22.

Aislamiento y cuantificacin de glucgeno

Jess Diez Dapena, Carmen Alicia Padilla Pea, Emilia
Martnez Galisteo, Jos Antonio Brcena Ruiz, Concepcin
Garca Alfonso
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba

RESUMEN

El glucgeno es la forma de almacenamiento de la glucosa en los tejidos

animales. Se encuentra principalmente en el hgado y en el msculo
representando hasta un 10% y un 1-2% de su peso hmedo,
respectivamente. Las propiedades fsicas y qumicas de muchos
polisacridos neutros difieren lo bastante de las de otras biomolculas,
para permitir su fcil aislamiento. El glucgeno se puede liberar del
hgado por calentamiento con una base fuerte, hasta la destruccin total
del tejido. Al aadir cido tricloroactico al homogeneizado anterior,
precipitan numerosas sustancias de peso molecular elevado, como las
protenas y los cidos nucleicos, en tanto que el glucgeno continua
disuelto. El glucgeno puede separarse de los monosacridos y otros
compuestos hidrosolubles por precipitacin con alcohol, porque los
polisacridos son mucho menos solubles en alcohol acuoso que los
monosacridos. La determinacin del grado de pureza de la preparacin
obtenida se puede realizar mediante el tratamiento con antrona y
comparando con una solucin estndar de glucgeno.
Ttulo corto: Purificacin y cuantificacin de glucgeno.
Palabras clave: aislamiento, cuantificacin, glucgeno, pureza.
Abreviaturas empleadas. TCA: tricloro actico.

1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS
El glucgeno es la forma de almacenamiento de la glucosa en los tejidos
animales. Se encuentra principalmente en el hgado y en el msculo
representando hasta un 10% y un 1-2% de su peso hmedo, respectivamente.
Est formado por unidades de glucosa unidas por enlaces (1-4) y
ramificaciones (1-6) (Figura 1).

HOH2C

HOH2C

H H
OH
OH
H

H H

H
O

OH

OH

OH

H
O
Enlace (1,6)
H2C

Enlace (1,4)

H H
O

OH

OH

H
O

Figura 1. Estructura del glucgeno

El glucgeno acta como regulador de la glucosa sangunea, almacenndola

como glucgeno durante una buena alimentacin (glucogenognesis) y
liberndola por fosforolisis (glucogenolisis) durante el ayuno, ya que en esta
situacin no hay absorcin intestinal. La duracin del glucgeno heptico en
ayunas es de aproximadamente 24 h. A partir de este momento, la
concentracin en sangre se mantiene por sntesis de glucosa a partir de
sustancias distintas a los carbohidratos (gluconeognesis) (figura 2). En estos
mecanismos de control, actan la adrenalina y el cortisol.
HOH 2C

HOH 2C

H H
OH
OH
H

O
H
OH

H H
O

OH
H

HOH 2C

O
H
OH

Glu cgen o (n res idu os)

Fosforilasa

H
O

H H
OH
OH

R
Pi

HOH 2C

OPO

-2
3

H
OH
Gluc osa-1-fosfato
-2 OPOH 2C
3
2

H H
OH

H H
OH

OH

H
OH
Glu cgen o (n-1 residu os)

Fosfogluc omut as a

O
H

OH

Glu cogenognes is

Glic erol (grasas)

Am inocid os (p rotenas)
Lactato ( gluc gen o mu scul ar)

OH

H
OH
Gluc osa-6-fosfato
Glu coneognesi s

H 2O

Glu cosa-6
fosfat a

Pi

HOH 2C
H H
OH

OH

OH

H
OH

Glu cosa

Figura 2. Degradacin del glucgeno

El glucgeno se libera de los tejidos que lo contienen por calentamiento con

una base fuerte (KOH) hasta la destruccin total del tejido.

La separacin del glucgeno del tejido se consigue mediante la adicin de

etanol (precipita polisacridos y elimina los monosacridos solubles) y sulfato
de sodio (coprecipitante). As, se produce un precipitado que contiene una
mezcla de glucgeno, protenas y cidos nucleicos, que han resistido el
calentamiento anterior.
El tratamiento posterior con cido tricloroactico (TCA) hace que precipiten
las protenas y cidos nucleicos de la mezcla. El glucgeno aislado se vuelve a
precipitar con etanol, obtenindose una preparacin con un alto grado de
pureza.
El tratamiento con antrona (que contiene (H2SO4) es un mtodo rpido para
la determinacin de hexosas y alopentosas constituyentes de un polisacrido.
Mediante este mtodo, el glucgeno es hidrolizado por un cido (H2SO4) hasta
sus unidades elementales (monosacridos), que pueden ser luego
deshidratadas dando furfural, y ste ltimo, reacciona con la antrona y se forma
un producto coloreado (azul-verdoso) con un mximo de absorbancia a 620
nm. El valor resultante se compara con los obtenidos al preparar una recta
estndar con glucosa pura, usando el mismo mtodo.
Los objetivos fundamentales de esta prctica son dos:
Extraccin de glucgeno de hgado de cerdo y cuantificacin por pesada y
colorimetra.
Estimacin del rendimiento de la purificacin del mismo.

2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO

2.1.Equipamiento
Bao de agua hirviendo.
Bao de hielo y agua del grifo.
Centrfuga de mesa.
Balanza.
Estufa a 35C.
Colormetro.
Agitador de tubos.
2.2.Material
Tubos de vidrio (2,2 x 16 cm; 1,5 x 16 cm) y gradilla.
Tubos de centrfuga cnicos de plstico con tapn.
Guantes de latex.
Pipetas automticas (0,1 y 1,0 mL) (puntas).
Pipetas de vidrio (5,0 y 10 mL).
Propipeta.
Papel de filtro.
Pinzas de madera.
2.3.Reactivos
Hgado de cerdo troceado.
Solucin de hidrxido potsico.
Solucin de tricloroactico.
Solucin de sulfato de sdio.
Etanol.
3

Solucin de glucosa .
Glucgeno aislado y desecado de hgado de cerdo (apartado 3,1).
Solucin de antrona en cido sulfrico.
Solucin amortiguadora de fosfato sdico .
Agua destilada.

3. PROTOCOLO A REALIZAR
3.1. Aislamiento de glucgeno de hgado de cerdo
3.1.1. Se ponen 3 mL de la solucin de hidrxido potsico al 30% en un tubo
de ensayo de vidrio grueso.
3.1.2. Se pesan 4 g de tejido (aproximadamente) y se introducen en el tubo
anterior. Anotad el peso exacto.
3.1.3. Se calienta en un bao de agua hirviendo, agitando con cuidado para
acelerar el proceso, durante 20 minutos (o hasta su digestin). USAD
UN TROZO DE PAPEL HIGINICO O PINZAS DE MADERA PARA
MANIPULAR LOS TUBOS. PRECAUCION: ALCALI HIRVIENDO!!
3.1.4. Se enfra el tubo bajo el grifo una vez acabada la digestin.
3.1.5. Una vez enfriado el tubo de ensayo (comprobadlo por contacto con el
dorso de la mano), se aaden 0,2 mL de la solucin saturada de
Na2SO4 y se mezclan fuertemente. Dejad reposar 5 minutos.
3.1.6. Se precipita el glucgeno que est en solucin por adicin de 7 mL de
etanol al 95%. Se agita y deja en fro en un bao de hielo durante 5
minutos.
3.1.7. Se pasa la solucin a tubos de centrfuga cnicos de plstico con
tapn, y se centrifuga a la mxima velocidad (5.000 x g) durante 5
minutos. Se desecha el sobrenadante y se coloca el tubo invertido
sobre papel de filtro.
3.1.8. Se aaden 5 mL de la solucin de TCA al 10% al tubo y se disuelve
totalmente el sedimento agitando fuertemente.
3.1.9. Se centrifuga de nuevo 5 minutos a 5.000 x g.
3.1.10. Se pesa un tubo de centrfuga cnico de plstico vaco y anota el
peso. Marcadlo con una seal para su posterior identificacin.
3.1.11. Se aade el sobrenadante obtenido en la ltima centrifugacin a un
tubo de ensayo largo, al que previamente se han aadido 10 mL de
etanol al 95%, desechando el sedimento de la centrifugacin. Se deja
reposar 5 minutos para que se produzca la precipitacin del
glucgeno.
3.1.12. Se traslada la solucin al tubo de centrfuga de plstico, previamente
pesado, y se centrifuga durante 5 minutos ms a 5.000 x g.
3.1.13. Una vez acabada la centrifugacin se tira el sobrenadante. El
sedimento obtenido representa el glucgeno prcticamente exento de
sustancias contaminantes. Dejadlo secar en la estufa a 35C hasta su
utilizacin.

3.2. Determinacin de la pureza del glucgeno obtenido

3.2.1. Se pesa en la balanza el tubo con el glucgeno desecado, obtenido
en la parte anterior, y se anota el resultado.
4

3.2.2. Se disuelve este glucgeno a razn de 8 mg de dicho glucgeno por

mL de tampn fosfato 0,02 M pH 7,0 que contenga NaCl 0,005 M, (el
in que activa la -amilasa). De esta manera queda preparado el
glucgeno para las siguientes determinaciones.
3.2.3. Se prepara una dilucin 1/50 del glucgeno disuelto anteriormente
(0,1 mL en 5 mL de agua).
3.2.4. Se preparan tres tubos de ensayo como se describe en la Tabla 1:
Tabla 1. Determinacin de la pureza del glucgeno
A
B
Tubo (n)
Glucosa (9 mg/mL)
1 mL
--Agua
----Glucgeno (dilucin 1/50)
--1 mL
Antrona (2 g/L H2SO4)
5 mL
5 mL

C
--1 mL
--5 mL

3.2.5. Una vez preparados los tubos, se sumergen en un bao con agua
hirviendo durante 5 minutos. Pasado este tiempo, se enfran en un
bao de hielo. (Precaucin al coger los tubos. Usad pinzas de
madera).
3.2.6. Se mide la absorbancia a 620 nm ajustando a 0 con el tubo C
(blanco).
3.2.7. Para calcular el porcentaje de pureza se aplica la relacin:
A620 GLUCGENO / A620 GLUCOSA
3.2.8. Se expresa la relacin de absorbancia obtenida como mg de
glucgeno/g de tejido, (rendimiento).

4. RESULTADOS ESPERADOS
Una vez finalizada la parte prctica, hay que presentar los resultados
obtenidos. Para ello se debe indicar el rendimiento total en glucgeno y
calcular el contenido en glucgeno del hgado, expresndolo en mg de
glucgeno por g de tejido fresco. A continuacin se muestra un ejemplo
representativo de resultados esperados:
En la Tabla 2 se muestran las absorbancias determinadas en las muestras
Tabla 2. Absorbancia a 620 nm
Glucosa
Glucgeno

1,420
0,527

Porcentaje de glucgeno obtenido:

A620 nm glucgeno x 100
0,527 x100
% de glucgeno =_______________________________ = ___________________= 37,1%
A620 nm glucosa
1,420
Rendimiento de glucgeno en hgado:
Clculo de los g glucgeno puro en 25 mg del precipitado obtenido a partir
de 4,54 g de hgado utilizado como muestra:

mg precipitado x % glucgeno
glucgeno puro (mg) =

_______________________________________

= 9,257 mg

100 mg
mg de glucgeno puro
Rendimiento =

_______________________________

= 2,04 mg glucgeno puro/g hgado

g de hgado muestra

5. DISCUSIN Y COMENTARIOS
El mtodo de aislamiento utilizado en este protocolo se basa en las
propiedades qumicas del glucgeno no compartidas por otras sustancias
presentes en el hgado.

6. BIBLIOGRAFA
Alemany M, Font S (1983): Prcticas de Bioqumica, 1 ed. Editorial Alhambra
(Madrid, Espaa), pp 99-107.
Clark JM (1966): Biqumica Experimental, 1 ed. Editorial Acribia (Zaragoza,
Espaa), pp 40-42.
Nelson DL, Cox MM (2001): Principios de Bioqumica, 3 ed. Editorial Omega
(Barcelona, Espaa), pp 304-305.
Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003): Bioqumica, 5 ed. Editorial Revert
(Barcelona, Espaa), pp 577-580.

ANEXO 1: MEDIOS, SOLUCIONES Y MATERIAL BIOLGICO EMPLEADO

Solucin de KOH 30%
Tabla 3. Solucin de KOH
KOH
Agua destilada

300 g
Hasta 1 litro

Solucin de tricloroactico TCA 10%

Tabla 4. Solucin de TCA
TCA
Agua destilada

100 g
Hasta 1 litro

Solucin saturada de Na2SO4

Tabla 5. Solucin de Na2SO4
Na2SO4
10 g
Agua destilada
Hasta 30 mL

Solucin de glucosa (9 mg/mL)

Tabla 6. Solucin de glucosa

Glucosa
90 mg
Agua destilada
Hasta 10 mL

Solucin amortiguadora: tampn fosfato sdico 0,02 M; NaCl 0,005 M pH 7,0

Tabla 7. Solucin de fosfato sdico pH 7,0
Na2HPO4
1,70 g
NaH2PO4
1,59 g
NaCl
0,30 g
Agua destilada
Hasta 1 L
Ajustar el pH a 7,0 si fuera necesario

Solucin de glucgeno: a partir del glucgeno obtenido en el apartado 3.1.

Tabla 8. Solucin de glucgeno
Glucgeno
Fosfato sdico 0,02 M; NaCl 0,005 M pH 7,0

80 mg
Hasta 10 mL

Solucin de antrona 0,2% en H2SO4

Tabla 9. Solucin de antrona
Antrona
H2SO4

1g
Hasta 500 mL