UNIVERSIDAD DEL CAUCA

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS Y DE LA EDUCACIÓN

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
LABORATORIO DE BIOQUIMICA I (MACROMOLÉCULAS)
2 Abril 2014

DETERMINACION CUANTITATIVA DE CASEÍNA

Cerón .I; Delgado Ojeda A.F

Química, Facultad de Ciencias Naturales Exactas y de la Educación, Universidad del Cauca

OBJETIVO:
 Extraer caseína de leche líquida deslactosada (comercial) mediante un procedimiento
químico

DIAGRAMA DE FUJO:

HCl 0,2 N
H2O Caliente Hasta alcanzar
15 mL Leche pH 4,8

40°C comprobar pH
con pH-metro Dejar reposar, hasta
f omación precipitado

acetona

centrif ugar eliminar agitar eliminar

sobrenadante acetona
4000 rpm / 3 min

eter

agitar
Introducir en Horno desecador
40°C por 20 min
Pesar

RESULTADOS Y ANÁLISI DE RESULTADOS:

En la tabla N°1 se muestran las concentraciones de las soluciones patrón realizadas para la curva de
calibración y absorbancia generada a 750 nm . La curva fue facilitada por el grupo que trabajaba con
Caseína en la práctica anterior.
 Concentración Absorbancia
10 0,0506
50 0,095
100 0,203
150 0,288
200 0,457
250 0,513
Tabla N°1. Absorbancia de las soluciones patrón.

A continuación se muestra la curva patrón (Gráfica 1) obtenida a partir de los datos de la tabla N°1. Se
realizó una regresión lineal de la forma y=mx+b en un plano en el que la absorbancia toma valores en el
eje de ordenadas y la concentración en el eje de abscisas.

0.6

0.5

0.4
Absorvancia

0.3

0.2

0.1

0
0 50 100 150 200 250 300
Concentración (ppm)
Gráfica 1. Curva de calibración.

Se obtuvo la ecuación (1) a partir de la regresión lineal de la curva patrón

y = 0.0021x + 0.0076 (1)

Se preparó una muestra de caseína para medir la absorbancia de esta y a partir de la curva de
calibración observar su concentración, para esto se pesó 1.3mg de la caseína obtenida y se disolvieron
en 4 mL de agua, se adicionó 1 gota de NaOH para obtener un pH 10 y luego la solución se vertió en un
balón de 10 mL donde se aforó con agua, seguido se adicionó el reactivo de Lowry y Folin y por último
se llevó la muestra al espectrofotómetro. La absorbancia de la muestra fue de 0.318.

Al reemplazar y igual a la absorbancia de la caseína y despejar x como se muestra a continuación se

determina la concentración de la muestra obtenida mediante la curva de calibración.

0.318 = 0.0021x + 0.0073

x= (0.318 – 0.0076)/0.0021
x=147,8ppm
Concentración = 147,8 ppm

La concentración de la muestra preparada fue de (1.3mg/0.01L)= 130mg/L = 130ppm. Se logra

observar un desfase en estos valores, ya que se conoce la concentración de la solución. Esto se puede
atribuir a errores sistemáticos y/o instrumentales, ya que el espectrofotómetro donde se tomó la lectura
de absorbancia no es muy confiable, ya que por parte de la tecnóloga se dijo que éste presentaba
ciertas dificultades técnicas. Además del tiempo de reacción, que no se dejó un tiempo prudente para
que se diera la reacción de derivatizacion (reducción de reactivo Folion-Cicualteu)

Después de obtener la caseína por medio del procedimiento que se llevó a cabo en el laboratorio, se
dejó secar por 10 minutos y se llevó a la balanza, el peso resultante fue de 1.2214g. Ya que esta
muestra contenía gran cantidad de agua se dejó secar por cerca de 48 horas más, al pesar la muestra
seca se obtuvo un peso de 0.4916g, esta fue la cantidad de caseína extraída de 15 mL de leche.

Por tanto:
0.4916g /0.015 L = 32.77g/L

La concentración de caseína en la leche utilizada fue de 32.77g/L

En la composición química de la leche de vaca, los nutrimentos que forman parte del extracto seco
(12,5%) y que se encuentran en abundancia son los carbohidratos, (4,7%), las proteínas (3,5%) y los
lípidos (3,5%) y en menor cuantía los minerales, las vitaminas y las enzimas [1]. Así las caseínas
representan aproximadamente el 80% de proteínas de la leche, donde se reporta un valor teórico de
concentración que se encuentra en los 35 g/L, como podemos observar en los datos anteriores, el
valor determinado es menor, unos de los errores fue de tipo instrumental, es decir, fue inevitable que
el precipitado de caseína se quedara sobre las paredes de los recipientes, se hizo el mayor esfuerzo
para que esto no fuese así.
En el laboratorio tomamos como matriz 15 mL de leche comercial, la cual se encuentra descremada
y deslactosada, es por eso que se obvia el paso de eliminación de grasas sugerido en la guía.
La mayoría de las proteínas muestran una solubilidad mínima es su punto isoeléctrico, dicha
propiedad se usa para separar la caseína ajustando el pH de la matriz (leche) donde se empleó 1,8
mL HCl 0,2 N y la lectura del pH-metro dió 4,87, donde se observa que se da la precipitación de la
caseína. Se reportan un rango de pI donde se da la precipitación, así el valor al cual los llevamos es
un valor intermedio. Existen además otras formas de desestabilizar las micelas a parte de la
acidificación, y esta las desestabilización enzimática y por sales divalentes de calcio.
La caseína se encuentra en la leche como caseinato, por ello en la adición de ácido se da la
liberación de ésta, así:
Ca+2-Caseinato + 2 HCl Caseína + CaCl2
Para el propósito de la precipitación de la caseína en su pI, también se pudo haber empleado una
solución tampón o Buffer, por ejemplo el tampón de acetato de sodio (pKa 4,76) y se puede haber
tenido mayor estabilidad en el valor de pH, por las propiedades que se conocen de este tipo de
sustancias.

Ya que las caseínas son moléculas de gran tamaño y que se agrupan en forma de polímeros, así
estos complejos moleculares formados se conocen como micelas de caseína. Estas micelas
presentan ciertas subunidades que aproximadamente son 10 moléculas de los cuatro tipos diferentes
de caseínas (α s 1 , y α s 2 , , β y К ¿ en proporciones variables [2], con presencia de calcio en cada grupo
fosfato.
Figura 1. Formación micelar de las caseínas:

Es por ello que el precipitado luego de la centrifugación forma ciertos grumos (coloide), y nos es un
precipitado de forma uniforme. La estructura de la micela se encuentra de la siguiente manera, en el
centro se encuentran las caseínas α y β (Hidrofóbicas), mientras que las К caseínas presentan un
comportamiento hidrofílico, se sitúan en la periferia, éstas adquieren una carga negativa, por ello
presenta cierta afinidad por al agua, asi se formara una segunda capa, la cual corresponde a la parte
hidratada.

La fracción de los carbohidratos se encuentra representada básicamente por el disacárido lactosa, la

fracción proteica está compuesta por las caseínas y proteínas del lactosuero, en cuanto a la fracción
lipídica están los triglicéridos. Aproximadamente el 80% de las proteínas totales de la leche está
constituido por caseínas [1], es el único alimento que contiene este tipo de proteína, así el 20%
restante está representado por las proteínas del lactosuero y las proteínas que presentan cierto
grado de afinidad por agua, por ello cuando se hizo el ensayo de Biuret para el residuo sobrenadante
de la centrifugación es positivo, por la presencia de otro tipo de proteínas (proteínas del lactosuero,
enzimas), que ya se indicaron anteriormente.

El tratamiento que se siguió luego de separar el precipitado en la centrifugación, fue la adición de

solventes orgánicos con el fin de eliminar interferencias o residuos de carbohidratos y demás
compuestos que se puedan eliminar con acetona inicialmente; Luego se procede a adicionar un poco
de éter etílico, con el fin de deslipizar la sustancia de interés [3] y ya se finaliza con la filtración al
vacío, donde se emplea un mayor volumen de éter, ya que se presentaba dificultad en dejar la
mínima presencia de caseína en el recipiente, ya que ésta se encontraba adherida a las paredes.

CONCLUSIONES:
 Los métodos colorimétricos son efectivos para determinar la presencia de proteínas en
distintas muestras, dado que este método da resultados variables se requiere una curva de
calibración que se hace a partir de una soluciones patrón, pero se debe tener cuidado en el
procedimiento (tiempo prudente de reacción) para la respectiva derivatización.
 La separación de la caseína de la leche en general, depende principalmente del pH del
medio, esto dado que a un valor fijo del mismo las interacciones de la proteína con la matriz
serán diferentes, y por tanto sus propiedades también en este caso la solubilidad de la
misma, generándose así la precipitación de éstas.
 La literatura reporta un procedimiento donde se incluye una adición de una solución tampón
o Buffer, éste procedimiento no se llevó a cabo como ya se ha mencionado. De acuerdo a
las propiedades que se conocen de estas soluciones, pudiese haber sido mejor la separación
(precipitación) de la casína.
BIBLIOGRAFÍA:
[1]H.Zumbado.Análisis Químico de los Alimentos, Métodos clásicos. Instituto de farmacia y
alimentos. Universidad de la Habana. 2002 (pp 238-242)
[2]Gil, Ángel, H. Ruiz López, Maria Dolores. Tratado de Nutrición. Médica Panamericana. 2 Ed.
Madrid. 2010.. (capitulo 1).
[3]Macarulla J,M. Goñi F,M. Biomoléculas, lecciones de bioquímica estrutural. Editorial
Reverte S.A. 3 Ed. España 2002(pp 117-122)
[4] Universidad de Antioquia, centros de capacitación internet (en
http://docencia.udea.edu.co/QcaAlimentos/contenido/clasificacion3.htm)

ANEXOS:
Respuesta a las preguntas del aguía:
 ¿Qué otras proteínas contiene la leche y describir un procedimiento para separar y
cuantificar?
Como se dijo anteriormente el 80% corresponde a caseínas, el otro 20% de las proteínas
corresponde a las proteínas del suero. Estas proteínas del lactosuero, se pueden obtener
mediante procesos de Ultrafiltración, ya que por su diferencias de peso significativa se puede
aplicar este método.. Entre estas se encentran:
 α-Lactoglobulina: Esta es la proteína cuyo PM está cerca a los 16 kD y supone del 20
al 25% de total de las proteínas del suero.
 β-Lactoglobulina: Es la proteína soluble más abundante en la leche de vaca. Su peso
esta cera a los 18 kD y suele formar dímeros constituidos por dos cadenas
polipeptídicas iguales.
 Albúmina sérica 65kD: Es exactamente igual a la albúmina del suero sanguíneo y
representa alrededor del 5% de las proteínas séricas.
 Proteasas-peptonas: Son péptidos que provienen de la proteólisis de la β-caseína.
Posee un peso <10kD y contienen en su estructura glúcidos y ácido siálico
 Inmunoglobulinas y otras proteínas: Las inmunoglobulinas no son específicas de la
leche, puesto que básicamente se sintetizan en los linfocitos B producidos en la médula
ósea y son transportados en la sangre. Estas desempeñan un papel fundamental y es
en la transferencia de anticuerpos de la madre al ternero. Así el calostro es rico en
globulinas (IgG, IgM, IgA).
 Metaloproteínas: Estas tienen la capacidad de fijar específicamente y de forma
reversible hierro y cobre, encontramos tres subdivisiones:
 Lactoferrina, tienen gran afinidad por el Hierro, por ello es clave en la introducción
de éste en la leche, a partir de la sangre (dos átomos de hierro por molecula)
 Transferrina, procedente de la sangre y posee la capacidad de fijar Hierro.
 Ceruloplasmina, de origen sanguíneo, y fija el Cobre.
 Enzimas, entre las que encontramos lipasas, fosfatasas y proteasas. La
lactoperoxidasa es una enzima abundante en la leche., casi indetectable en la leche
Humana.
Para la determinación de proteínas encontramos diferentes métodos, algunos de ellos ya
se han trabajado en prácticas anteriores, dentro de los cuales esta: Método de Biuret,
método de Bradford, método de Lowry, BCA, Método por UV, con colorantes como el
verde de bromo cresol, determinación de proteínas por Kjelhdal (determinación del
contenido de Nitrógeno)
 Factores que afectan la solubilidad de una proteína:
Se debe tener en cuenta factores como: Clase de disolvente, temperatura ( si es alta se da la
desnaturalización de la misma), Fuerza iónica (presencia de sales), pH y la concentración.
 Cuando se tiene como medio el agua, se tiene en cuanta la formación de enlaces de
Hidrógeno, donde también se pueden dar con los grupos R (cadena lateral).
 ¿En qué forma las variaciones de pH afectan la solubilidad de la proteína?
La forma en la que el pH actúa sobre el comportamiento de una solución proteica, es de la
siguiente manera:
pH>pI adquiere una carga –
pH<pI adquiere una carga +
pH=pI la carga neta es cero
a pH alcalinos la solubilidad es mayor que a pH ácidos [4]