Tesis Detergentes

VALIDACIÓN DEL MÉTODO DE DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN
AGUA POTABLE UTILIZANDO AGAR CHROMOCULT
AUTORES:
ELISA MARCELA CARRILLO ZAPATA
AURA MARÍA LOZANO CAICEDO
TRABBAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar el titulo de
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTA D.C. DICIEMBRE DE 2008
NOTA DE ADVERTENCIA:
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral
católica y por qué las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien
se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”
AUTORES
APROBADO
DRA. JEINNY ROMERO TORRES DRA. JANETH ARIAS PALACIOS

Microbióloga Industrial Bacterióloga MSc
DIRECTOR ASESOR
_
CINDY MARLENE FERNANDEZ ZULMA VALBUENA
Microbiologa industrial Bacteriologa
JURADO JURADO
AUTORES:
APROBADO
INGRID SCHULER JANETH ARIAS

Bióloga, Ph D. Bacterióloga, Msc.
DECANA ACADEMICA DIRECTORA CARRERAS
MICROBIOLOGIA
DEDICATORIA
A Dios, porque nunca nos abandono en el largo andar de nuestro aprendizaje, porque
cuando mas necesitamos de su ayuda, el estuvo allí, sosteniéndonos entre sus brazos
para que no nos doliera el caminar en los momentos difíciles.
A nuestras familias porque gracias a su eterno amor para cada una de nosotras, llenaron
nuestros corazones de fortaleza para que este largo andar, se hiciera mas corto y
placentero; por su apoyo incondicional sin importar las circunstancias, porque pece a
todos los momentos vividos, siempre están presentes para brindarnos el amor que
reconforta nuestro ser.
Aura y Marcela
A mi padre que esta en el cielo porque mientras estuvo a mi lado fue un ejemplo de
sabiduría y superación, un apoyo incondicional, un padre lleno de esperanza y amor
para conmigo y porque ahora que esta en el cielo se que desde allí ilumina todos mis
caminos, ayudándome a seguir siempre por el mejor y porque se que este donde este
siempre velara mis sueños.
Aura M
AGRADECIMIENTOS
A Dios por acompañarnos siempre y por estar a nuestro lado en los buenos y malos momentos.
A la Dra. Janeth Arias, asesora, por su entrega, compromiso, comprensión y apoyo

incondicional.
Al Dr. Juan Carlos Jiménez, Director Administrativo de INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.,

por brindarnos la oportunidad de compartir en su empresa los conocimientos adquiridos y por
el préstamo de las instalaciones y recursos económicos para llevar a cabo este trabajo de
grado.
A la Dra. Jeinny Romero, nuestra directora por aceptar guiarnos en la realización de este
trabajo, por llenarse de paciencia, por transmitirnos su conocimiento y experiencia, por ser mas
que una amiga, por su colaboración y apoyo durante el desarrollo de este trabajo.
A INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda., especialmente al área de microbiología, a Diana,

Consuelo y Zamaira por su colaboración y apoyo.
RESUMEN
La validación realizada en este trabajo de grado tuvo como propósito utilizar el agar Chromocult,
como método alternativo en la detección de microorganismos indicadores de la calidad del agua
potable, gracias a su fácil manejo y rápida recuperación para reducir costos y desarrollar
procedimientos con mayor eficacia y seguridad en el laboratorio INTHERPHARM DE COLOMBIA
Ltda, basados en la USP 31, realizando un análisis que garantice resultados confiables y la
disminución de los riesgos de reanálisis que aumentan el tiempo de análisis y los costos.
Se realizó una revisión y recopilación bibliográfica, para obtener toda la información necesaria y se
verificó que el programa de calibración y mantenimiento de los equipos, estuviera vigente, para de
esta manera poder garantizar el procedimiento realizado y los resultados obtenidos. Luego se
realizaron pruebas preliminares en donde se llevo a cabo la estandarización de los inóculos,
realizando diluciones de un cultivo de 24 horas y comparando con el tubo 1 de la escala de Mac
farland para E.coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Enterobacter aerogenes
ATCC 13048, posteriormente se estandarizó la técnica filtración por membrana con tres muestras
de tres replicas cada una y después de obtener los resultados esperados (30 UFC\ml
aproximadamente) se realizó la metodología para la validación de la técnica filtración por membrana,
analizando diez muestras de agua potable diferentes, con tres replicas para cada una, mediante
las cuales se realizaron recuentos de cada uno de los microorganismos con los cuales fueron
contaminadas las muestras de agua, bajo condiciones alternadas, variando los analistas y los días
de análisis; se llevo acabo el análisis de una prueba estándar (agua estéril para inyección, inoculada
con cada uno de los microorganismos a evaluar Escherchia coli ATCC 8739, Salmonella
typhimurium ATCC 14028 y Enterobacter aerogenes ATCC 13048), una solución de prueba (agua
potable inoculada con los microorganismos utilizados como prueba: Escherchia coli ATCC 8739,
Salmonella typhimurium ATCC 14028 y Enterobacter aerogenes ATCC 13048), un control negativo
(agua potable con tiosulfato de sodio al 1% y sin inocular) y una prueba combinando la muestra de
agua con los microorganismos a evaluar (agua potable + Escherchia coli ATCC 8739 + Salmonella
typhimurium ATCC 14028; agua potable + Escherichia coli ATCC 8739 + Enterobacter aerogenes
ATCC: 13048; agua potable + Escherichia coli ATCC 8739 + Enterobacter aerogenes ATCC 13048
) de esta manera se obtuvieron, 30 recuentos por día para un total de 300 recuentos por analista,
por lo tanto se obtuvieron 600 datos en total, por los dos analistas, luego de obtener todos los datos,
se procedió a realizar el análisis y se determinaron los parámetros cuantitativos para la validación
del método.
La metodología se llevo a cabo con muestras de agua potable, provenientes del acueducto de
Bogotá que cumplen con las especificaciones descritas según la resolución 2115 de 2007
Finalmente se logro concluir que el método es reproducible y repetible, también se logro establecer
que el método es especifico para la demostración de coliformes Fecales, debido a que para este
grupo de microorganismos indicadores se logro obtener un porcentaje de recuperación superior al
96%, comparado con los otros microorganismos.
ABSTRACT
The corroboration undertook in this examination paper pretended to utilize the agar chromocult
as an alternative method in the detection of indicating micro-organisms of drinking water’s
quality thanks to its handling capability and short period ability to recuperate in order to reduce
costs and to develop more efficient and safer procedures at INTHERPHARM DE COLOMBIA
Ltda. laboratories, based on the USP 31, and developing the montage which warranties reliable
results and a decrease in repetition risks which generate an increase in analysis time and costs.
As a start up, a bibliographic revision and compilation took place in order to obtain the required
amount of information. The tune-up and maintenance of the equipment was also verified aiming
to warranty the undertook procedure and the obtained results. Then, some preliminary testing
were developed for the standardization of the inocules, also effecting dilutions of a 24 hours’
crop with Pipe 1 of Mac Falrland’s scale for E.coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC:
14028, Enterobacter aerogenes ATCC: 13048. Later, the set up of the membrane filtration
technique was standardised analyzing ten different samples of drink water with three replicas
for each one in which it was determined the keeping of the contaminating micro-organisms in
the membrane filters with a pore size of 0.45um under alternated conditions, with variation of
annalists and days; it also took place the analysis of and standard test (sterilized water,
inoculated with each of the micro-organisms to be evacuated Escherchia coli, Salmonella
typhimurium y Enterobacter aerogenes), a test solution (drinking water inoculated with the
micro-organisms used for the test Escherchia coli, Salmonella typhimurium y Enterobacter
aerogenes ), a negative control (Drinking water with 1% thiosulfate without inoculation) and a
test combining the sample water with the micro-organisms to be examined (drinking water +
Escherchia coli + Salmonella typhimurium; drinking water + Escherichia coli + Enterobacter
aerogenes; drinking water + Escherichia coli + Enterobacter aerogenes ) in which way 30
recounts were obtained for an aggregated amount of 310 recounts per analyst, amounting to a
total data of 620, between the two analysts. After obtaining all the data, the next step consisted
in determining the quantitative parameters for the validation of the method.
The methodology was undertaken with drinking water samples taken from Bogota’s water
purification plant which follow the specifications prescribed by Resolution 2115/07. Finally, it
was possible to conclude that the utilized method is reproducible and repeatable; in addition, it
was ascertained that the method is specific for the demonstration of fecal coliforms, ought to the
fact that for this group of indicating micro-organisms it was possible to obtain a recuperation
percentage superior to 96%, compared with other micro-organisms.
TABLA DE CONTENIDO
PAG.
1. INTRODUCCIÓN.................................................................................................................... 1
2. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA..............................................................2
2.1. AGUA POTABLE..................................................................................................... 2
2.1.1 Características del agua potable..............................................................3
2.1.2. Análisis microbiológico del agua..............................................................3
2.1.3. Proceso de potabilización del agua..........................................................4
2.1.3.1 Inactivación del cloro en el agua potable...................................4
2.2. MICROORGANISMOS INDICADORES DE LA CALIDAD DEL AGUA..................5
2.2.1. Coliformes Totales....................................................................................5
2.2.1.1. Enterobacter aerogenes...........................................................6
2.2.2. Coliformes Fecales..................................................................................7
2.2.2.1. Escherichia coli.........................................................................8
2.2.3. Salmonella spp....................................................................................................9
2.3. TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA DETECCIÓN DE COLIFORMES
TOTALES Y FECALES....................................................................................................... 10
2.3.1. Filtros de membrana......................................................................................11
2.3.2. Tipos de filtros de membrana.......................................................................12
2.3.2.1. Filtros de profundidad..............................................................12
2.3.2.2. Filtros de superficie o membrana..................................................12
2.3.2.2.1. Membrana de nitrato de celulosa......................13
2.3.2.2.2. Membrana de acetato de celulosa...................13
2.4. MEDIOS DE CULTIVO.......................................................................................... 14
2.4.1. Medios cromógenos...............................................................................15
2.4.1.1. Medio Chromocult para Coliformes.........................................15
2.4.1.2. Ventajas de los medios cromógenos frente a los
convencionales.....................................................................................16
2.5. VALIDACIÓN......................................................................................................... 16
2.5.1. Parámetros de desempeño de la validación...........................................17
2.5.1.1. Especificidad............................................................................17
2.5.1.2. Eexactitud...............................................................................18
2.5.1.3. Precisión..................................................................................18
2.5.2 Datos requeridos para la validación.........................................................18
2.6. VALIDACIÓN Y SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO

MICROBIOLÓGICO.............................................................................................19
I
2.6.1. Pruebas cualitativas para detectar la presencia o
Ausencia de microorganismos.............................................................20
2.6.2. Pruebas cuantitativas para microorganismos.........................................20
2.6.3 Métodos normalizados.............................................................................21
2.6.4. Métodos desarrollados por el laboratorio................................................21
2.6.5. Métodos normalizados con modificaciones............................................21
2.7. PRERREQUISITOS DE LA VALIDACIÓN............................................................21
2.7.1. Monitoreo ambiental...............................................................................21
2.7.2. Escala de Mc Farland.............................................................................24
2.7.3. Medios de cultivo....................................................................................24
2.7.3.1. Esterilización del medio de cultivo..........................................24
2.7.3.2. Incubación..............................................................................25
2.7.3.3. Control de autoclave..............................................................25
2.7.4. Documentación......................................................................................26
2.7.5. Desarrollo del protocolo de validación....................................................26
2.7.6. Informe Final de Validación...................................................................27
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN.......................................................28
3.1. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA.......................................................................28
3.2. JUSTIFICACIÓN DEL PROBLEMA......................................................................28
4. OBJETIVOS........................................................................................................................... 29
4.1 OBJETIVO GENERAL............................................................................................ 29
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...................................................................................29
5. MATERIALES Y MÉTODOS................................................................................................. 30
5.1 DISEÑO EXPERIMENTAL................................................................................................. 30
5.2. POBLACIÓN DE ESTUDIO Y MUESTRA POBLACION DE ESTUDIO................30
5.3. VARIABLES DE ESTUDIO....................................................................................31
5.4. PRUEBAS PRELIMINARES..................................................................................32
5.4.1. Recopilación de la información.......................................................................32
5.4.2. Calibración y mantenimiento de equipos......................................................32
5.4.3. Preparación del inoculo...........................................................................32
5.4.4. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo......................................33
5.4.5. Prueba de promoción de crecimiento............................................................33
5.5.MATERIALES Y METODOS EN LA EVALUACION DE PARAMETROS
CUANTITATIVOS................................................................................................... 34
5.5.1. Materiales..........................................................................................................34
5.5.2. Microorganismos Estándar….........................................................................35
5.5.3. Métodos.............................................................................................................35
5.5.3.1. Control de ambiente, superficie y operarios….............................35
5.5.3.2. Control negativo-muestra..................................................................36
II
5.5.3.3. Prueba Estándar…............................................................................37
5.5.3.4. Solución de prueba............................................................................38
5.5.3.5. Solución de prueba combinando los microorganismos…............39
5.6. VARIABLES DE ESTUDIO....................................................................................41
5.7. RECOLECCION DE LA INFORMACION..............................................................41
5.8. ANALISIS DE LA INFORMACION........................................................................42
5.8.1. Análisis de datos.....................................................................................42
5.8.1.1. Media....................................................................................................42
5.8.1.2. Desviación Estándar..................................................................42
6. RESULTADOS...................................................................................................................... 44
6.1. ESTANDARIZACION DE LOS INOCULOS DE TRABAJO..................................44
6.2. VERIFICACION DE PROGRAMA DE CALIBRACION Y MANTENIMIENTO
DE EQUIPOS........................................................................................................ 46
6.3. PRUEBAS PRELIMINARES..................................................................................46
6.3.1. Prueba de Esterilidad de los medios de cultivo...........................................46
6.3.2. Prueba de Promoción de crecimiento............................................................47
6.3.3. Controles microbiológicos durante el proceso.............................................47
6.4.METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA PARA DETECCION DE

COLIFORMES FECALES Y TOTALES..................................................................49
6.5. RECUENTO COMBINADO DE LOS MICROORGANISMOS EVALUADOS
EN EL ENSAYO.................................................................................................... 61
7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS............................................................................................ 70
8. CONCLUSIONES.................................................................................................................. 75
9. RECOMENDACIONES.......................................................................................................... 76
10. BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................... 77
11. ANEXOS.............................................................................................................................. 82
ANEXO 1................................................................................................................................... 82
III
LISTA DE TABLAS
PAG.
TABLA 1. Características físicas del agua potable...............................................................................3
TABLA 2. Características químicas de sustancias presentes en el agua.........................................3
TABLA 3. Características microbiológicas del agua.............................................................................4
TABLA 4. Comparación de pruebas bioquímicas de E. coli y E. aerogenes...............................7
TABLA 5. Características de coliformes totales y E. coli..............................................................9
TABLA 6. Aplicaciones de los filtros de membrana............................................................................14
TABLA 7. Datos requeridos para la validación....................................................................................19
TABLA 8. Parámetros de validación por tipo de prueba microbiológica.........................................20
TABLA 9. Límites microbiológicos ambientales, área de recuentos de
INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda...............................................................................22
TABLA 10. Límites microbiológicos de superficies, área de recuentos de
INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.................................................................................23
TABLA 11. Límites microbiológicos de dotación – guantes, área de recuentos de
INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda
.................................................................................................................................
23
TABLA 12. Características morfológicas y enzimáticas de los microorganismos evaluados......41
TABLA 13. Estandarización de inóculos: Escherichia coli ATCC 8739, Enterobacter aerogenes
ATCC: 13048 y Salmonella typhimurium ATCC 14028 Analista 1.............................44
TABLA 14. Estandarización de inóculos: Escherichia coli ATCC 8739, Enterobacter aerogenes
ATCC 13048 y Salmonella typhimurium ATCC 14028 – Analista 2............................45
TABLA 15. Programa de Calibración y mantenimiento de los equipos utilizados
en la validación...................................................................................................... 46
TABLA 16. Prueba de promoción de crecimiento..............................................................................47
TABLA 17. Resultados del control microbiológico de ambiente, superficie y analista durante
los ensayos realizados. Analista 1..................................................................47
TABLA 18. Resultados del control microbiológico de ambiente, superficie y analista durante
los ensayos realizados. Analista 2..........................................................................48
TABLA 19. Resutados control Negativo. Analista 1.........................................................................49
TABLA 20. Resultados control Negativo. Analista 2........................................................................49
TABLA 21. Porcentaje de recuperación de E. coli ATCC 8739en la solución de
prueba (analista 1).................................................................................................. 50
TABLA 22. Porcentaje de recuperación de E. aerogenes ATCC: 13048 en la solución de
prueba (Analista 1)................................................................................................. 52
TABLA 23. Porcentaje de recuperación de S. typhimurium ATCC 14028 en la solución de
prueba (Analista 1)................................................................................................... 54
TABLA 24. Porcentaje de recuperación de E. coli ATCC 8739 en la solución de prueba
IV
(Analista 2).............................................................................................................. 56
TABLA 25. Porcentaje de recuperación de E. aerogenes ATCC: 13048 en la solución de

prueba (Analista 2)................................................................................................. 58
TABLA 26. Porcentaje de recuperación de S. typhimurium ATCC 14028 en la solución de
prueba (Analista 2).................................................................................................. 60
TABLA 27. Recuento de E. coli ATCC 8739 y S. typhimurium ATCC 14028 en la solución de
prueba (analista 1)................................................................................................... 62
TABLA 28. Recuento de E. aerogenes ATCC: 13048 y S. typhimurium ATCC 14028 en la
solución de prueba (Analista 1).................................................................................63
TABLA 29. Recuento de E. aerogenes ATCC: 13048 y E. coli ATCC 8739 en la solución de
prueba (analista 1)................................................................................................... 64
TABLA 30. Recuento de E. coli ATCC 8739 y S. typhimurium ATCC 14028 en la solución de
prueba (analista 2)................................................................................................... 65
TABLA 31. Recuento de E. aerogenes ATCC: 13048 y S. typhimurium ATCC 14028 en la
Solución de prueba (Analista 2)................................................................................66
TABLA 32. Recuento de E. aerogenes ATCC: 13048 y E. coli ATCC 8739 en la solución de
prueba (analista 2)................................................................................................... 67
V
LISTA DE FIGURAS
PAG.
FIGURA 1. Fuente de agua......................................................................................................................2
FIGURA 2. Enterobacter aerogenes........................................................................................... 6
FIGURA 3. E. coli en agar EMB…..........................................................................................................9
FIGURA 4. Salmonella en agar XLD....................................................................................................10
FIGURA 5. Trampa de filtración............................................................................................................11
FIGURA 6. Filtros de profundidad.........................................................................................................12
FIGURA 7. Filtros de membrana o superficie......................................................................................13
FIGURA 8. Preparación de inoculos..........................................................................................33
FIGURA 9. Diagrama de flujo de Control negativo-muestra.............................................................36
FIGURA 10. Diagrama de flujo de la Prueba estándar…..................................................................37
FIGURA 11. Diagrama de flujo de la solución de Prueba..........................................................38
FIGURA 12. Diagrama de flujo de la solución de prueba combinando los
Microorganismos.................................................................................................................40
FIGURA 13. Porcentaje de recuperación de E. coli (analista 1)................................................51
FIGURA 14. Porcentaje de recuperación de E. aerogenes (analista 1)….....................................53
FIGURA 15. Porcentaje de recuperación de S. typhimurium (analista 1)…..................................55
FIGURA 16. Porcentaje de recuperación de E. coli (analista 2)…...................................................57
FIGURA 17. Porcentaje de recuperación de E. aerogenes (analista 2)….....................................59
FIGURA 18. Porcentaje de recuperación de S. typhimurium (analista 2)…..................................61
FIGURA 19. Prueba de promoción de crecimiento de E. coli en agar chromocult........................68
FIGURA 20. Prueba de promoción de crecimiento de E. aerogenes en agar chromocult..........68
FIGURA 21. Prueba de promoción de crecimiento de S. typhimurium en agar chromocult........69
FGURA 22. Solución de prueba: E coli......................................................................................69
FIGURA 23. Solución de prueba S. typhimurium.......................................................................69
VI
VII
1. INTRODUCCIÓN
El agua es una de las principales fuentes de vida en nuestro planeta, son infinitos los
usos del agua, para consumo humano, para labores domesticas y en la industria
farmacéutica, es utilizada en las diferentes actividades como el lavado de materiales,
utensilios, áreas accesorias, de análisis, y como base para la preparación de
medicamentos y/o cosméticos, en este caso el agua debe cumplir unos estándares mas
estrictos y su sistema de purificación debe ser muy eficiente, para obtener un alto grado
de pureza y estar libre de contaminantes que puedan afectar la calidad del producto
terminado y más aún, la salud del paciente a quien se le suministren los medicamentos
elaborados. (Walter, J. 2003).
Así mismo, el agua puede ser uno de los principales transmisores de enfermedades
entéricas si se llegara a consumir en estado contaminado; entre los microorganismos
indicadores del agua potable, se pueden encontrar las bacterias del grupo coliforme,
perteneciendo a este grupo, géneros como: Escherichia coli, Enterobacter spp, Klebsiella
spp y Citrobacter spp; los cuales, generalmente se pueden encontrar en la capa
superficial del agua o en los sedimentos del fondo (OMS, 1995).
Es por esto, que los laboratorios de análisis microbiológico, buscan validar las técnicas
desarrolladas para el análisis de este tipo de aguas, que en la mayoría de los casos
buscan detectar bacterias coliformes totales y fecales, mediante la técnica de filtración
por membrana, técnica que es aceptada y utilizada a nivel nacional e internacional por
entes reguladores, debido a su fácil manejo y empleo y de esta manera contribuir a que
el agua suministrada al consumo humano sea de excelente calidad y que su sistema de
potabilización logre eliminar la mayor cantidad de organismos contaminantes que
puedan llegar a afectar la salud de los consumidores. (Walter, J. 2003).
Con el fin de cumplir con las reglamentaciones gubernamentales y ayudar a mejorar la

calidad del agua para consumo humano, en el presente trabajo de grado se realizó la
validación del método de detección de coliformes totales y fecales en agua potable
utilizando agar chromocult gracias a su fácil manejo y rápida recuperación como un
método alternativo para reducir costos y mejorar tiempos en el laboratorio INTERPHARM
DE COLOMBIA Ltda.
1
2. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA
2.1. AGUA POTABLE
Es aquella que por cumplir las características físicas, químicas y microbiológicas, es apta
para el consumo humano; se utiliza en bebida directa, en la preparación de alimentos o
en la higiene personal (Resolución 2115, 2007).
Puede provenir de distintas fuentes, incluyendo los servicios públicos de agua, un

suministro etc. El agua potable se puede usar en las primeras etapas de limpieza de los
equipos de fabricación farmacéutica y de componentes en contacto con los productos,
también es usada en la preparación de sustancias oficiales y otros ingredientes
farmacéuticos a granel (USP 31, 2007)
El peligro mas común y más difundido relativo al agua potable es el de su contaminación,

sea esta directa o indirecta, debido al efecto de aguas servidas, de otros desechos o de
las excretas del hombre o de los animales. Si dicha contaminación es reciente y entre los
factores que contribuyen a ella se hallan agentes portadores de enfermedades entéricas
transmisibles, es posible que estén presentes algunos de los organismos vivos causales
de las mismas. Beber agua contaminada o emplearla en la preparación de soluciones
puede producir mayor número de casos de infección. (OPS, 1997)
Figura 1: Fuente de agua
Fuente: quincher.wordpress.com/2008/06/30/el-agua/
2
2.1.1 Características del agua potable
El agua potable no debe contener en ningún caso microorganismos considerados

patógenos y debe estar libre de bacterias indicadoras de contaminación fecal (OPS,
1997). En el caso de plaguicidas la concentración máxima aceptable presente en el agua
deberá ser de 0.0001mg/L.
No debe contener substancias o cuerpos extraños de origen biológico, orgánico,

inorgánico o radiactivo en cantidades tales que la hagan peligrosa para la salud. Deberá
presentar sabor agradable y ser prácticamente incolora, inodora, límpida y transparente.
(Resolución 2115, 2007)
Tabla 1. Características físicas del agua potable
Fuente: Resolución 2115 de 2007
Tabla 2. Características químicas de sustancias presentes en el agua
Fuente: Resolución 2115 de 2007.
2.1.2. Análisis microbiológico del agua
Se define análisis microbiológico a cada uno de los procedimientos de laboratorio que

se efectúan a una muestra de agua para el consumo humano para evaluar la presencia o
ausencia, tipo y cantidad de microorganismos. (Resolución 2115/ 2007)
En cuanto a microorganismos indicadores, ninguna muestra de agua podrá contener
E.coli en 100cm3, independientemente del tipo de análisis utilizado. Como prueba
complementaria se recomienda realizar la determinación de microorganismos mesófilos
cuyo valor máximo será de 100 UFC/ 100cm3 (Resolución 2115, 2007).
3
Tabla 3. Características microbiológicas del agua potable
Tomado de: Resolución 2115 de 2007.
2.1.3. Proceso de potabilización del agua
El cloro fue descubierto en 1774 por el químico sueco Karl Wihellm Scheele como
producto de la reacción entre ácido hipoclorhídrico y dióxido de manganeso. Es una
sustancia tan energética y activa que solo existe en la naturaleza en combinación con
otros elementos, es aplicado en exceso de manera que pueda satisfacer la demanda
para oxidar compuestos como nitritos, iones de hierro, plomo, sulfuros y eliminar
bacterias, de manera que así se reste una cantidad de cloro residual en los ductos del
agua; parte de este cloro residual queda para continuar desinfectando el agua desde que
sale de la planta de tratamiento hasta que llega al consumidor.
Debe ser aplicado en el agua a tratar en forma gaseosa o como un sólido ionizado; al ser
adicionado al agua, este reacciona con el amoníaco y materia orgánica formando
cloraminas y compuestos órgano clorados, los cuales son reducidos a un valor mínimo y
queda como resultado el cloro residual libre (Ocasio, N et al., 2004).
Según la resolución 2115 de 2007, el valor aceptable del cloro residual en cualquier
punto de la distribución del agua potable, debe ser comprendido entre 0.3 y 2.0 mg/L.
2.1.3.1 Inactivación del cloro en el agua potable

La cloración de aguas de suministro sirve principalmente para destruir o desactivar
microorganismos que pueden causar enfermedades.
El compuesto utilizado para inactivar el cloro en el agua es el tiosulfato de sodio, el cual

esta compuesto por tiosulfato, que a su vez se compone de sales de ácido tiosulfúrico,
estables en medios con pH básico y neutro; se descomponen bajo formación de azufre
elemental, dióxido de azufre trazas de otros compuestos azufrados en presencia de
ácido (Walter, J. 2003).
4
2.2. MICROORGANISMOS INDICADORES DE LA CALIDAD DEL AGUA
Varios organismos patógenos de transmisión fecal-oral pueden estar presentes en el

agua cruda (agua natural que no ha sido sometida a proceso de tratamiento para su
potabilización), entre ellos bacterias como Salmonella sp, Shigella sp, coliformes totales
y fecales, los cuales han sido encontradas en abastecimientos de aguas. (Ocasio y
Lopez, 2004)
Las bacterias coliformes, son el principal indicador de la adecuación del agua para uso
doméstico, industrial, o de otro tipo. La experiencia ha demostrado que la densidad del
grupo de los coliformes es un indicador del grado de contaminación y por tanto, de la
calidad sanitaria (APHA - AWWA - WPCF, 2000)
Desde hace tiempo, se reconoce que los organismos del grupo coliforme son un buen
indicador microbiano de la calidad del agua potable, debido principalmente a que son
fáciles de detectar y enumerar en el agua. La presencia de E. coli en muestras de agua
potable, indica la existencia de fallas en la eficacia de tratamiento de aguas, integridad,
sistema de distribución y por tanto es una evidencia de contaminación de diferentes
orígenes: suelo, superficies de agua dulce y tracto digestivo (Organización
Panamericana de la Salud, 1987)
Cabe señalar sin embargo, que aunque se reconoce que la determinación de la

concentración de estas bacterias en el agua es un elemento crítico para determinar el
riesgo de enfermedades relacionadas al consumo de la misma, no existe una relación
simple entre el nivel de coliformes en el agua con la presencia de patógenos en la misma
y el riesgo de enfermedades. (Perdomo C.H. et al. 2001)
2.2.1. Coliformes Totales
El grupo coliforme se define como todas las bacterias Gram negativas en forma bacilar
que fermentan la lactosa a temperatura de 35 a 37 °C, produciendo ácido y gas (CO 2) en
24 horas, aerobias o anaerobias facultativas, son oxidasa negativa, no forman esporas y
presentan actividad enzimático de la B-galactosidasa (Ministerio de salud, 1998). Entre
ellos se encuentran los diferentes Escherichia coli, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella.
(Organización Panamericana de la Salud, 1987)
La prueba mas relevante utilizada para la identificación del grupo Coliformes, es la

hidrólisis de la lactosa. El rompimiento de este disacárido es catalizado por la enzima B-
5
D- Galactosidasa. Ambos monosacáridos (la galactosa después es transformada en
glucosa por reacciones bioquímicas) posteriormente son metabolizados a través del ciclo
glicolítico y ciclo del citrato. Los productos metabólicos de estos ciclos son ácidos y/o
CO2. Para la determinación de la B- Galactosidasa se utilizan medios cromógenos tales
como chromocult. (MANAFI, 1998).
2.2.1.1. Enterobacter aerogenes

Genero de bacterias Gram negativas, anaerobias facultativas, de la familia de
Enterobacterias, muchas son patógenas y son causa de infecciones oportunistas en
huéspedes comprometidos generalmente hospitalizados, causa infección del tracto
urinario y de tracto respiratorio. (Loessner M, et al. 1993)
Se encuentra en el tracto digestivo humano, aunque también libremente en el suelo y

agua; sus colonias son grandes y mucosas, algunas cepas llegan a formar cápsula,
como fuente de carbono pueden utilizar glucosa y lactosa, no forman sulfato de
hidrogeno. (Shekhar N.C et al. 2007)
Figura 2. Enterobacter aerogenes
Fuente: www.wales.nhs.uk/sites3/page.cfm?orgid=379...
Escherichia coli y Enterobacter aerogenes, son dos bacterias idénticas en muchas

formas superficiales, ambas fermentan lactosa produciendo ácido y gas, son bacilos
Gram negativos pero en agar EMB, E.coli produce un subproducto del metabolismo de
dicho azúcar que reacciona produciendo un brillo metálico en la luz reflejada y
Enterobacter aerogenes no lo hace, en cuanto a pruebas bioquímicas se presenta la
siguiente comparación:
6
Tabla 4. Comparación de pruebas bioquímicas de E.coli y E. aerogenes
Prueba Bioquímica E.coli Enterobacter aerogenes
Producción de Indol + -
Rojo de Metilo + -
Voges Proskauer - +
Citrato - +
Lisina descarboxilasa +
Hidrólisis de la esculina +
Utilización de malonato - +
Arginina deshidrolasa +
Fuente: Gamazo .C, et al. 2005
2.2.2 Coliformes Fecales
Los coliformes fecales también denominados coliformes termotolerantes, llamados así

porque soportan temperaturas hasta de 45°C, comprenden un grupo muy reducido de
microorganismos los cuales son indicadores de calidad, ya que son de origen fecal. En
su mayoría están representados por el microorganismo E. coli pero se pueden encontrar,
entre otros menos frecuentes, Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae estos últimos
hacen parte de los coliformes termotolerantes, pero su origen se asocia normalmente
con la vegetación y solo ocasionalmente aparecen en el intestino. (HAYES; 1993)
Los coliformes fecales integran el grupo de los coliformes totales, pero se diferencian de
los demás microorganismos que hacen parte de este grupo, en que son indol positivo, su
rango de temperatura óptima de crecimiento es muy amplio (hasta 45°C) y son mejores
indicadores de higiene en alimentos y en aguas, la presencia de estos indica presencia
de contaminación fecal de origen humano o animal, ya que las heces contienen dichos
microorganismos, presentes en la flora intestinal y de ellos entre un 90% y un 100% son
E. coli mientras que en aguas residuales y muestras de agua contaminadas este
porcentaje disminuye hasta un 59%. (GOMES; 1999).
7
2.2.2.1 Escherichia coli
Originalmente llamada Bacterium comune, fue aislada por primera vez en 1985 a partir
de heces de niños; son bacilos estrechos de 1,1 a 1,5 µm de diámetro y de 2 a 6 µm de
longitud, se encuentran solos o en parejas, Gram negativos, móviles por flagelos
perítricos o inmóviles, anoxigénicos facultativos, poseen metabolismo respiratorio y
fermentativo. (LEMINOR, 1994).
Perteneciente a la familia Enterobariaceae, son coliformes capaces de producir indol a

partir de triptófano, en 21 +/- 3 horas a 44 +/- 0.5°C. También poseen la enzima B-
Galactosidasa, que reacciona positivamente en el ensayo del rojo de metilo y pueden
descarboxilar el ácido L- glutámico, pero no son capaces de utilizar citrato como única
fuente de carbono o de crecer en un caldo con cianuro de potasio (KCN). (MILLIPORE;
2005).
E. coli es la única especie dentro de las Enterobacterias que presenta la enzima B-D-
Glucoronidasa, que degrada el sustrato 4-metilumberiferil-β-D-glucorónico (MUG),
formando 4-metilumbeliferona, este producto tiene la propiedad de emitir fluorescencia
azul/verde cuando se ilumina con luz ultravioleta. (MANAFI, 1998).
E.coli presenta características bioquímicas importantes que permiten la diferenciación

con otros coliformes, como ser positivo para la prueba de indol.
El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano.

Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el
triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La prueba de indol está
basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo
aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo del reactivo de
Kovac’s descrito más adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptófano
(HOPKINS,K.L y HILTON, A.C. 2000)
8
Figura 3. Escherichia coli en Agar EMB
Fuente: science.kukuchew.com/category/microbiology/
Tabla 5. Características de Coliformes Totales y E. coli

COLIFORMES TOTALES E. COLI
Bacterias Gram Negativas Bacterias Gram negativas
No esporulados No esporulados
Anaerobios facultativos Anaerobios facultativos
Fermentadores de la lactosa con Fermentadoras de la lactosa con
producción de ácido y gas a 36+/- 1°C en producción de ácido y gas a 36 +/- 1°C en
24-48 horas 24-48 horas y 44.5 +/- 0.2°C en 24 horas
Hábitat: Tracto gastrointestinal de animales Características de heces de animales
de sangre caliente (bacterias entéricas) homeotermos
son comunes en otros ambientes (suelos,
vegetales, agua)
Fuente: Memorias seminario internacional: El agua y los riesgos para la salud
2.2.3. Salmonella spp.

Bacilo corto (1.2 um). Gram negativo, no esporulado y generalmente móvil con flagelos
perítricos. El género Salmonella contiene unas 2000 cepas distintas (denominadas
serovares o serotipos) de acuerdo a sus antígenos O y H.
Salmonella spp se caracteriza bioquímicamente por su capacidad de fermentar la

glucosa con producción de ácido y gas y por su capacidad de hidrolizar la lactosa y la
sacarosa. Su temperatura óptima de crecimiento, como la de la mayoría de las bacterias
causantes de toxiinfecciones alimentarias esta próxima a los 37°C; son relativamente
9
fotosensibles y se destruyen a 60°C en unos 15 – 20 minutos, siendo incapaces de
crecer por debajo de los 7 u 8°C (Doyle; et al.; 1997)
Figura 4. Salmonella spp en agar XLD
Fuente: bioinfo.bact.wisc.edu/.../Salmonella.html
2.3. TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA DETECCIÓN DE

COLIFORMES TOTALES Y FECALES
Para la determinación de coliformes totales y fecales en agua potable, la legislación

colombiana en la resolución 2115 de 2007, recomienda entre otras técnicas, la de
filtración por membrana.
La técnica de filtración por membrana utiliza un mecanismo mediante el cual se atrapan

en la superficie de una membrana microorganismos cuyo tamaño es mayor que el
tamaño del poro (0.45 um); esto gracias a una bomba eléctrica que ejerce una presión
diferencial sobre la muestra de agua haciendo que se filtre. Los microorganismos de
tamaño menor que el específico del poro pasan la membrana o quedan retenidos en su
interior, las bacterias quedan en la superficie de la membrana y luego esta es llevada a
un medio enriquecido, selectivo o diferencial, quien a través de intercambio metabólico y
una incubación, evidencian el crecimiento de microorganismos y Unidades Formadoras
de Colonia. (APHA - AWWA - WPCF, 2000).
Esta técnica es altamente reproducible y proporciona resultados numéricos, es una

manera rápida y simple de estimar las poblaciones bacterianas en el agua, y
especialmente útil al evaluar grandes volúmenes o al realizar diariamente muchas
pruebas de Coliformes (HACH, 2000).
10
El equipo de soporte del filtro (Fabricado en vidrio, plástico resistente a autoclave,
porcelana o acero inoxidable) consiste en un embudo, unido a una base por un artefacto
de cierre que se mantiene en su lugar mediante una fuerza magnética. El diseño debe
permitir que la membrana se mantenga con seguridad sobre la placa porosa, sin que
sufra daño mecánico, de manera que todo el líquido pase a través de la membrana
durante la filtración. (APHA, 1992)
Figura 5. Trampa de filtración
Fuente. fbio.uh.cu/educacion_distancia/laboratorios_virtuales/Laboratorio%20Virtual%20
micro.pps
2.3.1. Filtros de membrana
Se deben utilizar filtros de membrana con un diámetro de poro que permita una completa
retención de las bacterias coliformes. Solo se emplean filtros en los que se haya
comprobado, mediante una adecuada prueba de control de calidad y por garantía del
fabricante, que permita una retención de las bacterias coliformes. (APHA, 1992).
Se debe tener en cuenta, que dichos filtros deben ser libres de químicos susceptibles de
inhibir el crecimiento y desarrollo bacteriano, que posean una velocidad de filtración
satisfactoria, ausencia de influencias significativas sobre el pH del medio (no mas de +/-
0.2 unidades) y que no produzcan un aumento en el número de colonias confluentes o
expansivas, en comparación con los filtros de membrana de control (APHA, 1992).
Se recomienda utilizar filtros de membrana preesterilizados cuyos fabricantes garanticen

que la técnica de esterilización no ha inducido toxicidad ni alterado las propiedades
físicas o químicas de la membrana, si estas se esterilizan en el laboratorio se deben
someter al autoclave por 10 minutos a 121°C. (APHA, 1992).
El mecanismo de acción es muy simple: retienen todas las partículas que posean un
tamaño mayor que los poros, estos poros quedan formados por los espacios que
11
resultan de la superposición de las fibras de las distintas capas que forman la
membrana, así algunas partículas de menor tamaño son retenidas por otros mecanismos
como las fuerzas de Van der Waals o por la suma de partículas retenidas previamente
(PEARCE, 2007)
2.3.2. Tipos de filtro de membrana
2.3.2.1 Filtros de profundidad

Están elaborados por un material fibroso (papel, asbesto o fibra de vidrio) dispuesto al
azar, de manera que dentro de la estructura del filtro se crean vías tortuosas donde
pueden quedar retenidos la mayoría de los contaminantes presentes.
Presenta ventajas como la alta capacidad de retención de partículas sobre su superficie

y a través de toda su estructura y que permiten filtrar grandes volúmenes. Presenta
desventajas en cuanto a que no presentan un tamaño de poro uniforme y existe la
liberación, hacia el material filtrado, de partículas y microorganismos que hayan crecido
dentro del filtro. (http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf)
Figura 6. Filtros de profundidad
Fuente: http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf
2.3.2.2 Filtros de superficie o membrana

Elaborados generalmente de acetato de celulosa o nitrato de celulosa, contienen poros
de tamaño uniforme. Se pueden saturar rápidamente y la velocidad de filtración a través
de ellos es lenta. (http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf)
12
Figura 7. Filtros de membrana o superficie.
Fuente: http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf
2.3.2.2.1 Membrana de nitrato de celulosa

La nitrocelulosa es un material utilizado de manera habitual para la fabricación de filtros
de membrana. Estas membranas son de naturaleza hidrofílica, con una microestructura
muy uniforme lo que permite excelentes niveles de retención de partículas y un
comportamiento perfecto en pruebas microbiológicas. (http://fanoia.com/filterlab/micro-8-
15.pdf)
Tienen una estructura de poro muy uniforme, lo que asegura una excelente retención y
un óptimo crecimiento microbiológico en muestras de agua, bebidas, fármacos
(PEARCE, 2007).
2.3.2.2.2 Membrana de acetato de celulosa

Son de naturaleza hidrofílica, presentan una excelente estabilidad térmica, permiten gran
capacidad de carga y altas velocidades de flujo, por lo que resultan apropiados para la
esterilización y clarificación de soluciones acuosas, alcohólicas y aceites.
Las partículas más grandes que el tamaño del poro son rechazados por la superficie de
la membrana y el remanente permanece o se concentra allí. El volumen del fluido y otras
partículas finas de menor tamaño del poro pueden pasar a través de la membrana al sitio
de filtrado (PEARCE, 2007).
13
Tabla 6. Aplicaciones de los filtros de membrana
Filtros de nitrato de celulosa Filtros de acetato de celulosa
Filtración de aguas Esterilización de muestras de proteínas
Análisis microbiológico Esterilización de fluidos biológicos
Análisis gravimétrico Filtración de alcoholes
Análisis cualitativos de partículas Filtración de aceites
Esterilización de muestras Filtración de muestras de aguas
Determinación de proteínas
Identificación de ácidos nucleicos
Pre filtración de muestras
Clarificación de muestras
Fuente. http://www.fanoia.com/filterlab/micro-8-15.pdf
2.4. MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es un sustrato o solución de nutrientes en donde crecen, y se

multiplican los microorganismos, con el objetivo de aislar diferentes especies de
microorganismos que induzcan al desarrollo de estrategias complementarias de
identificación, cuantificación, caracterización de la microflora (Tortora, G. 1993). De la
inocuidad y de la capacidad de recuperación del medio de cultivo, así como de su
posterior manipulación dependen en gran medida los resultados de una prueba
microbiológica. (Tortora, G. 1993).
Los medios de cultivo se pueden clasificar de la siguiente manera:
Según su estado físico: líquidos, semisólidos y sólidos

Según su finalidad:
No selectivos: contienen los nutrientes suficientes para soportar el crecimiento
de gran variedad de microorganismos.
Selectivo: permite el crecimiento de solo un tipo de microorganismo
Enriquecido: son medios no selectivos a los que se le agregan sustancias como
sangre, suero, albumina, etc., para microorganismos exigentes.
Diferenciales: son medios de cultivo que permiten establecer diferencias entre
diferentes tipos de microorganismos. (ISO\TS 11133-2: 2003)
La composición química del medio de cultivo debe proveer los requerimientos

nutricionales básicos para el crecimiento de microorganismos, sin embargo un medio de
cultivo debe cumplir con dos características muy importantes. La selectividad y la
14
productividad. Su productividad se refiere a la formulación básica del medio de tal forma
que favorezca el crecimiento de microorganismos con las características macroscópicas
y microscópicas esperadas. (Tortora, G. 1993).
Además de las características anteriormente mencionadas, existen otras pruebas de

control de calidad que se realizan a los medios de cultivo, entre ellas podemos
encontrar: propiedades bioquímicas (diferenciales y diagnosticas), propiedades físicas
(pH, volumen) y la especificidad (cuando se trate de medios con características de
diferenciales) (ISO\TS 11133-2: 2003)
2.4.1. Medios cromógenos
Basados en sustancias químicas que añadidas al medio dan un precipitado coloreado

que demuestra la presencia de una enzima especifica, si el microorganismo posee el
sistema enzimático para utilizar el sustrato, se produce un cambio de color visible en las
colonias. Son medios rápidos, sencillos y fiables para detectar actividades enzimáticas
específicas de varios organismos. (Tortora, G. 1993).
2.4.1.1. Medio Chromocult para Coliformes

Es un agar selectivo para el crecimiento de coliformes totales y E. coli en muestras de
aguas y alimentos. Por la acción conjunta de peptonas selectivas, piruvato y tampón de
fosfatos se garantiza un rápido crecimiento también de coliformes con daños
sublaterales. El contenido de lauril sulfato inhibe el crecimiento de bacterias Gram
positivas sin tener influencias negativas sobre el crecimiento de los coliformes. La
formación simultánea de coliformes totales y E. coli se hace posible por la nueva
formación de dos sustratos cromógenos: el sustrato Salmon – Gal es separado por la
enzima β-D-galactosidasa característico de coliformes y provoca una coloración roja de
las colonias de coliformes. (MERCK, 1998).
La formación de la β-D-Glucoronidasa característica para E. coli tiene lugar mediante el

sustrato X- glucorónido, que al ser cortado por la encima produce una coloración azul
para las colonias positivas. Ya que E. coli separa tanto Salmon-Gal como X-
Glucorónido, las colonias se tiñen de violeta – azul oscuro y debido a ellos se pueden
diferenciar de los coliformes restantes que se presentan de color rojo. (MERCK, 1998).
El contenido de triptófano mejora la reacción de indol para la confirmación adicional de

E. coli que se dá con el reactivo de kovac’s y aumenta con ello la confirmación de la
reacción Salmon -Gal y la reacción X-Glucorónido (MERCK, 1998).
15
2.4.1.2. Ventajas de los medios cromógenos frente a los convencionales.
La identificación bacteriana se basa generalmente en una extensa batería de pruebas
bioquímicas convencionales, que permiten determinar sus características de desarrollo y
de metabolismo; estos métodos requieren una colonia bacteriana pura, tomada de una
placa de aislamiento primario, su siembra en diferentes medios y su posterior lectura e
interpretación. En la mayoría de los casos el diagnóstico lleva tiempo y varios pasos de
manipulación.
Los sustratos enzimáticos sintéticos realizan la identificación de microorganismos por

medio de la formación de color que ponen de manifiesto la presencia de enzimas
específicas para cada especie.
En general se distinguen grupos de compuestos cromogénicos que han sido usado en

reacciones bioquímicas para estudiar la cinética de enzimas especificas, de acuerdo al
principio, que el sustrato es hidrolizado por la enzima especifica, liberando un cromóforo,
permiten identificar un microorganismo específico en un tiempo, evitando una cantidad
de pasos que hacen mas tedioso el trabajo de identificación, logrando visualizar de forma
rápida especies diferentes en una misma muestra analizada. (Moreno. C. 2004)
2.5. VALIDACIÓN
Validar es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia

documentada que un proceso especifico producirá de forma consistente productos que
reunirán las características de calidad predefinidas (CORTES, 2002; FDA, 1987). Este
proceso además ofrece evidencia de que un método es capaz de servir para su
propósito planteado, para tal fin se deben reflejar las condiciones reales de ensayo, esto
puede conseguirse usando productos contaminados o productos inoculados con un
número conocido de microorganismos (ENAC, 2002; GTC 84, 2003).
El proceso de validación se inicia con las actividades de pre validación, las cuales
consisten en la recopilación de la información relacionada con el proceso, en la revisión
de las evaluaciones de riesgos, la calificación técnica a las instalaciones locativas y a los
equipos, existencia de procedimientos para las tareas u operaciones y el entrenamiento
a los trabajadores. Posteriormente se procede a elaborar los protocolos en donde se
define los objetivos específicos de las evaluaciones a efectuar, las responsabilidades de
cada una de las áreas involucradas en la validación, se establecen las variables de
16
interés que se quieren monitorear y el plan de monitoreo respectivo, además de incluir
los criterios de aceptación que no son otra cosa que la comparación de los resultados
con los niveles permisibles o los resultados esperados. (Estrada C, 1999)
A continuación se desarrolla la validación propiamente dicha en donde se realiza una

evaluación de una muestra representativa, en número de lotes de producción si la
producción es por lotes o en tiempo si esta es continua. Durante esta fase se recopilan
las muestras de las variables que se desean medir y se realizan los análisis o cálculos
respectivos. Finalmente con los resultados arrojados por el proceso anterior se hacen las
recomendaciones respectivas y conclusiones, que después de cumplir un plan de acción
se cierran y se procede a declarar el proceso como validado. (Estrada C, 1999)
Para la recuperación e identificación microbiana, los análisis microbiológicos, son

ajustables a veces, a métodos alternativos a los descritos en la USP por diversas
razones: económicas, de producción, y tiempo. Por tanto estos métodos requieren ser
validados. (USP 31, 2008) En Los métodos microbiológicos alternativos es importante
tener en cuenta un cierto grado de variabilidad. Cuando se llevan a cabo pruebas
microbiológicas por conteo en placa convencional, se puede llegar a encontrar
resultados con porcentajes de desviación estándar relativa de 15 a 35 ya que muchos
métodos microbiológicos convencionales están sujetos a errores de muestreo, de
dilución, de incubación y del operador. (USP 31, 2008).
Incluso cuando se haya realizado la validación, el laboratorio tendrá que verificar

periódicamente que se cumplen los parámetros documentados, utilizando por ejemplo
muestras inoculadas o materiales de referencia incorporados a las matrices más
representativas. (ENAC, 2002).
2.5.1. Parámetros de Desempeño de la Validación
Son las propiedades, características o capacidades del método.
2.5.1.1. Especificidad
Capacidad de un método de determinar inequívocamente un analíto/parámetro en
presencia de los otros componentes de la muestra. La especificidad puede ser afectada
por la presencia de interferentes (como precursores de síntesis, impurezas, productos de
degradación, entre otros). (OGA-016,2004).
17
2.5.1.2. Exactitud
La exactitud, es la cercanía de un resultado al valor verdadero por comparación con los
valores de referencia de un material caracterizado (material de referencia). Los valores
de referencia deberían ser trazables a las normas internacionales; los materiales de
referencia certificados (MRC) generalmente se aceptan como trazables. Es ideal que el
material de referencia sea de matriz natural lo mas similar posible a las muestras de
interés. (RODRÍGUEZ, 2004). Usualmente, la exactitud se expresa como el porcentaje
de recuperación de los microorganismos mediante el método de validación. (USP 31,
2008).
2.5.1.3. Precisión
Las dos medidas más comunes de la precisión, que generalmente se define en términos
de desviación estándar o el coeficiente de variación (desviación estándar relativa) son la
repetibilidad y la reproducibilidad. La repetibilidad, da una idea de la variabilidad que se
espera cuando un proceso es aplicado por un solo analista en un equipo durante un
periodo corto (análisis por duplicado). La reproducibilidad, es la que representa la
variabilidad que se obtiene cuando un proceso es analizado por diferentes analistas, lo
cual tiene un valor más amplio. La precisión intermedia y más útil en casos específicos
se obtiene cuando se evalúa reproducibilidad entre analistas en un mismo laboratorio.
(RODRÍGUEZ, 2004).
2.5.2. Datos requeridos para la validación
Los requisitos de las pruebas farmacopeicas varían desde valoraciones analíticas muy
rigurosas hasta evaluaciones subjetivas de atributos. Considerando esta amplia
variedad, es lógico que diferentes procedimientos de prueba requieran diferentes
esquemas de validación. Las categorías más habituales para las que se exigen datos de
validación son:
Categoría I: Los procedimientos analíticos para la cuantificación de componentes
principales de fármacos a granel o ingredientes activos (incluyendo conservantes) en
productos farmacéuticos terminados.
Categoría II: Los procedimientos analíticos para la determinación de impurezas en
fármacos a granel o productos de degradación en productos farmacéuticos terminados.
Estos procedimientos incluyen análisis cuantitativos y pruebas de límite.
Categoría III: Los procedimientos analíticos para la determinación de las características
de desempeño.
Categoría IV: Pruebas de identificación
18
Para cada categoría, se requiere de diferente información analítica. La validez de un
procedimiento analítico puede verificarse sólo mediante estudios de laboratorio. Por lo
tanto, la documentación final de dichos estudios constituye un requisito básico para
determinar si un procedimiento es adecuado para sus aplicaciones previstas. (USP 31,
2008)
Tabla 7. Datos requeridos para la validación
DATOS REQUERIDOS PARA LA VALIDACIÓN
Categoría II
Características Categoría análisis Prueba Categoría Categoría
de Desempeño I cuantitativa de límite III IV
analítico
Exactitud Si Si * * No
Precisión Si Si No Si No
Especificidad Si Si Si * Si
Límite de No No Si * No
detección
Límite de No Si No * No
Cuantificación
Linealidad Si Si No * No
Fuente: USP 31, 2008.
2.6. VALIDACIÓN Y SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO MICROBIOLÓGICO
El análisis microbiológico tiene como fin proporcionar información confiable acerca de la

inocuidad y calidad sanitaria de una muestra cualquiera. Es por ello que es indispensable
la elección de un método de ensayo adecuado.
Para decidir si un método es apropiado o no, se debe tener en cuenta: si ese método es
aplicable a la muestra analizar a analizar, la cantidad de muestra necesaria para el
ensayo, si usando esta metodología se puede evaluar el cumplimiento de las exigencias
requeridas para el analíto. El laboratorio debe elegir los métodos que mejor se adecuen
a sus objetivos y debe documentarlos debidamente. (GUARNIZO, 2005).
19
Existen tipos principales de determinaciones propias de las pruebas microbiológicas,
entre las que se incluyen: Pruebas para determinar si los microorganismos están
presentes en una muestra y pruebas para cuantificar el número de microorganismos.
(USP 31, 2008)
2.6.1. Pruebas cualitativas para detectar la presencia o ausencia de

microorganismos
Este tipo de pruebas se caracteriza por el uso de turbidez en un medio líquido de

crecimiento como evidencia de la presencia de microorganismos viables en la muestra
de la prueba. (USP 31, 2008)
2.6.2. Pruebas cuantitativas para microorganismos
El método de recuento en placa es el ejemplo más común de esta clase de pruebas que
se emplean para estimar el número de microorganismos viables en la muestra. (USP 31,
2008)
Tabla 8. Parámetros de Validación por tipo de prueba microbiológica.
Parámetro Pruebas Pruebas
cualitativas cuantitativas
Exactitud No Si
Precisión No Si
Especificidad Si Si
Límite de detección Si Si
Límite de cuantificación No Si
Linealidad No Si
Robustez Si Si
Repetibilidad Si Si
Fuente: USP 31, 2008.
Un laboratorio debe validar los métodos no normalizados, los métodos que diseña o
desarrolla, los métodos normalizados empleados fuera del alcance previsto, así como las
ampliaciones y las modificaciones de los métodos normalizados, para confirmar que son
aptos para el fin previsto. La validación debe ser tan amplia como sea necesario para
satisfacer las necesidades del tipo de aplicación o del campo de aplicación dados. El
laboratorio debe registrar los resultados obtenidos, el procedimiento utilizado para la
20
validación y una declaración sobre la aptitud del método para el uso previsto. (ENAC,
2002).
2.6.3. Métodos normalizados
Son métodos que el laboratorio aplica como ya esta descrito en un procedimiento o en

una norma, en este caso también es necesario anexar o volver a escribir bajo forma de
procedimientos las especificaciones reconocidas que tengan suficiente información para
realizar los ensayos (G-ENAC. 1997) .
El laboratorio debe confirmar que puede operar correctamente los métodos normalizados
antes de introducir los ensayos. Si el método normalizado cambia se debe repetir la
confirmación.
2.6.4. Métodos desarrollados por el laboratorio
Elaborados en el laboratorio y no se encuentran en ningún documento oficial, debe ser

una actividad planificada y debe ser asignada a personal calificado y proveer los
recursos necesarios (G-ENAC. 1997)
2.6.5. Métodos normalizados con modificaciones
Son métodos tomados de una norma, pero con alguna modificación, tal es el caso de
una filtración con membrana utilizando otro medio de cultivo diferente; aquí se debe
realizar lo mismo a como si se estuviera realizando la validación de un método
desarrollado por el laboratorio, debido a que ya existe una modificación sobre el método
normalizado (G-ENAC. 1997).
2.7. PRERREQUISITOS DE LA VALIDACIÓN
2.7.1. Monitoreo ambiental
La calidad microbiológica del aire y las superficies de laboratorio son un indicador de la

efectividad de las tareas realizadas según el programa de limpieza y desinfección.
21
El programa de muestreo para monitoreo ambiental incluye:
Determinación cuantitativa de microorganismos presentes en el ambiente

(recuento total de determinado tipo de microorganismos, por ejemplo: hongos y
levaduras, mesófilos).
Determinación cualitativa dependiendo de los ensayos que realiza el laboratorio

(ejemplo: Enterobacterias, coliformes, Salmonella spp).
El laboratorio debe definir los recuentos máximos de microorganismos que

considere aceptable y disponer de un procedimiento documentado en el que se
describan las acciones a tomar para corregir las situaciones en que sobrepasen
estos límites.
Se recomienda realizar como mínimo los siguientes controles microbiológicos, aunque es

importante resaltar que existe variedad de métodos para llevarlos a cabo:
Monitoreo de la calidad del aire por exposición de placas o equipos

muestreadores
Monitoreo de la calidad microbiológica de las superficies de trabajo, por frotación
con hisopos o por placas rodac
Control de dotación y de personal (VILLOCH, C.A. 2002)
Tabla 9. Límites microbiológicos ambientales, área de recuentos

INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
Ambiente del área / No. De microorganismos No. De microorganismos

60 minutos viables bacterias viables hongos y levadura
UFC/placa UFC/placa
Cabina flujo laminar

– clase 100 0 0
Área Max. 12 Max. 12

No: Número
22
Tabla 10. Límites microbiológicos superficies, área de recuentos
No. de microorganismos
Superficie del área / No. de microorganismos viables hongos y levaduras
25cm2 viables bacterias UFC/ 25 cm2
UFC/ 25 cm 2
Cabina flujo laminar– Max. 0 Max. 0

clase 100
Mesa, Puerta o Pared Max. 12 Max. 12
No: Número
Tabla 11. Límites microbiológicos dotación - guantes, área de recuentos

Superficie del área No. de microorganismos No. de microorganismos

/placa viables bacterias viables hongos y levaduras
UFC/placa UFC/placa
Guantes inicio Max. 3 Max. 1

Guantes final Max. 7 Max. 5
No: Número
Se debe limpiar y desinfectar el espacio de ambiente controlado, en el cual se desarrolla

el procedimiento. Este permitirá a la empresa mantener un nivel mínimo consistente de
contaminación, en pisos y mesón de muestras, es importante siempre tener en cuenta
que en las cabinas se exige cero contaminación. Un método eficiente es la desinfección
apropiada mediante un sistema de rotación de desinfectantes, usando generalmente los
de tipo fenólicos, amonios cuaternarios, aldehídos, peróxidos y haluros.
En el caso de algunos equipos que no se pueden esterilizar por los diversos métodos
como: Equipos eléctricos y electrónicos, balanzas, baterías, etc.; la desinfección de estos
equipos debe ser más rigurosa debido a su potencial de contaminación con un gran
número de microorganismos. (CARLENTON, 1999)
23
2.7.2. Escala de Mc Farland
La escala de Mc Farland, es utilizada como estándar de turbidez en la preparación de

suspensiones de microorganismos. Los estándares de turbidez son preparados por la
mezcla de químicos que se precipitan para formar una solución de turbidez reproducible.
Son realizados adicionando ácido sulfúrico a una solución acuosa de cloruro de bario,
del cual resulta la formación de un precipitado de sulfato de bario (ZIMBRO Y POWER,
2003) Esta escala de turbidez es elaborada con una mezcla de BaCl2 de 0.048 M y
H2S04 0.6 M, la turbidez la da el BaCl2, el cual va en cantidad creciente mientras al
ácido sulfúrico va disminuyendo la proporción. (ESCOBAR, 2002)
Cada uno de los tubos del patrón de acuerdo con la turbidez, representa un número de
bacterias, para suspensiones de igual turbidez, que ha sido determinado por recuentos
de colonias. De esta forma al comparar una emulsión de bacterias con el tubo del patrón
de Mc farland que más se asemeje se puede saber aproximadamente el numero de
bacterias en la emulsión (ESCOBAR, 2002)
2.7.3. Medios de cultivo
Los medios de cultivo seleccionados deberán ser evaluados con la prueba de promoción
de crecimiento de bacterias, mohos y levaduras. Las unidades de promoción de
crecimiento deben ser inoculadas con un número menor de 100 UFC. Si las pruebas de
promoción de crecimiento fallan, se debe investigar el origen de cualquier contaminación
encontrada durante la simulación y repetir la prueba. (ROGANTI, 2004)
2.7.3.1. Esterilización del medio de cultivo

El medio seleccionado debe ser esterilizado por uno de los dos métodos primarios,
filtración o esterilización por vapor. La esterilización por filtración requiere que el medio
pase por un filtro de 0.22µm a un contenedor previamente esterilizado; este método
presenta dificultad debido a que los medios de cultivo son mezcla de varios materiales
naturales y una cantidad considerable de estos son sólidos no solubles que se
encuentran presentes en la mezcla acuosa. (CARLENTON, 1999)
El proceso con vapor (autoclave) emplea la esterilización terminal del medio en un

contenedor del cual será dispensado para el envase, este procedimiento terminal reduce
la necesidad de manipulación post-esterilización que puede comprometer la esterilidad
del medio. (CARLENTON, 1999)
24
Después de la esterilización del medio este debe ser manejado realizando las mismas
practicas usadas para las operaciones de producción rutinarias. Algunas empresas
siguen algunos pasos adicionales como la preincubación del medio antes de empezar la
corrida de la prueba, para asegurarse de la esterilidad del medio antes del envase de
este. (CARLENTON, 1999)
2.7.3.2. Incubación
Los medios se deben incubar en condiciones adecuadas de modo que se puedan
evidenciar los microorganismos que podrían de otra manera ser difíciles de cultivar. Se
deben establecer las condiciones de incubación de acuerdo con las siguientes pautas
generales:
La temperatura y el tiempo de incubación debe ser conveniente para la recuperación de

la carga microbiana, en ningún momento deben estar fuera del rango de 20-35°; y se
debe mantener dentro de +/- 2.5°C de la temperatura requerida. (CARLENTON, 1999)
2.7.3.3. Control de autoclave

Para verificar que el proceso de esterilización se realiza en forma adecuada, se realiza
un control por cada ciclo introduciendo un vial que contiene esporas de Bacillus
stearothermophilus en el autoclave. (I-DCM 008 “USO Y MANEJO DE BIOINDICADOR
EN PROCESO DE ESTERILIZACIÓN” Codificación correspondiente al Sistema de
Gestión de Calidad de INTERPHARM de COLOMBIA Ltda.)
Esta prueba consiste en introducir en el autoclave viales de Bacillus stearothermophilus

en posiciones establecidas, junto con el material que se esta esterilizando en los
parámetros normales, cuando finaliza el proceso se incuba y se determina el crecimiento
o no por medio del cambio en el indicador de pH que se encuentra en la ampolleta. (NTC
- 4543, 1998). Adicionalmente el autoclave debe estar calificado (se debe tener en
cuenta la ultima fecha de la calificación del autoclave), para de esta manera asegurar la
adecuada distribución de calor para cargas y volúmenes definidos, usualmente se
recomienda que se use un ciclo de autoclave de 121° durante 15 minutos (USP 31,
2008). Para llevar a cabo la calificación del autoclave existen tres etapas fundamentales:
certificación de la instalación (CI), certificación operativa (CO) y certificación funcional
(CF).
En el caso de la certificación de la instalación, se debe registrar toda la información de

identificación (nombre del equipo, descripción, número de modelo e identificación,
25
certificados de compra), ubicación, requisitos de servicios básicos y cualquier
característica de seguridad del equipo (fácil acceso a todos los planos, manuales, listas
de repuestos, dirección del vendedor y numero telefónico de contacto).
En cuanto a la certificación operativa: se debe describir toda la información necesaria en

la que conste que todos los componentes del equipo (autoclave), funcionan según lo
especificado; esto se obtiene sometiendo a prueba todos los controles de operación
normal, todos los puntos de alarma, todos los interruptores y dispositivos visualizadores.
Para finalizar el proceso de calificación del autoclave, se realiza la certificación

funcional, en la cual se describe el procedimiento necesario para demostrar que el
sistema del equipo funciona uniformemente y cumple las especificaciones exigidas
bajo la operación cotidiana (OMS, 1998)
2.7.4. Documentación
Es esencial que el programa de validación este documentado y que la documentación

sea mantenida correctamente. Es importante registrar los detalles del proceso (ej.
tiempo, equipo usado) y registrar los cambios que hayan ocurrido. Un registro del
mantenimiento puede ser útil en la ejecución de investigaciones de fallas referentes a un
lote específico de fabricación. Los datos de la validación (junto con datos de pruebas
específicas) pueden también determinar la variación prevista en las características del
producto o el equipo (RODRÍGUEZ, 2004).
2.7.5 Desarrollo del protocolo de validación
El propósito del protocolo de validación es demostrar que el proceso es reproducible y

está normalizado de manera que los resultados que provee serán comparables a los de
otro proceso en un lugar diferente y viceversa. (RODRÍGUEZ. 2004) El protocolo consta
de:
Identificación del proceso que se va a validar
Criterios objetivos y que se pueden medir para una validación exitosa

Duración de la validación
Turnos, operadores, equipo que se va a usar en el proceso
Identificación de servicios para el equipo de proceso y la calidad de los servicios

Consideración del mantenimiento y reparaciones de equipo de fabricación
Identificación de los operadores y calificación del operador
requerido Descripción completa del proceso
26
Cualquier control o condición especial que se coloque en los procesos
precedentes durante la validación
Parámetros de proceso que se van a monitorear, y métodos para controlar y

monitorear
Características de producto o proceso que se van a monitorear y métodos para
monitorear
Métodos estadísticos para recolección y análisis de datos
Se deben tener en cuenta las causas de variación controlables en un proceso de

validación como son: temperatura, humedad, variaciones de suministro eléctrico,
vibración, contaminantes ambientales, pureza del agua usada en el proceso, luz,
variabilidad de los materiales, desgaste del equipo, factores humanos (entrenamiento,
factores económicos, tensión, etc.) (RODRÍGUEZ. 2004)
2.7.6 Informe Final de Validación
Este informe resume y presenta todos los protocolos, resultados y deriva conclusiones
relacionadas con el estado de validación del proceso. Debe ser revisado y aprobado por
el equipo de validación y la administración. (RODRÍGUEZ. 2004)
27
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
3.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
En el presente trabajo se realizo la validación del método de detección de coliformes

totales y fecales en agua potable utilizando agar chromocult según POE – DCM 046
“DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN AGAR CHROMOCULT”
(codificación correspondiente al Sistema de Gestión de Calidad de INTERPHARM DE
COLOMBIA Ltda.) estableciendo parámetros estándares de validación tales como
especificidad, exactitud, precisión, repetibilidad, reproducibilidad. Todo lo anterior
teniendo en cuenta la necesidad de reducir tiempos y costos, además de cumplir con los
requisitos tanto de la normatividad gubernamental como aquellos que puedan llegar a
dar reconocimiento al laboratorio.
3.2 JUSTIFICACIÓN DEL PROBLEMA
La validez en los resultados de los análisis microbiológicos se ven afectados por factores
como: La preparación del inóculo, la naturaleza de los microorganismos utilizados, las
condiciones específicas de la prueba, las condiciones de recuperación, entre otros. Por
lo anterior, todos los métodos y especialmente los relacionados con el análisis
microbiológico del agua potable, dada la importancia como materia prima, ingrediente y
disolvente en el procesamiento, formulación, fabricación de productos farmacéuticos y
para el consumo humano, deben ser validados.
Por esta razón, en este trabajo de grado se demuestra que el método de filtración por
membrana utilizado por el laboratorio INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda, para la
detección de coliformes totales y fecales en agua potable utilizando agar chromocult, es
confiable, reduce costos y tiempo.
28
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL

Realizar la validación del método de filtración por membrana para la detección de
coliformes totales y fecales en agua potable utilizando agar chromocult, técnica
empleada en el laboratorio de INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Comprobar la efectividad del agar chromocult como un método de detección

eficaz para coliformes totales y fecales en agua potable.
 Demostrar mediante pruebas de enumeración y recuperación de los

microorganismos evaluados que el método de filtración por membrana para la
detección de coliformes fecales y totales, es apropiado para analizar muestras
de agua.
 Comprobar si el método cuantitativo de filtración por membrana para la detección

de coliformes totales y fecales en agua potable es especifico, exacto,
reproducible, repetible y preciso.
Elaborar el protocolo de validación del método de detección de coliformes totales

y fecales en agua potable utilizando agar chromocult.
29
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 DISEÑO EXPERIMENTAL
En el presente trabajo se realiza un estudio experimental, para obtener la validación del

método de filtración por membrana para la detección de coliformes totales y fecales en
agua potable utilizando agar chromocult en el laboratorio INTERPHARM DE COLOMBIA
Ltda.
5.2 POBLACIÓN DE ESTUDIO Y MUESTRA POBLACIÓN DE ESTUDIO
El estudio se realiza en el laboratorio de análisis microbiológico de la empresa

INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda. Ubicado en la Carrera 68 A # 19-79 de la ciudad
de Bogotá, con muestras de agua potable del laboratorio, inoculadas con un número
conocido de microorganismos contaminantes.
Se utiliza agua potable, proveniente del acueducto de Bogotá, a la cual el laboratorio le

realiza pruebas fisicoquímicas, para determinar el cumplimiento de las especificaciones
descritas para agua potable según la resolución 2115 de 2007 y según el programa de
controles internos establecido en el laboratorio.
Se utilizan tres microorganismos:

Escherichia coli ATCC 8739
Salmonella typhimurium ATCC 14028
Enterobacter aerogenes ATCC 13048
Las cepas utilizadas corresponden al cuarto pase, (cepas de trabajo) según POE – DCM
013 “MANEJO DEL CEPARIO” (Codificación correspondiente al Sistema de Gestión de
Calidad de INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.)
Para la validación del método de detección de coliformes totales y fecales, se analizan

diez (10) muestras diferentes de agua potable, provenientes de la misma fuente (llave de
agua - área de lavado- laboratorio INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda) las cuales se
analizan por dos analistas, en días diferentes. Cada día se evalúa una muestra de agua
diferente con tres réplicas, para cada prueba, realizando una prueba estándar(control
positivo), en la cual se evaluó cada microorganismo por separado (agua estéril para
inyección, inoculada con cada uno de los microorganismos a evaluar Escherchia coli
ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028 y Enterobacter aerogenes ATCC
30
13048), una solución de prueba (agua potable inoculada con los microorganismos
utilizados como prueba: Escherchia coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC
14028 y Enterobacter aerogenes ATCC 13048 ), un control negativo (agua potable con
tiosulfato al 1% y sin inocular) y una prueba combinando la muestra de agua con los
microorganismos a evaluar (agua potable + Escherchia coli ATCC 8739 + Salmonella
typhimurium ATCC 14028); (agua potable + Escherichia coli ATCC 8739 + Enterobacter
aerogenes ATCC 13048 ) y (agua potable + Salmonella typhimurium ATCC: 14028 +
Enterobacter aerogenes ATCC 13048 ) de esta manera se obtienen, 30 recuentos por
día para un total de 300 recuentos por analista, por lo tanto se obtienen 600 datos en
total por los dos analistas, para determinar posteriormente parámetros cuantitativos para
la validación del método.
Para llevar a cabo el análisis de las muestras de agua se desarrolla la técnica de

filtración por membrana llevando a cabo el montaje del equipo de filtración según
instructivo I – DCM 013 “ARMADO DEL EQUIPO DE FILTRACIÓN” (Codificación
correspondiente al Sistema de Gestión de Calidad de INTERPHARM DE COLOMBIA
Ltda.) y se utilizan membranas de nitrato de celulosa, con poro de 0.45um y diámetro de
47 mm.
5.3 VARIABLES DE ESTUDIO
Para la validación del método de detección de coliformes totales y fecales en agar

chromocult se determinan los siguientes parámetros cuantitativos:
 Precisión
 Repetibilidad
 Reproducibilidad
 Especificidad
 Exactitud
31
5.4. PRUEBAS PRELIMINARES
5.4.1 Recopilación de la Información
Para obtener toda la información que puede influir en la validez de la prueba se realiza
una revisión de los siguientes factores: personal, equipos e instalaciones, medios de
cultivos utilizados en la prueba, reactivos, entre otros.
5.4.2 Calibración y mantenimiento de equipos
Se verifica que los equipos utilizados en la prueba, se encuentran calibrados y dentro de

los parámetros establecidos de funcionamiento. ( Ver tabla 15)
Los equipos utilizados fueron los siguientes:

Cabina de flujo laminar horizontal
Bomba de vacío
Balanza de platillo
externo Autoclave
horizontal
Incubadora de 20-
25°C Incubadora de
30-35°C Microscopio
Nevera
5.4.3 Preparación de inóculos
Se realizan aislamientos de los tres microorganismos prueba (Escherchia coli ATCC

8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028 y Enterobacter aerogenes ATCC 13048) en
agar casoy, incubando los medios durante 24 horas en un rango de temperatura entre
30 - 35 ºC, para luego obtener en cada caso colonias aisladas. Con las cepas obtenidas,
se realiza una suspensión de 9 ml en solución salina, de cada uno de los
microorganismos de acuerdo al tubo Nº 1 de la escala de Mc Farland, el cual
corresponde a una concentración de 3 x 10 8 UFC/ml. A partir de cada suspensión se
realizan diluciones seriadas hasta 3x10 -8 (según figura 8). De las tres últimas diluciones
(10-6, 10-7 y 10-8) se siembra en superficie 0.1 ml y por duplicado en Agar Casoy,
incubando en un rango de temperatura entre 30-35ºC por 24 horas, transcurrido este
periodo de tiempo, se realiza recuento y se busca la dilución en la se encuentran menos
32
de 100UFC\ml, para de esta manera iniciar la estandarización del inoculo con el cualk se
trabajar en la diferentes pruebas realizadas en la validación; según POE - DCM 043
“PREPARACIÓN Y MANEJO DE INÓCULOS A PARTIR DE LA ESCALA DE MC
FARLAND ” (Codificación correspondiente al Sistema de Gestión de Calidad de
INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.).
Figura 8. Preparación de inóculo
1ml 0.1ml 0.1ml 1ml 1ml
1 2 3 4 5
Cultivo
de 24 Patrón 9.0 9.9 9.0 9.0
9.9 ml
horas 9.0 ml ml ml ml
ml
-1 -2 3X10 - 3X10 - 3X10 - 3X10 -

3X10 3X10 6 7 8
4
UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/ml
UFC/ml
5.4.4 Prueba de esterilidad de los medios de cultivo
Se realiza la prueba de esterilidad a cada medio de cultivo preparado (agar chromocult)

para el desarrollo de la prueba. Tomando una muestra equivalente al 10% de cada
medio y llevándola a incubar por 24 horas (tiempo presuntivo en cual pueden crecer los
microorganismos contaminantes) a una temperatura entre 30-35°C y de esta manera
evidenciar que no existe crecimiento alguno y que efectivamente el medio se encuentra
en condiciones optimas para su uso; cabe destacar que luego de transcurridas las 24
horas de incubación, así no se evidencie crecimiento, las cajas con medio permanecen
en incubación por otras 24 horas.
5.4.5. Prueba de promoción de crecimiento
La prueba de promoción de crecimiento se realiza a cada medio de cultivo preparado

(agar chromocult), para garantizar que el medio utilizado en la prueba, contiene los
nutrientes necesarios para los microorganismos evaluados logrando un óptimo
crecimiento; se realiza un aislamiento de la cepa de trabajo de cada microorganismo en
una caja de petri que contiene el medio a evaluar (agar chromocult), además de
33
evidenciar las características típicas de crecimiento de cada microorganismo, también se
realizan pruebas cuantitativas para evidenciar la recuperación de las colonias, esta fase
de la prueba se realiza en la preparación de cada inoculo de trabajo; en la cual se
inocula 0.1 ml de cada suspensión a utilizar (tubo # 5 que contiene una concentración de
30 UFC\ml), tanto en agar chromocult, como en agar casoy.
5.5 MATERIALES Y MÉTODOS EN LA EVALUACIÓN DE PARÁMETROS

CUANTITATIVOS
La evaluación de los parámetros cuantitativos, se obtiene a partir de procedimientos

establecidos y estandarizados, para el método de filtración por membrana para la
detección de coliformes totales y fecales en agua potable, se utiliza el POE – DCM 046
“DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN AGAR CHROMOCULT”,
del LABORATORIO INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
5.5.1. Materiales
Tiosulfato de Sodio al 0.1N
Colorantes de tinción de Gram.

Reactivo de Kovack’s
Aceite de Inmersión
Alcohol al 70%
Alcohol al 96%
Frascos Schott por
250ml Frascos Schott
por 500ml
Pipetas graduadas de 1, 2, 5 y 10ml
Cajas de petri desechables estériles
Bolsas de polietileno resistentes al calor
Membranas para filtración con poro de 0,45 µm y diámetro de 47mm

Guantes estériles
Pera pipeteadora
Agar
Chromocult Agar
Casoy
Cepa de Escherichia coli ATCC 8739
Cepa de Enterobacter aerogenes ATCC

13048 Cepa de Salmonella typhimurium ATCC
34
14028 Papel kraft
Pinzas de acero inoxidable estériles
35
Asa redonda
Asa recta
Cabina de flujo laminar
horizontal Microscopio
Incubadora de 20-
25°C Incubadora de
30-35°C Equipo de
filtración
Bomba de vacío
Contador de colonias
Mangueras
Tijeras estériles
Vasos de
filtración
Autoclave
5.5.2 Microorganismos estándar
Los microorganismos utilizados son:

Enterobacter aerogenes ATCC 13048
5.5.3 Métodos
5.5.3.1 Control de ambiente, superficie y operarios.

Para la realización de la validación del método filtración por membrana para agua
potable en agar chromocult se evaluaron inicialmente los controles del proceso,
realizando monitoreo ambiental por sedimentación por exposición de placas durante 60
minutos en agar casoy y en agar saboureaud en la cabina de flujo laminar en donde se
realizo la prueba y sobre el mesón en el cual se ubican las muestras, también se llevo a
cabo el control del analista al inicio y al final de cada análisis mediante la impresión de
los guantes en agar letheen; adicionalmente se desarrollo un control de superficies
mediante la impresión de placas rodac sobre la cabina de flujo laminar y la pare del área
de recuentos.
36
5.5.3.2. Control negativo - muestra
Se toma una muestra de 100 ml de agua potable en frasco schott estéril de 250 ml según
I – DCM 007 “MUESTREO DE AGUA PARA EL CONTROL MICROBIOLOGICO”
procedente del área de lavado del laboratorio INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
Posteriormente se lleva al área de recuentos y bajo cabina de flujo laminar se adiciona
tiosulfato de sodio al 1% (para inactivar el cloro procedente del proceso de
potabilización) y se deja actuar durante 30 minutos. A continuación se adiciona la
muestra (100 ml) a la copa de filtración y se hace pasar a través de la membrana y una
vez filtrado todo el líquido se coloca la membrana sobre la superficie de una caja petri
con agar chromocult y se lleva a incubar durante 24 horas a una temperatura entre 30-
35°C. Este procedimiento se realiza tres veces, por cada operario.
FIGURA 9. Diagrama de flujo del control negativo

Control Negativo
Armar equipo de filtración
Frascos schott de 250 ml con 100 ml de agua potable cada uno
Adicionar Tiosulfato de sodio Adicionar

al 1% Tiosulfato de sodio al
Adicionar
1% Tiosulfato de
Filtrar 100 ml Filtrar 100 ml

Filtrar 100 ml
Colocar membrana sobre superficie de caja de agar chromocult
Para microorganismo
Fuente: Autor por separado
Incubar 24 horas 30 – 35°C

Realizar
coloraci
ón de
Informar resultados
Realizar recuento Gram
37
5.5.3.3. Prueba estándar
Para la prueba estándar, a 100 ml de agua estéril para inyección se adiciona 1 ml de la
dilución 3x10-8 (30 UFC/ml) para cada uno de los microorganismos utilizados:
Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Escherichia coli ATCC 8739 y Salmonella
typhimurium ATCC 14028, para cada microorganismo por separado; seguidamente se
filtra y se coloca la membrana sobre la superficie de agar plate count, se lleva a incubar
durante 24 horas a una temperatura entre 30-35°C, luego de este tiempo se realiza el
recuento, se evidencian las características típicas de crecimiento y se realiza coloración
de Gram a las colonias; este procedimiento se realiza por triplicado.
FIGURA 10. Diagrama de flujo de la prueba estándar

Prueba estándar (Control positivo)
Armar equipo de filtración
Frascos schott con 100 ml de agua estéril para inyección cada uno
Adicionar
Adicionar 1 ml
1 ml de de 3x10-8
3x10-8 (30(30 Adicionar 1 ml
UFC/ml) de la suspensión de Enterobacter
UFC/ml) de 3x10-8
aerogenes (30 UFC/ml)
ATCC 13048
de la suspensión de Escherichia coli ATCC 8739 de la suspensión de Salmonella typhimurium ATCC
Filtrar 100Filtrar
ml tres100 ml tres veces
veces Filtrar 100 ml tres veces
Colocar membrana sobre superficie de caja de agar plate count

Para cada microorganismo por separado
Realizar
Incubar 24 horas 30 – 35°C coloración
de Gram
Realizar recuento
Informa
r
Fuente: Autor
38
5.5.3.4. Solución de prueba
Para llevar a cabo la solución de prueba, se toma una muestra de 100 ml de agua
potable en frasco schott estéril de 200 ml y se adiciona tiosulfato de sodio al 1% (para
inactivar el cloro procedente del proceso de potabilización) y se deja actuar durante 30
minutos, transcurrido el tiempo, se adiciona 1 ml de la dilución 3x10 -8 (30 UFC/ml), de los
microorganismos a evaluar por separado: Enterobacter aerogenes ATCC 13048,
Escherichia coli ATCC 8739 y Salmonella typhimurium ATCC 14028; este procedimiento,
se realiza por separado para cada uno de los microorganismos utilizados y por triplicado.
A continuación, se realiza la filtración de 100 ml y se coloca cada una de las membranas

sobre la superficie de una caja petri con agar chromocult (para un total de 3 cajas de
agar chromocult para cada microorganismo, por cada muestra analizada). Finalmente se
lleva a incubar durante 24 horas a una temperatura entre 30-35°C, transcurrido este
tiempo se realiza el recuento, se realiza la prueba de Indol, coloración de Gram y se
informan los resultados.
FIGURA 11. Diagrama de flujo de la solución de prueba
Solución de prueba Armar equipo de filtración
Frascos Schott de 250 ml con 100 ml de agua potable cada uno
Adicionar tiosulfato de sodio Adicionar

1% tiosulfato de sodio Adicionar
1% tiosulfato de sodio 1%
Dejar actuar Dejar actuar Dejar actuar

durante 30 durante 30 durante 30
Adicionar 1 ml Adicionar 1 ml Adicionar 1 ml

de dilución de dilución de dilución
3x10-8 (30 3x10-8 (30 3x10-8 (30
UFC/ml) de la UFC/ml) de la UFC/ml) de la
suspensión de suspensión de suspensión de
39
Filtrar 100 ml, tres veces Filtrar 100 ml, tres veces Filtrar 100 ml, tres veces
Incubar 24 horas 30 – 35°C Realizar la prueba de Indol y coloración de Gram
Realizar recuento
Fuente: Autor
Informar resultados
5.5.3.5. Solución de prueba combinando los microorganismos

Para llevar a cabo la solución de prueba combinando los microorganismos, se toma una
muestra de 100 ml de agua potable en frasco schott estéril de 200 ml y se adiciona
tiosulfato de sodio al 1% (para inactivar el cloro procedente del proceso de
potabilización) y se deja actuar durante 30 minutos, transcurrido el tiempo, se adiciona
0.5 ml de la dilución 3x10-8 (30 UFC/ml), de los microorganismos a evaluar por separado:
(Enterobacter aerogenes ATCC 13048 + Escherichia coli ATCC 8739); (Salmonella
typhimurium ATCC 14028 + Enterobacter aerogenes ATCC 13048) y (Escherichia coli
ATCC 8739 + Salmonella typhimurium ATCC 14028); este procedimiento, se realiza por
separado para cada una de las combinaciones utilizadas y por triplicado.
A continuación se realiza la filtración de 100 ml y se coloca cada una de las membranas

sobre la superficie de una caja petri con agar chromocult (para un total de 3 cajas de
agar chromocult para cada combinación, por cada muestra analizada). Finalmente se
lleva a incubar durante 24 horas a una temperatura entre 30-35°C, transcurrido este
tiempo se realiza el recuento, se realiza la prueba de Indol, coloración de Gram y se
informan los resultados.
40
FIGURA 12. Diagrama de flujo de la solución de prueba combinando los
microorganismos
Solución de prueba combinada Armar equipo de filtración
Frascos Schott de 250 ml con 100 ml de agua potable cada uno
Adicionar tiosulfato de sodioAdicionar

1% Adicionar
tiosulfato de sodio 1% tiosulfato de sodio 1%
Dejar actuar Dejar actuar Dejar actuar

durante 30 durante 30 durante 30
Incubar 24 horas 30 – 35°C
Adicionar
lución 3x10-8 de la suspensión de Adicionar
E. coli y 10.5
mlml
1
deml
dilución
de de dilución
3x10-8
dilución 3x10-8
dede
3x10-8 lade
suspensión
la la suspensión
dede
suspensión S.de
typhimurium
E. E. coli y y 0.5 ml de dilución 3 x10- de la
aerogenes
Realizar la prueba
0.5 ml de dilución 3x10-8 de la suspensión
de Indol y
deRealizar
S. typhimurium
recuento
coloración de Gram
Filtrar 100 ml, tres veces Filtrar 100 ml, tres veces Filtrar 100 ml, tres veces
Informar resultados
Fuente: Autor
41
5.6 VARIABLES DE ESTUDIO
Para llevar a cabo la validación del método de filtración por membrana para la detección
de coliformes totales y fecales en agua potable, utilizando agar chromocult y teniendo en
cuenta su carácter cuantitativo se analizan variables como: exactitud, repetibilidad,
reproducibilidad, especificidad.
Se determina la precisión de las técnicas en términos de reproducibilidad, repetibilidad, a

través de la desviación estándar y el coeficiente de variación La repetibilidad se evalúa
en el proceso cuando este es desarrollado por un solo analista en un equipo durante un
período corto, y la reproducibilidad se evalúa por la variabilidad que se obtiene cuando
el proceso es llevado a cabo por diferentes analistas para un mismo proceso en
diferentes días. De esta manera se lleva a cabo una rotación entre dos analistas en dos
días diferentes. Se realizan controles microbiológicos de ambientes, superficies y
personal durante y al finalizar el proceso. Con esto se puede encontrar la precesión,
repetitividad y la reproducibilidad.
Tabla 12. Características morfológicas y enzimáticas de los microorganismos evaluados

Microorganismo Color de la Salmon-GAL X-glucoronido Indol
colonia
Escherichia coli Azul + + +
oscuro/violeta
Enterobacter Rojo/rosado + + +
aerogenes
Salmonella Incoloro - - -
typhimuium
Fuente: MERCK (Manual de medios de cultivo)
5.7. RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN
Se realiza una revisión bibliográfica en la farmacopea oficial vigente de Estados Unidos

(USP 31), libros, artículos científicos, revistas especializadas en el tema y normas
relacionadas con el control de calidad microbiológico de aguas para uso farmacéutico
(para nuestro caso agua potable, que es utilizada en la primera fase de producción),
específicamente en la detección coliformes totales y coliformes fecales. Así mismo, la
preparación de reactivos, medios de cultivo y el desarrollo de los métodos se realizan
según Procedimientos Operativos Estándar de INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
42
5.8 ANÁLISIS DE INFORMACIÓN
Para determinar el control del proceso, se realiza un análisis de los resultados obtenidos
a lo largo de la validación de la técnica, además de tener en cuenta los recuentos
obtenidos en los análisis microbiológicos de ambientes, superficies y personal.
5.8.1 Análisis de datos
Los datos de los recuentos se analizan según la media y desviación estándar.
5.8.1.1 Media. ( )
Se define como un valor representativo de una serie de mediciones de un parámetro
determinado. Estas mediciones deben ser tomadas bajo las mismas condiciones de
modo tal que el valor resultante represente en forma objetiva dicho parámetro. Este
concepto señala la tendencia de centralización de los datos con respecto al valor
nominal de la especificación. (Montgomery, 1991)
Numéricamente se obtiene el coeficiente entre la sumatoria de todos los valores de la

serie y el número total de mediciones, es decir
= sumatoria
= media
N = número de elementos
X = valores o datos
5.8.1.2 Desviación Estándar (σ)

Es una medida de la dispersión de una serie de mediciones de un determinado
parámetro, esto significa que no es un indicador de la variación entre cada valor y la
media, se visualizan mejor cuando se presentan los datos en forma de una distribución
de Frecuencia, es decir, ordenados por clase según su magnitud (Montgomery. 1991)
Numéricamente la desviación estándar se obtiene de la raíz cuadrada de la sumatoria de

todas los N cuadrados de la diferencia entre cada valor de una serie y su media, dividido
por el número total de mediciones, es decir:
43
∑: sumatoria
X: valor de la serie
: Media
N: número total de mediciones
44
6. RESULTADOS
6.1. ESTANDARIZACIÓN DE INÓCULOS DE

TRABAJO Analista 1: Aura Lozano
Analista 2: Marcela Carrillo
Tabla 13. Estandarización de inóculos Escherichia coli ATCC 8739, Enterobacter

aerogenes ATCC 13048 y Salmonella typhimurium ATCC 14028, La cantidad de inoculo
utilizada para el recuento fue de 0.1ml según La figura 8 Analista 1
Recuento Recuento
Prueba microorganismo DILUCION UFC/ml UFC/ml
Tubo
# Replica 1 Replica 2
Escherichia 4 3x10-7 28x10=280 29x10=290
coli 5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 8739
Salmonella 4 3x10-7 27x10=270 29x10=290
typhimurium 5 3x10-8
3x10=30 3x10=30
ATCC 14028
Enterobacter 4 3x10-7 34x10=340 31x10=310

aerogenes 5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 13048
Escherichia 4 3x10-7 27x10=270 28x10=280

coli
5 3x10-8 2x10=20 3x10=30
ATCC 8739
Salmonella 4 3x10-7 27x10=270 28x10=280
typhimurium 5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 14028
2 Enterobacter 4 3x10-7 27x10=270 26x10=260
aerogenes
5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 13048
Escherichia coli 4 3x10-7 29x10=290 29x10=290
ATCC 8739
5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
Salmonella 4 3x10-7
28x10=280 27x10=270
typhimurium
5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 14028
3
aerogenes 5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 13048
45
Tabla 14. Estandarización de inóculos Escherichia coli ATCC 8739, Enterobacter
aerogenes ATCC 13048 y Salmonella typhimurium ATCC 14028, La cantidad de inoculo
utilizada para el recuento fue de 0.1ml segun La figura 8 – Analista 2
Recuento Recuento
Prueba Microorganism Tubo DILUCION UFC/ml UFC/ml
o # Replica 1 Replica 2
Escherichia 4 3x10 -7
26x10=260 28x10=280
coli 5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 8739
Salmonella 4 3x10-7 26x10=260 29x10=290
typhimurium
1 5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 14028
aerogenes
5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 13048
Escherichia 4 3x10-7 28x10=280 29x10=290
coli
5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 8739
Salmonella 4 3x10-7 26x10=260 29x10=290
typhimurium
5 3x10-8 3x10=20 3x10=30
ATCC 14028
2 Enterobacter 4 3x10-7 29x10=290 28x10=280
aerogenes 5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 13048
Escherichia 4 3x10-7 28x10=280 28x10=180
coli
5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 8739
Salmonella 4 3x10-7 29x10=290 28x10=280
typhimurium
5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 14028
Enterobacter 4 3x10 -7
29x10=290 28x10=280
3
aerogenes
5 3x10-8 3x10=30 3x10=30
ATCC 13048
46
6.2. VERIFICACIÓN DE PROGRAMA DE CALIBRACIÓN Y MANTENIMIENTO DE
EQUIPOS DE INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
Tabla 15. Programa de Calibración y mantenimiento de los equipos utilizados en la

validación.
EQUIPO MARCA/ ULTIMA PROXIMA PROVEEDOR

MODELO VERIFICACION VERIFICACION
Incubadora M: 06-08-08 M: 06-02-09 Tecnibásculas y

Hongos MEMMERT / balanzas E. U.
Rango 20-25 ºC U40
Incubadora PRECISION M: 06-08-08 M: 06-02-09 Tecnibásculas y

Bacterias SCIENTIFIC / balanzas E. U.
Rango 30-35 CAT 31468
ºC
ICASA / M: 06-08-08 M: 06-02-09 Tecnibásculas y
Nevera NE balanzas E. U.
2-8 ºC
PAF / CF: 19-02-08 CF: 19-02-08 Interpharm de

Cabina de flujo NE Colombia Ltda.
laminar
OHAUS / M:06-08-08 M: 06-02-09 Tecnibásculas y

Balanza 700-800 balanzas E. U.
mecánica
CARL ZEISS M:05-03-08 M: 05-03-09 Tecnibasculas y

Microscopio JENA / balanzas E. U.
BINOCULAR
M: 06-08-08 M: 06-02-09 Tecnibásculas y

pH-metro SCHOTT / CG balanzas E. U.
820
Fuente: INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
M: MANTENIMIENTO C: CALIBRACIÓN CF: CALIFICACIÓN N.E: NO EXISTE
6.3 PRUEBAS PRELIMINARES
6.3.1. Prueba de esterilidad del medio de cultivo
Para evaluar la prueba de esterilidad del agar chromocult, se escoge el 10% del medio
preparado y se lleva a incubar a temperatura 30-35oC, durante 24 horas, pasado el
tiempo de incubación, no se observó ningún tipo de crecimiento microbiano, asegurando
el cumplimiento de la prueba de esterilidad para el agar chromocult.
47
6.3.2 Prueba de promoción de crecimiento
En la siguiente tabla se puede apreciar los resultados de la prueba de promoción de

crecimiento, según el ensayo realizado de tipo cualitativo, los resultados del ensayo de
tipo cuantitativo, son los mismos de las tablas 13 y 14 en las cuales se encuentran
tabulados los resultados de la prueba de estandarización del inoculo.
Tabla 16. Prueba de promoción de crecimiento

MICROORGANISMO CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS EN
AGAR CHROMOCULT
Colonias pequeñas, con pigmentación morada
Escherichia coli debida a corta el sustrato X-glucoronido y Salmon
– GAL.
Enterobacter aerogenes Colonias rosadas, pequeñas, con pigmentación
rosada debido a que solo corta el sustrato Salmon-
GAL.
Colonias pequeñas, puntiformes y de coloración
Salmonella typhimurium blanca debido a que no corta ningún sustrato del
medio.
6.3.3. Controles microbiológicos durante el proceso
Tabla 17. Resultados del control microbiológico de ambiente, superficie y analista

durante los ensayos realizados. Analista 1
AMBIENTE UFC/ hora SUPERFICIE UFC/25cm2 ANALISTA UFC/placa

Pared Guantes Guantes
Cabina Área Cabina Recuentos Inicio Final
ENSAYOS M HyL M HyL M HyL M HyL M HyL M HyL
0 0 0 0
Max Max Max Max Max Max Max Max
12 12 12 12 3 1 7 5
Ensayo 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 1
Ensayo 3 0 0 BG- 1H 0 0 BG- 0 0 0 0 0
Ensayo 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
CUMPLE SI SI SI SI SI SI SI SI SI SI SI SI
48
M: bactérias mesófilas
L: Levadura
H: hongo
BG+: Bacilos Gram positivos
BG-: Bacilos Gram negativos
Tabla 18. Resultados del control microbiológico de ambiente, superficie y analista

durante los ensayos realizados. Analista 2
AMBIENTE UFC/ SUPERFICIE ANALISTA
hora UFC/25cm2 UFC/placa
Pared Guantes Guantes
Cabina Área Cabina Recuentos Inicio Final
ENSAYOS M HyL M HyL M HyL M HyL M HyL M HyL
0 0 0 0
Max Max Max Max Max Max Max Max
Especificación 12 12 12 12 3 1 7 5
Ensayo 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 1
Ensayo 3 0 0 BG- 1H 0 0 BG- 0 0 0 0 0
Ensayo 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ensayo 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
SI SI SI SI SI SI SI SI SI SI SI SI
CUMPLE
M: bactérias mesófilas
L: Levadura
H: hongo
BG+: Bacilos Gram positivos
BG-: Bacilos Gram negativos
Los resultados obtenidos para el control microbiológico de ambientes, superficies y

dotación de analistas CUMPLEN con las especificaciones establecidas por el laboratorio
INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda
49
6.4. MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA DETECCIÓN DE
COLIFORMES TOTALES Y FECALES
6.4.1. Control negativo.
Los resultados del control negativo en la prueba, fueron satisfactorios, debido a que en
ningún análisis realizado se presento crecimiento.
Tabla 19. Resultados control negativo. Analista 1
Muestras 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Recuentos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
UFC/100ml
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tabla 20. Resultados control negativo. Analista 2
Muestras 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Recuentos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
UFC/100ml
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6.4.2. Prueba estándar y solución de prueba
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 1, para el ensayo de la
solución prueba mas E. coli ATCC 8739, comparados con los resultados de la prueba estándar
(agua estéril), también llamada control positivo
50
Solución de prueba: Agua potable + E.coli ATCC 8739
Analista 1: Aura María Lozano
Solución Replica Solución Prueba Porcentaje de Desviación Coeficiente de
recuperación estándar variación
de prueba de prueba estandar
(%)
UFC/100ml UFC/100ml
1 32 34
2 29 31
1 3 34 31
Promedio 32 32
100 2.5 7.0
1 30 35
2 32 32
3 30 30
Promedio 31 32
2 97 1.1 3.0
1 28 31
2 27 33
3 31 30
Promedio 29 31
3 92 2.0 6.0
1 29 31
2 28 30
3 30 29
Promedio 29 30
4 93 1.0 3.0
1 31 28
2 29 29
3 28 30
Promedio 29 29
5 100 1.5 5.0
1 16 18
2 17 18
3 18 19
Promedio 17 18
6 94 1.0 5.0
1 30 31
2 31 33
3 28 29
Promedio 30 31
7 97 1.5 5.0
1 29 30
2 27 30
3 30 31
Promedio 29 30
8 97 1.5 5.0
1 30 31
2 31 33
3 29 29
Promedio 30 31
9 97 1.0 3.0
1 31 33
2 33 33
3 32 35
Promedio 32 33 97 1.0 3.0
10
Tabla 21. Comparativo del porcentaje de recuperación E.coli ATCC 8739 en la solución de
prueba y prueba estándar
51
FIGURA 13. Porcentaje de recuperación de E.coli ATCC 8739
solución prueba mas Enterobacter aerogenes ATCC 13048, comparados con los resultados
de la prueba estándar (agua estéril), también llamada control positivo.
52
Solución de prueba: Agua potable + Enterobacter aerogenes ATCC 13048
Solución Replica Solución de Prueba Porcentaje de Desviación Coeficiente de
de prueba prueba estándar
(%)
UFC/100ml UFC/100ml
1 29 30
2 30 35
1 3 28 33
Promedio 29 33
88 1.0 3.4
1 31 31
2 27 30
3 29 32
Promedio 29 31
2 93 2.0 6.8
1 30 30
2 25 30
3 28 31
Promedio 28 30
3 2.5 10
93
1 28 30
2 27 31
3 28 28
Promedio 28 30
4 0.5 1.7
93
1 29 32
2 29 29
3 27 28
Promedio 28 30
5 93 1.1 3.9
1 29 30
2 29 30
3 30 30
Promedio 29 30
6 96 0.5 1.7
1 32 36
2 30 35
3 29 30
Promedio 30 33
7 90 1.5 5.0
1 31 33
2 27 30
3 29 30
Promedio 29 31
8 93 2.0 6.8
1 30 30
2 26 29
3 29 30
Promedio 28 30
9 93 2.0 7.0
1 29 33
2 30 31
3 29 29
Promedio 29 31 93 0.5 1.7
10
Tabla 22. Comparativo del porcentaje de recuperación de Enterobacter aerogenes ATCC

13048 en la solución de prueba y prueba estándar
53
FIGURA 14. Porcentaje de recuperación de E. aerogenes ATCC 13048
solución prueba mas Salmonella typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados
54
Solución de prueba: Agua potable + Salmonella typhimurium ATCC 14028
de prueba de prueba estándar
(%)
UFC/100ml UFC/100ml
1 26 31
2 27 29
1 3 29 33
Promedio 27 31
87 1.5 5.5
1 29 29
2 30 31
3 27 33
Promedio 29 31
2 93 1.5 5.0
1 27 31
2 29 30
3 28 29
93 1.0 3.5
Promedio 28 30
3
1 29 31
2 27 29
3 28 30
Promedio 28 30
4 93 1.0 3.5
1 30 30
2 29 29
3 27 28
Promedio 29 29
5 100 1.5 5.0
1 26 29
2 29 31
3 28 29
Promedio 28 30
6 93 1.5 5.0
1 27 30
2 29 32
3 28 29
Promedio 28 30
7 93 1.0 3.5
1 25 27
2 27 29
3 29 32
Promedio 27 29
8 93 2.0 7.4
1 29 30
2 26 31
3 26 28
Promedio 27 30
9 90 1.7 6.2
1 26 30
2 30 31
3 29 27
Promedio 28 29 96 2.0 7.0
10
Tabla 23. Comparativo del porcentaje de recuperación de Salmonella typhimurium

ATCC 14028 en la solución de prueba y prueba estándar
55
FIGURA 15. Porcentaje de recuperación de S. typhimurium ATCC 14028
solución prueba más E.coli ATCC 8739, comparados con los resultados de la prueba estándar
(agua estéril), también llamada control positivo
56
Solución de prueba: Agua potable + E.coli ATCC 8739
Solución Replica Solución de Prueba Porcentaje de Desviación Coeficiente
recuperación estándar de variación
(%)
UFC/100ml UFC/100ml
1 35 31
2 29 32
1 3 29 30
Promedio 31 31
100 3.4 10.9
1 26 32
2 29 35
3 30 34
Promedio 28 34
2 82 2.0 7.1
1 29 30
2 29 32
3 30 30
Promedio 29 31
3 93 0.5 1.7
1 29 30
2 29 29
3 28 28
Promedio 29 29
4
100 0.5 1.7
1 27 29
2 28 29
3 29 31
Promedio 28 30
5
93 1.0 3.5
1 18 18
2 19 20
3 19 21
Promedio 19 20
6
95 0.5 2.6
1 29 30
2 28 29
3 30 32
Promedio 29 30
7
97 1.0 3.4
1 26 29
2 30 29
3 29 31
Promedio 28 30
8 93 2.0 7.1
1 29 30
2 30 30
3 28 28
Promedio 29 29
9
100 1.0 7.1

1 30 32
2 29 33
3 32 30
Promedio 30 32
10
94 1.5 5.0
Tabla 24. Comparativo del porcentaje de recuperación de E. coli ATCC 873 en la
solución de prueba y prueba estándar
57
FIGURA 16. Porcentaje de recuperación de E. coli ATCC 8739
solución prueba mas Enterobacter aerogenes ATCC 13048, comparados con los resultados
de la prueba estándar (agua estéril), también llamada control positivo
58
Solución de prueba: Agua potable + Enterobacter aerogenes ATCC 13048
de prueba de prueba estándar
(%)
UFC/100ml UFC/100ml
1 28 32
2 31 32
1 3 30 34
Promedio 30 33
91 1.5 5.0
1 29 30
2 27 31
3 29 33
Promedio 29 31
2 93 1.1 3.7
1 26 30
2 30 32
3 27 29
Promedio 28 30
3
90 2.0 7.1
1 29 30
2 29 29
3 27 30
Promedio 28 30
4 93
1.1 4.0
1 30 31
2 26 28
3 27 29
Promedio 28 29
5
96 2.0 7.1
1 32 36
2 33 35
3 29 30
Promedio 31 34
6
91 2.0 6.4
1 29 30
2 28 32
3 30 33
Promedio 29 32
7
91 1.0 3.4
1 31 33
2 31 33
3 29 31
Promedio 30 32
8
94 1.1 3.6
1 29 32
2 29 30
3 28 32
Promedio 29 31
9
93 0.5 1.7
1 29 30
2 27 33
3 29 30
Promedio 29 31
10
93 1.1 3.7
Tabla 25. Comparativo del porcentaje de recuperación de Enterobacter aerogenes
59
FIGURA 17. Porcentaje de recuperación de E. aerogenes ATCC 13048
solución prueba mas Salmonella typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados
60
Solución de prueba: Agua potable + Salmonella typhimurium ATCC 14028
Solución Replica Solución de Prueba Porcentaje de Desviación Coeficiente de
(%)
UFC/100ml UFC/100ml
1 35 31
2 28 33
1 3 27 34
Promedio 30 33
91 4.3 14.3
1 26 31
2 28 30
3 29 34
Promedio 28 32
2
87 1.5 5.3
1 27 30
2 28 31
3 28 29
Promedio 28 30
3
93 0.5 1.7
1 27 30
2 26 27
3 29 31
Promedio 27 29
4
93 1.5 5.5
1 29 29
2 26 28
3 30 30
Promedio 28 29
5
96 2.0 7.1
1 27 28
2 29 30
3 30 32
Promedio 29 30
6
97 1.5 5.1
1 28 32
2 29 35
3 30 34
Promedio 29 34
7
85 1.0 3.4
1 33 34
2 30 32
3 29 31
Promedio 31 32
8
97 2.0 6.4
1 30 30
2 30 33
3 28 29
Promedio 29 31
9
93 1.1 3.7
1 29 29
2 29 32
3 30 30
Promedio 29 30
10
97 0.5 2.5
Tabla 26. Comparativo del porcentaje de recuperación de Salmonella typhimurium
61
FIGURA 18. Porcentaje de recuperación de S. typhimurium ATCC 14028
6.5. RECUENTO COMBINADO DE LOS MICROORGANISMOS EVALUADOS EN

EL MEDIO.
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 1, para el ensayo de
recuentos combinados, en donde se adicionó al agua potable 0.5 ml de la dilución 3x10 -8
(30 UFC/ml) de Escherichia coli ATCC 8739 y 0.5 ml de la dilución 3x10 -8 de Salmonella
typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados de la prueba estándar (agua estéril),
también llamada control positivo
62
Analista 1: Aura Lozano
Solución Replica Solución de Prueba Recuento Control (+)
de prueba prueba estándar UFC/100ml
S. typhimurium
E. coli UFC/100ml
UFC/100ml
UFC/100ml
1 12 34 14 31
2 10 31 15 29
1 3 14 31 12 33
Promedio 12 32 13 31
1 15 35 12 29
2 17 32 14 31
3 12 30 11 33
2
1 7 31 13 31
2 6 33 12 30
3 7 30 11 29
Promedio 6 31 12 30
3
1 15 31 16 31
2 13 30 14 29
3 10 29 12 30
4
1 13 28 15 30
2 12 29 12 29
3 14 30 14 28
5
1 15 18 12 29
2 12 18 16 31
3 13 19 14 29
6
1 15 31 13 30
2 13 33 14 32
3 14 29 12 29
7
1 12 30 15 27
2 16 30 12 29
3 15 31 11 32
8
1 13 31 13 30
2 14 33 15 31
3 12 29 13 28
9
1 14 33 12 30
2 15 33 14 31
3 11 35 11 27
10
Tabla 27. Recuento Agua potable + Escherichia coli ATCC +
(30 UFC/ml) de Enterobacter aerogenes ATCC 13048 y 0.5 ml de la dilución 3x10 -8 de
Salmonella typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados de la prueba estándar
(agua estéril), también llamada control positivo.
63
S. typhimurium
E. aerogenes UFC/100ml
UFC/100ml
UFC/100ml
1 14 30 16 31
2 12 35 13 29
1 3 16 33 15 33
1 12 31 13 29
2 14 30 14 31
3 13 32 12 33
2
1 12 30 16 31
2 14 30 15 30
3 14 31 16 29
3
1 12 30 15 31
2 11 31 16 29
3 15 28 14 30
4
1 12 32 16 30
2 14 29 15 29
3 11 28 15 28
5
1 12 30 13 29
2 12 30 12 31
3 11 30 15 29
6
1 14 36 12 30
2 13 35 13 32
3 13 30 11 29
7
1 16 33 14 27
2 12 30 12 29
3 13 30 15 32
8
1 17 30 13 30
2 13 29 16 31
3 12 30 11 28
9
1 13 33 13 30
2 12 31 12 31
3 14 29 14 27
10
Tabla 28. Recuento Agua potable + Enterobacter aerogenes ATCC 13048 +
Salmonella typhimurium ATCC 14028.
Escherichia coli ATCC 8739, comparados con los resultados de la prueba estándar (agua
estéril), también llamada control positivo.
64
E. coli
UFC/100ml
UFC/100ml
1 12 30 13 34
2 16 35 15 31
1 3 14 33 13 31
1 12 31 11 35
2 13 30 13 32
3 14 32 13 30
2
1 12 30 9 31
2 15 30 7 33
3 12 31 8 30
Promedio 13 30 8 31
3
1 15 30 12 31
2 16 31 10 30
3 14 28 14 29
4
1 10 32 15 28
2 10 29 16 29
3 10 28 14 30
5
1 12 30 13 18
2 10 30 11 18
3 14 30 14 19
6
1 8 36 12 31
2 10 35 12 33
3 9 30 15 29
Promedio 9 33 13 31
7
1 12 33 12 30
2 15 30 15 30
3 11 30 15 31
8
1 13 30 12 31
2 12 29 13 33
3 14 30 13 29
9
1 11 33 11 33
2 14 31 10 33
3 15 29 13 35
10
Tabla 29. Agua potable + Enterobacter aerogenes ATCC 13048 +
(30 UFC/ml) de Escherichia coli ATCC 8739 y 0.5 ml de la dilución 3x10 -8 de Salmonella
typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados de la prueba estándar (agua estéril),
también llamada control positivo.
65
Analista 2: Marcela carrillo
S. typhimurium
E. coli UFC/100ml
UFC/100ml
UFC/100ml
1 13 31 16 31
2 10 32 14 33
1 3 12 30 13 34
1 12 32 15 31
2 11 35 12 30
3 14 34 11 34
2
1 12 30 14 30
2 15 32 13 31
3 13 30 15 29
3
1 15 30 14 30
2 17 29 13 27
3 13 28 11 31
4
1 12 29 16 29
2 14 29 15 28
3 12 31 12 30
5
1 13 18 14 28
2 12 20 12 30
3 15 21 10 32
6
1 10 30 12 32
2 10 29 15 35
3 13 32 14 34
7
1 13 29 13 34
2 12 29 12 32
3 14 31 15 31
8
1 13 30 14 30
2 16 30 12 33
3 11 28 15 29
9
1 12 32 11 29
2 15 33 14 32
3 10 30 14 30
10
Tabla 30. Agua potable + Escherichia coli ATCC +
Salmonella typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados de la prueba estándar
(agua estéril), también llamada control positivo.
66
S. typhimurium
UFC/100ml
UFC/100ml
1 15 32 16 31
2 13 32 15 33
1 3 14 34 15 34
1 15 30 12 31
2 17 31 10 30
3 12 33 13 34
2
1 13 30 16 30
2 12 32 15 31
3 11 29 12 29
3
1 15 30 14 30
2 13 29 12 27
3 11 30 13 31
4
1 14 31 13 29
2 12 28 16 28
3 10 29 10 30
5
1 10 36 14 28
2 12 35 10 30
3 11 30 11 32
6
1 13 30 12 32
2 15 32 14 35
3 12 33 13 34
7
1 12 33 12 34
2 15 33 14 32
3 10 31 11 31
8
1 12 32 13 30
2 14 30 11 33
3 13 32 10 29
9
1 15 30 14 29
2 12 33 15 32
3 14 30 11 30
10
Escherichia coli ATCC 8739, comparados con los resultados de la prueba estándar (agua
estéril), también llamada control positivo.
67
E. coli
UFC/100ml
UFC/100ml
1 15 32 16 31
2 13 32 14 32
1 3 14 34 15 30
1 15 30 12 32
2 17 31 15 35
3 12 33 10 34
2
1 13 30 14 30
2 12 32 15 32
3 11 29 12 30
3
1 15 30 14 30
2 13 29 12 29
3 11 30 13 28
4
1 14 31 16 29
2 12 28 16 29
3 10 29 14 31
5
1 10 36 14 18
2 12 35 10 20
3 11 30 13 21
6
1 13 30 12 30
2 15 32 14 29
3 10 33 13 32
7
1 12 33 15 29
2 10 33 12 29
3 15 31 11 31
8
1 14 32 13 30
2 12 30 10 30
3 10 32 14 28
9
1 15 30 12 32
2 12 33 10 33
3 10 30 15 30
10
68
FIGURA 19. Prueba de promoción de crecimiento de E. coli en agar chromocult
Fuente: Autor
FIGURA 20. Prueba de promoción de crecimiento de E. aerogenes
Fuente: Autor
69
FIGURA 21. Prueba de promoción de crecimiento de S. typhimurium
Fuente: Autor
FIGURA 22. Solución de prueba: E. coli en agar chromocult
Fuente: Autor
FIGURA 23. Solución de prueba: S. typhimurium en agar chromocult
70
7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Durante el procesamiento de las muestras, los resultados del control microbiológico de

ambientes, superficies y dotación de los analistas, fueron confiables. En las tablas 17 y
18, se observa que los controles microbiológicos de ambientes y superficies para la
cabina de flujo laminar y el área, cumplen con las especificaciones establecidas por
INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda., lo que asegura que las condiciones de trabajo en
las pruebas evaluadas, fueron óptimas. Al realizar las pruebas bajo condiciones
ambientales controladas se reducen falsos positivos por contaminación microbiana
cruzada, esto se garantiza con el proceso de limpieza y desinfección para el área de
recuentos y el laboratorio, siendo primordial para obtener resultados confiables durante
la validación.
La calificación y verificación de equipos es de suma importancia dentro de la

metodología por lo cual se evidenció que los equipos utilizados en la validación y etapa
experimental con relación a la fecha de calibración, calificación y verificación, se
encontraban vigentes; por consiguiente se puede asegurar que los equipos utilizados
funcionan de acuerdo con sus especificaciones operacionales establecidas. (Tabla
No.15).
Para evaluar la prueba de esterilidad en cada uno de los medios de cultivo preparados y
utilizados, se escogió el 10% de los medios de cultivo preparados en cada prueba (USP,
31) y se llevó a incubar a la temperatura y tiempo específicos (24 h a 30-35 oC) para
cada uno de los medios, pasado el tiempo de incubación no se observó ningún tipo de
crecimiento microbiano, asegurando que los resultados obtenidos en la prueba de
esterilidad de los medios es confiable dentro del proceso de validación.
El control de calidad en la preparación y evaluación de los medios de cultivo es

considerado como parte esencial y buena práctica de laboratorio, la cual es necesaria
para mantener el nivel y la ejecución de cualquier técnica microbiológica. Por está razón,
se le confiere una gran importancia y está considerado como uno de los puntos críticos
de control en el análisis microbiológico, del cual depende la seguridad de los resultados
que emiten los laboratorios de ensayo. De esta manera un medio de cultivo debe
contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios, además de estar exento de
todo microorganismo contaminante, ya que de la inocuidad y capacidad del medio de
promover el crecimiento de los microorganismos depende un buen resultado en el
análisis microbiológico. (Ligthfood, 2002). Es así, como la prueba de promoción de
71
crecimiento demostró que el medio de cultivo (agar chromocult) contiene los nutrientes
necesarios para el desarrollo y crecimiento de coliformes totales y fecales debido a que
se obtuvo una recuperación mayor del 70% de los microorganismos que fueron
inoculados; (tablas 21- 26) esto concuerda con lo establecido en la USP 31 (Sección
1227 “validación de métodos de neutralización – comparaciones de recuperación”), en la
que se detalla claramente que el numero de UFC recuperadas del producto (para
nuestro caso muestras de agua) no debe ser menor del 70% del numero recuperado del
control del inoculo (prueba estándar – control positivo); por otro lado como se puede ver
en cada una de las figuras los limites oscilan entre 50 y 200, debido a que según la
USP 31 en su capitulo 61 “EXAMEN MICROBIOLOGICO DE PRODUCTOS NO
ESTERILES: PRUEBAS DE RECUENTO MICROBIANO”, especifica que para medios
sólidos, el crecimiento obtenido no debe diferir en un factor mayor de dos a partir del
valor calculado para un inoculo estandarizado, lo cual concuerda con los resultados
obtenidos debido a que ningún recuento obtenido se sale se los limites establecidos, de
acuerdo con el limite de tendencia central obtenido gracias a los recuentos de nuestro
control positivo (prueba estándar 100%), los cuales sirvieron como base para la
comparación con los recuentos obtenidos en la solución de prueba, como se puede ver
en cada una de las graficas, los porcentajes de recuperación en cada una de las pruebas
están muy cercanos al valor central lo que nos indica que los resultados con muy
coherentes con los obtenidos en la prueba estándar.
Igualmente, al inocular las cepas ATCC sobre el agar chromocult se obtuvieron las
características macroscópicas típicas de cada una (Ver tabla No 16) y también se realizó
coloraciones de Gram a las colonias para evaluar las características microscópicas.
Además, el crecimiento de los microorganismos se obtuvo en un tiempo de 24 horas, de
esta manera, se establece que los medios cromogénicos poseen una ventaja sobre los
medios tradicionales, debido a que la detección de coliformes totales y fecales se obtiene
de una manera rápida (M.A YANEZ et al., 2005); esto gracias a que los sustratos que
presenta el medio son los específicos para que las enzimas que presentan tanto E.coli
como Enterobanter aerogenes, sean escindidos y de esta manera se puede, se produzca
un reacción rápida y sensible (Rompre,A et al., 2001).
En los ensayos estándar (control positivo) del método de recuento para coliformes
fecales, (Escherichia coli ATCC 8739), coliformes totales (Enterobacter aerogenes ATCC
13048) y Salmonella typhimurium ATCC 14028, la recuperación de los microorganismos
fue de 16-36 UFC/100ml, tal como se puede ver en las tablas 21 – 26, donde se
compara la prueba estándar y la solución de prueba. Cabe destacar que para la prueba
estándar, el vehículo de transporte de los microorganismos evaluados fue agua estéril
72
para inyección, debido a que es un agua en la que no se va a encontrar ninguna
interferencia (como cloro u otros elementos) que impida el crecimiento, lo que nos
llevaría a reportar falsos positivos y para la solución de prueba se utilizó agua potable.
Debido a que validar es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de
evidencia documentada que un proceso especifico producirá de forma consistente
productos que reunirán las características de calidad predefinidas (CORTES, 2002; FDA,
1987) para tal fin, se identificaron los factores que influyen en la validez de la prueba y
los pasos a seguir para el desarrollo de la validación del método de filtración por
membrana empleado para la detección de coliformes totales y fecales en agar
chromocult para agua potable, en donde se empleó una serie de datos para determinar
que realmente es eficaz y se obtienen resultados confiables; para esto se evaluaron
parámetros cuantitativos de validación como: especificidad, precisión (repetitividad y
reproducibilidad), y exactitud.
La especificidad se obtuvo al comparar las medias y los datos del porcentaje de

recuperación entre la prueba estándar y la solución de prueba, para el recuento de
coliformes fecales (Escherichia coli ATCC 8739 ), el porcentaje de recuperación es de
96.4%; para el recuento de coliformes totales (Enterobacter aerogenes ATCC 13048) es
del 92.5% y para Salmonella typhimurium ATCC 14028 el porcentaje de recuperación es
de 93.7%; los resultados anteriormente obtenidos concuerdan con los obtenidos en el
estudio de MAHEUX. A. et al. (2008), en el cual se obtuvieron porcentajes de
recuperación para E .coli semejantes, por tanto se puede concluir que la recuperación
de los coliformes fecales fue mayor que la de los otros dos microorganismos, lo anterior
se debe a que Escherichia coli es la única especie dentro de las enterobacterias que
presenta la enzima B-D- Glucoronidasa, que degrada el sustrato 4-metilumberiferil-β-D-
glucorónico (MUG) y el contenido de triptófano revela la reacción de indól y aumenta con
ello la identificación, en combinación con la reacción X-GAL y la reacción MUG, siendo
esta una ventaja para el crecimiento de este microorganismo.
Los porcentajes de recuperación anteriormente citados son reportados gracias a los

recuentos de colonias obtenidos por el conteo de colonias características para cada
especie gracias al color que tomaron las colinas, para este estudio la cepa de
Enterobacter aerogenes que fue el coliforme total seleccionado, tomo una coloración
rosada – roja; la colonia de E. coli tomo una coloración azul-violeta y la colonia de
Salmonella typhimurium tomo una coloración blanca, esto concuerda con los resultados
encontrados en el estudio realizado por M.A YANEZ et al. (2005), en el cual se
escogieron los mismos microorganismos y se presentaron las mismas coloraciones en
las colonias; las coloraciones características se deben principalmente a que los
73
coliformes totales solo pueden escindir uno de los sustratos, mientras que E. coli puede
escindir los dos sustratos.
Según la USP 31, 2008 la repetibilidad es la medida de la precisión del método cuando
éste se realiza por el mismo analista, el mismo día, mismos reactivos y mismo
instrumento, y la reproducibilidad se mide cuando el ensayo se realiza por diferentes
analistas, diferentes días y diferentes instrumentos, por lo tanto estos parámetros nos
indican la precisión del método de recuento, la cual se mide con la dispersión de la
medida alrededor de un valor medio o central y mide la concordancia entre ensayos
individuales cuando el método se aplica repetidas veces a muestras separadas e
idénticas, obtenidas del mismo lote de material homogéneo ( en este caso muestras de
agua potable obtenidas de la misma fuente, la llave del área de lavado del laboratorio).
De esta manera y de acuerdo a los resultados se determinaron los valores de las
medias, las desviaciones estándar y los coeficientes de variación obtenidos en cada una
de los ensayos y con cada uno de los analistas.
Al establecer la reproducibilidad y la repetibilidad del método, se demuestra que no hay

diferencia significativa entre los valores de las medias obtenidas por cada analista y
microorganismos evaluados, ni tampoco hay diferencia entre los valores de las medias
de cada analista, lo que muestra que el método evaluado es reproducible y repetible, y
que los resultados no van a diferir si los métodos son realizados por el mismo analista el
mismo día o por analistas diferentes en días diferentes.
De igual manera según los resultados obtenidos de las medias determinadas por cada
muestra de agua y microorganismo, se establece que el método es preciso (Tablas 21 -
26).
La exactitud de un método analítico es la proximidad entre los resultados de la prueba

obtenidos mediante el método y el valor verdadero (USP 31, 2008), este parámetro se
determinó comparando el porcentaje de recuperación de la solución de prueba con los
porcentajes de recuperación del ensayo estándar, determinando que en el método de
filtración por membrana para coliformes fecales el porcentaje de recuperación de los
microorganismos inoculados para el agua potable fue mayor al 96% (figura 13), mientras
que para los coliformes totales fue menor (90%) (Figura 14). Además se observó que
las desviaciones estándar y los coeficientes de variación no son muy variables en la
solución de prueba, y aunque existe un solo dato que sale del rango en cada una de las
tablas en los que se pueden encontrar los resultados obtenidos, este no tiene mucha
relevancia sobre los demás datos, debido a que no hay una dispersión notable; por otro
74
lado el coeficiente de variación nunca supera un valor de 10, lo cual es un valor aceptado
y utilizado en la industria farmacéutica (Tablas 21 - 26).
En la solución de prueba la recuperación de los microorganismos inoculados se

determinó por la presencia de características macroscópicas en agar chromocult, esta
recuperación fue del 96%, lo que indica que la adición de tiosulfato de sodio al 1% logra
inactivar el cloro presente en el agua potable, logrando así, recuperar casi la totalidad de
los microorganismos presentes en la muestra de agua (Figuras 22 - 23).
75
8. CONCLUSIONES
 Se realizó la validación del método de filtración por membrana para la detección

de coliformes totales y fecales para agua potable, utilizando agar chromocult en
el laboratorio INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda. Esta validación cumple con
los parámetros establecidos.
 Se demostró que el método de filtración por membrana para coliformes totales y

fecales para agua potable, en el LABORATORIO INTERPHARM DE COLOMBIA
Ltda. es repetible, reproducible, exacto y específico, según el POE – DCM 046
“DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN AGAR
CHROMOCULT”.
 Se comprobó la efectividad del agar chromocult como un método alternativo de

rápida recuperación para reducir costos y desarrollar técnicas con mayor eficacia
y seguridad en el laboratorio INTHERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
 Se demostró que el medio cromogénico utilizado en el método validado,

contiene los nutrientes necesarios para el desarrollo de los microorganismos
evaluados gracias a la óptima recuperación obtenida en la prueba de promoción
de crecimiento.
 Se logro evidenciar mediante la realización de un pool de microorganismos que

el medio presenta los sustratos adecuados para diferenciar el crecimiento de
diversos microorganismos mediante la coloración de las colonias.
76
9. RECOMENDACIONES
 Aunque los resultados obtenidos en este trabajo de grado, estaban dentro

de los parámetros esperados; se recomienda utilizar inóculos con un
número mayor de UFC/ml con el fin de evitar variaciones muy grandes en
los recuentos y por ende en los porcentajes de recuperación.
 Para próximos estudios de validación del método de detección de coliformes

totales y fecales, se debe tener en cuenta las pruebas preliminares de
promoción de crecimiento y esterilidad, las cuales se le deben realizar tanto
al medio que se esta evaluando (para este caso el agar chromocult), como a
los que se utilizan para la estandarización de los inóculos de trabajo y los
utilizados en las pruebas de controles positivos.
 Es aconsejable realizar una comparación entre el método a validar y el

método oficial, para de esta manera poder comparar los resultados
obtenidos entre cada uno de ellos y así establecer las ventajas del nuevo
método con respecto al tradicional
 Para próximas validaciones seria importante utilizando además de agar

chromocult, un medio de cultivo alterno, para tener una alternativa en caso
de que el laboratorio no cuente en un momento dado, con el medio que fue
validado el método.
 Es importante que para próximos estudios de validación de este método, se

realice adicionalmente pruebas bioquímicas para la identificación de cada
uno de los microorganismos utilizados en los ensayos de validación
 Se aconseja, tener en cuenta algún cambio de los equipos a lo largo de la

validación, ya que seria conveniente realizar una revalidación, utilizando los
equipos cambiados.
77
10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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y BBL Manual Estados Unidos. Págs. 590.
82
11. ANEXOS
ANEXO 1. Composición de los medios de cultivo (g/litro)
Agar Casoy: peptona de caseína 15g, peptona de harina de soya 5g, cloruro
sódico 5g, agar-agar 15g.
Agar Chromocult: peptona 3.0g, cloruro sódico 5.0g, dihidrogenofosfatopotasico

1.7g, hidrogenofosfato di potásico 3.0g, piruvato sódico 1.0g, triptófano 1.0g,
agar-agar 12.0g, laurilsultafo sódico 0.1g, mezcla de cromógenos 0.2g.
Agar Plate Count: peptona de caseína 5.0g, extracto de levadura 2.5g, D(+)-
glucosa 1.0g, agar-agar 14.0g
83

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VALIDACIÓN DEL MÉTODO DE DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN

AGUA POTABLE UTILIZANDO AGAR CHROMOCULT

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

DRA. JEINNY ROMERO TORRES DRA. JANETH ARIAS PALACIOS

INGRID SCHULER JANETH ARIAS

A la Dra. Janeth Arias, asesora, por su entrega, compromiso, comprensión y apoyo

Al Dr. Juan Carlos Jiménez, Director Administrativo de INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.,

A INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda., especialmente al área de microbiología, a Diana,

2.6. VALIDACIÓN Y SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO

6.4.METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA PARA DETECCION DE

TABLA 25. Porcentaje de recuperación de E. aerogenes ATCC: 13048 en la solución de

Con el fin de cumplir con las reglamentaciones gubernamentales y ayudar a mejorar la

2.1. AGUA POTABLE

Puede provenir de distintas fuentes, incluyendo los servicios públicos de agua, un

El peligro mas común y más difundido relativo al agua potable es el de su contaminación,

Figura 1: Fuente de agua

El agua potable no debe contener en ningún caso microorganismos considerados

No debe contener substancias o cuerpos extraños de origen biológico, orgánico,

Tabla 1. Características físicas del agua potable

Fuente: Resolución 2115 de 2007

Tabla 2. Características químicas de sustancias presentes en el agua

Fuente: Resolución 2115 de 2007.

2.1.2. Análisis microbiológico del agua

Se define análisis microbiológico a cada uno de los procedimientos de laboratorio que

Tomado de: Resolución 2115 de 2007.

2.1.3. Proceso de potabilización del agua

2.1.3.1 Inactivación del cloro en el agua potable

El compuesto utilizado para inactivar el cloro en el agua es el tiosulfato de sodio, el cual

Varios organismos patógenos de transmisión fecal-oral pueden estar presentes en el

Cabe señalar sin embargo, que aunque se reconoce que la determinación de la

2.2.1. Coliformes Totales

La prueba mas relevante utilizada para la identificación del grupo Coliformes, es la

2.2.1.1. Enterobacter aerogenes

Se encuentra en el tracto digestivo humano, aunque también libremente en el suelo y

Figura 2. Enterobacter aerogenes

Escherichia coli y Enterobacter aerogenes, son dos bacterias idénticas en muchas

2.2.2 Coliformes Fecales

Los coliformes fecales también denominados coliformes termotolerantes, llamados así

Perteneciente a la familia Enterobariaceae, son coliformes capaces de producir indol a

E.coli presenta características bioquímicas importantes que permiten la diferenciación

El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano.

Tabla 5. Características de Coliformes Totales y E. coli

2.2.3. Salmonella spp.

Salmonella spp se caracteriza bioquímicamente por su capacidad de fermentar la

Figura 4. Salmonella spp en agar XLD

2.3. TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA DETECCIÓN DE

Para la determinación de coliformes totales y fecales en agua potable, la legislación

La técnica de filtración por membrana utiliza un mecanismo mediante el cual se atrapan

Esta técnica es altamente reproducible y proporciona resultados numéricos, es una

Figura 5. Trampa de filtración

2.3.1. Filtros de membrana

Se recomienda utilizar filtros de membrana preesterilizados cuyos fabricantes garanticen

2.3.2. Tipos de filtro de membrana

2.3.2.1 Filtros de profundidad

Presenta ventajas como la alta capacidad de retención de partículas sobre su superficie

2.3.2.2 Filtros de superficie o membrana

2.3.2.2.1 Membrana de nitrato de celulosa

2.3.2.2.2 Membrana de acetato de celulosa

2.4. MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo es un sustrato o solución de nutrientes en donde crecen, y se

Los medios de cultivo se pueden clasificar de la siguiente manera:

Según su estado físico: líquidos, semisólidos y sólidos