CUANTIFICACIÓN DE

PROTEÍNAS TOTALES POR EL

MÉTODO DE BRADFORD

ALUMANA: DIANA CAROLINA CINTICALA QUISPE

CODIGO:2016-11007
CURSO: LABORATORIO DE BIOQUIMICA
DOCENTE: Mgr. CASTELLANOS CABRERA, ROBERTO
HORARIO: 5:00 A 7:00 PM
FECHA DE ENTREGA:21 DE MAYO DEL 2018

TACNA – PERU

2018
 UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
ESCUELA EN INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

PRÀCTICA Nº2
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES POR EL
MÉTODO DE BRADFORD

I. OBJETIVOS

 Construir la curva de calibración para la albumina sérica de bovino(BSA).

 Determinar la concentración de las proteínas x.

II. MARCO TEÓRICO

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES

La determinación de proteínas totales se realizó por el método de Bradford

(1976) utilizando una curva de calibración con estándar de seroalbúmina bovina
(BSA).

El método de Bradford es un método colorimétrico rápido para la cuantificación

de proteínas totales. El reactivo contiene principalmente Coomassie G-250 que
en medio ácido (ác fosfórico incluído en el reactivo) se une a las proteínas. Esto
provoca un desplazamiento espectral de la forma rojizo amarronado del
colorante (con máxima absorbancia a 465 nm) a la forma azul del mismo (cuyo
pico máximo de absorbancia es de 610 nm).

La diferencia entre las dos formas del colorante es mayor a 595 nm por lo que
se la considera la longitud de onda óptima para medir el color azul desarrollado
por la formación del complejo colorante-proteína (Cc-p). Si se Muestras de HL
en diferentes estados de oxidación 7 deseara podría medirse el color azul de
dicho complejo a cualquier longitud de onda comprendida entre 575 y 615 nm
aunque en los mencionados valores extremos existe una pérdida del 10% en la
medida del color desarrollado comparada con la obtenida a 595nm.

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El desarrollo de color obtenido en la reacción de formación del Cc-p se ha

asociado con la presencia de ciertos aminoácidos básicos (principalmente
arginina, lisina e histidina) en la proteína, aunque también participan en dicha
unión las fuerzas de Van der Waals y las interacciones hidrofóbicas. El número
de ligandos del colorante Coomassie que se une a cada molécula de proteína es
aproximadamente proporcional a la cantidad de cargas positivas encontradas en
esa proteína. Los aminoácidos libres, péptidos y proteínas de bajo peso
molecular no desarrollan color con reactivos a base de colorante Coomassie; en
general para la correcta utilización de este reactivo, la masa del péptido o
proteína a cuantificar debe ser al menos de 3.000 daltons.

Curva de calibración

Se arma una batería de 11 tubos de vidrio que se rotulan de la siguiente manera:

uno de ellos como “0” o “B” (blanco de reactivo) y 10 tubos más que se marcan
con números del 1 al 10 en el que se colocarán cantidades crecientes de un
patrón o solución estándar (st.) de concentración conocida. En este caso se
utilizó seroalbúmina bovina (SAB). Se procesan de igual manera y en el mismo
tiempo que las muestras incógnitas. A las lecturas de absorbancia obtenidas
(leídas contra blanco de agua) se les resta el blanco de reactivo. Con estos
valores se realiza una curva de concentración st. vs. absorbancia a 595 nm de la
que se interpolarán los valores de las muestras incógnita. Es conveniente
realizar una curva de calibración cada vez que se procese una batería de
muestras de concentración desconocida.

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III. MATERIALES

1. Material de vidrio
 Tubos de ensayo
 Frascos de insulina

2. Material de papel, aluminio y plástico

 Celdas
 Gradilla

3. Equipos
 Pipetas automáticas
 Espectrofotómetro

4. Reactivos y/o elementos

 Reactivo de Bradford
 Agua destilada
 BSA
 Proteína x

IV. METODOLOGÍA

 Rotular 6 tubos de ensayo y colocar volúmenes necesarios en cada uno de

ellos, según la siguiente tabla.

Sistema de tubos de ensayo

Componentes
1 2 3 4 5 6
Agua destilada (ml) 100 80 60 40 20 0
Solución de BSA mg/ml (uL) 0 20 40 60 80 100
(Alicuota)Proteina x 0 20 40 60 80 100
Bradford (ml) 900 900 900 900 900 900

 Agitar en vortex después el reactivo de Bradford a cada tubo.

 Esperar 5 minutos antes de colocar las muestras en las celdas para el
espectrofotómetro

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 Fijar la absorbancia cero a 595nm con el tubo 1(mezcla en el tubo de ensayo

numero 1).

V. RESULTADOS

 Datos obtenidos

C(ug/uL) A 595nm
1 0 0.000
2 20 0.412
3 40 0.851
4 60 1.068
5 80 1.111
6 100 1.309

 Curva de calibración

1.600 y = 0.0127x + 0.159

R² = 0.9187
1.400

1.200
Aabsorbancia

1.000

0.800

0.600

0.400

0.200

0.000
0 20 40 60 80 100 120
Concentracion

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Interpretación

La pendiente 0.0127
El intercepto 0.159
Coeficiente de regresión al cuadrado 0.9187
Abs=Ɛ*C

Hallando el coeficiente de extinción molar

C(ug/uL) A 595nm Ɛ
1 0 0.000 0.0000
2 20 0.412 0.0206
3 40 0.851 0.0213
4 60 1.068 0.0178
5 80 1.111 0.0139
6 100 1.309 0.0104

VI. CONCLUSIONES

 Se cumplió con los objetivos propuestos para la práctica dado que se logró
realizar la técnica de cuantificación de Bradford y además mediante la
realización de este reporte se logró comprender el fundamento de esta
técnica. Además, mediante los datos obtenidos en la práctica se logró
calcular el coeficiente de extinción molar.

 Se puede llegar a la conclusión de que el método de Bradford es un método

muy recomendable para la cuantificación de proteínas, siempre y cuando se
lleve de una manera correcta.

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VII. BIBLIOGRAFÍA

 Johnson M. (2012). Cuantificación de proteínas. Recuperado de

http://www.labome.es/method/Protein-Quantitation.html

 DETERMINACION DE PROTEINAS: METODO DE BRADFORD.

Recuperado de https://bioquibi.webs.ull.es/practicas/3.pdf

 Garcia S. (2015). Informe sobre la cuantificación de proteínas totales en

hemolinfa de abejas melíferas (Apis Mellífera L.) en época invernal.
Recuperado de
file:///C:/Users/USUARIO/Downloads/Informeabejasinvierno.pdf

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