 1: Se hicieron dos cultivos, uno partiendo de una

colonia no fluorescente, y otra fluorescente; ¿qué se trata de
demostrar haciendo esto?

Se demuestra así la función de la arabinosa, que activa la síntesis

de la proteína GFP.

Pregunta 2: ¿Qué papel cumplen en el proceso de clonación el

iluminador UV, la estufa de incubación y la agitación mecánica antes
y durante la incubación?

1. El iluminador se usa para seguir el rastro continuamente de las

colonias fluorescentes (que lo son en longitudes de onda de
UV).
2. La estufa de incubación, como tal, permite obtener mejores
condiciones de incubación de las colonias bacterianas.
3. La agitación mecánica, se emplea para homogeneizar la
muestra.

Pregunta 3: ¿Para que se hacen crecer las bacterias en caldo

nutritivo previamente a hacer la purificación?

Para tener un crecimiento mayor de las bacterias.

Fase de concentración celular y lisis

Pregunta 1: Indica el papel en esta fase del protocolo de la

ultracentrífuga, la lisozima y el congelador.

La ultracentrífuga sirve para precipitar todas las bacterias en

suspensión, para poder decantar posteriormente. La lisozima sirve
para la digestión enzimática de la pared bacteriana, mientras que el
congelador se emplea para la rotura completa de la bacteria.

Pregunta 2: ¿Por qué eliminamos el sobrenadante después de la

primera centrifugación?

Para tener una mayor concentración protéica.

Pregunta 3: ¿Cómo puede la congelación romper las membranas

celulares?

Mediante la formación de cristales tras la digestión con la lisozima.

 Pregunta 4: ¿Cuál es el propósito de lisar las bacterias?

Conseguir la extracción de la proteína que contiene la bacteria.

Pregunta 5: ¿Qué color tiene el concentrado celular? ¿Qué color

debería tener el sobranadante? Interpreta los resultados.

El color del concentrado ha de ser fluorescente, pues es quien

contiene el gen GPF, mientra sque el sobrenadante no presenta color
(no se ha producido la lisis de las células).

Pregunta 6: ¿Por qué eliminamos el concentrado celular en esta

fase del procedimiento?

Fase de cromatografía

Pregunta 1: Describe brevemente el proceso de cromatografía

por interacción hidrofóbica. Relaciona la expliación con el caso
concreto de purificación de esta práctica.

Este tipo de cromatografía separa las proteínas en base a su

hidrofobicidad superficial, y se caracteriza por la adsorción de las
biomoléculas a la superficie débilmente hidrofóbica de la resina en
una solución fuertemente salina y su posterior elución mediante un
gradiente salino negativo.

Pregunta 2: Cubre la siguiente tabla indicando las observaciones

realizadas después de correr los tres tampones de cromatografía.

Tubo de recogida Predicción Observación bajo luz

UV (columna e tubo)
#1 Sin color Sin color / color verde
#2 Sin color Sin color / color verde
#3 Con color verde Color verde / sin color

Pregunta 3: Teniendo en cuenta los resultados, indica el papel

de:

• El tampón de equilibrado: estabilizar los cationes y aniones en

la columna de intercambio catódico.
• El tampón de unión:
 • El tampón de lavado: arrastra los restos que quedan en la
columna.
• El tampón de elución (TE): ayuda en la elución de las proteínas.

Pregunta 4: ¿Qué tampones tienen concentración salina mayor y

cual menor? ¿Qué se puede decir sobre el papel de la salinidad?

Los primeros tienen mayor concentración. La salinidad de la

superficie hidrofóbica permite una mayor elución al disminuir la
concentración de la sal en el tampón