Cuantificacin de protenas

AUTOR:
Mariel Rodrguez Salinas
B. Ximena Olivares Guadarrama
Francisco Javier Mora vila
Xochitl Dvila Gonzlez
Asley Mara Solano Snchez

Profesores: GERARDO PREZ

HERNNDEZ, REFUGIO CRUZ TRUJILLO
UEA: LABORATORIO DE BIOQUMICA
Trimestre: 13I

Autoevaluacin:

Evaluacin del profesor:

INTRODUCCIN
En mtodo Bradford se basa en utilizar un colorante hidrofbico (comassie blue G-250)
cuyas disoluciones acuosas en presencia de cido fosfrico tienen un color pardo que al
entrar en contacto con la parte hidrofbico del interior de una protena se fija.
Las protenas se unen a la forma azul para formar un complejo protena-colorante con un
coeficiente de extincin mayor que el colorante libre.
La determinacin del contenido proteico de una muestra requiere la comparacin del valor
de absorbancia de la muestra con los obtenidos a partir de cantidades conocidas de
protenas, con los que se construye una curva de calibracin: a mayor cantidad de protenas,
mayor color desarrollado y por lo tanto, mayor absorbancia, es por ello que se considera un
cromforo exgeno. Es un mtodo que depende de la interaccin relativamente inespecfica
entre un colorante hidrofobico y las protenas, por lo que es sensible a la presencia de
contaminantes tales como los restos de detergentes y lquidos orgnicos, ya que las
protenas pueden perder su estabilidad y perder su forma nativa, lo que provocara la
perdida de la unin entre el cromforo y la zona hidrofbica de las protenas.
Para determinar la concentracin total de protena se realiza una curva de calibracin
empleando una protena patrn que generalmente es la seroalbumina bovina.
Se preparan tubos testigos con distintas cantidades de protena y otra disolucin llamada
blanco que solo contiene agua y reactivo Bradford y en los tubos testigos se les mantiene
constante el reactivo Bradford siendo los volmenes de todos los tubos iguales.
Una vez preparados los tubos se mide la absorbancia a cada uno de ellos a una longitud de
onda de 595nm, es calibrado el equipo con el tubo blanco (no contiene protena) de esta
manera se construye la grfica de absorbancia vs concentracin

OBJETIVOS

Conocer el procedimiento empleado para cuantificacin de protena.

Interpretar los resultados, mediante una curva de valores conocidos.
Realizar un anlisis matemtico, para saber cul es la concentracin de protena, una
vez se haya realizado un ajuste lineal de la curva patrn.

Materiales y mtodo.
Procedimiento
1. Se agrega 10 ml de agua destilada a cada uno de los tubos falcon que contienen las
muestras tras las diferentes centrifugaciones, y se remueve con una espatula para
poder diluir.
2. Se tom 10 microlitros de cada muestra ya diluidas y se deposit en diferentes
alicuotas, a cada una de ellas se le adicion 990 microlitros de agua destilada.
3. Colocar en siete tubos de ensayo albumina en diferentes proporciones 0, 5, 10, 25,
40, 50 y 60 microlitros, aadir agua destilada hasta tener un volumen de 200
microlitros y posteriormente agregar 800 microlitros de reactivo de bradford.
4. Colocar en otros diez tubos de ensayo 10 microlitros de albumina de las difernentes
alicuotas, 2 muestras de cada alicuota, 190 microlitros de agua destilada y 800
microlitros de reactivo de bradford.
5. Posteriormente se medira la absorbancia a cada una de las soluciones que contienen
los tubos. Estas soluciones deberan ser deporsitadas en .. para que puedan ser
leidos por el espectrofotometro. El tubo uno se tomar como muestra blanco ya que
no contiene albumina.
TUBO

REACTIVO DE
BRADFORD

H 2 O( L)

800

200

800

195

800

190

10

800

175

25

800

160

40

800

150

50

ALBMINA

(L)

800

140

60

Tabla1. Cantidades a adicionar en los tubos.

TUBO

REACTIVO DE BRADFORD

H 2 O( L)

ALBMINA

MUESTRA
1

800

190

10

800

190

10

MUESTRA 1ra. CENTRIFUGACIN

3

800

190

10

800

190

10

MUESTRA 2da. CENTRIFUGACIN

5

800

190

10

800

190

10

MUESTRA 3ra. CENTRIFUGACIN

7

800

190

10

800

190

10

MUESTRA DIALISIS
9

800

190

10

10

800

190

10

Tabla 2. Cantidades a adicionar en los tubos

RESULTADOS

(L)

Fig.1 Alcuotas con muestra de

albmina y dilisis respectivamente.

Fig. 2 Se coloc en cada tubo la

cantidad sealada en la tabla de BSA y
de agua.

Fig. 3 Posteriormente se aadi el Reactivo

de Bradford a cada tubo. Es importante
que el reactivo se adicione al final.

Fig. 4 Imagen de los tubos, una vez

terminado de aadir todo lo necesario.

Fig. 5 Los tubos de la parte delantera

contienen BSA y en la parte trasera contienen
nuestra protena X.

Fig. 6 Preparando el espectrofotmetro para

analizar la absorbancia, tanto de la protena
patrn, como de la protena X.

Fig. 7 Para colocar las muestras dentro del

espectrofotmetro, se deben vaciar dentro de
los pequeos tubos mostrados.

Fig. 8 Una vez colocada la muestra en ese

tubo, se mete en el espectrofotmetro.

Fig. 9 Se cierra el espectrofotmetro y se

presiona el botn para que nos seale la
absorbancia.

Muestra
Licuado
1 Centrifugacin

Fig. 10 Una vez obtenida la absorbancia, se

retira el tubo pequeo y se vaca la muestra al
tubo original.

Volumen

[Potena] Bradford

90 mL

10 L+ 990 L=1000

Sobrenadante 30 mL

10 L prote na+990 L=1000 L

Precipitadotubo 1=9.9 g
2 Centrifugacin 40% Sulfato
de Amonio

14 mL sobrenadante

3 Centrifugacin 60% Sulfato

de Amonio

12 mL sobrenadante

Dilisis

V i=4.5 mL

10 L prote na+990 L=1000 L

Precipitadotubo 2=9.9839 g

10 L prote na+990 L=1000 L

Precipitadotubo 3=0.3582 g

10 L prote na+990 L=1000 L

V f =5 mL

Tabla 2. Representa concentracin BSA, agua y absorbancia de albmina, protena a

comparar
con
LDHTubo
BSA
Absorbancia
[P]
Deshidrogenasa.
(Albmina)
(nm)
1
2
3
4
5
6
7

O
0.562
30.710
5
0.204
11.1475
10
0.357
19.508
25
0.710
8.554
40
0.987
53.934
50
1.047
57.213
Tabla
1
Disolucin
del
sobrenadante
en
agua
destilada.
60
1.233
67.377

Curva patrn
1.4
1.2

f(x) = 0.02x + 0.18

R = 0.98

1
0.8

Linear ()

0.6
0.4
0.2
0
0

10

20

30

40

50

60

70

BSA (L)

Grfica 1. Representacin lineal de absorbancia, con respecto a la concentracin de

albmina en cada tubo.

Grafica 2. Representacin de los datos obtenidos de la concentracin de

albmina con respecto a la absorbancia
En la siguiente tabla se presentan los valores de la cantidad de protena y absorbancia
obtenida en cada tubo de nuestra protena desconocida.

Muestra
Tubo
(Licuado)
1
2
Tubo
(1ra )

Concentracin de
Absorbancia
[P]
prtena
(nm)
Grfica 3. Representacin de la concentracin de protena desconocida con respecto a
la absorbancia en cada muestra
10
0.109
5.956
10
0.114
6.229

3
10
0.074
Tabla 3. Absorbancia obtenida
de las disoluciones
de protena con
0.078
reactivo de Bradford. 4
Tubo
(2nda )
SA 40%
5
10
0.047
6
10
0.035
Tubo
(3ra )
SA 60%
7
10
0.050
8
10
0.052
Tubo
(Dilisis)
9
10
1.467
10
10
1.541
DISCUSIN

4.043
4.262

2.568
1.912

2.732
2.841
80.163
84.207

El mtodo para cuantificar protena empleando cromoforos exgenos, puede ser afectado
por los componentes de la solucin como el tipo de buffer. La eleccin de uno u otro
cromoforo va a depender de la cantidad que deseemos medir. En esta prctica se empleo
azul de coomassie, y lo que se midi fue la unin de este a los diferentes tipos de protena
desconocida y albmina. Una vez obtenidos los valores, se grafico la absorbancia de
albmina (ver grafica1) la cual ser nuestra curva patrn ya que bien se sabe la

concentracin de protena empleada para el anlisis. Adems se tiene la certeza de que la

albmina no est junto con otro tipo de protenas sino esta ya purificada, caracterstica que
aun falta definir en el cumulo de protena desconocida. Una vez que se adicionaron los
reactivos necesarios (ver, procedimiento) se midi la absorbancia de albmina, y los
valores obtenidos fueron mayores a 0.204nm y menores a 1.233nm. Por dicha razn, la
absorbancia a diferentes concentraciones de protena desconocida, no deben sobrepasar
este rango, ya que no conoceramos la cantidad ni actividad a analizar ms all de
1.233nm. Sin embargo, al medir la absorbancia de la protena desconocida se encontraba
entre 0.035nm a 1.541nm evidentemente menores y mayores a los ya establecidos, por eso
se aument hasta tres veces la concentracin de protena en cada tubo. Pero tampoco, se
obtuvieron los valores dentro del rango previsto, inferimos que las diluciones que
contenan la protena no se agitaron antes de pipetear la cantidad requerida o que el
espectrofotmetro no fue calibrado adecuadamente, fueron las posibles causas que dieron
lugar a datos, que no favorecen al anlisis de cuantificacin mediante el reactivo de
Bradford. Por otro lado los valores, de concentracin en cada tubo tanto, de albmina
como de protena desconocida se muestran en las figuras 2 y 3.
CONCLUSIN
De acuerdo a las observaciones vistan el clase y los resultados obtenidos se puede llegar a
la conclusin que el metodo de Brandford esta basado en el cambio de color del colorante
esto se debe a las desigualas en la concentracion de proteina este intereactua
especialmente con Arginina (es un aa bsico con grupos R cargados positivamente), esto
provoca un cambio en el mximo de absorbancia del colorante desde 465 a 595 nm.
Este mtodo nos permite cuantificar la concentracin de protenas presentes, basados en las
propiedades que muestran las protenas en solucin.
Tambin se puede subrayar algunas de las ventajas de este mtodo que son:
La intensidad de absorbancia que depende del contenido de aminocidos que tiene la
protena, de igual manera la unin colorante-protena es estable durante algn tiempo (1
hora), por lo tanto resulta un mtodo rpido, adems se puede saber que tan fuertemente
una substancia absorbe la luz a una longitud de onda proporcionada (coeficiente de
extincin).
En comparacin con otros mtodos por ejemplo el de Lowry es un tcnica colorimtrico de
valoracin cuantitativa de las protenas tiene como desventaja que algunos agentes como
los quelantes y Cu interfieren en la reaccin esto provoca que las protenas producirn
diferentes intensidades de color dependiendo del contenido de Tyr y Trp.
De acuerdo a la obtencin de nuestra curva patrn de la cual partimos de datos conocidos
en este caso fue (BSA) que se utiliza universalmente como protena estndar y as poder
determinar la cantidad de protenas presentes en nuestra muestra incgnita.
Esto se refleja en los resultados que obtuvimos con la absorbancia de nuestra protena se
vieron afectados directamente por nuestra tcnica y manipulacin de los reactivos y de los
instrumentos que en este caso fueron las pipetas. Esto se pudo observar con mayor
precisin al momento de graficar ya que los valores de la dilisis sobrepasaron los valores

de 1.0 por lo tanto ya no pudimos utilizarlo o tomarlos en cuenta dentro de nuestra curva
patrn

PERSPECTIVAS

Tener cuidado de que las burbujas no se formen durante la agitacin y la adicion de

reactivos, porque esto puede generar que la enzima se desnaturalice.
Es importante tener precisin al momento de utilizar las micropipetas, pues si se le
da un manejo inadecuado pueden variar las cantidades que se desean medir.
Se tienen que agitar las alcuotas para que no quede el precipitado en el fondo y asi
no alteren los datos de absorbancia.
Mantener cuidado con las puntillas para las micropipetas, evitando tocar las puntas
pues podran ser contaminadas.