Manual de Tecnicas para Laboratorio

MANUAL DE TECNICAS PARA LABORATORIO DE NUTRICION ...
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http://www.fao.org/docrep/field/003/ab489s/ab489s03.htm
Producido por: Departamento de Pesca

Ttulo: Manual de tecnicas para laboratorio de nutricion de peces y crustaceos...
Ms informacin
3. ANALISIS PROXIMALES.
Los anlisis comprendidos dentro de este grupo, tambin conocido como anlisis proximales Weende,
se aplican en primer lugar a los materiales que se usarn para formular una dieta como fuente de
protena o de energa y a los alimentos terminados, como un control para verificar que cumplan con las
especificaciones o requerimientos establecidos durante la formulacin. Estos anlisis nos indicarn el
contenido de humedad, protena cruda (nitrgeno total), fibra cruda, lpidos crudos, ceniza y extracto
libre de nitrgeno en la muestra. Una descripcin ms amplia de estos anlisis se puede encontrar en
Osborne y Voogt (1978), MAFF (1982) y AOAC (1984).
3.1. Humedad.
Durante el balanceo de la racin, es fundamental conocer el contenido de agua en cada uno de los
elementos que la compondrn; as mismo, es necesario vigilar la humedad en el alimento preparado,
ya que niveles superiores al 8% favorecen la presencia de insectos y arriba del 14%, existe el riesgo de
contaminacin por hongos y bacterias (Cockerell et al., 1971). El mtodo se basa en el secado de una
muestra en un horno y su determinacin por diferencia de peso entre el material seco y humedo.
Aparatos
Horno de secado.
Desecadores.
Procedimiento
1. Pese alrededor de 510 g de la muestra previamente molida.
2. Coloque la muestra en un horno a 105C por un mnimo de 12 h.
3. Deje enfriar la muestra en un desecador.
4. Pese nuevamente cuidando de que el material no este expuesto al medio ambiente.
Clculos
Contenido de humedad (%) = 100(((B-A) - (C-A))/(B-A))
Donde:
A = Peso de la charolilla seca y limpia (g)
B = Peso de la charolilla + muestra hmeda (g)
C = Peso de la charolilla + muestra seca (g)
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FIGURA 1
Determinacin del contenido de humedad en ingredientes alimenticios.
3.2. Protena cruda.

Por su costo es este el nutriente ms importante en la dieta en una operacin comercial; su adecuada
evaluacin permite controlar la calidad de los insumos proteicos que estn siendo adquiridos o del
alimento que se est suministrando. Su anlisis se efecta mediante el mtodo de Kjeldahl, mismo que
evala el contenido de nitrgeno total en la muestra, despus de ser digerida con cido sulfrico en
presencia de un catalizador de mercurio o selenio.
a) Mtodo simple propuesto por Chow et al. (1980)
Reactivos
Oxido de mercurio, grado reactivo.
Sulfato de potasio o sulfato de sodio anhidro, grado reactivo.
Acido sulfrico (98%), libre de Nitrgeno.
Parafina.
Solucin de hidrxido de sodio al 40%; disolver 400 g de hidrxido de sodio en agua y diluir a
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1,000 ml.
Solucin de sulfato de sodio al 4%.
Solucin indicadora de cido brico; agregue 5 ml de una solucin con 0.1% de rojo de metilo y
0.2% de verde de bromocresol a un litro de solucin saturada de cido brico.
Solucin estndar de cido clorhdrico 0.1N.
Materiales y Equipo
Unidad de digestin y destilacin Kjeldahl.
Matraces Kjeldahl de 500 ml.
Matraces Erlenmayer de 250 ml.
Perlas de ebullicin.
Procedimiento
1. Pese con precisin de miligramos 1g de muestra y colquelo en el matraz Kjeldahl; agrguele
10g de sulfato de potasio, 0.7g de xido de mercurio y 20 ml de cido sulfrico concentrado.
2. Coloque el matraz en el digestor en un ngulo inclinado y caliente a ebullicin hasta que la
solucin se vea clara, contine calentando por media hora ms. Si se produce mucha espuma,
adicinele un poco de parafina.
3. Deje enfriar; durante el enfriamiento adicione poco a poco alrededor de 90 ml de agua destilada y
desionizada. Ya fro agregue 25 ml de solucin de sulfato de sodio y mezcle.
4. Agregue una perla de ebullicin y 80 ml de la solucin de hidrxido de sodio al 40% manteniendo
inclinado el matraz. Se formarn dos capas.
5. Conecte rpidamente el matraz a la unidad de destilacin, caliente y colecte 50 ml del destilado
conteniendo el amonio en 50 ml de solucin indicadora.
6. Al terminar de destilar, remueva el matraz receptor, enjuague la punta del condensador y titule
con la solucin estndar de cido clorhdrico.
Clculos:
A = Acido clorhdrico usado en la titulacin (ml)
B = Normalidad del cido estndar
C = Peso de la muestra (g)
Nitrgeno en la muestra (%) = 100[((A B)/C) 0.014]
Protena cruda (%) = Nitrgeno en la muestra * 6.25
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FIGURA 2
Determinacin de protena cruda por el mtodo Kjeldahl.
b) Mtodo estndar MAFF (1982) para la determinacin de protenas en alimentos y sus ingredientes.
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Reactivos:
Oxido de mercurio.
Sulfato de potasio o sulfato de sodio anhidro.
Sacarosa.
Zinc granulado.
Granulado de piedra pomex lavada con cido sulfrico y quemada.
Acido sulfrico concentrado (d = 1.84 g/ml).
Solucin de hidrxido de sodio al 40 %.
Solucin saturada de sulfato de sodio.
Solucin de tiosulfato de sodio; 8g de Na2S2O35H2O en 100ml.
Solucin de hidrxido de sodio 0.1N.
Solucin de hidrxido de sodio 0.25N.
Solucin de cido sulfrico 0.1N.
Solucin indicadora de rojo de metilo; disuelva 0.3 g de rojo de metilo en 100 ml de etanol
(9596 % V/V).
Solucin indicadora rojo de metilo-azul de metileno; (a) disuelva 0.2g de rojo de metilo en 100ml
de etanol (9596 % V/V) y (b) disuelva 0.1g de azul de metileno en 100ml de etanol (9596 %
V/V), mezcle un volumen de (a) con uno de (b).
Materiales y Equipo
Unidad de digestin y destilacin Kjeldahl.
Matraces Kjeldahl.
Procedimiento
1. Pese 1g de muestra con aproximacin de miligramos y psela a un matraz Kjeldahl; adicione 10g
de sulfato de potasio o sulfato de sodio, 0.6 0.7g de xido de mercurio, 25 ml de cido sulfrico
y unos pocos granos de piedra pomex.
2. Caliente el matraz moderadamente al principio, agitando ocasionalmente hasta que la materia
este carbonizada y las burbujas hayan desaparecido, luego aumente la temperatura y permita
que se establezca una ebullicin suave. Evite que las paredes del matraz se sobrecalienten para
que no se le peguen partculas orgnicas.
3. Cuando la solucin se vea clara y sin color, contine la ebullicin por 2 horas ms y luego
permita que se enfre. Si despus de la digestin y del enfriamiento se cristaliza la solucin repita
el anlisis; si sigue ocurriendo la cristalizacin repita el anlisis usando una mayor cantidad de
cido sulfrico.
4. Adicione con cuidado al matraz 250350ml de agua destilada, mezclando el contenido al mismo
tiempo; deje enfriar y agrguele unas lentejas de Zinc.
5. Transfiera 25 ml de solucin de cido sulfrico 0.1 0.5N al matraz de colecta del aparato de
destilacin, de acuerdo con el valor esperado de Nitrgeno en la muestra, as como unas
cuantas gotas de indicador de rojo de metilo.
6. Tomando precauciones para evitar prdida de amonio, adicione cuidadosamente a la muestra
100 ml de solucin de hidrxido de sodio y luego 10 ml de solucin de sulfato de sodio o 25 ml
de solucin de tiosulfato de sodio. Mezcle bien y conecte inmediatamente al aparato de
destilacin.
7. Caliente el matraz de tal manera que se destilen alrededor de 150 ml del lquido en 30 min. Al
finalizar, mida con papel indicador el pH del destilado resultante y si es alcalino contine con la
destilacin, la cual se suspender cuando el pH aparezca neutro. Durante este proceso agite
ocasionalmente el contenido del matraz. Si el destilado se torna alcalino, la determinacin
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deber ser abandonada y el anlisis repetido con los ajustes apropiados.

8. En el matraz de colecta titule el exceso de cido sulfrico con hidrxido de sodio 0.1 0.25N, de
acuerdo con la normalidad del cido empleado, al punto final del indicador de rojo de metilo o
rojo de metilo-azul de metileno.
9. Corra un blanco de reactivos usando 1g de sacarosa en lugar de la muestra, para usarlo en el
clculo de los resultados.
Clculos
a. Determine el H2SO4 consumido. 1 ml de cido 1.4mg de Nitrgeno.
b. Calcule el porcentaje de Nitrgeno en la muestra y convirtalo a porcentaje de protena
multiplicando el resultado por 6.25.
c. Si se sospecha de la presencia de Nitrgeno amoniacal o nitratos en la muestra, debern ser
evaluados para restarse del Nitrgeno total. Exceptuando los alimentos para rumiantes, se
deber evaluar el contenido de Nitrgeno no proteico y tambin substraerse del Nitrgeno total.
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FIGURA 3
Mtodo estndar MAFF para la determinacin de protena cruda
3.3. Lpidos crudos

En este mtodo, las grasas de la muestra son extradas con ter de petrleo y evaluadas como
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porcentaje del peso despus de evaporar el solvente.

Reactivos, Materiales y Equipo
- Eter de petrleo, punto de ebullicin 4060C.
Aparato de extraccin Soxhlet.
Horno de laboratorio ajustado a 105C.
Desecador.
Dedales de extraccin.
Procedimiento
1. Saque del horno los matraces de extraccin sin tocarlos con los dedos, enfrelos en un
desecador y pselos con aproximacin de miligramos.
2. Pese en un dedal de extraccin manejado con pinzas, de 3 a 5g de la muestra seca con
aproximacin de miligramos y colquelo en la unidad de extraccin. Conecte al extractor el
matraz con ter de petrleo a 2/3 del volumen total.
4. Lleve a ebullicin y ajuste el calentamiento de tal manera que se obtengan alrededor de 10
reflujos por hora. La duracin de la extraccin depender de la cantidad de lpidos en la muestra;
para materiales muy grasosos ser de 6 horas.
5. Al trmino, evapore el ter por destilacin o con rotovapor. Coloque el matraz en el horno durante
hora y media para eliminar el ter. Enfre los matraces en un desecador y pselos con
aproximacin de miligramos. La muestra desengrasada puede usarse para la determinacin de
fibra cruda.
Clculos
A = Peso del matraz limpio y seco (g)
B = Peso del matraz con grasa (g)
Contenido de lpidos crudos (%) = 100((B - A)/C)
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FIGURA 4
Determinacin de lpidos por el mtodo de Soxhlet
3.4. Fibra cruda

Este mtodo permite determinar el contenido de fibra en la muestra, despus de ser digerida con
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soluciones de cido sulfrico e hidrxido de sodio y calcinado el residuo. La diferencia de pesos

despus de la calcinacin nos indica la cantidad de fibra presente.
Reactivos
Solucin de cido sulfrico 0.255N.
Solucin de hidrxido de sodio 0.313N, libre de carbonato de sodio.
Antiespumante (ej. alcohol octil o silicona).
Alcohol etlico al 95% (V/V).
Eter de petrleo.
Solucin de cido clorhdrico al 1% (V/V).
Materiales y equipo.
Matraz de bola fondo plano, 600 ml, cuello esmerilado.
Unidad de condensacin para el matraz.
Matraz Kitazato de un litro.
Embudo Buchner.
Crisol de filtracin.
Conos de hule.
Papel filtro Whatman No. 541.
Pizeta de 500 ml.
Desecador.
Horno de laboratorio.
Mufla.
Mtodo
1. Pese con aproximacin de miligramos de 2 a 3 gramos de la muestra desengrasada y seca.
Colquela en el matraz y adicione 200ml de la solucin de cido sulfrico en ebullicin.
3. Coloque el condensador y lleve a ebullicin en un minuto; de ser necesario adicinele
antiespumante. Djelo hervir exactamente por 30 min, manteniendo constante el volumen con
agua destilada y moviendo peridicamente el matraz para remover las partculas adheridas a las
paredes.
4. Instale el embudo Buchner con el papel filtro y precalintelo con agua hirviendo.
Simultneamente y al trmino del tiempo de ebullicin, retire el matraz, djelo reposar por un
minuto y filtre cuidadosamente usando succin; la filtracin se debe realizar en menos de 10 min.
Lave el papel filtro con agua hirviendo.
5. Transfiera el residuo al matraz con ayuda de una pizeta conteniendo 200ml de solucin de NaOH
en ebullicin y deje hervir por 30 min como en paso 2.
6. Precaliente el crisol de filtracin con agua hirviendo y filtre cuidadosamente despus de dejar
reposar el hidrolizado por 1 min.
7. Lave el residuo con agua hirviendo, con la solucin de HCI y nuevamente con agua hirviendo,
para terminar con tres lavados con ter de petrleo. Coloque el crisol en el horno a 105C por 12
horas y enfre en desecador.
8. Pese rpidamente los crisoles con el residuo (no los manipule) y colquelos en la mufla a 550C
por 3 horas, djelos enfriar en un desecador y pselos nuevamente.
Clculos
A = Peso del crisol con el residuo seco (g)
B = Peso del crisol con la ceniza (g)
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Contenido de fibra cruda (%)= 100((A - B)/C)
Recomendaciones
Uno de los problemas ms frecuentes durante la evaluacin de la fibra cruda es la oclusin de los
filtros, por lo que en algunos casos se recomienda sustituir el papel (paso 4 del mtodo) por una pieza
de tela de algodn. Para evitar la saturacin del crisol de filtracin (paso 6) colquelo ligeramente
inclinado y agregue muy lentamente el material a filtrar, de manera que gradualmente se vaya
cubriendo la superficie filtrante.
Con el uso los crisoles de filtracin tienden a taparse. Para su limpieza calcnelos a 500C y hgales
pasar agua en sentido inverso. Cuando se han tapado con partculas minerales, prepare una solucin
que contenga 20% KOH, 5% de Na3PO4 y 0.5% de EDTA sal sdica, calintela y hgala pasar por el
crisol en sentido inverso. Este tratamiento erosiona al filtro de vidrio.
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FIGURA 5
Determinacin proximal de fibra cruda
3.5. Ceniza
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El mtodo aqu presentado se emplea para determinar el contenido de ceniza en los alimentos o sus
ingredientes mediante la calcinacin. Se considera como el contenido de minerales totales o material
inorgnico en la muestra.
Materiales y equipo.
Crisoles de porcelana.
Mufla.
Desecador.
Procedimiento
1. En un crisol de porcelana que previamente se calcin y se llevo a peso constante, coloque de 2.5
a 5g de muestra seca.
2. Coloque el crisol en una mufla y calcnelo a 550C por 12 horas, deje enfriar y pselo a un
desecador.
3. Cuidadosamente pese nuevamente el crisol conteniendo la ceniza.
Clculos
A = Peso del crisol con muestra (g)
B = Peso del crisol con ceniza (g)
Contenido de ceniza (%)= 100((A - B)/C)
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FIGURA 6
Determinacin del contenido de ceniza en ingredientes alimenticios.
3.6. Extracto Libre de Nitrgeno (ELN)

Dentro de este concepto se agrupan todos los nutrientes no evaluados con los mtodos sealados
anteriormente dentro del anlisis proximal, constituido principalmente por carbohidratos digeribles, as
como tambin vitaminas y dems compuestos orgnicos solubles no nitrogenados; debido a que se
obtiene como la resultante de restar a 100 los porcientos calculados para cada nutriente, los errores
cometidos en su respectiva evaluacin repercutirn en el cmputo final.
Clculo
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Extracto Libre de Nitrgeno (%) = 100-(A+B+C+D+E)

Donde:
A = Contenido de humedad (%)
B = Contenido de protena cruda (%)
C = Contenido de lpidos crudos (%)
D = Contenido de fibra cruda (%)
E = Contenido de ceniza (%)
3.7. Correcciones
Debido a que los anlisis normalmente se hacen con muestras preparadas para tal fin, es necesario
realizar ciertas correcciones en los resultados para que reflejen el contenido real de nutrientes en el
material en las condiciones en que se usar.
a) Humedad
Si los anlisis se efectuaron en base seca (BS), esto es material deshidratado, es necesario corregir el
resultado para expresarlo en base hmeda (BH), tal como se encuentra en el alimento o material para
su elaboracin, mediante la siguiente expresin:
A = Contenido de nutriente (%/BS)
B = Contenido de humedad de el material (%)
Contenido de nutriente (%/BH) = (A ((100 - B)/100))
b) Lpidos
Cuando se usa material desengrasado, por ejemplo en el anlisis de fibra cruda, se aplica una
expresin similar a fin de obtener un valor representativo de la muestra:
A = Contenido de fibra (desengrasada, %)
B = Contenido de lpidos en el material (%)
Contenido de fibra ajustado (%) = (A ((100 - B)/100))
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