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Detección de Coliformes
Detección de Coliformes
AUTORES:
ELISA MARCELA CARRILLO ZAPATA
AURA MARA LOZANO CAICEDO
TRABBAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar el titulo de
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
NOTA DE ADVERTENCIA:
AUTORES
ELISA MARCELA CARRILLO ZAPATA
AURA MARA LOZANO CAICEDO
APROBADO
Microbiloga Industrial
Bacteriloga MSc
DIRECTOR
ASESOR
___________________________
__________________________
ZULMA VALBUENA
Microbiologa industrial
Bacteriologa
JURADO
JURADO
AUTORES:
ELISA MARCELA CARRILLO ZAPATA
AURA MARA LOZANO CAICEDO
APROBADO
INGRID SCHULER
JANETH ARIAS
Biloga, Ph D.
Bacteriloga, Msc.
DECANA ACADEMICA
DIRECTORA CARRERAS
MICROBIOLOGIA
DEDICATORIA
A Dios, porque nunca nos abandono en el largo andar de nuestro aprendizaje, porque
cuando mas necesitamos de su ayuda, el estuvo all, sostenindonos entre sus brazos
para que no nos doliera el caminar en los momentos difciles.
A nuestras familias porque gracias a su eterno amor para cada una de nosotras, llenaron
nuestros corazones de fortaleza para que este largo andar, se hiciera mas corto y
placentero; por su apoyo incondicional sin importar las circunstancias, porque pece a
todos los momentos vividos, siempre estn presentes para brindarnos el amor que
reconforta nuestro ser.
Aura y Marcela
A mi padre que esta en el cielo porque mientras estuvo a mi lado fue un ejemplo de
sabidura y superacin, un apoyo incondicional, un padre lleno de esperanza y amor
para conmigo y porque ahora que esta en el cielo se que desde all ilumina todos mis
caminos, ayudndome a seguir siempre por el mejor y porque se que este donde este
siempre velara mis sueos.
Aura M
AGRADECIMIENTOS
A Dios por acompaarnos siempre y por estar a nuestro lado en los buenos y malos momentos.
A la Dra. Jeinny Romero, nuestra directora por aceptar guiarnos en la realizacin de este
trabajo, por llenarse de paciencia, por transmitirnos su conocimiento y experiencia, por ser mas
que una amiga, por su colaboracin y apoyo durante el desarrollo de este trabajo.
RESUMEN
La validacin realizada en este trabajo de grado tuvo como propsito utilizar el agar Chromocult,
como mtodo alternativo en la deteccin de microorganismos indicadores de la calidad del agua
potable, gracias a su fcil manejo y rpida recuperacin para reducir costos y desarrollar
procedimientos con mayor eficacia y seguridad en el laboratorio INTHERPHARM DE COLOMBIA
Ltda, basados en la USP 31, realizando un anlisis
disminucin de los riesgos de reanlisis que aumentan el tiempo de anlisis y los costos.
Se realiz una revisin y recopilacin bibliogrfica, para obtener toda la informacin necesaria y se
verific que el programa de calibracin y mantenimiento de los equipos, estuviera vigente, para de
esta manera poder garantizar el procedimiento realizado y los resultados obtenidos. Luego se
realizaron pruebas preliminares en donde se llevo a cabo la estandarizacin de los inculos,
realizando diluciones de un cultivo de 24 horas y comparando con el tubo 1 de la escala de Mac
farland para E.coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Enterobacter aerogenes
ATCC 13048, posteriormente se estandariz la tcnica filtracin por membrana con tres muestras
de tres replicas cada una y despus de obtener los resultados esperados (30 UFC\ml
aproximadamente) se realiz la metodologa para la validacin de la tcnica filtracin por membrana,
analizando diez muestras de agua potable diferentes, con tres replicas para cada una, mediante
las cuales se realizaron recuentos de cada uno de los microorganismos con los cuales fueron
contaminadas las muestras de agua, bajo condiciones alternadas, variando los analistas y los das
de anlisis; se llevo acabo el anlisis de una prueba estndar (agua estril para inyeccin, inoculada
con cada uno de los microorganismos a evaluar Escherchia coli ATCC 8739,
Salmonella
typhimurium ATCC 14028 y Enterobacter aerogenes ATCC 13048), una solucin de prueba (agua
potable inoculada con los microorganismos utilizados como prueba: Escherchia coli ATCC 8739,
Salmonella typhimurium ATCC 14028 y Enterobacter aerogenes ATCC 13048), un control negativo
(agua potable con tiosulfato de sodio al 1% y sin inocular) y una prueba combinando la muestra de
agua con los microorganismos a evaluar (agua potable + Escherchia coli ATCC 8739 + Salmonella
typhimurium ATCC 14028; agua potable + Escherichia coli ATCC 8739 + Enterobacter aerogenes
ATCC: 13048; agua potable + Escherichia coli ATCC 8739 + Enterobacter aerogenes ATCC 13048
) de esta manera se obtuvieron, 30 recuentos por da para un total de 300 recuentos por analista,
por lo tanto se obtuvieron 600 datos en total, por los dos analistas, luego de obtener todos los datos,
se procedi a realizar el anlisis y se determinaron los parmetros cuantitativos para la validacin
del mtodo.
La metodologa se llevo a cabo con muestras de agua potable, provenientes del acueducto de
Bogot que cumplen con las especificaciones descritas segn
Finalmente se logro concluir que el mtodo es reproducible y repetible, tambin se logro establecer
que el mtodo es especifico para la demostracin de coliformes Fecales, debido a que para este
grupo de microorganismos indicadores se logro obtener un porcentaje de recuperacin superior al
96%, comparado con los otros microorganismos.
ABSTRACT
The corroboration undertook in this examination paper pretended to utilize the agar chromocult
as an alternative method in the detection of indicating micro-organisms of drinking waters
quality thanks to its handling capability and short period ability to recuperate in order to reduce
costs and to develop more efficient and safer procedures at INTHERPHARM DE COLOMBIA
Ltda. laboratories, based on the USP 31, and developing the montage which warranties reliable
results and a decrease in repetition risks which generate an increase in analysis time and costs.
As a start up, a bibliographic revision and compilation took place in order to obtain the required
amount of information. The tune-up and maintenance of the equipment was also verified aiming
to warranty the undertook procedure and the obtained results. Then, some preliminary testing
were developed for the standardization of the inocules, also effecting dilutions of a 24 hours
crop with Pipe 1 of Mac Falrlands scale for E.coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC:
14028, Enterobacter aerogenes ATCC: 13048. Later, the set up of the membrane filtration
technique was standardised analyzing ten different samples of drink water with three replicas
for each one in which it was determined the keeping of the contaminating micro-organisms in
the membrane filters with a pore size of 0.45um under alternated conditions, with variation of
annalists and days; it also took place the analysis of and standard test (sterilized water,
inoculated with each of the micro-organisms to be evacuated Escherchia coli,
Salmonella
typhimurium y Enterobacter aerogenes), a test solution (drinking water inoculated with the
micro-organisms used for the test Escherchia coli, Salmonella typhimurium y Enterobacter
aerogenes ), a negative control (Drinking water with 1% thiosulfate without inoculation) and a
test combining the sample water with the micro-organisms to be examined (drinking water +
Escherchia coli + Salmonella typhimurium; drinking water + Escherichia coli + Enterobacter
aerogenes; drinking water + Escherichia coli + Enterobacter aerogenes ) in which way 30
recounts were obtained for an aggregated amount of 310 recounts per analyst, amounting to a
total data of 620, between the two analysts. After obtaining all the data, the next step consisted
in determining the quantitative parameters for the validation of the method.
The methodology was undertaken with drinking water samples taken from Bogotas water
purification plant which follow the specifications prescribed by Resolution 2115/07. Finally, it
was possible to conclude that the utilized method is reproducible and repeatable; in addition, it
was ascertained that the method is specific for the demonstration of fecal coliforms, ought to the
fact that for this group of indicating micro-organisms it was possible to obtain a recuperation
percentage superior to 96%, compared with other micro-organisms.
TABLA DE CONTENIDO
PAG.
1. INTRODUCCIN..1
2. MARCO TERICO Y REVISIN DE LITERATURA..2
2.1. AGUA POTABLE.2
2.1.1 Caractersticas del agua potable..3
2.1.2. Anlisis microbiolgico del agua..3
2.1.3. Proceso de potabilizacin del agua.4
2.1.3.1 Inactivacin del cloro en el agua potable4
2.2. MICROORGANISMOS INDICADORES DE LA CALIDAD DEL AGUA.5
2.2.1. Coliformes Totales..5
2.2.1.1. Enterobacter aerogenes..6
2.2.2. Coliformes Fecales....7
2.2.2.1. Escherichia coli..8
2.2.3. Salmonella spp9
2.3. TCNICA DE FILTRACIN POR MEMBRANA PARA DETECCIN DE COLIFORMES
TOTALES Y FECALES10
2.3.1.
Filtros de membrana..11
2.3.2.
2.3.2.2.2.
II
III
LISTA DE TABLAS
PAG.
TABLA 1. Caractersticas fsicas del agua potable...3
TABLA 2. Caractersticas qumicas de sustancias presentes en el agua.3
TABLA 3. Caractersticas microbiolgicas del agua.4
TABLA 4. Comparacin de pruebas bioqumicas de E. coli y E. aerogenes...7
TABLA 5. Caractersticas de coliformes totales y E. coli.9
TABLA 6. Aplicaciones de los filtros de membrana14
TABLA 7. Datos requeridos para la validacin19
TABLA 8. Parmetros de validacin por tipo de prueba microbiolgica.20
TABLA 9. Lmites microbiolgicos ambientales, rea de recuentos de
INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda...22
TABLA 10. Lmites microbiolgicos de superficies, rea de recuentos de
INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.23
TABLA 11. Lmites microbiolgicos de dotacin guantes, rea de recuentos de
INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda....23
TABLA 12. Caractersticas morfolgicas y enzimticas de los microorganismos evaluados..41
TABLA 13. Estandarizacin de inculos: Escherichia coli ATCC 8739, Enterobacter aerogenes
ATCC: 13048 y Salmonella typhimurium ATCC 14028 Analista 1.....44
TABLA 14. Estandarizacin de inculos: Escherichia coli ATCC 8739, Enterobacter aerogenes
ATCC 13048 y Salmonella typhimurium ATCC 14028 Analista 2...45
TABLA 15. Programa de Calibracin y mantenimiento de los equipos utilizados
en la validacin..46
TABLA 16. Prueba de promocin de crecimiento......47
TABLA 17. Resultados del control microbiolgico de ambiente, superficie y analista durante
los ensayos realizados. Analista 1 .47
TABLA 18. Resultados del control microbiolgico de ambiente, superficie y analista durante
los ensayos realizados. Analista 2. 48
TABLA 19. Resutados control Negativo. Analista 1.....49
TABLA 20. Resultados control Negativo. Analista 2....49
TABLA 21. Porcentaje de recuperacin de E. coli ATCC 8739en la solucin de
prueba (analista 1) .....50
TABLA 22. Porcentaje de recuperacin de E. aerogenes ATCC: 13048 en la solucin de
prueba (Analista 1).52
TABLA 23. Porcentaje de recuperacin de S. typhimurium ATCC 14028 en la solucin de
prueba (Analista 1)...54
TABLA 24. Porcentaje de recuperacin de E. coli ATCC 8739 en la solucin de prueba
IV
(Analista 2)...56
en la
en la solucin de
LISTA DE FIGURAS
PAG.
FIGURA 1. Fuente de agua..2
FIGURA 2. Enterobacter aerogenes..6
FIGURA 3. E. coli en agar EMB..9
FIGURA 4. Salmonella en agar XLD....10
FIGURA 5. Trampa de filtracin....11
FIGURA 6. Filtros de profundidad.12
FIGURA 7. Filtros de membrana o superficie..13
FIGURA 8. Preparacin de inoculos ....33
FIGURA 9. Diagrama de flujo de Control negativo-muestra.36
FIGURA 10. Diagrama de flujo de la Prueba estndar..37
FIGURA 11. Diagrama de flujo de la solucin de Prueba 38
FIGURA 12. Diagrama de flujo de la solucin de prueba combinando los
Microorganismos.40
FIGURA 13. Porcentaje de recuperacin de E. coli (analista 1)..51
FIGURA 14. Porcentaje de recuperacin de E. aerogenes (analista 1).53
FIGURA 15. Porcentaje de recuperacin de S. typhimurium (analista 1).....55
FIGURA 16. Porcentaje de recuperacin de E. coli (analista 2)...57
FIGURA 17. Porcentaje de recuperacin de E. aerogenes (analista 2).59
FIGURA 18. Porcentaje de recuperacin de S. typhimurium (analista 2)..61
FIGURA 19. Prueba de promocin de crecimiento de E. coli en agar chromocult....68
FIGURA 20. Prueba de promocin de crecimiento de E. aerogenes en agar chromocult..68
FIGURA 21. Prueba de promocin de crecimiento de S. typhimurium en agar chromocult69
FGURA 22. Solucin de prueba: E coli....69
FIGURA 23. Solucin de prueba S. typhimurium69
VI
VII
1. INTRODUCCIN
El agua es una de las principales fuentes de vida en nuestro planeta, son infinitos los
usos del agua, para consumo humano, para labores domesticas y en la industria
farmacutica, es utilizada en las diferentes actividades como el lavado de materiales,
utensilios, reas accesorias, de anlisis, y como base para la preparacin de
medicamentos y/o cosmticos, en este caso el agua debe cumplir unos estndares mas
estrictos y su sistema de purificacin debe ser muy eficiente, para obtener un alto grado
de pureza y estar libre de contaminantes que puedan afectar la calidad del producto
terminado y ms an, la salud del paciente a quien se le suministren los medicamentos
elaborados. (Walter, J. 2003).
Es por esto, que los laboratorios de anlisis microbiolgico, buscan validar las tcnicas
desarrolladas para el anlisis de este tipo de aguas, que en la mayora de los casos
buscan detectar bacterias coliformes totales y fecales, mediante la tcnica de filtracin
por membrana, tcnica que es aceptada y utilizada a nivel nacional e internacional por
entes reguladores, debido a su fcil manejo y empleo y de esta manera contribuir a que
el agua suministrada al consumo humano sea de excelente calidad y que su sistema de
potabilizacin logre eliminar la mayor cantidad de organismos contaminantes que
puedan llegar a afectar la salud de los consumidores. (Walter, J. 2003).
Es aquella que por cumplir las caractersticas fsicas, qumicas y microbiolgicas, es apta
para el consumo humano; se utiliza en bebida directa, en la preparacin de alimentos o
en la higiene personal (Resolucin 2115, 2007).
Puede provenir de distintas fuentes, incluyendo los servicios pblicos de agua, un
suministro etc. El agua potable se puede usar en las primeras etapas de limpieza de los
equipos de fabricacin farmacutica y de componentes en contacto con los productos,
tambin es usada en la preparacin de sustancias oficiales y otros ingredientes
farmacuticos a granel (USP 31, 2007)
Fuente: quincher.wordpress.com/2008/06/30/el-agua/
El cloro fue descubierto en 1774 por el qumico sueco Karl Wihellm Scheele como
producto de la reaccin entre cido hipoclorhdrico y dixido de manganeso. Es una
sustancia tan energtica y activa que solo existe en la naturaleza en combinacin con
otros elementos, es aplicado en exceso de manera que pueda satisfacer la demanda
para oxidar compuestos como nitritos, iones de hierro, plomo, sulfuros y eliminar
bacterias, de manera que as se reste una cantidad de cloro residual en los ductos del
agua; parte de este cloro residual queda para continuar desinfectando el agua desde que
sale de la planta de tratamiento hasta que llega al consumidor.
Debe ser aplicado en el agua a tratar en forma gaseosa o como un slido ionizado; al ser
adicionado al agua, este reacciona con el amonaco y materia orgnica formando
cloraminas y compuestos rgano clorados, los cuales son reducidos a un valor mnimo y
queda como resultado el cloro residual libre (Ocasio, N et al., 2004).
Segn la resolucin 2115 de 2007, el valor aceptable del cloro residual en cualquier
punto de la distribucin del agua potable, debe ser comprendido entre 0.3 y 2.0 mg/L.
2.1.3.1 Inactivacin del cloro en el agua potable
La cloracin de aguas de suministro sirve principalmente para destruir o desactivar
microorganismos que pueden causar enfermedades.
Desde hace tiempo, se reconoce que los organismos del grupo coliforme son un buen
indicador microbiano de la calidad del agua potable, debido principalmente a que son
fciles de detectar y enumerar en el agua. La presencia de E. coli en muestras de agua
potable, indica la existencia de fallas en la eficacia de tratamiento de aguas, integridad,
sistema de distribucin y por tanto es una evidencia de contaminacin de diferentes
orgenes:
suelo,
El grupo coliforme se define como todas las bacterias Gram negativas en forma bacilar
que fermentan la lactosa a temperatura de 35 a 37 C, produciendo cido y gas (CO2) en
24 horas, aerobias o anaerobias facultativas, son oxidasa negativa, no forman esporas y
presentan actividad enzimtico de la B-galactosidasa (Ministerio de salud, 1998). Entre
ellos se encuentran los diferentes Escherichia coli, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella.
(Organizacin Panamericana de la Salud, 1987)
Fuente: www.wales.nhs.uk/sites3/page.cfm?orgid=379...
E.coli
Enterobacter aerogenes
Produccin de Indol
Rojo de Metilo
Voges Proskauer
Citrato
Lisina descarboxilasa
Hidrlisis de la esculina
Utilizacin de malonato
Arginina deshidrolasa
+
+
Los coliformes fecales integran el grupo de los coliformes totales, pero se diferencian de
los dems microorganismos que hacen parte de este grupo, en que son indol positivo, su
rango de temperatura ptima de crecimiento es muy amplio (hasta 45C) y son mejores
indicadores de higiene en alimentos y en aguas, la presencia de estos indica presencia
de contaminacin fecal de origen humano o animal, ya que las heces contienen dichos
microorganismos, presentes en la flora intestinal y de ellos entre un 90% y un 100% son
E. coli mientras que en aguas residuales y muestras de agua contaminadas este
porcentaje disminuye hasta un 59%. (GOMES; 1999).
Fuente: science.kukuchew.com/category/microbiology/
E. COLI
No esporulados
No esporulados
Anaerobios facultativos
Anaerobios facultativos
Fermentadores
de
la
lactosa
con
Fermentadoras
de
la
lactosa
con
24-48 horas
homeotermos
Fuente: bioinfo.bact.wisc.edu/.../Salmonella.html
2.3. TCNICA
DE
FILTRACIN
POR
MEMBRANA
PARA
DETECCIN
DE
10
Fuente. fbio.uh.cu/educacion_distancia/laboratorios_virtuales/Laboratorio%20Virtual%20
micro.pps
2.3.1.
Filtros de membrana
Se deben utilizar filtros de membrana con un dimetro de poro que permita una completa
retencin de las bacterias coliformes. Solo se emplean filtros en los que se haya
comprobado, mediante una adecuada prueba de control de calidad y por garanta del
fabricante, que permita una retencin de las bacterias coliformes. (APHA, 1992).
Se debe tener en cuenta, que dichos filtros deben ser libres de qumicos susceptibles de
inhibir el crecimiento y desarrollo bacteriano, que posean una velocidad de filtracin
satisfactoria, ausencia de influencias significativas sobre el pH del medio (no mas de +/0.2 unidades) y que no produzcan un aumento en el nmero de colonias confluentes o
expansivas, en comparacin con los filtros de membrana de control (APHA, 1992).
El mecanismo de accin es muy simple: retienen todas las partculas que posean un
tamao mayor que los poros, estos poros quedan formados por los espacios que
11
Fuente: http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf
12
Fuente: http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf
Tienen una estructura de poro muy uniforme, lo que asegura una excelente retencin y
un ptimo crecimiento microbiolgico en muestras de agua, bebidas, frmacos
(PEARCE, 2007).
2.3.2.2.2 Membrana de acetato de celulosa
Son de naturaleza hidroflica, presentan una excelente estabilidad trmica, permiten gran
capacidad de carga y altas velocidades de flujo, por lo que resultan apropiados para la
esterilizacin y clarificacin de soluciones acuosas, alcohlicas y aceites.
Las partculas ms grandes que el tamao del poro son rechazados por la superficie de
la membrana y el remanente permanece o se concentra all. El volumen del fluido y otras
partculas finas de menor tamao del poro pueden pasar a travs de la membrana al sitio
de filtrado (PEARCE, 2007).
13
Filtracin de aguas
Anlisis microbiolgico
Anlisis gravimtrico
Filtracin de alcoholes
Filtracin de aceites
Esterilizacin de muestras
Determinacin de protenas
Identificacin de cidos nucleicos
Pre filtracin de muestras
Clarificacin de muestras
Fuente. http://www.fanoia.com/filterlab/micro-8-15.pdf
14
15
2.5. VALIDACIN
El proceso de validacin se inicia con las actividades de pre validacin, las cuales
consisten en la recopilacin de la informacin relacionada con el proceso, en la revisin
de las evaluaciones de riesgos, la calificacin tcnica a las instalaciones locativas y a los
equipos, existencia de procedimientos para las tareas u operaciones y el entrenamiento
a los trabajadores. Posteriormente se procede a elaborar los protocolos en donde se
define los objetivos especficos de las evaluaciones a efectuar, las responsabilidades de
cada una de las reas involucradas en la validacin, se establecen las variables de
16
17
2.5.1.2. Exactitud
La exactitud, es la cercana de un resultado al valor verdadero por comparacin con los
valores de referencia de un material caracterizado (material de referencia). Los valores
de referencia deberan ser trazables a las normas internacionales; los materiales de
referencia certificados (MRC) generalmente se aceptan como trazables. Es ideal que el
material de referencia sea de matriz natural lo mas similar posible a las muestras de
inters. (RODRGUEZ, 2004). Usualmente, la exactitud se expresa como el porcentaje
de recuperacin de los microorganismos mediante el mtodo de validacin. (USP 31,
2008).
2.5.1.3. Precisin
Las dos medidas ms comunes de la precisin, que generalmente se define en trminos
de desviacin estndar o el coeficiente de variacin (desviacin estndar relativa) son la
repetibilidad y la reproducibilidad. La repetibilidad, da una idea de la variabilidad que se
espera cuando un proceso es aplicado por un solo analista en un equipo durante un
periodo corto (anlisis por duplicado). La reproducibilidad, es la que representa la
variabilidad que se obtiene cuando un proceso es analizado por diferentes analistas, lo
cual tiene un valor ms amplio. La precisin intermedia y ms til en casos especficos
se obtiene cuando se evala reproducibilidad entre analistas en un mismo laboratorio.
(RODRGUEZ, 2004).
18
anlisis
Prueba
Categora
Categora
cuantitativa
de lmite
III
IV
Exactitud
Si
Si
No
Precisin
Si
Si
No
Si
No
Especificidad
Si
Si
Si
Si
de
No
No
Si
No
de
No
Si
No
No
Si
Si
No
No
Caractersticas
de
Desempeo
analtico
Lmite
deteccin
Lmite
Cuantificacin
Linealidad
Para decidir si un mtodo es apropiado o no, se debe tener en cuenta: si ese mtodo es
aplicable a la muestra analizar a analizar, la cantidad de muestra necesaria para el
ensayo, si usando esta metodologa se puede evaluar el cumplimiento de las exigencias
requeridas para el analto. El laboratorio debe elegir los mtodos que mejor se adecuen
a sus objetivos y debe documentarlos debidamente. (GUARNIZO, 2005).
19
2.6.1.
Pruebas
cualitativas
para
detectar
la
presencia
ausencia
de
microorganismos
Pruebas
Pruebas
cualitativas
cuantitativas
Exactitud
No
Si
Precisin
No
Si
Especificidad
Si
Si
Lmite de deteccin
Si
Si
Lmite de cuantificacin
No
Si
Linealidad
No
Si
Robustez
Si
Si
Repetibilidad
Si
Si
Un laboratorio debe validar los mtodos no normalizados, los mtodos que disea o
desarrolla, los mtodos normalizados empleados fuera del alcance previsto, as como las
ampliaciones y las modificaciones de los mtodos normalizados, para confirmar que son
aptos para el fin previsto. La validacin debe ser tan amplia como sea necesario para
satisfacer las necesidades del tipo de aplicacin o del campo de aplicacin dados. El
laboratorio debe registrar los resultados obtenidos, el procedimiento utilizado para la
20
validacin y una declaracin sobre la aptitud del mtodo para el uso previsto. (ENAC,
2002).
2.6.3.
Mtodos normalizados
El laboratorio debe confirmar que puede operar correctamente los mtodos normalizados
antes de introducir los ensayos. Si el mtodo normalizado cambia se debe repetir la
confirmacin.
2.6.4. Mtodos desarrollados por el laboratorio
Son mtodos tomados de una norma, pero con alguna modificacin, tal es el caso de
una filtracin con membrana utilizando otro medio de cultivo diferente; aqu se debe
realizar lo mismo a como si se estuviera realizando la validacin de un mtodo
desarrollado por el laboratorio, debido a que ya existe una modificacin sobre el mtodo
normalizado (G-ENAC. 1997).
21
Monitoreo de la calidad
del
muestreadores
Monitoreo de la calidad microbiolgica de las superficies de trabajo, por frotacin
con hisopos o por placas rodac
Control de dotacin y de personal (VILLOCH, C.A. 2002)
No. De microorganismos
No. De microorganismos
60 minutos
viables bacterias
UFC/placa
UFC/placa
clase 100
rea
Max. 12
Max. 12
No: Nmero
22
No. de microorganismos
viables bacterias
UFC/ 25 cm2
UFC/ 25 cm2
Max. 0
Max. 0
Max. 12
Max. 12
clase 100
Mesa, Puerta o Pared
No: Nmero
No. de microorganismos
No. de microorganismos
/placa
viables bacterias
UFC/placa
UFC/placa
Guantes inicio
Max. 3
Max. 1
Guantes final
Max. 7
Max. 5
No: Nmero
En el caso de algunos equipos que no se pueden esterilizar por los diversos mtodos
como: Equipos elctricos y electrnicos, balanzas, bateras, etc.; la desinfeccin de estos
equipos debe ser ms rigurosa debido a su potencial de contaminacin con un gran
nmero de microorganismos. (CARLENTON, 1999)
23
Cada uno de los tubos del patrn de acuerdo con la turbidez, representa un nmero de
bacterias, para suspensiones de igual turbidez, que ha sido determinado por recuentos
de colonias. De esta forma al comparar una emulsin de bacterias con el tubo del patrn
de Mc farland que ms se asemeje se puede saber aproximadamente el numero de
bacterias en la emulsin (ESCOBAR, 2002)
2.7.3.
Medios de cultivo
Los medios de cultivo seleccionados debern ser evaluados con la prueba de promocin
de
crecimiento deben ser inoculadas con un nmero menor de 100 UFC. Si las pruebas de
promocin de crecimiento fallan, se debe investigar el origen de cualquier contaminacin
encontrada durante la simulacin y repetir la prueba. (ROGANTI, 2004)
2.7.3.1. Esterilizacin del medio de cultivo
El medio seleccionado debe ser esterilizado por uno de los dos mtodos primarios,
filtracin o esterilizacin por vapor. La esterilizacin por filtracin requiere que el medio
pase por un filtro de 0.22m a un contenedor previamente esterilizado; este mtodo
presenta dificultad debido a que los medios de cultivo son mezcla de varios materiales
naturales y una cantidad considerable de estos son slidos no solubles que se
encuentran presentes en la mezcla acuosa. (CARLENTON, 1999)
24
Despus de la esterilizacin del medio este debe ser manejado realizando las mismas
practicas usadas para las operaciones de produccin rutinarias. Algunas empresas
siguen algunos pasos adicionales como la preincubacin del medio antes de empezar la
corrida de la prueba, para asegurarse de la esterilidad del medio antes del envase de
este. (CARLENTON, 1999)
2.7.3.2. Incubacin
Los medios se deben incubar en condiciones adecuadas de modo que se puedan
evidenciar los microorganismos que podran de otra manera ser difciles de cultivar. Se
deben establecer las condiciones de incubacin de acuerdo con las siguientes pautas
generales:
25
la certificacin
26
Este informe resume y presenta todos los protocolos, resultados y deriva conclusiones
relacionadas con el estado de validacin del proceso. Debe ser revisado y aprobado por
el equipo de validacin y la administracin. (RODRGUEZ. 2004)
27
La validez en los resultados de los anlisis microbiolgicos se ven afectados por factores
como: La preparacin del inculo, la naturaleza de los microorganismos utilizados, las
condiciones especficas de la prueba, las condiciones de recuperacin, entre otros. Por
lo anterior, todos los mtodos y especialmente los relacionados con el anlisis
microbiolgico del agua potable, dada la importancia como materia prima, ingrediente y
disolvente en el procesamiento, formulacin, fabricacin de productos farmacuticos y
para el consumo humano, deben ser validados.
Por esta razn, en este trabajo de grado se demuestra que el mtodo de filtracin por
membrana utilizado por el laboratorio INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda, para la
deteccin de coliformes totales y fecales en agua potable utilizando agar chromocult, es
confiable, reduce costos y tiempo.
28
4. OBJETIVOS
29
5. MATERIALES Y MTODOS
30
13048),
utilizados como prueba: Escherchia coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC
14028 y Enterobacter aerogenes ATCC 13048 ), un control negativo (agua potable con
tiosulfato al 1% y sin inocular) y una prueba combinando la muestra de agua con los
microorganismos a evaluar (agua potable + Escherchia coli ATCC 8739 + Salmonella
typhimurium ATCC 14028); (agua potable + Escherichia coli ATCC 8739 + Enterobacter
aerogenes ATCC 13048 ) y (agua potable + Salmonella typhimurium ATCC: 14028 +
Enterobacter aerogenes ATCC 13048 ) de esta manera se obtienen, 30 recuentos por
da para un total de 300 recuentos por analista, por lo tanto se obtienen 600 datos en
total por los dos analistas, para determinar posteriormente parmetros cuantitativos para
la validacin del mtodo.
Precisin
Repetibilidad
Reproducibilidad
Especificidad
Exactitud
31
Para obtener toda la informacin que puede influir en la validez de la prueba se realiza
una revisin de los siguientes factores: personal, equipos e instalaciones, medios de
cultivos utilizados en la prueba, reactivos, entre otros.
Preparacin de inculos
de acuerdo al tubo
-7
(10 , 10
-8
32
de 100UFC\ml, para de esta manera iniciar la estandarizacin del inoculo con el cualk se
trabajar en la diferentes pruebas realizadas en la validacin; segn POE - DCM 043
PREPARACIN Y MANEJO DE INCULOS A PARTIR DE LA ESCALA DE MC
FARLAND (Codificacin correspondiente al Sistema de Gestin de Calidad de
INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.).
1ml
Cultivo
de 24
horas
Patrn
9.0 ml
-1
3X10
UFC/ml
0.1ml
0.1ml
9.0
ml
9.9
ml
-2
3X10
UFC/ml
-4
3X10
UFC/ml
1ml
1ml
9.9
ml
9.0
ml
9.0
ml
-6
3X10
UFC/ml
-7
3X10
UFC/ml
33
-8
3X10
UFC/ml
MATERIALES
MTODOS EN
LA EVALUACIN
DE
PARMETROS
CUANTITATIVOS
5.5.1. Materiales
Tiosulfato de Sodio al 0.1N
Colorantes de tincin de Gram.
Reactivo de Kovacks
Aceite de Inmersin
Alcohol al 70%
Alcohol al 96%
Frascos Schott por 250ml
Frascos Schott por 500ml
Pipetas graduadas de 1, 2, 5 y 10ml
Cajas de petri desechables estriles
Bolsas de polietileno resistentes al calor
Membranas para filtracin con poro de 0,45 m y dimetro de 47mm
Guantes estriles
Pera pipeteadora
Agar Chromocult
Agar Casoy
Cepa de Escherichia coli ATCC 8739
Cepa de Enterobacter aerogenes ATCC 13048
Cepa de Salmonella typhimurium ATCC 14028
Papel kraft
Pinzas de acero inoxidable estriles
34
Asa redonda
Asa recta
Cabina de flujo laminar horizontal
Microscopio
Incubadora de 20-25C
Incubadora de 30-35C
Equipo de filtracin
Bomba de vaco
Contador de colonias
Mangueras
Tijeras estriles
Vasos de filtracin
Autoclave
35
Adicionar Tiosulfato de
sodio al 1%
Filtrar 100 ml
Adicionar Tiosulfato de
sodio al 1%
Filtrar 100 ml
Adicionar
Tiosulfato de
sodio al 1%
Filtrar 100 ml
Informar
resultados
Realizar recuento
Fuente: Autor
36
Realizar
coloracin
de Gram
Armar equipo de
filtracin
Frascos schott con 100 ml de agua estril para inyeccin cada uno
Adicionar 1 ml de
3x10-8 (30 UFC/ml)
de la suspensin
de Escherichia coli
ATCC 8739
Adicionar 1 ml de 3x10-8
(30 UFC/ml) de la
suspensin de
Enterobacter aerogenes
ATCC 13048
Adicionar 1 ml de
3x10-8 (30 UFC/ml)
de la suspensin de
Salmonella
typhimurium ATCC
14028
Realizar recuento
Fuente: Autor
37
Realizar
coloracin
de Gram
Armar equipo
de filtracin
Adicionar tiosulfato
de sodio 1%
Adicionar tiosulfato
de sodio 1%
Adicionar tiosulfato
de sodio 1%
Dejar actuar
durante 30 minutos
Adicionar 1 ml de
-8
dilucin 3x10 (30
UFC/ml) de la
suspensin de E.
coli
Adicionar 1 ml de
-8
dilucin 3x10 (30
UFC/ml) de la
suspensin de E.
aerogenes
Adicionar 1 ml de
-8
dilucin 3x10 (30
UFC/ml) de la
suspensin de S.
typhimurium
38
Realizar la prueba
de Indol y coloracin
de Gram
Realizar recuento
Informar resultados
Fuente: Autor
0.5 ml de la dilucin 3x10 (30 UFC/ml), de los microorganismos a evaluar por separado:
(Enterobacter aerogenes ATCC 13048 + Escherichia coli ATCC 8739); (Salmonella
typhimurium ATCC 14028 + Enterobacter aerogenes ATCC 13048) y (Escherichia coli
ATCC 8739 + Salmonella typhimurium ATCC 14028); este procedimiento, se realiza por
separado para cada una de las combinaciones utilizadas y por triplicado.
39
Armar equipo
de filtracin
Adicionar tiosulfato
de sodio 1%
Adicionar 0.5 ml de
dilucin 3x10-8 de la
suspensin de E. coli
y 0.5 ml de dilucin
3x10-8 de la
suspensin de E.
aerogenes
Adicionar tiosulfato
de sodio 1%
Adicionar tiosulfato
de sodio 1%
Adicionar 1 ml de
dilucin 3x10-8 de la
suspensin de E. coli y
0.5 ml de dilucin
3x10-8 de la suspensin
de S. typhimurium
Adicionar 1 ml de
dilucin 3x10-8 de la
suspensin de S.
typhimurium y 0.5 ml de
dilucin 3 x10- de la
suspensin de E.
aerogenes
Realizar recuento
Informar resultados
Fuente: Autor
40
Realizar la prueba
de Indol y
coloracin de Gram
Para llevar a cabo la validacin del mtodo de filtracin por membrana para la deteccin
de coliformes totales y fecales en agua potable, utilizando agar chromocult y teniendo en
cuenta su carcter cuantitativo se analizan variables como: exactitud, repetibilidad,
reproducibilidad, especificidad.
Se determina la precisin de las tcnicas en trminos de reproducibilidad, repetibilidad, a
travs de la desviacin estndar y el coeficiente de variacin La repetibilidad se evala
en el proceso cuando este es desarrollado por un solo analista en un equipo durante un
perodo corto, y la reproducibilidad se evala por la variabilidad que se obtiene cuando
el proceso es llevado a cabo por diferentes analistas para un mismo proceso en
diferentes das. De esta manera se lleva a cabo una rotacin entre dos analistas en dos
das diferentes. Se realizan controles microbiolgicos de ambientes, superficies y
personal durante y al finalizar el proceso. Con esto se puede encontrar la precesin,
repetitividad y la reproducibilidad.
Tabla 12. Caractersticas morfolgicas y enzimticas de los microorganismos evaluados
Microorganismo
Color de la
Salmon-GAL
X-glucoronido
Indol
Rojo/rosado
Incoloro
colonia
Escherichia coli
Azul
oscuro/violeta
Enterobacter
aerogenes
Salmonella
typhimuium
41
Para determinar el control del proceso, se realiza un anlisis de los resultados obtenidos
a lo largo de la validacin de la tcnica, adems de tener en cuenta los recuentos
obtenidos en los anlisis microbiolgicos de ambientes, superficies y personal.
5.8.1 Anlisis de datos
5.8.1.1 Media. (
= sumatoria
= media
N = nmero de elementos
X = valores o datos
5.8.1.2 Desviacin Estndar ()
Es una medida de la dispersin de una serie de mediciones de un determinado
parmetro, esto significa que no es un indicador de la variacin entre cada valor y la
media, se visualizan mejor cuando se presentan los datos en forma de una distribucin
de Frecuencia, es decir, ordenados por clase segn su magnitud (Montgomery. 1991)
42
: sumatoria
X: valor de la serie
: Media
N: nmero total de mediciones
43
6. RESULTADOS
Prueba
microorganismo
Tubo
DILUCION
#
Escherichia
coli
Recuento
Recuento
UFC/ml
UFC/ml
Replica 1
Replica 2
-7
28x10=280
29x10=290
-8
3x10
3x10
3x10=30
3x10=30
3x10-7
27x10=270
29x10=290
-8
3x10
3x10=30
3x10=30
3x10-7
34x10=340
31x10=310
3x10-8
3x10=30
3x10=30
3x10-7
27x10=270
28x10=280
3x10
-8
2x10=20
3x10=30
3x10
-7
27x10=270
28x10=280
3x10-8
3x10=30
3x10=30
3x10-7
27x10=270
26x10=260
3x10
3x10=30
3x10=30
3x10-7
29x10=290
29x10=290
3x10
-8
3x10=30
3x10=30
-7
ATCC 8739
Salmonella
typhimurium
ATCC 14028
Enterobacter
aerogenes
ATCC 13048
Escherichia
coli
ATCC 8739
Salmonella
typhimurium
2
ATCC 14028
Enterobacter
aerogenes
ATCC 13048
Escherichia coli
ATCC 8739
Salmonella
typhimurium
-8
3x10
28x10=280
27x10=270
3x10-8
3x10=30
3x10=30
3x10-7
29x10=290
28x10=280
3x10
3x10=30
3x10=30
ATCC 14028
3
Enterobacter
aerogenes
-8
ATCC 13048
44
Prueba
Microorganism
Tubo
Escherichia
coli
ATCC 8739
Salmonella
1
typhimurium
ATCC 14028
Enterobacter
aerogenes
ATCC 13048
Escherichia
coli
ATCC 8739
Salmonella
typhimurium
Recuento
UFC/ml
UFC/ml
Replica 1
Replica 2
-7
26x10=260
28x10=280
-8
3x10=30
3x10=30
-7
3x10
3x10
3x10
26x10=260
29x10=290
3x10-8
3x10=30
3x10=30
3x10
28x10=280
29x10=290
3x10-8
3x10=30
3x10=30
3x10-7
28x10=280
29x10=290
3x10-8
3x10=30
3x10=30
3x10-7
26x10=260
29x10=290
3x10
3x10=20
3x10=30
3x10-7
29x10=290
28x10=280
3x10-8
3x10=30
3x10=30
3x10-7
28x10=280
28x10=180
3x10-8
3x10=30
3x10=30
3x10
-7
29x10=290
28x10=280
3x10
-8
3x10=30
3x10=30
-7
-7
-8
ATCC 14028
Enterobacter
aerogenes
ATCC 13048
Escherichia
coli
ATCC 8739
Salmonella
typhimurium
DILUCION
Recuento
ATCC 14028
Enterobacter
aerogenes
3x10
29x10=290
28x10=280
3x10-8
3x10=30
3x10=30
ATCC 13048
45
MARCA/
ULTIMA
PROXIMA
MODELO
VERIFICACION
VERIFICACION
M: 06-08-08
M: 06-02-09
Incubadora
Hongos
MEMMERT /
Rango 20-25 C
U40
Incubadora
PRECISION
Bacterias
SCIENTIFIC /
Rango 30-35 C
CAT 31468
ICASA /
Nevera
PROVEEDOR
Tecnibsculas y
balanzas E. U.
M: 06-08-08
M: 06-02-09
Tecnibsculas y
balanzas E. U.
M: 06-08-08
M: 06-02-09
NE
Tecnibsculas y
balanzas E. U.
2-8 C
PAF /
Cabina de flujo
CF: 19-02-08
CF: 19-02-08
NE
Interpharm de
Colombia Ltda.
laminar
OHAUS /
Balanza
M:06-08-08
M: 06-02-09
700-800
Tecnibsculas y
balanzas E. U.
mecnica
CARL ZEISS
Microscopio
M:05-03-08
M: 05-03-09
JENA /
Tecnibasculas y
balanzas E. U.
BINOCULAR
M: 06-08-08
pH-metro
M: 06-02-09
SCHOTT / CG
Tecnibsculas y
balanzas E. U.
820
Para evaluar la prueba de esterilidad del agar chromocult, se escoge el 10% del medio
o
46
CARACTERSTICAS MACROSCPICAS EN
AGAR CHROMOCULT
Colonias pequeas, con
pigmentacin
morada
Escherichia coli
GAL.
Enterobacter aerogenes
Salmonella typhimurium
6.3.3.
ENSAYOS
Cabina
M
HyL
0
rea
M
HyL
Max
Max
12
12
SUPERFICIE UFC/25cm 2
Pared
Cabina
Recuentos
M
HyL
M
HyL
0
ANALISTA UFC/placa
Guantes
Guantes
Inicio
M
HyL
Final
M
HyL
Max
Max
Max
Max
Max
Max
12
12
Ensayo 1
Ensayo 2
1H
0
1
BG-
Ensayo 3
Ensayo 4
Ensayo 5
Ensayo 6
Ensayo 7
Ensayo 8
Ensayo 9
Ensayo 10
0
2
BG-
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
CUMPLE
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
47
M: bactrias mesfilas
L: Levadura
H: hongo
BG+: Bacilos Gram positivos
Especificacin
Ensayo 1
Ensayo 2
Ensayo 3
Ensayo 4
Ensayo 5
Ensayo 6
Ensayo 7
Ensayo 8
Ensayo 9
Ensayo 10
CUMPLE
HyL
rea
M
SUPERFICIE
ANALISTA
UFC/25cm2
UFC/placa
Pared
Guantes Guantes
Cabina Recuentos
Inicio
Final
HyL
HyL
Max Max
12
12
HyL
HyL
HyL
12
1H
0
1
BG-
0
1
BG-
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
M: bactrias mesfilas
L: Levadura
H: hongo
BG+: Bacilos Gram positivos
48
6.4.
MTODO
Los resultados del control negativo en la prueba, fueron satisfactorios, debido a que en
ningn anlisis realizado se presento crecimiento.
Tabla 19. Resultados control negativo. Analista 1
Muestras
Recuentos
UFC/100ml
10
Recuentos
UFC/100ml
10
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 1, para el ensayo de la
solucin prueba mas E. coli ATCC 8739, comparados con los resultados de la prueba estndar
(agua estril), tambin llamada control positivo
49
Replica
de prueba
Solucin
Prueba
de prueba
estandar
Porcentaje de
recuperacin
(%)
Desviacin
estndar
Coeficiente de
variacin
100
2.5
7.0
97
1.1
3.0
UFC/100ml
UFC/100ml
1
2
3
Promedio
1
2
3
Promedio
32
29
34
32
30
32
30
31
34
31
31
32
35
32
30
32
1
2
3
Promedio
28
27
31
29
31
33
30
31
92
2.0
6.0
1
2
3
Promedio
29
28
30
29
31
30
29
30
93
1.0
3.0
1
2
3
Promedio
31
29
28
29
28
29
30
29
100
1.5
5.0
1
2
3
Promedio
16
17
18
17
18
18
19
18
94
1.0
5.0
1
2
3
Promedio
30
31
28
30
31
33
29
31
97
1.5
5.0
1
2
3
Promedio
29
27
30
29
30
30
31
30
97
1.5
5.0
1
2
3
Promedio
30
31
29
30
31
33
29
31
97
1.0
3.0
31
33
10
2
3
Promedio
33
32
32
33
35
33
97
1.0
3.0
Tabla 21. Comparativo del porcentaje de recuperacin E.coli ATCC 8739 en la solucin de
prueba y prueba estndar
50
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 1, para el ensayo de la
solucin prueba mas Enterobacter aerogenes ATCC 13048, comparados con los resultados
de la prueba estndar (agua estril), tambin llamada control positivo.
51
Replica
Solucin de
Prueba
prueba
estndar
Porcentaje de
recuperacin
(%)
Desviacin
estndar
Coeficiente de
variacin
UFC/100ml
UFC/100ml
1
2
3
Promedio
1
2
3
Promedio
29
30
28
29
31
27
29
29
30
35
33
33
31
30
32
31
88
1.0
3.4
93
2.0
6.8
1
2
3
Promedio
30
25
28
28
30
30
31
30
93
2.5
10
1
2
3
Promedio
28
27
28
28
30
31
28
30
93
0.5
1.7
1
2
3
Promedio
29
29
27
28
32
29
28
30
93
1.1
3.9
1
2
3
Promedio
29
29
30
29
30
30
30
30
96
0.5
1.7
1
2
3
Promedio
32
30
29
30
36
35
30
33
90
1.5
5.0
1
2
3
Promedio
31
27
29
29
33
30
30
31
93
2.0
6.8
1
2
3
Promedio
30
26
29
28
30
29
30
30
93
2.0
7.0
29
33
10
2
3
Promedio
30
29
29
31
29
31
93
0.5
1.7
de prueba
52
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 1, para el ensayo de la
solucin prueba mas Salmonella typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados
de la prueba estndar (agua estril), tambin llamada control positivo.
53
Replica
Solucin
Prueba
de prueba
estndar
Desviacin
estndar
Coeficiente de
variacin
UFC/100ml
UFC/100ml
1
2
3
Promedio
1
2
3
Promedio
26
27
29
27
29
30
27
29
31
29
33
31
29
31
33
31
87
1.5
5.5
93
1.5
5.0
1
2
3
Promedio
27
29
28
28
31
30
29
30
93
1.0
3.5
1
2
3
Promedio
29
27
28
28
31
29
30
30
93
1.0
3.5
1
2
3
Promedio
30
29
27
29
30
29
28
29
100
1.5
5.0
1
2
3
Promedio
26
29
28
28
29
31
29
30
93
1.5
5.0
1
2
3
Promedio
27
29
28
28
30
32
29
30
93
1.0
3.5
1
2
3
Promedio
25
27
29
27
27
29
32
29
93
2.0
7.4
1
2
3
Promedio
29
26
26
27
30
31
28
30
90
1.7
6.2
26
30
10
2
3
Promedio
30
29
28
31
27
29
96
2.0
7.0
de prueba
Porcentaje de
recuperacin
(%)
54
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 2, para el ensayo de la
solucin prueba ms E.coli ATCC 8739, comparados con los resultados de la prueba estndar
(agua estril), tambin llamada control positivo
55
Replica
de prueba
Solucin de
Prueba
prueba
estndar
UFC/100ml
UFC/100ml
1
2
3
Promedio
1
2
3
Promedio
35
29
29
31
26
29
30
28
31
32
30
31
32
35
34
34
1
2
3
Promedio
29
29
30
29
30
32
30
31
1
2
3
Promedio
29
29
28
29
30
29
28
29
1
2
3
Promedio
10
1
2
3
Promedio
27
28
29
28
18
19
19
19
Porcentaje de
recuperacin
(%)
Desviacin
estndar
Coeficiente
de variacin
100
3.4
10.9
82
2.0
7.1
93
0.5
1.7
100
0.5
1.7
93
1.0
3.5
95
0.5
2.6
97
1.0
3.4
93
2.0
7.1
100
1.0
7.1
94
1.5
5.0
29
29
31
30
18
20
21
20
1
2
3
Promedio
29
28
30
29
30
29
32
30
1
2
3
Promedio
26
30
29
28
29
29
31
30
1
2
3
Promedio
29
30
28
29
30
30
28
29
30
32
2
3
Promedio
29
32
30
33
30
32
56
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 2, para el ensayo de la
solucin prueba mas Enterobacter aerogenes ATCC 13048, comparados con los resultados
de la prueba estndar (agua estril), tambin llamada control positivo
57
Replica
de prueba
Solucin
Prueba
de prueba
estndar
UFC/100ml
UFC/100ml
1
2
3
Promedio
1
2
3
Promedio
28
31
30
30
29
27
29
29
32
32
34
33
30
31
33
31
1
2
3
Promedio
26
30
27
28
30
32
29
30
1
2
3
Promedio
1
2
3
Promedio
29
29
27
28
30
26
27
28
36
35
30
34
1
2
3
Promedio
29
28
30
29
30
32
33
32
10
1
2
3
Promedio
29
29
28
29
Coeficiente de
variacin
91
1.5
5.0
93
1.1
3.7
90
2.0
7.1
1.1
4.0
96
2.0
7.1
91
2.0
6.4
91
1.0
3.4
93
31
28
29
29
32
33
29
31
31
31
29
30
Desviacin
estndar
30
29
30
30
1
2
3
Promedio
1
2
3
Promedio
Porcentaje de
recuperacin
(%)
33
33
31
32
94
1.1
3.6
93
0.5
1.7
93
1.1
3.7
32
30
32
31
29
30
2
3
Promedio
27
29
29
33
30
31
58
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 2, para el ensayo de la
solucin prueba mas Salmonella typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados
de la prueba estndar (agua estril), tambin llamada control positivo.
59
Replica
de prueba
Solucin de
Prueba
prueba
estndar
UFC/100ml
UFC/100ml
1
2
3
Promedio
35
28
27
30
31
33
34
33
1
2
3
Promedio
26
28
29
28
31
30
34
32
1
2
3
Promedio
27
28
28
28
30
31
29
30
1
2
3
Promedio
27
26
29
27
30
27
31
29
1
2
3
Promedio
29
26
30
28
29
28
30
29
1
2
3
Promedio
27
29
30
29
28
30
32
30
10
1
2
3
Promedio
1
2
3
Promedio
28
29
30
29
33
30
29
31
Porcentaje de
recuperacin
(%)
Desviacin
estndar
Coeficiente de
variacin
91
4.3
14.3
87
1.5
5.3
93
0.5
1.7
93
1.5
5.5
96
2.0
7.1
97
1.5
5.1
85
1.0
3.4
97
2.0
6.4
93
1.1
3.7
97
0.5
2.5
32
35
34
34
34
32
31
32
1
2
3
Promedio
30
30
28
29
30
33
29
31
29
29
2
3
Promedio
29
30
29
32
30
30
60
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 1, para el ensayo de
recuentos combinados, en donde se adicion al agua potable 0.5 ml de la dilucin 3x10
-8
(30 UFC/ml) de Escherichia coli ATCC 8739 y 0.5 ml de la dilucin 3x10-8 de Salmonella
typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados de la prueba estndar (agua estril),
tambin llamada control positivo
61
Replica
Solucin de
de prueba
Prueba
prueba
estndar
E. coli
UFC/100ml
Recuento
S. typhimurium
UFC/100ml
Control (+)
UFC/100ml
UFC/100ml
1
2
3
Promedio
12
10
14
12
34
31
31
32
14
15
12
13
31
29
33
31
1
2
3
Promedio
15
17
12
14
35
32
30
32
12
14
11
12
29
31
33
31
1
2
3
Promedio
7
6
7
6
31
33
30
31
13
12
11
12
31
30
29
30
1
2
3
Promedio
15
13
10
12
31
30
29
30
16
14
12
14
31
29
30
30
1
2
3
Promedio
13
12
14
13
28
29
30
29
15
12
14
13
30
29
28
29
1
2
3
Promedio
15
12
13
13
18
18
19
18
12
16
14
14
29
31
29
30
1
2
3
Promedio
15
13
14
14
31
33
29
31
13
14
12
13
30
32
29
30
1
2
3
Promedio
12
16
15
14
30
30
31
30
15
12
11
12
27
29
32
29
1
2
3
Promedio
13
14
12
13
31
33
29
31
13
15
13
13
30
31
28
30
14
33
12
30
10
2
3
Promedio
15
11
13
33
35
33
14
11
12
31
27
29
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 1, para el ensayo de
recuentos combinados, en donde se adicion al agua potable 0.5 ml de la dilucin 3x10-8
-8
de
Salmonella typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados de la prueba estndar
(agua estril), tambin llamada control positivo.
62
Replica
Solucin de
de prueba
prueba
E. aerogenes
Prueba
estndar
UFC/100ml
Recuento
S. typhimurium
UFC/100ml
Control (+)
UFC/100ml
UFC/100ml
1
2
3
Promedio
14
12
16
14
30
35
33
33
16
13
15
14
31
29
33
31
1
2
3
Promedio
12
14
13
13
31
30
32
31
13
14
12
13
29
31
33
31
1
2
3
Promedio
12
14
14
13
30
30
31
30
16
15
16
15
31
30
29
30
1
2
3
Promedio
12
11
15
12
30
31
28
30
15
16
14
15
31
29
30
30
1
2
3
Promedio
12
14
11
12
32
29
28
30
16
15
15
15
30
29
28
29
1
2
3
Promedio
12
12
11
11
30
30
30
30
13
12
15
13
29
31
29
30
1
2
3
Promedio
14
13
13
13
36
35
30
33
12
13
11
12
30
32
29
30
1
2
3
Promedio
16
12
13
13
33
30
30
31
14
12
15
13
27
29
32
29
1
2
3
Promedio
17
13
12
14
30
29
30
30
13
16
11
13
30
31
28
30
13
33
13
30
12
14
10
2
3
Promedio
31
29
31
12
14
13
31
27
29
13
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 1, para el ensayo de
recuentos combinados, en donde se adicion al agua potable 0.5 ml de la dilucin 3x10
-8
63
Replica
de prueba
Solucin de
prueba
E. aerogenes
Prueba
estndar
UFC/100ml
Recuento
E. coli
UFC/100ml
Control (+)
UFC/100ml
UFC/100ml
1
2
3
Promedio
12
16
14
14
30
35
33
33
13
15
13
13
34
31
31
32
1
2
3
Promedio
12
13
14
13
31
30
32
31
11
13
13
12
35
32
30
32
1
2
3
Promedio
12
15
12
13
30
30
31
30
9
7
8
8
31
33
30
31
1
2
3
Promedio
15
16
14
15
30
31
28
30
12
10
14
12
31
30
29
30
1
2
3
Promedio
10
10
10
10
32
29
28
30
15
16
14
15
28
29
30
29
1
2
3
Promedio
12
10
14
12
30
30
30
30
13
11
14
12
18
18
19
18
1
2
3
Promedio
8
10
9
9
36
35
30
33
12
12
15
13
31
33
29
31
1
2
3
Promedio
12
15
11
12
33
30
30
31
12
15
15
14
30
30
31
30
1
2
3
Promedio
13
12
14
13
30
29
30
30
12
13
13
12
31
33
29
31
11
33
11
33
10
2
3
Promedio
14
15
13
31
29
31
10
13
11
33
35
33
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 2, para el ensayo de
recuentos combinados, en donde se adicion al agua potable 0.5 ml de la dilucin 3x10
-8
(30 UFC/ml) de Escherichia coli ATCC 8739 y 0.5 ml de la dilucin 3x10-8 de Salmonella
typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados de la prueba estndar (agua estril),
tambin llamada control positivo.
64
Replica
Solucin de
de prueba
Prueba
prueba
estndar
E. coli
UFC/100ml
Recuento
S. typhimurium
UFC/100ml
Control (+)
UFC/100ml
UFC/100ml
1
2
3
Promedio
13
10
12
12
31
32
30
31
16
14
13
10
31
33
34
33
1
2
3
Promedio
12
11
14
12
32
35
34
34
15
12
11
13
31
30
34
32
1
2
3
Promedio
12
15
13
13
30
32
30
31
14
13
15
14
30
31
29
30
1
2
3
Promedio
15
17
13
15
30
29
28
29
14
13
11
13
30
27
31
29
1
2
3
Promedio
12
14
12
13
29
29
31
30
16
15
12
14
29
28
30
29
1
2
3
Promedio
13
12
15
13
18
20
21
20
14
12
10
12
28
30
32
30
1
2
3
Promedio
10
10
13
11
30
29
32
30
12
15
14
14
32
35
34
34
1
2
3
Promedio
13
12
14
13
29
29
31
30
13
12
15
13
34
32
31
32
1
2
3
Promedio
13
16
11
13
30
30
28
29
14
12
15
14
30
33
29
31
12
32
11
29
10
2
3
Promedio
15
10
12
33
30
32
14
14
13
32
30
30
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 2, para el ensayo de
recuentos combinados, en donde se adicion al agua potable 0.5 ml de la dilucin 3x10-8
(30 UFC/ml) de Enterobacter aerogenes ATCC 13048 y 0.5 ml de la dilucin 3x10-8 de
Salmonella typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados de la prueba estndar
(agua estril), tambin llamada control positivo.
65
Replica
Solucin de
de prueba
prueba
E. aerogenes
Prueba
estndar
UFC/100ml
Recuento
S. typhimurium
UFC/100ml
Control (+)
UFC/100ml
UFC/100ml
1
2
3
Promedio
15
13
14
14
32
32
34
33
16
15
15
15
31
33
34
33
1
2
3
Promedio
15
17
12
15
30
31
33
31
12
10
13
12
31
30
34
32
1
2
3
Promedio
13
12
11
12
30
32
29
30
16
15
12
14
30
31
29
30
1
2
3
Promedio
15
13
11
13
30
29
30
30
14
12
13
13
30
27
31
29
1
2
3
Promedio
14
12
10
12
31
28
29
29
13
16
10
13
29
28
30
29
1
2
3
Promedio
10
12
11
11
36
35
30
34
14
10
11
12
28
30
32
30
1
2
3
Promedio
13
15
12
13
30
32
33
32
12
14
13
13
32
35
34
34
1
2
3
Promedio
12
15
10
12
33
33
31
32
12
14
11
12
34
32
31
32
1
2
3
Promedio
12
14
13
13
32
30
32
31
13
11
10
11
30
33
29
31
15
30
14
29
10
2
3
Promedio
12
14
14
33
30
31
15
11
13
32
30
30
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 2, para el ensayo de
recuentos combinados, en donde se adicion al agua potable 0.5 ml de la dilucin 3x10-8
-8
de
Escherichia coli ATCC 8739, comparados con los resultados de la prueba estndar (agua
estril), tambin llamada control positivo.
66
Replica
de prueba
Solucin de
prueba
E. aerogenes
Prueba
estndar
UFC/100ml
Recuento
E. coli
UFC/100ml
Control (+)
UFC/100ml
UFC/100ml
1
2
3
Promedio
15
13
14
14
32
32
34
33
16
14
15
15
31
32
30
31
1
2
3
Promedio
15
17
12
15
30
31
33
31
12
15
10
12
32
35
34
34
1
2
3
Promedio
13
12
11
12
30
32
29
30
14
15
12
14
30
32
30
31
1
2
3
Promedio
15
13
11
13
30
29
30
30
14
12
13
13
30
29
28
29
1
2
3
Promedio
14
12
10
12
31
28
29
29
16
16
14
15
29
29
31
30
1
2
3
Promedio
10
12
11
11
36
35
30
34
14
10
13
12
18
20
21
20
1
2
3
Promedio
13
15
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13
30
32
33
32
12
14
13
13
30
29
32
30
1
2
3
Promedio
12
10
15
12
33
33
31
32
15
12
11
13
29
29
31
30
1
2
3
Promedio
14
12
10
12
32
30
32
31
13
10
14
12
30
30
28
29
15
30
12
32
10
2
3
Promedio
12
10
12
33
30
31
10
15
12
33
30
32
67
Fuente: Autor
Fuente: Autor
68
Fuente: Autor
FIGURA 22. Solucin de prueba: E. coli en agar chromocult
Fuente: Autor
FIGURA 23. Solucin de prueba: S. typhimurium en agar chromocult
69
7. DISCUSIN DE RESULTADOS
70
crecimiento demostr que el medio de cultivo (agar chromocult) contiene los nutrientes
necesarios para el desarrollo y crecimiento de coliformes totales y fecales debido a que
se obtuvo una recuperacin mayor
inoculados; (tablas 21- 26) esto concuerda con lo establecido en la USP 31 (Seccin
1227 validacin de mtodos de neutralizacin comparaciones de recuperacin), en la
que se detalla claramente que el numero de UFC recuperadas del producto (para
nuestro caso muestras de agua) no debe ser menor del 70% del numero recuperado del
control del inoculo (prueba estndar control positivo); por otro lado como se puede ver
en cada una de las figuras los limites oscilan entre 50 y 200, debido a que segn la
USP 31 en su capitulo 61
Igualmente, al inocular las cepas ATCC sobre el agar chromocult se obtuvieron las
caractersticas macroscpicas tpicas de cada una (Ver tabla No 16) y tambin se realiz
coloraciones de Gram a las colonias para evaluar las caractersticas microscpicas.
Adems, el crecimiento de los microorganismos se obtuvo en un tiempo de 24 horas, de
esta manera, se establece que los medios cromognicos poseen una ventaja sobre los
medios tradicionales, debido a que la deteccin de coliformes totales y fecales se obtiene
de una manera rpida (M.A YANEZ et al., 2005); esto gracias a que los sustratos que
presenta el medio son los especficos para que las enzimas que presentan tanto E.coli
como Enterobanter aerogenes, sean escindidos y de esta manera se puede, se produzca
un reaccin rpida y sensible (Rompre,A et al., 2001).
En los ensayos estndar (control positivo) del mtodo de recuento para coliformes
fecales, (Escherichia coli ATCC 8739), coliformes totales (Enterobacter aerogenes ATCC
13048) y Salmonella typhimurium ATCC 14028, la recuperacin de los microorganismos
fue de 16-36 UFC/100ml, tal como se puede ver en las tablas 21 26,
donde se
compara la prueba estndar y la solucin de prueba. Cabe destacar que para la prueba
estndar, el vehculo de transporte de los microorganismos evaluados fue agua estril
71
para inyeccin,
interferencia (como cloro u otros elementos) que impida el crecimiento, lo que nos
llevara a reportar falsos positivos y para la solucin de prueba se utiliz agua potable.
Debido a que validar es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de
evidencia documentada que un proceso especifico producir
de forma consistente
productos que reunirn las caractersticas de calidad predefinidas (CORTES, 2002; FDA,
1987) para tal fin, se identificaron los factores que influyen en la validez de la prueba y
los pasos a seguir para el desarrollo de la validacin del mtodo de filtracin por
membrana empleado para la deteccin de coliformes totales y fecales en agar
chromocult para agua potable, en donde se emple una serie de datos para determinar
que realmente es eficaz y se obtienen resultados confiables; para esto se evaluaron
parmetros cuantitativos de validacin como: especificidad, precisin (repetitividad y
reproducibilidad), y exactitud.
La especificidad se obtuvo al comparar las medias y los datos del porcentaje de
recuperacin entre la prueba estndar y la solucin de prueba, para el recuento de
coliformes fecales (Escherichia coli ATCC 8739 ), el porcentaje de recuperacin es de
96.4%; para el recuento de coliformes totales (Enterobacter aerogenes ATCC 13048) es
del 92.5% y para Salmonella typhimurium ATCC 14028 el porcentaje de recuperacin es
de 93.7%; los resultados anteriormente obtenidos concuerdan con los obtenidos en el
estudio de MAHEUX. A. et al. (2008), en el cual se obtuvieron porcentajes de
recuperacin para E .coli semejantes, por tanto se puede concluir que la recuperacin
de los coliformes fecales fue mayor que la de los otros dos microorganismos, lo anterior
se debe a que Escherichia coli es la nica especie dentro de las enterobacterias que
presenta la enzima B-D- Glucoronidasa, que degrada el sustrato 4-metilumberiferil--Dglucornico (MUG) y el contenido de triptfano revela la reaccin de indl y aumenta con
ello la identificacin, en combinacin con la reaccin X-GAL y la reaccin MUG, siendo
esta una ventaja para el crecimiento de este microorganismo.
Los porcentajes de recuperacin anteriormente citados son reportados gracias a los
recuentos de colonias obtenidos por el conteo de colonias caractersticas para cada
especie gracias al color que tomaron las colinas, para este estudio la cepa de
Enterobacter aerogenes que fue el coliforme total seleccionado, tomo una coloracin
rosada roja; la colonia de E. coli tomo una coloracin azul-violeta y la colonia de
Salmonella typhimurium tomo una coloracin blanca, esto concuerda con los resultados
encontrados en el estudio realizado por
72
coliformes totales solo pueden escindir uno de los sustratos, mientras que E. coli puede
escindir los dos sustratos.
Segn la USP 31, 2008 la repetibilidad es la medida de la precisin del mtodo cuando
ste se realiza por el mismo analista, el mismo da, mismos reactivos y mismo
instrumento, y la reproducibilidad se mide cuando el ensayo se realiza por diferentes
analistas, diferentes das y diferentes instrumentos, por lo tanto estos parmetros nos
indican la precisin del mtodo de recuento, la cual se mide con la dispersin de la
medida alrededor de un valor medio o central y mide la concordancia entre ensayos
individuales cuando el mtodo se aplica repetidas veces a muestras separadas e
idnticas, obtenidas del mismo lote de material homogneo ( en este caso muestras de
agua potable obtenidas de la misma fuente, la llave del rea de lavado del laboratorio).
De esta manera y de acuerdo a los resultados se determinaron los valores de las
medias, las desviaciones estndar y los coeficientes de variacin obtenidos en cada una
de los ensayos y con cada uno de los analistas.
Al establecer la reproducibilidad y la repetibilidad del mtodo, se demuestra que no hay
diferencia significativa entre los valores de las medias obtenidas por cada analista y
microorganismos evaluados, ni tampoco hay diferencia entre los valores de las medias
de cada analista, lo que muestra que el mtodo evaluado es reproducible y repetible, y
que los resultados no van a diferir si los mtodos son realizados por el mismo analista el
mismo da o por analistas diferentes en das diferentes.
De igual manera segn los resultados obtenidos de las medias determinadas por cada
muestra de agua y microorganismo, se establece que el mtodo es preciso (Tablas 21 26).
73
lado el coeficiente de variacin nunca supera un valor de 10, lo cual es un valor aceptado
y utilizado en la industria farmacutica (Tablas 21 - 26).
74
8. CONCLUSIONES
DE
COLIFORMES
TOTALES
FECALES
EN
AGAR
CHROMOCULT.
75
9. RECOMENDACIONES
76
77
GUA TCNICA COLOMBIANA 84. 2003. Calidad del Agua. Gua para la
orientacin acerca de la validacin de los Mtodos de Anlisis Microbiolgicos.
ICONTEC. Instituto colombiano de normas Tcnicas y Cientficas.
HOPKINS K.L AND HILTON A.C. 2000. Methods available for the sub-typing of
Escherichia coli 0157. Word J. Microbiol. Biotechol, 16.741-748
78
ISO/ TR 13843: 2000. Calidad del agua Guia para la validacin de mtodos
microbiolgicos.
ISO\TS 11133-2:2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs -Guidelines on preparation and production of culture media -- Part 2: Practical
guidelines on performance testing of culture media
2006.
MAHEUX. A.; HUPP. V.; BOISSINOT. M.; PICARD. F.; BISSONNETTE. L.;
BERNIER. J. and Bergeron. M. 2008. Analytical limits of four -glucuronidase
and -galactosidase-based commercial culture methods used to detect
Escherichia coli and total coliforms. Journal of Microbiological Methods 75. 506
514
Ministerio de la Proteccin Social. 2007 Decreto 1575. Por medio del cual se
establece el sistema de la proteccin y control de la calidad del agua para
consumo humano.
79
Moreno,
C.
2004.
http://www.britanialab.com/esp/productos/b04/chromobit.htm
[Consulta: 21 abril. 2008].
http://www.edustatipr.com/proyectos/inv97-98-11-3.pdf [Consulta: 18
octubre. 2008].
Guas para la
Nacional
de
Medicamentos
FDA,
Guatemala.
<http://www.paho.org/Spanish/AD/THS/EV/bpm-validacion-
80
81
11. ANEXOS
Agar Casoy: peptona de casena 15g, peptona de harina de soya 5g, cloruro
sdico 5g, agar-agar 15g.
82