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TP 6
TP 6
Objetivos:
• Demostrar el efecto de metales pesados, sales, ácidos fuertes, y calor sobre la
estabilidad de las proteínas en solución acuosa y demostrar a través del uso de test
estándares la detección de proteínas presentes en distintos materiales.
• Determinar la concentración proteica de 4 muestras complejas utilizando el método
de Bradford
Introducción:
Las proteínas son compuestos biológicos constituídos principalmente por α -
aminoácidos (aa) unidos linealmente por enlaces peptídicos. Las proteínas conocidas
están formadas por una combinación de 20 aminoácidos unidos en una secuencia
determinada, propia de cada proteína (estructura primaria).
Una de las propiedades más características de los aminoácidos es su naturaleza
anfótera. En soluciones acuosas pueden encontrarse como iones bipolares o zwiteriones,
los cuales en presencia de ácidos se comportan como bases y toman protones mientras
que en presencia de bases se comportan como ácidos cediendo protones.
Las moléculas proteicas pueden reaccionar unas con otras, también con iones de
carga opuesta y con agua por ser ésta un dipolo, ya que una proteína tiene muchos
grupos correspondientes a sus cadenas laterales, cargados positiva o negativamente
(dependiendo del pH del medio en que se haya disuelta). Tendremos por lo tanto,
interacción proteína-proteína, proteína-H2O, proteína-ión.
Si la interacción proteína-proteína es grande y la interacción proteína- H2O es
pequeña, la proteína será insoluble. Si la interacción proteína - H2O es alta, entonces la
proteína tenderá a solubilizarse (altamente solvatada). Cualquier condición que aumente
la interacción proteína-proteína o disminuya la interacción proteína- H2O disminuye la
solubilidad de las proteínas (le quita la capa de solvatación).
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• Precipitación por salado: grandes cantidades de una sal muy soluble agregada a
una solución de proteínas, disminuye la interacción proteína- H 2O porque le quita la
capa de solvatación, predominará la interacción proteína-proteína y se producirá la
precipitación. La concentración salina a la que se produce la precipitación no es igual
para cualquier proteina, lo que permite usar ésta propiedad para la separación y
purificación de proteínas particulares a partir de mezclas complejas.
Comúnmente se usa sulfato de amonio (NH4)2SO4 para tal fin, a causa de su gran
solubilidad. La adición gradual de ésta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de
proteínas, las cuales son precipitadas pero no desnaturalizadas, entonces un exceso de
agua, por encima del punto de precipitación, permite solubilizar nuevamente las
proteínas.
• Formación de sales:
Efecto de metales pesados: las proteínas son precipitadas de sus soluciones por sales de
metales pesados, por combinación del ión metálico con la forma aniónica de la proteína.
Las sales comúnmente usadas son HgCl2 ó ZnCl2.
Efecto de los ácidos: las proteínas pueden precipitarse de la solución acuosa por la
adición de ciertos ácidos tales como tricloroacético (TCA), perclórico, clorhídrico, los
cuales forman con las proteínas sales insolubles.
PARTE PRÁCTICA:
A) Reactivos:
B) Técnica:
1.- En una serie de 8 tubos de ensayo, colocar 1.5 ml de la muestra en 4 tubos y igual
volumen de H2O en los restantes.
2.- Efecto de sales: A 2 tubos, uno conteniendo la muestra y el otro H 2O, agregar el
mismo volumen de la solución saturada de (NH4)2SO4. Mezclar bien y colocar en baño
de hielo. Observar y registrar el resultado. Luego agregar 5 ml de H2O. Cómo explica lo
ocurrido?
3.- Efecto del calor: A 2 tubos, uno conteniendo la muestra y el otro H2O, calentar
CUIDADOSAMENTE a la llama del mechero. Observar y registrar el resultado. Luego
agregar 5 ml de H2O y observar lo que ocurre.
4.- Efecto de metales pesados: A 2 tubos, uno conteniendo la muestra y el otro H2O,
agregar gota a gota solución de HgCl2 1%. Observar y registrar el resultado. Luego
agregar 5 ml de H2O y observar lo que ocurre.
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5.- Efecto de ácidos: A 2 tubos, uno conteniendo la muestra y el otro H2O, agregar gota
a gota solución de ácido TCA al 5%. Observar y registrar el resultado. Luego agregar 5
ml de H2O y observar lo que ocurre.
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A) Reactivos:
Cada grupo realizará una curva de calibrado de albúmina en las concentraciones finales
indicadas en la tabla, y tendrá una solución problema a la cual determinar la
concentración a partir de la curva de calibrado construída.
1- Rotular 10 tubos eppendorf como B, T2, T4, T6, T8, T10, P1, P2, P3, P4. Los
datos de estas muestras serán empleados en el TP siguiente.
2- Colocar en cada tubo la cantidad de H2O y solución Standard de albúmina según
se indica en la tabla.
3- Agregar 1 mL del reactivo de Bradford y agitar en vortex.
4- Incubar 5 minutos (y no más de 15) a temperatura ambiente.
5- Leer absorbancia a 595 nm.
6-Preparar la curva de calibrado graficando la DO corregida de cada patrón en
función de la concentración de los mismos.
7- Determinar la concentración de proteínas en la muestra problema utilizando la
curva elaborada anteriormente.