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NORMA CUBANA
ISO 4832: 2002
(Publicada por ISO, 1991)
ICS: 07.100.30
1. Edicin
Diciembre 2002
REPRODUCCION PROHIBIDA
Oficina Nacional de Normalizacin (NC) Calle E No. 261 Vedado, Ciudad de La Habana.
Telf.: 830-0835 Fax: (537) 33-8048 E-mail: nc@ncnorma.cu
Prefacio
La Oficina Nacional de Normalizacin (NC), es el Organismo Nacional de Normalizacin
de la Repblica de Cuba que representa al pas ante las Organizaciones Internacionales y
Regionales de Normalizacin.
La preparacin de las Normas Cubanas se realiza generalmente a travs de los Comits
Tcnicos de Normalizacin. La aprobacin de las Normas Cubanas es competencia de la
Oficina Nacional de Normalizacin y se basa en evidencias de consenso.
Esta Norma Cubana:
Ha sido elaborada, por el NC/CTN No. 61 de Microbiologa, integrado por las siguientes Instituciones:
- Ministerio de Salud Pblica (UNSA)
-
Es una adopcin idntica por el mtodo de traduccin de la ISO 4832: 1991 Microbiology.
General guidance for enumeration of coliforms. Colony count technique.
Con independencia de la existencia de normas ISO para productos especficos, la NC-ISO
4832 se aplicar para todos los alimentos para consumo humano y de animales.
Sustituye a la NC 76-04-3: 82: Productos alimenticios y bebidas. Mtodos de ensayo microbiolgicos. Determinacin de microorganismos coliformes; y a la NC 74-39: 86: Ganadera.
Alimentacin animal. Determinacin de microorganismos coliformes.
NC, 2002
Todos los derechos reservados. A menos que se especifique, ninguna parte de esta publicacin podr ser reproducida o utilizada por alguna forma o medios electrnicos o mecnicos, incluyendo las fotocopias o microfilmes, sin el permiso previo escrito de:
Oficina Nacional de Normalizacin (NC).
Calle E No. 261 Ciudad de La Habana, Habana 3. Cuba.
Impreso en Cuba
II
NC
NC
4.3 Clculo del nmero de coliformes por mililitro o por gramo de muestra a partir del nmero de
colonias caractersticas en las placas seleccionadas (ver 10.1).
5 Medio de cultivo y dilucin
5.1 General
Para la marcha prctica ver ISO 7218.
5.2 Dilucin
Ver NC ISO 6887-1.
5.3 Medio slido selectivo: Agar rojo violeta bilis (VRBL)
Composicin:
Peptona
Extracto de levadura
Lactosa
Cloruro de sodio
Sales de bilis
Rojo neutro
Violeta cristal
Agar
Agua destilada
1)
7g
3g
10 g
5g
1.5 g
0.03 g
0.002 g
12 g a 18 g 1)
1000 mL
Preparacin:
Proceda como sigue para conservar el poder selectivo y la especificidad del medio.
Agite los componentes o el medio completo deshidratado con el agua destilada y deje reposar unos minutos.
Ajuste el pH a 7.4 a 250C.
Posteriormente se mezcla bien calentando y agitando hasta su ebullicin. Deje ebullir por 2
min.
A continuacin coloque el medio en bao de agua (6.5) a 47 2 C.
Evite el recalentamiento del medio, calentando por tiempo prolongado o recalentando.
Este medio no puede ser esterilizado en autoclave, se debe preparar momentos antes de usarlo, chequee la esterilidad del medio en el momento del uso. (ver 9.2.2)
Deseche cualquier sobrante del mismo.
Utilice el medio no ms de 3 horas despus de su preparacin.
6 Aparatos y utensilios
Aparatos usuales en el laboratorio de microbiologa, y en particular los siguientes:
NC
6.1 Aparato para esterilizacin seca (horno) o para esterilizacin hmeda (autoclave)
6.2 Incubadoras a temperatura de (301) C, (351) C (371) C.
6.3 Placas de Petri de 90 mm a 100 mm de dimetro y 15 mm de altura.
6.4 Pipetas graduadas con capacidad de 10 mL y 1 mL.
6.5 Bao de agua de temperatura regulable ajustado a 47 2 C
6.6 Contador de colonias
6.7 Medidor de pH
6.8 Homogenizador con vaso esterilizable u homogenizador peristltico
6.9 Frascos para cultivo
NOTA: Pueden ser usados frascos, blancos o mbar, de 200 mL para cultivo con tapa adecua
da, que garantice la esterilidad.
7 Muestreo
Utilice un muestreo de acuerdo con una norma nacional o internacional establecida para el producto en cuestin.
Si no existe una norma nacional o internacional se recomienda que se realice el muestreo de
acuerdo entre partes.
8 Preparacin de la muestra de ensayo
Prepare la muestra de ensayo de acuerdo con la norma especfica para el producto en cuestin. Si
no existe una norma especfica se recomienda que se realice la preparacin de la muestra de
acuerdo entre las partes.
9. Procedimiento.
9.1 Porcin de ensayo. Suspensin inicial y diluciones
Ver NC ISO 6887-1 y la Norma Internacional especfica para el producto que se va a analizar.
9.2 Inoculacin e Incubacin.
9.2.1 Se cogen dos placas de Petri (6.3). Transfiera a cada placa con pipeta estril (6.4) 1 mL de la
muestra de ensayo si el producto es lquido, 1 mL de la suspensin 10 1 ,en el caso de otros productos se cogen otras dos placas de Petri (6.3). Transfiera a cada placa con pipeta estril (6.4)
1 mL de la dilucin 10 -1 si el producto es lquido 1 mL de la dilucin 10 2 en el caso de otros
productos.
NC
C
(n1 + 0,1n 2 )d
donde:
C: Sumatoria de las colonias contadas en todas las placas.
NC
N=
C
83 + 97 + 13 + 8
201
=
=
= 9136
2
(n1 + 0,1n 2 )d (2 + 0,1x 2) x10
0,022
Redondeando el resultado segn lo especificado anteriormente da 9100 9.1 x 103 coliformes/mL 9.1 x 103 coliformes/g de producto.
10.1.2 Caso donde cada placa contiene menos de 15 colonias caractersticas
Calcular el nmero estimado NE de coliformes utlizando la siguiente ecuacin que aparece en
10.1.1.
Ejemplo:
Una enumeracin de coliformes a 30C dio los siguientes resultados:
En la primera dilucin 10-4 140 y 145 colonias, de las cuales 5 y 3 colonias respectivamente fueron caractersticas.
En la dilucin 10-5: 11 y 8 colonias, de las cuales 0 y 1 colonias respectivamente fueron caractersticas.
N=
5 + 3 + 0 +1
9
=
= 4000
4
(2 + 0.1x 2) x10
2.2 x10 4
Redondeando el resultado segn lo especificado anteriormente da 4000 4.0 x 104 coliformes/mL 4.0 x 104 coliformes/ g de producto.
NC
menos de (15 x 1/d) coliformes/g (otros productos), donde d es el factor de dilucin de la suspensin inicial.
menos de (1x 1/d) coliforme/ g (otros productos), donde d es el factor de dilucin de la suspensin inicial.
10.2 Precisin
10.2.1 Placas conteniendo entre 15 y 150 colonias caractersticas. (Ver 10.1.1)
Por razones estadsticas solamente, en el 95% de los casos los limites de confiabilidad de este
mtodo varan desde 16% hasta 52% ( Cowell y Morisetti, J. Sci. Fd.Agric., 1969, Vol 20 P.
573). En la prctica puede encontrarse gran variacin especialmente cuando los resultados son
obtenidos por diferentes microbilogos.
10.2.2 Cada placa conteniendo menos de 15 colonias caractersticas (Ver 10.1.2)
Referirse a la tabla A.1. Para obtener los lmites de confiabilidad, multiplicar el lmite inferior y superior dado por 1/d donde d es el factor de dilucin de la suspensin inicial.
10.2.3 Estimacin de nmeros pequeos (Ver 10.1.3)
Los lmites de confiabilidad para la estimacin de nmeros pequeos de coliformes se ofrecen en
la tabla A.1.
11 Informe de ensayo
Debe especificar el mtodo usado, el objetivo de la prueba (tecnolgica o salud pblica) y la temperatura seleccionada y los resultados obtenidos. Debe tambin hacer mencin en detalles de las
operaciones que no estn especificada en este Normas Internacional o que se ofrecen como opcin. Adems debe incorporarse los detalles de cualquier incidente que puede tener influencia en
los resultados.
Este informe debe incluir toda la informacin necesaria para la completa identificacin de la muestra.
NC
Los lmites de confianza para el nivel de 95% para la estimacin de pequeos nmeros, cuando el
nmero de colonias caractersticas es menor que 15, estn dada en la tabla A.1.
Tabla A.1
Nmero de
coliformes
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
NC
Bibliografa
[1] COWELL and MORISETI. J. Sci. Food Agric., 1969 (Vol. 20), p. 573.