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Anlisis farmacutico
Mara Guillermina Volont
Pablo Quiroga (coordinadores)
FACULTAD DE
CIENCIAS EXACTAS
ANLISIS FARMACUTICO
2013
1. Farmacologa. I. Quiroga, Pablo II. Ruiz, Mara Esperanza, colab. III. Marano, Claudia,
colab. IV. Retaco, Patricia , colab. V. Ttulo
CDD 615.1
Fechadecatalogacin:25/10/2013
NDICE
Prlogo. Nstor O. Caffini
Captulo 1. Introduccin al Control de Calidad de Medicamentos.
Mara Guillermina Volont
Captulo 2. El Mtodo Analtico en el Control de Calidad.
Mara Guillermina Volont
Captulo 3. Cromatografa en Capa Fina (TLC). Pablo Quiroga
Captulo 4. Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC)
Mara Guillermina Volont
Captulo 5. Electroforesis Capilar. Pablo Quiroga
Captulo 6. Mtodos espectroscpicos aplicados al Anlisis
Farmacutico. Mara Guillermina Volont
Captulo 7. Mtodos de Anlisis Trmico. Mara Esperanza Ruiz
Captulo 8. Determinacin de Agua. Claudia Marano
Captulo 9. Anlisis Funcional. Patricia Retaco
Captulo 10. La Prueba de Disolucin. Mara Esperanza Ruiz
Captulo 11. Uniformidad de Unidades de Dosificacin.
Susana Gmez
Captulo 12. Estabilidad de Drogas y Medicamentos.
Mara Guillermina Volont
Captulo 13. Ensayos Biolgicos. Pablo Quiroga
Captulo 14. Trazabilidad de Medicamentos. Pablo Quiroga
Anexo I. Respuestas a los Test de Autoevaluacin
Los autores
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56
78
121
137
159
186
200
232
262
274
300
321
344
348
PRLOGO
Jean Cocteau deca que escribir era un acto de amor. Y es probable que as
sea, porque difcilmente el escritor lo hace tan slo para satisfacerse a s
mismo. De todos modos el escritor de ficciones o de ensayos raramente llegue
a conocer a la mayora de sus lectores, a diferencia del autor de un texto, que
seguramente tomar contacto con algunos de ellos (sus futuros alumnos).
Y este hecho le otorga caractersticas especiales al acto de escribir,
reafirmando que se trata de un acto de amor, como lo es la enseanza en s
misma, sea oral (presencial o virtual) o escrita.
Nstor O. Caffini
La Plata, Marzo de 2013
CAPITULO 1
INTRODUCCIN AL CONTROL DE CALIDAD DE MEDICAMENTOS
Mara Guillermina Volont
de
Elaboracin
de
Productos
Farmacuticos,
habitualmente
que los
10
de
Produccin:
independientes
segn
el
producto,
11
12
Control de Calidad
En cuanto al Control de Calidad, es la parte de las GMP que se refiere al
muestreo, especificaciones y ensayos necesarios para que las materias primas,
material de acondicionamiento y productos terminados, sean considerados de
buena calidad y por lo tanto aprobados para su distribucin y dispensacin.
El Departamento de Control de Calidad debe ser independiente de otros
departamentos, en especial del de Produccin, y estar bajo la autoridad de una
13
14
Normalizados
de
Trabajo,
denominados
tambin
15
16
17
18
tratamientos
individualizados
que
responden
necesidades
particulares.
Dentro de las pautas de actuacin tendientes a optimizar la prescripcin y
dispensacin de estos medicamentos, debemos considerar que solamente
debern ser utilizadas para cubrir vacos teraputicos (caso de medicamentos
peditricos no elaborados por las industrias farmacuticas) o adaptar los
medicamentos a los pacientes (modificacin de la forma farmacutica para
lograr una mejor aceptacin por parte del paciente, por ejemplo comprimidos
muy voluminosos destinados a pacientes con problemas de deglucin). Salvo
que, mediante una variacin de la dosis del principio activo o del excipiente se
pretenda una adaptacin del medicamento a la situacin clnica del paciente,
no se justifica una preparacin magistral cuya composicin sea igual que la de
una especialidad ya comercializada. De existir una especialidad que posea el o
los mismos principios activos prescriptos en cantidad igual a la especificada en
la prescripcin, con idntica va de administracin y que no contenga entre los
componentes de la formulacin sustancias no toleradas por el paciente, se
preferir siempre la dispensacin de la especialidad.
Por otra parte no se debern utilizar principios activos retirados del mercado,
por su ineficacia o falta de seguridad. Se debe procurar no asociar ms de dos
principios activos, salvo en aquellos casos en los que esa asociacin est
claramente indicada. Este principio se ajusta a los criterios del uso racional de
medicamentos, segn los cuales son pocas las ocasiones en que es necesario
asociar ms de dos principios activos. De esta manera se evitan los riesgos de
incompatibilidades fsico-qumicas que pueden afectar negativamente el efecto
farmacolgico.
No se debe elaborar, ni dispensar ms cantidad de la estrictamente necesaria.
Se evitarn as problemas de inestabilidad, de mayor consumo de dosis por
parte del paciente, etc.
19
20
21
poco
estables
y/o
txicos,
se
manipularn
conforme
agregado
los
medicamentos
magistrales
que
jerarquizan
la
dispensacin.
En la etiqueta debern figurar los siguientes datos: composicin cuali y
cuantitativa de los principios activos (utilizando el nombre en espaol de la
Denominacin Comn Internacional de la OMS, no aceptndose las sinonimias
o nombres alternativos);
22
23
y la
24
25
Las Farmacopeas
Las Farmacopeas constituyen las normas oficiales de calidad. Para el registro
de Medicamentos ante los Organismos de Control, no solo es necesario aportar
datos de seguridad y eficacia de las materias primas y los productos
terminados
sino
que
es
imprescindible
garantizar
esas
condiciones,
calidad
que
los
principios
activos
los
medicamentos
deben
obligatoriamente cumplir.
Para que un producto sea considerado de buena calidad deber responder
adecuadamente con una serie de estndares, como ser, identidad, pureza,
potencia, biodisponibilidad y estabilidad, cada uno de ellos involucra ensayos
especficos que el producto deber cumplir.
En las farmacopeas encontramos: Monografas de principios activos y
monografas de medicamentos, sin la dosis utilizada. En una monografa de un
principio activo se incluye:
Definicin
Sinonimia
Caracteres generales
Envasado y conservacin
Sustancias de Referencia
26
Identificacin
Prdida por secado o Determinacin de agua
Residuo de ignicin
Pureza cromatogrfica o Sustancias relacionadas
Otros ensayos: ensayos lmites, impurezas orgnicas voltiles, rotacin
ptica, pH.
Valoracin
En una monografa de un medicamento se incluye
Definicin
Envasado y conservacin
Sustancias de Referencia
Identificacin
Disolucin (segn la forma farmacutica)
Uniformidad de unidades de dosificacin
Otros ensayos: pH (para formas farmacuticas lquidas, polvos, cremas),
endotoxinas bacterianas (para inyectables), esterilidad (para soluciones
oftlmicas)
Valoracin
Preguntas Orientadoras
1. A qu se denomina Fase crtica de un proceso? Ejemplos.
2. Qu tipos de documentos deben llevarse en un Laboratorio productor
para cumplir con las GMP?
3. Cmo define GLP?. Qu son los Procedimientos Normalizados de
Trabajo, en qu casos se aplican y qu incluyen?
4. Con que finalidad se procede a la calibracin de equipos de
laboratorio como por ejemplo balanzas y espectrofotmetros?
27
Test de Autoevaluacin
1. Uno de los principales objetivos de las Buenas Prcticas de
Manufactura (GMP) es:
(a) Disminuir los errores de trazabilidad de las Sustancias de
Referencia
(b) Disminuir los riesgos de confusin en los rtulos
(c) Disminuir los errores de dispensacin de los medicamentos
(d) Aumentar la eficacia de un principio activo
28
Bibliografa
1. Ministerio de Salud ANMAT. Farmacopea Argentina. VII ed. (2003) Buenos
Aires.
2. Aiache, J-M; Aiache, S.; Renoux, R. (1996) Introduccin al estudio del
medicamento. Barcelona: Masson.
3. Barb Rocabert, C. (2001) Preparados farmacuticos y parafarmacuticos.
Barcelona: Masson.
4. Colegio de Farmacutico de Bizkaia. (1997) Formulacin magistral en
atencin primaria. Espaa.
5. Rodrguez de Ordaz, R. (1991) Compendio de frmulas magistrales y sus
tcnicas de manufactura. Caracas: Compograf .
6. Llopis Clavijo, M.J.; Baixauli Comes, V. (1997) La formulacin magistral en la
oficina de farmacia. Valencia: Distribuciones Cid.
29
CAPITULO 2
EL MTODO ANALTICO EN EL CONTROL DE CALIDAD
Mara Guillermina Volont
El concepto de Validacin
En el captulo anterior mencionamos que la validacin es la parte de las GMP
por la cual se logra que los sistemas, los equipos, los procesos y los
procedimientos para los ensayos de calidad estn bajo control y, por
consiguiente, se produzca uniformemente un producto de calidad.
La validacin se define como el establecimiento de pruebas de laboratorio,
debidamente documentadas, que aportan un alto grado de seguridad de que un
proceso planificado se efectuar uniformemente en conformidad con los
resultados previstos especificados, es decir, que dicho proceso ser apropiado
para el uso propuesto. Los estudios de validacin son aplicables a los mtodos
analticos no codificados en las Farmacopeas, a los equipos tanto de
produccin como analticos, a las computadoras, programas y sistemas, as
como a los servicios del establecimiento (por ejemplo aire, agua, vapor, etc.) y
a los procesos (como el de fabricacin, limpieza, esterilizacin, llenado estril,
liofilizacin, etc.). Se har una validacin para el liofilizador como equipo y otra
para el proceso de liofilizacin; una para la limpieza del material de vidrio y otra
para la limpieza del establecimiento; una para el proceso de esterilizacin y
otra para las pruebas de esterilidad. Es preciso demostrar que cada paso del
proceso de fabricacin de un medicamento se efecta segn lo previsto.
Los objetivos de una validacin son otorgar Confiabilidad, Seguridad y
Efectividad al proceso que se est validando.
Y por qu se debe validar? Porque un sistema validado es un sistema estable,
capaz y robusto y es as como nos interesa mantenerlo, dado que estas
caractersticas son esenciales para mantener altos niveles de calidad
Los estudios de validacin verifican el sistema en estudio y en condiciones de
pruebas extremas (pruebas a las que se llaman habitualmente peor caso),
30
31
32
El Mtodo Analtico
El empleo de mtodos analticos se inicia en la etapa de investigacin y
desarrollo de un medicamento, para luego aplicarse en las diferentes fases de
su fabricacin, as como en estudios posteriores tales como los de
bioequivalencia, analizando el frmaco en fluidos biolgicos, para establecer
condiciones de intercambiabilidad. En cada uno de los casos la metodologa
analtica deber ajustarse a los requerimientos necesarios para cumplir con la
finalidad especfica de la mencionada etapa.
Con la aplicacin de mtodos analticos podremos dar respuesta a diversos
interrogantes que debemos afrontar cuando a calidad de un medicamento nos
referimos. Entre otros, los principales son:
La identidad y la pureza del principio activo y de los excipientes empleados en
la formulacin, cumplen con las especificaciones farmacopeicas?
Cul es el contenido de principio activo en la formulacin? Cumple con lo que
declara?
Cul es su estabilidad y cul su fecha de vencimiento?
A qu velocidad se libera el activo desde la forma farmacutica, para luego
absorberse?
Cul es la concentracin del frmaco en un fluido biolgico, despus de
administrar una dosis de medicamento?
La eleccin del mtodo analtico adecuado para responder a cada una de estas
preguntas, ser determinante para la veracidad de los resultados obtenidos, ya
que no siempre el mismo mtodo analtico ser vlido para obtener la
respuesta correcta, quizs el mtodo seleccionado para evaluar la pureza de la
materia prima del principio activo, no sea el ptimo para controlar el contenido
del mismo en la formulacin o para establecer su estabilidad en dicha
formulacin. En las Farmacopeas podremos encontrar las especificaciones de
33
pruebas
documentadas
de
que
un
mtodo
proporciona
A nivel Nacional:
Farmacopea Argentina (FA) VII ed. <1130> Validacin de Mtodos
analticos.
Disposiciones de la Administracin Nacional de Medicamentos,
Alimentos y Tecnologa Mdica (ANMAT) 1930/92, 853/99, 2819/04.
34
A nivel Internacional:
USP 34 <1225> Validation of Compendials methods.
International
Conference
on
Harmonisation
of
Technical
Qu debe validarse?
Deben validarse mtodos analticos de:
Materias Primas.
Control de Procesos.
Estudios de Estabilidad.
Validaciones de Limpieza.
Parmetros a evaluar
Especificidad.
Linealidad y Rango.
Exactitud.
Precisin
Repetibilidad
Precisin Intermedia
35
Reproducibilidad
Sensibilidad
Lmite de Deteccin (LD)
Lmite de Cuantificacin (LC)
Robustez.
36
II (Cuant.)
II (Lm.)
III
IV
Especificidad
(*)
Linealidad
(*)
(*)
(*)
Exactitud
(*)
(*)
(*)
Precisin
(*)
(*)
LD
(*)
(*)
(*)
LC
(*)
(*)
(*)
(*)
Robustez
Intervalo
(*)
(*)
(*)
Especificidad
Definicin
La especificidad de un mtodo implica su capacidad para evaluar al analito en
presencia de otros componentes que pueden estar presentes, tales como
impurezas, productos de degradacin, componentes de la matriz, productos
laterales de sntesis, componentes endgenos o metabolitos del mismo analito
en un fludo biolgico, excipientes, etc. En otras palabras, se deber corroborar
que la matriz que rodea al analito, no influya en los resultados obtenidos al
aplicar el mtodo.
Determinacin
a) Si se dispone de dichos componentes.
37
estrechamente
relacionadas
que
pudieran
estar
presentes.
La
38
Fotlisis
de
pico
(MS-HPLC,
Hidrlisis
Hidrlisis cida (HCl 1N)
especfica).
Oxidacin (H2O2)
Para
Reduccin
producto
Calor
degradacin
enzimtica
determinar
de
si
algn
descomposicin
complementar
con
un
TLC
este
mtodo
GC,
los
componentes
de
la
muestra degradada)
Criterios de aceptacin
No deben observarse interferencias entre las seales de los excipientes,
impurezas de sntesis y/o productos de degradacin y la seal o respuesta
(por ejemplo: absorbancia, rea o altura de pico, etc.) del compuesto de
inters.
Linealidad e Intervalo
Definicin
La linealidad de un mtodo analtico es su capacidad de producir resultados
directamente proporcionales a la concentracin de analito, dentro de un
intervalo de concentracin. En algunos casos puede ser necesaria la aplicacin
de transformaciones matemticas para obtener una recta.
39
Determinacin
La linealidad debe establecerse a lo largo del intervalo de concentraciones del
mtodo analtico. Se debe establecer por medio de un mtodo estadstico
adecuado (por ejemplo regresin por cuadrados mnimos). Deben informarse el
coeficiente de correlacin (r), el coeficiente de determinacin (r2) la ordenada al
origen (a) y la pendiente (b) de la recta de regresin.
Para establecer la linealidad se debe ensayar un mnimo de cinco
concentraciones con tres rplicas de cada uno y tres determinaciones de cada
rplica.
Se recomienda considerar los siguientes intervalos:
yi b xi
n
40
xi yi
n
b
2
2 xi
xi
n
xi yi
xi yi
( xi 2
xi yi
n
( xi )2
( yi )2
)( yi 2
n
n
El valor r=1 indica una recta perfectamente lineal; un valor r=0 indica la no
correlacin entre x e y. Sin embargo, el mejor indicador del modelo lineal no es
r sino un test estadstico de Student (t), en el cual se calcula un valor de tr para
(n-2) grados de libertad y se compara con el valor t tabulado para el nivel de
confianza requerido.
En este caso, la Hiptesis Nula (H0) es la no correlacin entre x e y. Si el valor
observado de tr es mayor que t de tabla, se rechaza la hiptesis nula, siendo la
correlacin lineal significativa con la probabilidad calculada.
tr
(n 2)
(1 r 2 )
Sb
Sxy 2
Sxy 2
( x )2
2
i
xi
n
41
yi
a y i b x i y i
n2
[b t Sb]
Luego los intervalos de confianza sern:
[a t Sa]
Siendo t el que figura en tabla de Student para cierto nivel de confianza,
generalmente 0,05 y (n-2) grados de libertad.
Criterios de aceptacin
Coeficiente de correlacin:
para Macrocomponentes, r 0,99 y r2 0,98
para Impurezas, r 0,98.
Exactitud
Definicin
La exactitud, interpreta los errores sistemticos o tendencia de un mtodo
analtico, expresa la proximidad entre el resultado obtenido y el valor
verdadero. Debe establecerse en todo el rango especificado para el mtodo
analtico.
Matemticamente suele expresarse de los siguientes modos:
Error absoluto X X
Error relativo %
Recuperacin
( X X ) 100
X
X 100
X
Los errores deben ser tan pequeos como sea posible para que el valor medio
experimental se aproxime al de referencia o verdadero, si no fuera as y segn
su significancia los aceptaremos o reformularemos el protocolo de aplicacin
del mtodo, para minimizarlos o adaptarlos a los requerimientos exigidos para
cada mtodo analtico, en lo que a errores se refiere.
42
concentraciones al 80, 100 y 120% del valor esperado, al que se le agregan los
excipientes del producto (Ensayo de Recuperacin), con tres repeticiones
completas del mtodo para cada una de las concentraciones. Puede utilizarse
un test t de Student, efectuando varias determinaciones de la muestra de
concentracin conocida y calculando el t experimental, tob , que se compara con
el t de tabla para (n-1) grados de libertad en el nivel de confianza escogido,
generalmente p = 0,05.
[H0: no hay error sistemtico]
t ob
X
X
S
n
t ob
100 R
CV
n
Por otra parte, resulta conveniente graficar en todos los casos descriptos a
continuacin, masa hallada vs. masa agregada, rectificando por el mtodo de
los cuadrados mnimos. En este caso r 0.99, la pendiente deber ser cercana
a 1 o el Intervalo de confianza de la pendiente incluir al 1 y la ordenada al
origen deber ser prxima a 0 o el intervalo de confianza de la ordenada incluir
al 0. Si la pendiente fuera significativamente distinta de 1 indica un error
proporcional (por ejemplo, debida a la extraccin de un porcentaje constante
del componente). Una ordenada al origen significativamente diferente a cero
indica un error de tendencia constante y se visualiza como una recta paralela a
43
% Re cuperacin
Precisin
Definicin
La precisin de un mtodo analtico es el grado de concordancia entre los
resultados del ensayo individual cuando el mtodo se aplica repetidamente a
varias alcuotas de una muestra homognea. Est relacionada con la
dispersin de las medidas alrededor de su valor medio o central. La precisin
de un mtodo analtico generalmente se expresa como la desviacin estndar
(), estimada analticamente por S o ms comnmente con la desviacin
estndar relativa o coeficiente de variacin (CV).
El estimador S de la desviacin estndar se calcula como:
xi x
S
n 1
CV
siendo x
xi
n
S 100
X
44
Determinacin
La precisin de un mtodo analtico debe estudiarse sobre:
Criterio de Aceptacin: CV 2%
45
Resulta claro que dos tcnicas o la misma tcnica empleada para diferentes
matrices, pueden tener la misma sensibilidad de calibracin, pero diferente
sensibilidad analtica debida a factores propios como necesidad de extraccin,
concentracin, etc.
Los parmetros a definir al evaluar la sensibilidad de un mtodo son los lmites
de deteccin y de cuantificacin.
Definiciones
El lmite de deteccin es la concentracin ms baja de analito que puede
detectarse, pero no necesariamente cuantificarse, en una muestra bajo las
condiciones experimentales establecidas.
El lmite de cuantificacin es la menor concentracin de analito que puede
determinarse con precisin y exactitud en una muestra, bajo las condiciones
experimentales establecidas.
Determinacin
Existen diversas maneras para determinar el lmite de deteccin, dependiendo
de si se trata de un mtodo no instrumental o instrumental.
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concentracin
cero,
obtenindose
el
estimado
Sbl
Y 3S bl
LD bl
b n'
Y 10S bl
LC bl
b n'
47
Robustez
Definicin
La robustez de un mtodo analtico es la medida de su capacidad de no verse
afectado por variaciones pequeas, pero deliberadas, en los parmetros del
mtodo y proporciona una indicacin de su confiabilidad. Ejemplos de
variaciones que deben estudiarse durante la evaluacin de la robustez son:
diferentes instrumentos,
diferentes temperaturas,
Determinacin
48
Diseo de Placket-Burman:
Nmero de ensayo
Variables
% SVD
Ensayos: 1,28
Para cada variable elijo 2 niveles: por ejemplo (A) extremo o alto y (a) Nominal
o bajo.
Hallar para cada variable evaluada la DP: diferencia promedio:
DP = (Promedio de las valoraciones obtenidas a altos niveles) (Promedio
de las valoraciones obtenidas a bajos niveles).
Significativas)
(Donde SD: desviacin estndar obtenida en el ensayo de repetibilidad)
Ventaja: en un diseo normal de una variable por vez, el estudio de 5
variables resultara en 25 = 32 ensayos, en cambio siguiendo este diseo seran
solamente 6 ensayos.
Clculo de las DP de respuesta para cada parmetro:
49
Parmetros
Diferencia (DP)
Aa
Bb
Cc
Dd
Ee
Ff
G-g
mtodo
en
particular.
Su
principal
aplicacin
es
en
mtodos
50
especificarse tambin
como
requisito
A menos que
As
W0,05
2f
distancia entre el borde simtrico del pico y el centro del mismo medida al 5%
de la altura.
Estos datos se obtienen a partir de inyecciones repetidas del estndar u otras
soluciones segn se especifique en la monografa correspondiente.
51
Test de Dixon
Aplicado cuando tenemos un solo dato sospechoso.
Se procede de la siguiente manera:
1.
2.
4.
5.
52
Test de Grubbs
Aplicado cuando tenemos dos datos sospechosos. Se aplica de la siguiente
manera:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Resumiendo:
53
Preguntas Orientadoras
1. Qu mtodos analticos se incluyen en la Categora II de las
Farmacopeas?
2. Si Ud. deseara estudiar la robustez de un mtodo, cmo diseara
el estudio? Indique qu variables y qu niveles de cada una de ellas
elegira, y la forma general de realizar el ensayo.
3. Describa los mtodos que Ud. conoce para evaluar la selectividad de
un mtodo analtico.
4. Cul es la Hiptesis Nula (H0) al aplicar el Test de Student para
evaluar Exactitud?
Test de Autoevaluacin
1. En la validacin de un mtodo analtico destinado al control de una
especialidad, qu parmetro debe determinar para evaluar errores
inherentes al mismo:
(a) Selectividad
(b) Lmite de cuantificacin
(c) Exactitud
(d) Linealidad
2. En la validacin de un mtodo analtico, qu parmetro debe
determinar para evaluar si el mtodo es reproducible:
(a) Selectividad
(b) Lmite de cuantificacin
(c) Exactitud
(d) Precisin
3. Qu parmetro debe determinar para evaluar que los excipientes no
interfieren:
(a) Especificidad
54
Bibliografa
1.
Buenos Aires.
2.
Rockville.
4.
CAPITULO 3
CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (TLC)
Pablo Quiroga
Introduccin
Las tcnicas de separacin cromatogrficas, son mtodos de separacin de
mltiples etapas en los que los componentes de una muestra se distribuyen
entre dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra mvil.
La cromatografa en capa fina, es una de las tcnicas ms ampliamente
utilizadas para la separacin, identificacin y determinacin de
pureza de
de
localizacin.
La cromatografa en capa fina (TLC), es una forma de
cromatografa de
56
57
Aplicaciones de la TLC
En el Anlisis Farmacutico, se utiliza habitualmente para identificacin de
principios activos y determinacin de pureza cromatogrfica de los mismos
Bajo condiciones controladas puede ser empleada como tcnica de
cuantificacin.
Criterio de Identidad. Consiste en cromatografiar simultneamente la sustancia
desconocida, la sustancia de referencia y una mezcla de cantidades
aproximadamente iguales de ambas.
58
59
60
Debemos sembrar 100 g al menos de materia prima bajo estudio, para poder
visualizar todas aquellas impurezas o sustancias relacionadas que estn
presentes en la misma en un % a 0.5 %.
Preparacin de las soluciones de trabajo:
Solucin de Metoclopramida Sustancia de Referencia (Sol. SR 1): 50 mg de la
SR, se disuelven en 50 de metanol de manera de obtener una solucin de 1
mg/ml 1 g/l.
Sol.SR A: realizar una dilucin 1 en 20 de la Sol. SR 1 en metanol: 0.05 mg/ml0.05 g/l.
Solucin SR para identificacin (Sol SR I): realizar una dilucin 1 en 2 de la Sol.
SR 1 en metanol: 0.50 mg/ml- 0.50 g/l.
Solucin de la Muestra en estudio (Sol. M): 500 mg de la materia prima bajo
estudio, se disuelven en 50 de metanol de manera de obtener una solucin de
10 mg/ml 10 g/l.
Se siembran 10 l de cada una de las soluciones, resultando:
Sol. SR I: 0.50 g/l x 10 l= 5 g
Sol. SR A: 0.05 g/l x 10 l= 0.5 g
Sol. M: 10 g/l x 10 l= 100 g
A continuacin se muestra la placa cromatogrfica resultante:
61
Dilucin
Conc. g/l
1 en 4
0.25
0.5
3 en 20
0.15
0.3
1 en 20
0.05
0.1
62
63
64
65
Tcnica general
La tcnica de TLC comprende diferentes etapas:
Activacin de la placa
Corrida de la placa
Ver descripcin de las mismas en FA. Vll ed. (pg. 63); USP 23 (pg. 1770/71);
Farmacopea Britnica 93 (pg. A92/A93).
Adems de la forma de cromatografa convencional, descripta en la bibliografa
mencionada, donde se corre la fase mvil en direccin ascendente, hasta que
la misma haya recorrido las tres cuartas partes de la placa, existen otros tipos
de desarrollo:
Desarrollo Mltiple. Consiste en correr primero con una fase mvil, secar y
correr luego con la misma fase o con otra ms polar o de diferente pH, en la
misma direccin. Este proceso puede repetirse cuantas veces sea necesario
66
Materiales
Fase Estacionaria: La fase estacionaria (FE) se adhiere convenientemente a
una placa de vidrio, lmina de aluminio, o plstico. La adherencia se logra con
el agregado de sulfato de calcio a la FE. Si bien el vidrio es el soporte ms
conocido, los otros dos tienen la ventaja de poder cortarlos en placas menores
por su flexibilidad. Muchas de las FE son adsorbentes (ej. silicagel, almina) y
la separacin ocurre por interaccin de las sustancias con la FE. Otras (ej.
celulosa) operan primariamente por particin de la muestra entre FE y FM,
aunque generalmente es un proceso combinado. Cuando la FE es ms polar
que la FM el sistema se denomina de fase normal (ej. silicagel con solventes
orgnicos no polares); cuando la FE es la menos polar de las dos fases, el
sistema se denomina de fase reversa (ej. placa impregnada de parafina usando
una FM acuosa). Las Fases Estacionarias pueden ser inorgnicas, orgnicas o
mixtas.
Inorgnicas: silicagel; almina; silicato de magnesio (Florisil); etc. La silica gel o
SiO2, es el ms usado de los adsorbentes: contiene grupos silanoles
responsables de actividad adsorbente y es de naturaleza dbilmente cida. Las
placas tienen una distribucin uniforme de tamao de partcula normalmente
alrededor de 20 m de dimetro. Puede contener sulfato de calcio hidratado
(SO4Ca. 1/2H2O) como aglutinante (en proporcin 5%-15%), en cuyo caso se
denomina silicagel G. La silicagel H no contiene SO4Ca. 1/2H2O, ni otro
aglutinante. Tambin existe silicagel G o H con indicador de fluorescencia
(F254), la materia fluorescente es un silicato de Zn activado con Mn. La almina
o Al2O3 es otro adsorbente bastante empleado; puede ser neutro (pH 7.5),
67
68
1. Azobenceno
2. p- Metoxiazobenceno
3. Benceno-azo-2-naftol (Amarillo Sudan)
4. Rojo Sudan (Sudan III)
5. p-Aminoazobenceno
6. p-Hidroxiazobenceno
69
70
Segn Wohlleben
n-pentano
ter de petrleo
n-hexano
n-heptano
Ciclohexano
Tetracloruro de carbono
Tricloro etileno
Benceno
Diclorometano
Cloroformo
Dietilter
Acetato de etilo
Piridina
Acetona
n-propanol
Etanol
Metanol
Agua
Segn Strain
ter de petrleo (30-50 C)
ter de petrleo (50-70 C)
ter de petrleo (70-100 C)
Tetracloruro de carbono
Ciclohexano
Sulfuro de carbono
ter dietlico
Acetona
Benceno
Tolueno
steres de cidos orgnicos
1,2 dicloro etano
Cloroformo
Alcoholes
Agua
Piridina
cidos orgnicos
Mezcla de cidos con bases, agua, alcohol o piridina
Tabla 2. Series eluotrpicas
71
A
U
M
E
N
T
O
D
E
P
O
L
A
R
I
D
A
D
Tcnicas especiales
Cromatoplacas con zonas de concentracin. Tienen dos zonas en la misma
placa, la primera contiene un adsorbente inerte
o de poca capacidad
72
activo ej. silicagel. Se utiliza cuando la muestra es compleja, por ej. formas
farmacuticas con excipientes, cuando las sustancias se degradan al sembrar,
o cuando tienen muchas impurezas de tipo orgnicas, y de esta manera se
limpian (clean up), pues son retenidas en el Kieselgur. En estas placas no es
necesario sembrar en punto o banda, puede colocarse la placa directamente
en la solucin de siembra porque todas corren en forma de bandas.
Cromatografa en Capa Fina de Alta Performance HPTLC. Esta tcnica utiliza
placas de silicagel con tamao de partcula de aproximadamente 5m, mientras
que las comunes el tamao es de 20m. Para el desarrollo de estas placas se
usan cmaras de desarrollo horizontal, con las cuales se puede sembrar en
ambos extremos de la placa y el solvente corre desde ambos extremos hacia el
centro. La cmara posee dos pequeas cubetas en los extremos para colocar
el solvente, y esto posibilita el uso de dos solventes distintos, las placas se
ponen con el adsorbente para abajo, en forma horizontal. Para la
cuantificacin, este tipo de tcnica permite el uso solamente de Densitometra.
Los densitmetros miden la intensidad de la mancha, pueden trabajar en modo
transmitancia, fluorescencia o reflexin, es decir se mide la cantidad UV o
Visible transmitida, fluorescente o reflejada, luego se transforman estos valores
en reas que son proporcionales a la concentracin. Un densitmetro consta
de una fuente luminosa, un filtro, un colimador, una fotoclula y un
galvanmetro. La cromatoplaca se coloca entre la fuente luminosa y la
fotoclula y la radiacin se mide usando como referencia un lugar de la placa
sin muestra. Las seales se transmiten a un registrador donde las manchas
aparecen en forma de picos cuya rea es proporcional a la concentracin de la
sustancia.
Ventajas de la HPTLC: mayor resolucin debido al menor tamao de partcula
lo cual implica mayor superficie expuesta, mayor sensibilidad, tiempos ms
breves, recorridos ms cortos y mayor reproducibilidad. Las propiedades
cromatogrficas de este tipo de TLC correlacionan muy bien con los sistemas
de HPLC que usan la misma fase estacionaria.
Es til para trabajos preparativos y su uso se ha incrementado a partir de la
aplicacin de muestras con sembradores automticos y la cuantificacin por
73
TLC
HPTLC
20 x 20
10x10
Alrededor de 20
Alrededor de 5
100 - 250
150 - 200
1 - 10
< 0.1
<4
< 1.5
5 - 10
2 -5
10 - 15
3-6
30 - 120
5 - 15
10 - 15
30 - 40
10 - 100
30 - 40
0.1 - 1
0.01 1.0
Reproducibilidad de Rf
Alrededor 3%
Alrededor 1%
Reproducibilidad de cuantificacin
Alrededor 5%
2 % - 3%
Lipomat 5
Application
Seleccin de la capa
cromatogrfica
Siembra de Muestra y
Estndar
Desarrollo
Cromatogrfico
Capa pre-lavado
Capa preacondicionamiento
Scanner
Foto-documentacin con cmara
digital
74
TLC Preparativa. Como tcnica preparativa TLC es usada por ej., para el
aislamiento de componentes de mezclas para su posterior estudio como para
la obtencin de materiales puros para ser usados como sustancias de
referencia.
En TLC preparativa el espesor de la capa de adsorbente es mayor (0,5 a
2mm), lo cual permite sembrar mayor cantidad de muestra. Es mejor aplicar la
muestra en forma de banda que de punto, (se puede cromatografiar ms
muestra al mismo tiempo) La visualizacin de las manchas debe hacerse por
mtodos no destructivos, por ejemplo UV.
Preguntas Orientadoras
1. Describa los factores que influyen o afectan la reproducibilidad del Rf.
2. Describa las diferencias fundamentales entre TLC y HPTLC.
3. Que mecanismo/s se pone/n en juego en la separacin por TLC.
4. Describa en que consisten los sistemas de fase reversa.
5. Detalle el procedimiento para el anlisis cuantitativo por TLC.
Utilizara un mtodo Volumtrico para cuantificar las manchas?.
Justifique
Test de Autoevaluacin
1. En este captulo se define el Lmite de Deteccin como:
(a) La menor concentracin de principio activo y/o impurezas o
sustancias relacionadas en unidades de masa (g) que es
detectable y cuantificable de manera reproducible en las
condiciones de trabajo.
75
76
Bibliografa
1.
2.
3.
Buenos Aires.
4.
Rockville.
5.
6.
ManMonham,
Srrivastava
(2011)
High-Performance
77
Thin
Layer
CAPITULO 4
CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC)
Mara Guillermina Volont
se ha convertido en
rendimiento y eficacia
Durante muchos aos se practic la cromatografa lquida en una forma que
llamaremos clsica y que consisti bsicamente en lo siguiente: una columna
de vidrio, cuyo dimetro variaba entre 2-10 cm, una longitud de 50-500 cm,
rellena de algn material, como silicagel, almina, etc., cuyas partculas
posean un tamao entre 150-200 m, en la que la muestra se introduca
disuelta en la fase mvil u otro disolvente y luego se agregaba el mismo, con el
cual elua a travs de la columna. Los tamaos de la muestra variaban entre
0,1-1,0 g o ms. El disolvente o fase mvil flua a travs de la columna por
efecto de la gravedad y se recolectaba en la base de la misma en fracciones de
determinado volumen. Uno de los inconvenientes de esta tcnica era el largo
tiempo de anlisis requerido, horas o das, otra desventaja era que el material
78
de relleno se utilizaba por lo general una sola vez debido a que parte de la
muestra se adsorba en forma irreversible en l.
Otro problema consista en la identificacin y cuantificacin de los
componentes separados, en general mediante tcnicas auxiliares, como ser la
espectrofotometra, gravimetra, etc.
En HPLC en cambio, se usan columnas de acero inoxidable, de dimetro muy
reducido, por ejemplo 2 mm, rellenas de materiales cuyas partculas tienen un
tamao no mayor de 3040 m, usualmente entre 3-10 m. Este tipo de
columna ofrece una gran resistencia al flujo de la fase mvil, o sea una gran
cada de presin. Por esta razn es necesario emplear sistemas de bombeo de
alta presin (hasta 6000 psi) que hagan fluir la fase mvil a una velocidad
razonable a travs de la columna. La cantidad de fase estacionaria dentro de la
columna es pequea, por lo que se requiere que la muestra tambin sea
pequea, en el rango de g a pocos mg.
La muestra se introduce en el sistema mediante vlvulas de inyeccin.
Un detector, colocado a la salida de la columna, proporciona un registro
continuo de la composicin del lquido que sale, por lo que permite obtener un
cromatograma que se utiliza para identificar y cuantificar los componentes de la
muestra.
Interfase A/D
Computadora
Personal
Detector
Inyector
Fase Mvil
Columna
Bomba
79
Limitaciones:
Instrumental costoso.
El personal que utilice esta tcnica tendr que tener experiencia como
para poder obtener el mayor provecho de la tcnica instrumental.
80
81
entre la fase mvil y la muestra inica por los sitios grupos activos de una
resina intercambiadora. Se aplica a compuestos de un intervalo de PM muy
amplio, por ejemplo pptidos y aminocidos.
detector, concentracin del eluente u otra cantidad usada como una medida de
concentracin del eluente, versus el volumen de eluente o tiempo (IUPAC).
82
lnea de base interceptada por tangentes trazadas a ambos lados de una seal
cromatogrfica. Este valor de anchura se emplea en el clculo de la resolucin
(R) y eficiencia de los sistemas cromatogrficos (N). Se puede calcular
tomando el ancho en distintas posiciones, por ejemplo al 50 % de la altura de
pico, al 60.7 %, etc.
83
wi
60,7% (inflexin)
wh
5,54
w3
32,4% (3)
w4
16
13,4% (4)
w5
25
4,4% (5)
wtan
16
tangente
L
N
L
t0
84
( t n t 0 ) (Vn V0 )
t0
V0
k puede variar entre cero (si no es retenido en la fase estacionaria) e
k
de un par de picos. Si no existe separacin entre dos picos, por ejemplo pico 1
y 2, es igual a la unidad y su valor aumenta cuando aumenta la separacin.
Se calcula como:
k 2
k1
No depende de la fuerza de elucin, sino de la afinidad del soluto respecto
(t 2 t 1 )
1/ 2 ( w 2 w 1 )
85
As = a+b/2a
Donde a y b son las medidas entre la lnea que une el mximo del pico con la
lnea base y los extremos anterior (simtrico) y posterior del pico (con tailing)
respectivamente, medidos al 5 o al 10 % de su altura.
86
se observa claramente que los picos o bandas menos retenidos tienen mayor
ancho que los ms retenidos.
Este ensanchamiento de banda es normal y se conocen como ensanchamiento
de banda intracolumnar. Existen sin embargo otros procesos, extracolumnares,
que provocan el ensanchamiento de los picos y son producidos por factores
instrumentales y experimentales.
Proceso multipaso
Difusin longitudinal
encontrar diversos caminos por los cuales ser impulsado por la fase mvil a
recorrerlos. Algunas molculas seguirn caminos directos y otras, encontrando
partculas en su paso, caminos ms complejos, retrasndose respecto de las
primeras. Este fenmeno se conoce tambin como Difusin de Eddy y su
contribucin al ensanchamiento de banda est dado por el dimetro de la
partcula de la fase estacionaria y por una constante que depende del relleno y
de la calidad de su empaquetamiento en la columna. Una reduccin del tamao
de partcula de 45 a 6 m origina una disminucin de diez veces de la altura del
plato terico (H).
87
88
Volumen de inyeccin
ms estrictos y
89
90
Tuberas:
Las tuberas que se utilizan para conectar los componentes sometidos a alta
presin son de acero inoxidable (entre bomba e inyector, inyector y columna,
columna y detector y entre detectores conectados en serie) y son de materiales
polimricos las que conectan componentes donde la presin es atmosfrica o
ligeramente superior (entre el reservorio de solvente-bomba, ltimo detectorfrasco de desperdicios).
Las tuberas de acero tienen un dimetro externo estandarizado: 1/16
pulgadas. Sin embargo su dimetro interno es variable, por lo cual se
selecciona la de seccin ms fina para conectar los instrumentos por donde
circula la muestra (entre el inyector
91
Uniones:
Las uniones permiten conectar las tuberas con los distintos componentes del
sistema
cromatogrfico.
Las
uniones
deben
reunir
determinadas
Sistemas de Bombeo:
92
93
Reposicin de
Fase Mvil
Motor
a la Columna
94
Sistemas de Inyeccin:
Son vlvulas que orientan el caudal hacia la columna, pasando o no, segn su
posicin, a travs de un loop en el cual se introduce la solucin a inyectar
(figura 6). Las vlvulas pueden accionarse manual o automticamente.
Poseen un cuerpo fijo, un rotor con un sello que gira y un loop externo,
intercambiable, con volmenes entre 5-500 l, que contiene la muestra.
Tambin existen vlvulas de inyeccin de micromuestras, con loops de
volmenes entre 0,5-5l. Los inyectores automticos deben poseer adems un
carrusel que aloja viales donde se coloca las muestras a inyectar.
95
2.
96
Detectores:
97
Tipos de detectores
Detector UV:
simplemente
un
espectrofotmetro
en
el
cual
se
reemplaza
al
98
Detector de Fluorescencia:
Detector Electroqumico:
99
De absorbancia en el Infrarrojo
De Dispersin de luz
Fase Mvil
No todos los solventes son adecuados para trabajar en HPLC. Un solvente
apropiado para HPLC debe cumplir con algunos requisitos, por ejemplo:
Ser seguro
100
101
ultrasonido.
El valor del pH de la fase mvil puede ser un parmetro crtico en la retencin
de solutos ionizables y en algunos casos, debe controlarse rigurosamente. A
valores de pH mayores a 7,5 se disuelve la slice de base de las columnas, y a
pH menores a 2 se hidroliza la unin entre la slice y la fase enlazada.
Columnas
En todo sistema cromatogrfico, ya sea en fase lquida gaseosa, la columna
es el corazn del sistema puesto que en ella se lleva a cabo la separacin de
los componentes de la mezcla en estudio.
Bsicamente la columna consiste en un segmento de tubo de algn material
inerte, de dimetro uniforme y capaz de resistir altas presiones. De entre todos
los materiales, el acero inoxidable es el ms usado. Las paredes internas
deben tener una superficie finamente pulida pues se ha observado que posee
una cierta influencia sobre la eficacia de la columna.
La longitud de la columna se encuentra entre 10 y 50 cm, aunque puede ser
bastante ms larga, en especial en cromatografa de permeacin donde se
suele usar varias columnas conectadas una detrs de otra. El dimetro en la
mayora de los casos es de alrededor de 3-4 mm.
Tal vez la columna ms frecuentemente utilizada con fines analticos sea la de
25 cm de longitud y 4,6 mm de dimetro interno, empaquetada con partculas
de 5 m, que pueden tener de 40000 a 60000 platos/metro. Recientemente han
102
Fase Estacionaria:
103
porosos
de
silicagel
con
grupos
intercambiadores
104
105
Preparacin de la muestra
Esta etapa es sumamente importante sobre todo cuando la matriz que rodea al
analito es muy compleja. La seleccin del mtodo ms apropiado depende de
muchos factores, como ser:
-
como
la
solubilizacin
filtracin.
Analitos
en
bajas
Compatibilidad
de
los
medios
de
solubilizacin
con
el
sistema
Es decir que cada muestra deber ser preparada en forma apropiada para
reducir interferencias y aumentar la vida de la columna.
106
neutras,
cidos,
como
el
tngstico,
tricloroactico,
perclrico,
metafosfrico, cationes del tipo Hg2+, Cd2+, Fe3+, Cu2+ y Zn2+ o bien por
ultrafiltracin. En muchos casos durante la desproteinizacin se produce una
prdida de analito por adsorcin al precipitado lo que acarrea bajas
recuperaciones, es decir baja exactitud analtica. Este efecto puede
minimizarse controlando apropiadamente las condiciones en las que se realiza
la
desproteinizacin
agregando
la
solucin
muestra
al
agente
107
Cuerpo de la
columna
(polipropileno)
Filtro
Material
adsorbente
Filtro
108
109
110
111
Figura 12. Esquema de un equipo de HPLC para operar con derivatizacin post columna
112
113
Anlisis cuantitativo
El anlisis cuantitativo por medio de HPLC es tan confiable como el realizado
por cromatografa de gases. Etapas del anlisis cuantitativo:
1. Muestreo.
2. Preparacin de la muestra
3. Inyeccin de la muestra
4. Separacin cromatogrfica
5. Deteccin
6. Integracin de la seal
7. Clculo de la concentracin del analito
114
a)
A1
% A1
100
AreaTotal
3
2
Esta tcnica requiere que todos los componentes de la mezcla sean separados
y que la respuesta del detector sea igual para todos ellos, condicin sta que
por lo comn no se cumple y que da lugar a que la normalizacin de reas lleve
implcito el uso de factores de correccin de respuesta.
b) Calibracin Externa Estndar Externo. Es el mtodo de cuantificacin
ms utilizado en HPLC. Consiste en la preparacin de estndares de
concentracin aproximadamente igual al analito en la muestra y en el
ensayo cromatogrfico de ambas, muestra y estndar, en las mismas
condiciones operativas. La concentracin de analito en la mezcla se
determina comparando el rea del pico en cuestin con el rea
correspondiente al estndar de referencia, es decir:
Am C s
D 100
As
115
Interno.
Consiste
en
agregar
cantidades
iguales
Rm C s
D 100
Rs
Am C s
D 100
A ms A m
116
Respuesta
M+St 2
M+St1
M
Concentracin
Preguntas Orientadoras
1. Defina los siguientes parmetros y explique conceptualmente qu
interpretan cada uno de ellos y para qu se utilizan:
* Tiempo de retencin
117
Test de Autoevaluacin
1. En la cuantificacin de un principio activo por HPLC, con cul de estos
mtodos se independiza de los errores originados por variaciones en
el volumen de inyeccin de la muestra?
(a) Mtodo del Estndar Interno
(b) Mtodo del Estndar Externo
(c) Mtodo del Estndar Agregado
118
8. Cul
de
estos
factores
extra-columnares
119
influye
en
el
Bibliografa
1.
Chromatography. Springer-Verlag
3.
Rockville.
7.
Ed.
8.
Buenos Aires.
120
CAPITULO 5
ELECTROFORESIS CAPILAR
Pablo Quiroga
Introduccin
121
122
generacin
de
gradientes
de
temperatura,
los
cuales
generan
ef
(Ec. 2)
123
q x E = -6 r ef x E (Ec. 6)
q = -6 r ef Despejando el trmino correspondiente a ef, obtenemos la
siguiente relacin:
ef = q / 6 r (Ec. 7)
Por lo tanto un ion de pequeo tamao, sufrir menores fuerzas de friccin y
por lo tanto se mover en el medio con mayor velocidad que uno de mayor
tamao, similarmente un ion con cargas mltiples, experimentar una mayor
atraccin hacia el electrodo movindose en el medio tambin ms rpidamente.
Est diferencia de velocidades es el fundamento del efecto de separacin en la
electroforesis.
Flujo Electroosmtico
Cuando se aplica un campo elctrico a travs del capilar relleno con solucin
amortiguadora, se genera un flujo de disolvente dentro del capilar que se
denomina Flujo Electroosmtico (EOF), el mismo es un fenmeno que existe
en un sistema electrofortico, el mismo se genera, debido a que los capilares
utilizados estn constituidos por slice fundida (cuarzo), por lo tanto la superficie
interna del capilar est constituida por grupos silanoles (SiOH), los cuales
pueden presentar mltiples grados de ionizacin (pI = 3.0), por lo tanto, a todo
pH > a 3.0 los grupos silanoles se ionizan o hidrolizan en un buffer electrolito
acuoso, generando u originando como resultado una superficie interna del
capilar negativa. Las cargas negativas de la pared interna del capilar, atraen los
cationes de la solucin del electrolito, los cuales estn hidratados, creando una
diferencia de potencial (potencial zeta) y generando una doble capa elctrica.
Cuando un voltaje es aplicado a travs del capilar, los cationes que forman la
doble capa difusa, son atrados hacia el ctodo, y como los mismos estn
solvatados / hidratados, generan un movimiento de fluido hacia el ctodo,
dando origen al EOF. La velocidad del EOF, depende de la movilidad
electroosmtica (eof) que a su vez depende de la densidad de la carga en la
pared interna del capilar y de las caractersticas de la solucin amortiguadora.
124
125
126
esta
127
por
lser,
espectrometra
de
masas,
fluorescencia,
128
Est tcnica permite separar tanto aniones como cationes en la misma corrida
bajo condiciones de alto EOF.
anlisis de molculas pequeas (PM <2000) y grandes (2000 < PM < 10000).
Debido a la alta eficiencia lograda, se pueden separar molculas que presenten
diferencias pequeas en su relacin carga/masa. Est mtodo tambin permite
la separacin de compuestos quirales al agregar selectores quirales a la
solucin amortiguadora de separacin.
Para lograr una ptima separacin, hay que tener en cuenta diferentes
parmetros que se describen a continuacin:
129
130
131
orgnicos
pueden
utilizarse
hasta
una
concentracin
132
racmica
interacciona
con
un
reactivo
quiral
originando
133
Preguntas Orientadoras
1. Describa el fundamento de la Electroforesis Capilar.
2. A que se denomina ventana de separacin y como procedera para
evaluar la misma?
3. Que tcnica de electroforesis capilar utilizara para la separacin de
compuestos neutros? Justifique.
4. Describa el Flujo electroosmtico.
5. Que parmetro utiliza en la cuantificacin de un analito en EC y que
precauciones debe seguir con el mismo.? Justifique
134
Test de Autoevaluacin
1. El calor generado durante una separacin por EC
(a) Aumenta la resolucin.
(b) Disminuye el ancho de las bandas o picos
(c) Aumenta el ancho de las bandas o picos y disminuye la
resolucin
(d) Aumenta la eficiencia
135
Bibliografa
1.
Rockville
2.
3.
136
CAPITULO 6
MTODOS ESPECTROSCPICOS APLICADOS AL ANLISIS FARMACUTICO
Mara Guillermina Volont
Introduccin
Todos los tomos y molculas son capaces de absorber energa, de acuerdo
con ciertas limitaciones, las cuales dependen de la estructura de la sustancia.
La energa se puede proporcionar en forma de radiacin electromagntica (luz).
El tipo y cantidad de radiacin absorbida por una molcula guarda relacin con
la estructura de la molcula; la cantidad de radiacin absorbida depende del
nmero de molculas que interaccionan con la radiacin. El estudio de estas
dependencias se conoce como Espectroscopia de absorcin.
La espectroscopia de absorcin es, indudablemente una de las tcnicas
analticas ms tiles; sus ventajas incluyen rapidez, sencillez, especificidad y
sensibilidad.
A log
I
1
log 0
T
I
137
(1)
A
cb
1%
Absortividad especfica ( A1cm
): es la absorbancia de una solucin
%
A11cm
A
10a
cb
= aPM
%
Los valores de a, A11cm
y , a una longitud de onda especfica y en un solvente
Espectro de absorcin
Se obtiene un espectro de absorcin midiendo la absorbancia de una solucin
como funcin de la longitud de onda. Los espectros ultravioleta y visible (UVVIS) se representan como trazados de la absorbancia (eje de ordenadas)
respecto a la longitud de onda.
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
Anlisis cuantitativo
Si de una serie de soluciones de la misma sustancia se mide la absorbancia de
cada una de ellas a la misma longitud de onda, temperatura y condiciones de
disolucin, y se representa la absorbancia de cada solucin en funcin de su
concentracin se obtendr por lo general, una lnea recta que pasa por el
origen, de acuerdo con la ecuacin (1). Esta grfica se denomina trazado de la
ley de Beer, o curva de calibracin para el mtodo de absorcin UV-VIS, y si la
lnea es recta se dice que cumple con la ley de Beer en el margen de
concentracin investigado.
La pendiente de la lnea es igual a [kb] y dado que se conoce b se puede
calcular la absortividad (k).
139
su
concentracin
puede
obtenerse
grficamente,
por
Ap = abCp
Am = abCm
m = muestra
AmxCp
Ap
140
Anlisis de multicomponentes
En caso de tener una mezcla de dos sustancias en un disolvente transparente
y que cada una de las mismas absorba luz, procedemos de la siguiente
manera: si los espectros de absorcin de los dos componentes son tan
diferentes que se pueden encontrar dos longitudes de onda en las cuales cada
sustancia absorbe luz sin interferencia de la otra, el problema se reduce al del
anlisis de un componente nico, porque ningn componente interfiere en el
anlisis de los dems. En el caso ms general, ambas sustancias absorben luz
a las mismas longitudes de onda, pero si sus espectros de absorcin son
marcadamente distintos an es posible analizar la mezcla.
Primero hay que determinar los espectros de absorcin de los dos
componentes puros (P y Q), los cuales se comparan convirtiendo los valores de
absorbancia a un dato comn, como absortividades molares y procediendo a
superponer los espectros. Se seleccionan dos longitudes de onda analticas, de
tal forma que sea mxima la diferencia entre la absorcin de los compuestos a
estas longitudes de onda siendo la absortividad del compuesto P mayor que
para el compuesto Q a una longitud de onda y menor en la otra. En general, es
necesario seleccionar tantas longitudes de onda analticas como componentes
hay en la mezcla.
La prxima etapa en el anlisis consiste en trazar las representaciones de la
ley de Beer, utilizando soluciones de las sustancias puras para cada
compuesto a cada longitud de onda. As se obtienen cuatro grficas de la ley
de Beer, a partir de las cuales se calculan cuatro absortividades, simbolizadas
141
(2)
(3)
(4)
(5)
Las ecuaciones (4) y (5), constituyen un sistema de dos ecuaciones con dos
incgnitas, Cp y Cq, fcil de resolver. Cabe extender esta descripcin del
anlisis de mezclas a aquellas que tengan ms de dos componentes si los
espectros de absorcin son lo suficientemente distintos.
142
de
lectura,
algunos
digitales,
escalas
potenciomtricas,
144
A. Comprobacin
de
las
absorbancias
(exactitud fotomtrica)
1) Preparar una solucin de dicromato potsico (R)
de la siguiente manera: secar el dicromato, calidad
estndar, a 130C hasta peso constante. Pesar
aproximadamente y exactamente, 60 mg; disolver y
llevar a 1000 ml con cido sulfrico 0,005 M.
2) Determinar la absorbancia de dicha solucin en cubeta de 1cm de paso
ptico, utilizando cido sulfrico 0,005 M como blanco, a 235; 257; 313 y 350
nm.
3) Calcular para cada longitud de onda la absortividad especfica, mediante la
expresin:
1%
A 1cm
A( ) 10
C
%
4) La tolerancia de A11cm
a cada longitud de onda se indican en la siguiente
tabla:
Longitud de onda
Tolerancia
(nm)
235
122,9- 126,2
257
142,4 145,7
313
47,0 50,3
350
104,9- 108,2
145
Otros ensayos:
Verificacin de la escala de longitud de
onda: existen diversas formas de
verificarla, una de ellas consiste en medir
los mximos de absorbancia de una
solucin estndar de perclorato de holmio
a 214,15; 287,15; 361,50 y 536,30 nm.
146
Campos de aplicacin
Las aplicaciones de los mtodos cuantitativos de absorcin ultravioleta/visible
son numerosas y abarcan todos los campos en que se demanda informacin
qumica cuantitativa.
En la mayor parte de los anlisis espectrofotomtricos cuantitativos se emplean
medidas realizadas en las regiones ultravioleta y visible del espectro
electromagntico. El compuesto a ensayar debe tener absorcin de suficiente
intensidad para tener utilidad en anlisis, y la muestra no debe contener
sustancias interferentes.
Una de las ventajas de la espectroscopa de absorcin es su especificidad, o
ausencia de interferencias. Incluso en aquellos casos en que las bandas de
absorcin se interfieren parcialmente, es posible superar dicha interferencia ya
sea provocando un desplazamiento del espectro de absorcin del compuesto a
cuantificar hacia una zona libre de bandas interferentes por medio de una
variacin de pH, o bien se puede recurrir a una tcnica especial, por ejemplo la
espectroscopa derivativa.
Otra forma de desplazar el espectro de absorcin de un compuesto es por
conversin en la regin visible, convirtindose entonces una sustancia incolora
en un derivado coloreado. Esta tcnica se denomina: anlisis colorimtrico.
Existen tcnicas generales de anlisis colorimtrico para los distintos grupos
funcionales.
Es muy importante para un anlisis correcto, determinar con exactitud las
condiciones en que se realiza el mtodo; por ejemplo: solvente, pH, tiempo de
147
Espectroscopa Derivativa
La espectroscopa derivativa es una tcnica analtica moderna de gran utilidad
para extraer informacin cualitativa y cuantitativa a partir de espectros
compuestos por bandas sin resolver, utilizando la primera derivada o derivadas
de rdenes superiores, de la absorbancia con respecto a la longitud de onda.
La tcnica enfatiza caractersticas sutiles del espectro, presentndolas de una
forma distinta y visualmente accesible, permitiendo la resolucin de muestras
multicomponentes y reduciendo el efecto de interferencias, ya que permite
aumentar la detectabilidad, sensibilidad y especificidad en dichos anlisis.
Comparada con la espectroscopa convencional posee un gran valor ya que
permite eliminar interferencias sin recurrir a tcnicas separativas, ms
complejas y costosas. Ha encontrado amplia aplicacin en muchos campos
analticos, particularmente en las ciencias farmacuticas y bioqumicas ya que
mantiene todas las leyes de la espectroscopa clsica (por ejemplo, la
dependencia lineal del valor derivado respecto de la concentracin de analito y
la ley de aditividad).
Se expresa:
148
149
150
Estos tres requisitos que habr que verificar son especficos de los mtodos
derivativos, adems de ellos se deber proceder a calcular los habituales
parmetros de validacin como linealidad, especificidad, precisin, exactitud,
lmite de deteccin, de cuantificacin y robustez.
En general, los mtodos para dar derivadas espectrales pueden ser: mtodos
pticos, que operan sobre la radiacin del mismo haz y mtodos electrnicos o
digitales, que actan a la salida del detector fotomtrico.
151
Espectroscopa Infrarroja
La espectroscopa infrarroja (IR) es de gran importancia en anlisis de
medicamentos porque puede aplicarse como tcnica analtica cualitativa y
cuantitativa, siendo la primera la de mayor aplicacin. Puede detectar grupos
funcionales cuya presencia sera imposible de determinar por ensayos
qumicos convencionales.
El espectro IR de una sustancia es caracterstico de ella, por lo tanto la tcnica
de IR resulta til para determinar la identidad de una sustancia.
T
%
T
%
La regin del IR se encuentra entre 0,70 200 que equivale a 700 200.000
nm y si lo expresamos en nmero de onda, que es la recproca de la longitud
de onda expresada en cm, sera entre 4000 700 cm-1. A su vez esta regin
se divide en la regin de frecuencias de grupo, entre 4000 1300 cm-1 y de las
huellas digitales entre 1300 700 cm-1. En esta regin del espectro, pequeas
diferencias en la estructura y la constitucin de las molculas originan cambios
importantes en la distribucin de los picos de absorcin. Como consecuencia,
la estrecha correspondencia entre dos espectros en esta regin constituye una
evidencia de la identidad de los compuestos que producen los espectros.
152
153
154
155
Preguntas Orientadoras
1. Qu entiende por espectroscopa de absorcin? Para qu se utiliza?
2. En qu se basa el anlisis espectroscpico cuantitativo?
3. Qu es la absortividad? Unidades. Dependencias.
4. Qu tipo de desviaciones puede sufrir la ley de Beer?
5. Cules son los componentes bsicos de un espectrofotmetro UVVIS?
6. Cmo se cuantifican por UV multicomponentes?
7. Como se valida un mtodo de Espectroscopa Derivativa?
156
Test de Autoevaluacin
1. De cul de estos parmetros depende la Absortividad de un principio
activo en solucin:
(a) Concentracin
(b) Temperatura
(c) Intensidad de la radiacin
(d) Longitud del camino ptico
2. En espectroscopa UV-VIS se trabaja a la mx porque:
(a) El mtodo es ms exacto
(b) El mtodo es ms preciso
(c) El mtodo es ms lineal
(d) El mtodo es ms sensible
157
Bibliografa
1.
Buenos Aires.
2.
3.
Ed.
4.
5.
158
CAPITULO 7
MTODOS DE ANLISIS TRMICO
Mara Esperanza Ruiz
Introduccin
La definicin generalmente aceptada de anlisis trmico (AT) abarca al grupo
de tcnicas en las que se mide una propiedad fsica de un sistema (sustancia o
un material) en funcin de la temperatura, mientras se le somete a un programa
de temperatura controlado. La representacin grfica de la propiedad media en
funcin de la temperatura (o tiempo) se denomina termograma. Se pueden
distinguir ms de una docena de mtodos trmicos que difieren en las
propiedades medidas y en los programas de temperatura. Estos mtodos
encuentran una amplia aplicacin tanto en el control de calidad como en
investigacin de productos farmacuticos, arcillas y minerales, metales y
aleaciones, polmeros y plsticos.
Durante el calentamiento o enfriamiento de los materiales cambia su estructura,
estado o composicin qumica. Estas transformaciones y reacciones estn
ntimamente relacionadas con el intercambio de calor entre la muestra y la
atmsfera que la rodea. Los mtodos trmicos proporcionan informacin sobre
estos intercambios de calor y, por consiguiente, sobre un gran nmero de
procesos fsicos y fisicoqumicos que pueden tener lugar en la muestra:
absorcin, adsorcin, desorcin, quimisorcin, hidratacin, deshidratacin,
fusin, vaporizacin, sublimacin, reacciones en estado slido, transiciones
entre estados polimrficos o pseudo-polimrficos, reacciones gas-slido,
descomposicin, degradacin, etctera.
En el AT, el cambio de peso que sufre una muestra en funcin de la
temperatura constituye la base de la termogravimetra (TG), mientras que la
medida de los cambios de temperatura origina el anlisis trmico diferencial
(ATD), y si en lugar de temperatura se miden cambios de energa la tcnica se
159
Termogramas
Tanto para el ATD como para DSC, los picos observados en los termogramas
presentan varias temperaturas caractersticas que se emplean a la hora de
describirlos:
-
160
Exotrmico
Temp (C)
Ti
Tie
Tp
Tr
Figura 1. Tpica curva de anlisis trmico en la que se distinguen la temperatura de inicio (T i),
de inicio extrapolado (Tie), de pico (Tp) y de recuperacin (Tr)
Termogravimetra (TG)
En un anlisis termogravimtrico se registra, de manera continua, la masa de
una muestra colocada en una atmsfera controlada, cuando:
-
161
frecuencia
se
usa
una
variante
de
esta
tcnica
denominada
TG
dP/dt (mg/min)
TGD
100
200
300
400
500
600
Temperatura (C)
Figura 2. Termograma diferencial (curva inferior, eje derecho) y convencional (curva superior
punteada, eje izquierdo)
162
Descripcin de equipo
Los
instrumentos
que
permiten
el
registro
continuo
de
las
curvas
Control de atmsfera
Programador de la
temperatura
Horno
Muestra
Registrador
Sensor de
temperatura
Control de
la balanza
Balanza
163
164
farmacutico por su capacidad para proveer informacin muy til, como por
ejemplo transiciones de fase.
El termograma de ATD consiste en la representacin de T en funcin de la
temperatura de calentamiento. En la Figura 4 se observa una curva de este
tipo: en las regiones planas de dicha curva, de pendiente cero, la energa
provista por el calentador del equipo es utilizada, tanto por la muestra como
por la referencia, para aumentar la temperatura, por lo que la temperatura en
ambos pocillos ser la misma y T = 0. Cuando sucede una transformacin
endotrmica en la muestra (fusin por ejemplo), la energa aportada por el
horno se emplear en dicha fusin y no en aumentar la temperatura,
mientras que la referencia inerte sigue aumentado su temperatura junto con
el horno, resultando entonces en un aumento del T
(hacia valores
Endotrmico
Exotrmico
Oxidacin
Transicin
Vtrea
Cristalizacin
Fusin
Descomposicin
Temperatura (C)
Figura 4. Termograma de ATD
165
166
Control de
atmsfera
Programador de
temperatura
Horno
Muestra
Sensores de
temperatura
(termocuplas)
Referencia
Amplificador de
seal
Registrador
167
168
169
Control de atmsfera
Programador de
temperatura (TP)
Horno
Disco Termoelctrico
Muestra
Referencia
Termocuplas que
miden TM y TR
Termocuplas que
miden EM y ER
Sistema digital de
amplificacin y
captura de datos
Registrador
Los termogramas obtenidos son similares a los de ATD, pero en este caso el
rea bajo la curva de cada pico es proporcional a la energa requerida por la
muestra para compensar el proceso endotrmico, o por la sustancia de
referencia para igualar la energa emitida por la muestra cuando se trata de un
proceso exotrmico. Aunque tambin es necesario realizar una calibracin, en
este caso es para determinar un factor de conversin elctrico, que no depende
de las caractersticas de la muestra.
En un equipo DSC bien diseado, el valor de esta constante es independiente
de la temperatura, lo cual explica el atractivo de esta tcnica para
determinaciones
calorimtricas
cuantitativas.
170
Es
posible
determinar
Calibracin
171
Aplicacin
TG
ATD
DSC
Punto de fusin
Anlisis de solvatos
Solvente ligado
Solvente adsorbido
+
+
+
+
+
+
Transicin Vtrea
Calores de transicin
+?
Determinacin de pureza
+?
Anlisis de incompatibilidades
Cintica de descomposicin
Transiciones polimrficas
172
Eutctico
Fusin
Endotrmico
As
Pureza 94,86%
P f = 133,4 C
Pureza 98,34%
Pf = 135,1 C
Ts
90
100
110
120
130
140
Temperatura (C)
Figura 7. Termograma de DSC de la Fenacetina en dos grados de pureza. Ts es una
temperatura instantnea de la muestra en el rango de fusin y As es el rea bajo la endoterma
de fusin hasta dicha temperatura Ts
173
Figura 8. Termogramas por DSC (grficos superiores) y TG (inferiores) correspondientes a TCR anhidra
expuesta a 32% de Humedad Relativa (HR, izquierda) y a 100% de HR (derecha). En el caso de 32% HR,
los tiempos fueron t = 0 (a, a), t = 10 das (b, b), t = 20 das (c, c), y t = 60 das (d, d). En el caso de
100% de HR, los tiempos fueron t = 0 (e, e), t = 1 h (f, f), t = 24 hs (g, g), t = 20 dIas (h, h) y t = 40 das
(i, i). Adaptada de Sorrenti et al., Solid-state characterization of tacrine hydrochloride. J Pharm Biomed
Anal 63, 53. Copyright 2011. Con permiso de Elsevier.
175
176
F. Anlisis de incompatibilidades
177
Figura 9. Termogramas de DSC del principio activo AZT y los excipientes en estudio, obtenidos
bajo atmsfera dinmica de nitrgeno (50 ml/min) a una velocidad de calentamiento de 10
C/min. Adaptada de Arajo et al., Thermal analysis of the antiretroviral zidovudine (AZT) and
evaluation of the compatibility with excipients used in solid dosage forms. Int J Pharm 260, 303.
Copyright 2003. Con permiso de Elsevier.
178
Figura 10. Termogramas de DSC de mezclas binarias 1:1 de AZT ms excipientes, obtenidos
bajo atmsfera dinmica de nitrgeno (50 ml/min) a una velocidad de calentamiento de 10
C/min. Adaptada de Arajo et al., Thermal analysis of the antiretroviral zidovudine (AZT) and
evaluation of the compatibility with excipients used in solid dosage forms. Int J Pharm 260, 303.
Copyright 2003. Con permiso de Elsevier.
179
180
Temperatura (C)
Temperatura (C)
exotrmica, respectivamente.
PE
Vol. reactivo
PE
Vol. reactivo
181
ptica
de
la
muestra
durante
el
tratamiento
trmico),
Preguntas Orientadoras
1. En qu se basan todos los mtodos de anlisis trmico (AT)?
2. Describa el fundamento y principales caractersticas de una
termobalanza.
3. Cules son las principales aplicaciones de la TG en el anlisis
farmacutico?
4. Fundamento y equipamiento de la tcnica ATD.
5. Fundamento y equipamiento de la tcnica por DSC.
6. Cul es la principal diferencia entre ATD y DSC?
7. Explica el fundamento del empleo de DSC como tcnica cuantitativa,
y la manera de hacerlo (calibrado del equipo).
8. Enumera las principales constantes trmicas que pueden obtenerse
mediante AT, y cul es la tcnica de eleccin para cada una de ellas.
9. Si Ud. posee una sustancia que puede encontrarse tanto en forma
anhidra como mono o dihidrato, qu tcnica escogera para
establecer de qu forma se trata? Indique brevemente cmo se vera
el termograma en cada caso.
182
Test de Autoevaluacin
1. Cul de los siguientes fenmenos no podra ser estudiado por TG?
(a) Prdida de solvente
(b) Descomposicin con liberacin de CO2
(c) Transicin polimrfica slido-slido
(d) Hidratacin del slido
183
Bibliografa
1.
Wendlandt WW. (1986) Thermal analysis. John Wiley &Sons, 3rd ed:
184
4.
Arajo AAS, Storpirtis S, Mercuri LP, Carvalho FMS, Filho MdS, Matos
new
pseudopolymorphic
modifications
of
the
glucocorticoide
185
CAPITULO 8
DETERMINACIN DE AGUA
Claudia Marano
Introduccin
El agua merece especial atencin porque usualmente se debe indicar el
contenido de humedad de una muestra analtica. En las muestras liquidas, el
agua puede considerarse como diluyente o como impureza.
Las sales de cidos inorgnicos y orgnicos as como otros compuestos
cristalinos pueden retener agua de diferentes formas:
Agua enlazada
Agua adherida o libre
El agua libre (no enlazada) es humedad adsorbida en la superficie del slido, y
el agua enlazada es agua de cristalizacin (agua de hidratacin). Por
consiguiente, se tiene al agua libre como una impureza, mientras que el agua
enlazada, aunque en realidad es un diluyente, de hecho forma parte de la
estructura del cristal.
186
2I
I2 + 2e
% H 2O
100
10.72 P
C = Cantidad de electricidad requerida para la produccin de yodo
10,72 = Cantidad de electricidad requerida para producir Iodo por 1 mg de agua
P = Peso de muestra.
187
188
que ha resultado ser la mejor base para la reaccin de Karl Fisher ya que
asegura una valoracin rpida y exacta.
CH3 OH + SO2 + RN
RNH SO 3 CH3 + H 2 O + I2 + 2RN
RNH SO 3 CH 3
RNH SO 4 CH 3 + 2(RNH)I
RN : Base
189
190
Ensayo blanco: Este ensayo se realiza bajo las mismas condiciones que la
muestra.
Clculos: Una vez alcanzado el punto final debe leerse en la bureta el volumen
de reactivo utilizado.
%H2O = (VxF/P)x100
dnde:
F: ttulo del reactivo (mg H2O/ml)
V: volumen de reactivo
P: peso de muestra en gramos
Es necesario realizar
191
Interferencias:
Gran parte de los compuestos orgnicos no interfieren. Puede valorarse el
agua en presencia de cidos, alcoholes, fenoles, teres, hidrocarburos,
anhdridos, aminas, amidas y muchas otras sustancias.
Aquellas sustancias que consumen yodo perturban cuantitativamente, un
anlisis por separado permitir aplicar una correccin.
Los compuestos cabonlicos interfieren por formacin de acetales y cetales con
el metanol, liberando agua en el proceso.
Los cidos carboxlicos son capaces de esterificar con metanol, esta reaccin
de condensacin produce agua. El uso de piridina y dioxano como medio de
valoracin limita las reacciones de esterificacin.
192
voltiles distintas del agua en la muestra, y sta ser estable en las condiciones
de tratamiento del secado.
Se determina tanto el agua libre como enlazada. Es necesario buscar para
cada compuesto la temperatura apropiada y el perodo requerido de secado
para desalojar toda el agua. Algunos compuestos hidratados son muy
resistentes a la completa expulsin del agua por secado a la estufa.
Si la muestra es lbil al calor, tambin cabe someterla al secado a la estufa,
pero a presin reducida. Esto, naturalmente, tiene el efecto de disminuir el
punto de ebullicin del agua, por lo que se utilizar una temperatura ms baja
en el proceso.
Si el secado a la presin reducida a temperatura ambiente es suficiente para la
separacin completa del agua, un desecador con vaco es el aparato ms
sencillo para eliminar el agua de este tipo de muestras. Se coloca un desecante
en la parte inferior del desecador para absorber la humedad. Entre los mejores
desecantes se encuentran:
Deutxido de fsforo
193
Tcnica.
Homogeneizar y pesar exactamente la muestra y, a menos que se especifique
de otro modo en la monografa correspondiente, llevar a cabo la determinacin
sobre 1 o 2 g de muestra. Pesar un pesa-filtro seco y colocar la muestra en el
mismo. Distribuir la muestra lo ms uniformemente posible. Tapar y colocar el
pesa-filtro en la cmara de secado. Secar la muestra a la temperatura y
durante el tiempo especificado en la monografa correspondiente.
Nota: la temperatura especificada en la monografa se considera dentro del
intervalo de 2c del valor establecido.
Abrir la cmara de secado tapar el pesa-filtro y llevarlo a temperatura ambiente
en un desecador antes de pesar.
Para muestras contenidas en cpsulas, emplear el contenido de no menos de
cuatro unidades finamente pulverizadas.
Si la monografa correspondiente establece:
que
el
desecante
se
mantenga
activo
reemplazndolo
frecuentemente.
194
Cuando un ttulo est especificado como SDA nos indica que el contenido de
agua fue determinado por el mtodo de Karl Fischer ya que por l determino
solamente el agua, ya sea libre o ligada.
Cuando el ttulo est especificado como SDD
a elaborar un
medicamento es importante conocer el ttulo sobre droga tal cual (SDTC) esto
evitar dudas al momento de pesar.
Ejemplo 1
Se realiz la valoracin de la siguiente materia prima C6H8ClN7OHCl.2H2 (P.M.:
302,2), aplicando una volumetra cido base en medio no acuoso.
195
Cantidad de
Volumen de
Vol.RKF-Vol
RKF (ml)
blanco
O,503
4,51
4,42
61,44
12,21
0,509
4,55
4,46
61,99
12,18
0,500
4,49
4,4
61,16
12,23
Peso mp (g)
Agua encontrada
% de Agua
(mg)
Valor medio
C.V .%
12,21
0,21
50 ml de metanol (consumieron)
0,45 ml de RKF
Nota: Para expresar el resultado debo calcular el valor medio de mis tres
determinaciones y una medida
y se mezcla. Se
(HClO4).
1 ml de cido perclrico 0,1N es equivalente a 26,61 mg de C6H8ClN7OHCl
196
Vol. HClO4
g de mp
(ml)
blanco (ml)
encontrados
0,422
13,7
13,5
0,367
86,91
0,374
12,2
12
0,326
87,17
0,381
12,3
12,1
0,329
86,35
0,392
12,8
12,6
0,342
87,24
----
0,2
Peso mp (g)
% sdtc
Valor medio
86,92 %
C.V.%
0,46
86,92%
= 99,13% SDA
Ejemplo 2
Se debe preparar 100 cpsulas conteniendo metoclopramida clorhidrato 10 mg
1 caps --------- 10 mg metoclopramida clorhidrato
100 caps ---------X= 1000 mg metoclopramida clorhidrato
197
Preguntas Orientadoras
1. Que entiende por agua libre y agua enlazada?
2. Como est formado el reactivo de Karl Fischer?
3. Que mtodos de determinacin de agua conoce? Explique
detalladamente
4. Se disolvieron 0,5404 g de agua en 50 ml de metanol. Se aadieron
5 ml de esta solucin a 20 ml de metanol y valoraron con RKF,
consumindose 9,5 ml. Asimismo 25 ml del mismo metanol
requirieron 0,8 ml de reactivo. Calclese el ttulo del reactivo de KF
5. Se disolvieron 0,2310 g de una muestra en 10 ml de metanol y se
valor con el RKF del problema anterior .Se requirieron 2,4 ml de
reactivo para valorar el agua de la muestra. Cul es el porcentaje de
agua que contena la muestra?
Test de Autoevaluacin
1. El reactivo de KF se estandariza con:
(a) Cantidades conocidas de alcohol
198
Bibliografa
1. Ministerio de Salud ANMAT. Farmacopea Argentina. VII ed. (2003) Buenos
Aires.
2. Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica (USP 35) (2011) Rockville.
3. K.A.Connors (1980). Curso de Anlisis Farmacutico. 2da. Ed. 1980.
4. Pradeau D. (1998) Anlisis Qumicos Farmacuticos de Medicamentos.
Uteha Noriega Editores.
199
CAPITULO 9
ANLISIS FUNCIONAL
Patricia Retaco
Introduccin
Se llama Grupo Funcional al tomo o conjunto de tomos que presentan una
estructura y propiedades fsico-qumicas determinadas que caracterizan a los
compuestos orgnicos que los contienen.
Un alto porcentaje de principios activos presentes en medicamentos son
molculas orgnicas formadas por una estructura C e H y de la sustitucin de
estos tomos se obtienen los grupos funcionales o funciones qumicas, y son
estos grupos funcionales
presente ms
Compuestos hidroxlicos
El comportamiento qumico del grupo hidroxilo est marcadamente afectado
por la estructura del resto de la molcula.
200
Etanol
Fenol
Enol
Mtodos de Anlisis
1. Acilacin con anhdrido actico
Fundamento
Los mtodos de acilacin se utilizan para alcoholes primarios y secundarios, en
presencia del reactivo acilante y bajo ciertas condiciones forman steres. La
reaccin implica la sustitucin del hidrgeno del hidroxilo por un grupo acilo.
R-OH + (RCO)2O
RCOOR + RCOOH
201
(Ac)2 + HClO4
(Ac)2 OH+
CH3CO
+ R-OH
HOAc + CH3CO+
ion acetilio
AcOR + H
Tcnica
Se trasvasa la muestra pesada con exactitud a un erlenmeyer seco con tapn
de vidrio esmerilado, se adiciona un exceso de reactivo anhdrido actico. Se
agita la mezcla para disolver la muestra. Se deja en reposo un cierto tiempo y a
una determinada temperatura para que se lleve a cabo la acilacin.
Completada la reaccin se hidroliza el exceso de anhdrido y se valora el cido
formado con un lcali estndar (hidrxido de sodio 0.5N, libre de carbonato),
usando como indicador fenolftalena 1% en piridina. Deber hacerse un ensayo
en blanco.
Nota: Para que la reaccin sea completa el consumo de la muestra debe
representar aproximadamente el 60% del consumo del blanco.
Interferencias
Los compuestos hidroxlicos requieren elevadas temperaturas para que la
reaccin sea cuantitativa y si existe impedimento estrico, la reaccin es
muy lenta.
Los compuestos hidroxlicos aromticos que reaccionan incompletamente,
(en estos casos es posible la determinacin utilizando como catalizador
cido perclrico en acetato de etilo).
202
Fundamento
Se produce la oxidacin del compuesto 1,2 dihidroxlico por el cido peridico
obtenindose dos aldehdos.
OH OH
R-CH-CH-R + HIO4 RCHO + RCHO + H2O + HIO3
produce 4 iodos y cada idico, 3 iodos, con el resultado total de que por cada
unidad 1,2 dihidroxlica en la muestra resulta la produccin de 1 mol (2
equivalentes) menos de iodo relativo a la valoracin del blanco. Es decir 1 mol
de unidad 1,2 dihidroxlica corresponde a una disminucin de 2 equivalentes en
el consumo de tiosulfato; por tanto, el peso equivalente de una unidad 1,2
203
Tcnica
Se adiciona a la muestra, previamente disuelta, un exceso de cido peridico
(este reactivo debe protegerse de la luz). Completada la oxidacin, se aade
ioduro de potasio y se valora el iodo liberado con tiosulfato. La diferencia entre
el tiosulfato consumido por el blanco y la muestra guarda relacin con la
cantidad de cido peridico utilizado en la oxidacin del glicol. Se debe hacer
un ensayo en blanco.
Interferencias
Los aminoalcoholes e hidroxicetonas son posibles interferencias.
3. Bromacin de Fenoles
Fundamento
Compuestos hidroxlicos aromticos reaccionan con bromo va sustitucin en
posicin orto y para respecto del grupo hidroxilo.
204
Tcnica
Se adiciona a la muestra, previamente disuelta, un exceso de reactivo de
bromo (en cido actico). Completada la reaccin, se aade ioduro de potasio
y se valora el iodo liberado con tiosulfato. Se debe hacer un ensayo en blanco.
La diferencia entre el tiosulfato consumido por el blanco y la muestra guarda
relacin con la cantidad de bromo utilizado para sustituir el compuesto
hidroxlico.
Interferencias
Aminas aromticas capaces de dar reacciones de sustitucin.
Aldehdos y olefinas que pueden consumir reactivo y sufrir oxidaciones y
adiciones respectivamente.
Fundamento
Los fenoles reaccionan con una solucin de nitrato de hierro (III) en cido
ntrico, se produce un color caracterstico cuya intensidad se mide en la regin
del visible a una determinada longitud de onda.
Fundamento
Los fenoles se acoplan en posicin para respecto al grupo fenlico (si esta
posicin est ocupada el acoplamiento se desarrollar en la posicin orto) con
una sal de diazonio, para dar un compuesto coloreado caracterstico cuya
intensidad se mide en la regin del visible a una determinada longitud de onda.
205
Fundamento
Los compuestos que poseen 1,2 glicoles y que por oxidacin con cido
peridico generan como producto de reaccin formaldehdo, ste reacciona con
cido cromotrpico (1,8 dihidroxinaftaleno-3,5-disulfnico) desarrollando una
coloracin caracterstica cuya intensidad se mide en la regin del visible a una
determinada longitud de onda.
D. Volumetra cido-base
Fundamento
Los fenoles se comportan como cidos dbiles ya que ocurre la estabilizacin
resonante del anin por deslocalizacin de la carga negativa. Es posible
valorarlos
con
exactitud
en
sistemas
no
acuosos.
Los
disolventes
recomendados para valorar cidos dbiles tienen carcter bsico, pueden ser
neutros tambin para la valoracin diferenciadora de mezclas (ver tabla 1).
Valorantes adecuados son por ejemplo:
Hidrxido de tetrabutilamonio.
206
Aminas
Las aminas se clasifican en:
Aminas Primarias
R-NH2
Aminas Secundarias
R-N-HR1
Aminas Terciarias
R-N-R1R2(R3N)
Las alquilaminas son ms bsicas que el NH3 ya que los grupos alquilo son
donantes de electrones al N en cambio los grupos que atraen electrones
disminuyen la basicidad, por lo cual las aminas aromticas son bases ms
dbiles que las alifticas.
Ejemplos de aminas presentes en principios activos:
Dopamina
Dobutamina
Mtodos de Anlisis
1. Formacin de iminas (Bases de Schiff) usando como reactivo 2,4
pentanodiona
207
Fundamento
Las aminas primarias alifticas experimentan condensacin con carbonilos
para producir iminas.
RNH2 + RCHO RHC = NR + H2O
Tcnica
Se adiciona a la muestra, previamente disuelta en piridina, un exceso de
reactivo 2,4-pentanodiona, completada la formacin de iminas, se adiciona un
indicador (timolftalena) y el exceso del compuesto carbonlico, se valora por
retroceso con solucin estndar de lcali como por ejemplo metxido de sodio.
Se debe hacer un ensayo en blanco.
Interferencias
Los cidos libres reaccionan lentamente con el reactivo valorante.
Puede ser aplicado a aminocidos, pero previamente deben ser
transformados en su sal sdica.
Tambin se puede aplicar para determinar amino-alcoholes, etilenaminas y
compuestos amino primario que tengan un nitrgeno heterocclico. Dicha
clase de compuestos, es dificultoso determinarlos por otros mtodos.
Las aminas aromticas primarias no pueden ser determinadas por este
mtodo.
Alcoholaminas secundarias, como dietanolamina y tioles reaccionan bajo
las condiciones del mtodo.
Aminas
secundarias
heterocclicas,
como
piperazina
morfolina,
208
Fundamento
Esta tcnica tiene amplio uso en anlisis farmacutico, muchas de estas
valoraciones figuran en la Farmacopea Argentina, en la USP y en otras
farmacopeas. La posibilidad de utilizar la volumetra cido-base depende de la
concentracin de la base y de su fuerza.
Las aminas alifticas son suficientemente bsicas para poder ser valoradas en
soluciones acuosas con un cido fuerte, mientras que las aminas aromticas
son demasiado dbiles para valorarlas en medio acuoso.
Aplicaciones
Las bases cuyos valores de Kb sean iguales o mayores que 10-6 podrn ser
valoradas en medios acuosos (pKb 6 y pKa 8), en cambio las bases con
valores de Kb menor que 10-6 (pKb > 6 y pKa <8) no podrn ser valoradas en
medios acuosos y requerirn de medios no acuosos. Adems las bases cuyos
valores de pKa(en agua) > 4 (pKb < 10) estn niveladas en cido actico glacial y
se pueden valorar por deteccin visual del punto final, en cambio las bases
cuyos valores de pKa(en
agua)
209
RNH+3
+ 2X2X- + AC2Hg
X2Hg
+ 2 Ac2CI04H + 2AcOH
2AcOH2+ + 2CI042AcOH2+ + 2Ac 4AcOH
Donde X= Cl, Br, I, F.
Los acetatos de aminas son valorados en forma usual. Con el agregado del
acetato de mercurio a la solucin del haluro se produce el reemplazo de las
bases por una cantidad equivalente de ion acetato que se comporta como la
base ms fuerte que puede existir en medio actico.
Los disolventes que se usan como medios en la valoracin de bases dbiles
son neutros o cidos (ver Tabla 1).
Como valorante se utiliza un cido fuerte. Por ejemplo:
cido perclrico: como el disolvente, cido actico, es diferenciador para
los cidos minerales, el perclrico es el ms fuerte y aconsejable. Este cido
disuelto en cido actico es el valorante ms usado para determinar bases
dbiles. Se disponen comercialmente de cido perclrico en solucin acuosa
concentrada, por lo que conviene separar el agua, con este propsito se suele
adicionar cierta cantidad (estimada
evita adicionar exceso de anhdrido por que las muestras acilables, tales como
las aminas primarias y secundarias, podran convertirse en su presencia en
compuestos mucho menos bsicos (amidas).
La estandarizacin de valorantes cidos es factible con cualquier sustancia que
sea una base fuerte y de gran pureza, por ejemplo: biftalato de potasio:
210
Fundamento
Este mtodo es llamado tambin de Diazotacin, pues el fundamento del
mismo consiste en la reaccin entre el cido nitroso y el grupo amino primario
aromtico, para dar una sal de diazonio. La reaccin global entre el cido
nitroso y las aminas aromticas es:
R-NH2
NO2H +
HCl
(R-N2)+ Cl-
2H2O
NO2H R-NH-N=O +
nitrosamina
R-NH-N=O
R-N=N-HO
diazohidrxido
211
H2O
R-N=N-HO
HCl
(R-NN)+ Cl- +
H2O
Sal de diazonio
Tcnica
La muestra de la amina a valorar se disuelve en agua destilada y se le agrega
una determinada cantidad de HCl concentrado (puede usarse como catalizador
de la reaccin de nitrosacin BrK al 25% si la amina no reacciona
rpidamente). Se sumerge el recipiente conteniendo la solucin en un bao de
hieloagua ( 5C) para minimizar la prdida del cido nitroso. Luego se
sumerge la punta de la bureta conteniendo el valorante (Solucin de nitrito de
sodio) en la solucin a valorar, se adiciona el valorante desde bureta
lentamente y con agitacin continua, tratando de evitar una alta concentracin
de NO2H.
Se determina el punto final empleando electrodos apropiados (platino-calomel o
platino-platino) o mediante un indicador externo, como puede ser un papel de
filtro impregnado con engrudo de almidn y solucin de ioduro de potasio o
una piedra de toque con dicha solucin. Luego del punto final una gota de la
solucin de valoracin produce inmediatamente un color azul, estable durante
un minuto (no confundir un lento y progresivo color azul que es causa de la
oxidacin en el aire del ioduro en medio cido). El valorante se estandariza con
cido sulfanlico como patrn primario.
Interferencias
Interfieren las aminas secundarias que consumen NO2H, por formacin de
los derivados N-nitrosados, y las aminas alifticas que tambin consumen
NO2H con liberacin de nitrgeno y produccin de un alcohol.
Las aminas terciarias alifticas en su reaccin con NO 2H producen
nitrgeno.
212
Fundamento
En primera instancia se produce diazotacin de la amina aromtica primaria
seguido del acoplamiento de la sal de diazonio, altamente reactiva, con un
segundo compuesto orgnico para dar un compuesto azo coloreado. El fenol
es el reactivo copulante caracterstico.
El producto de reaccin es altamente conjugado y absorbe radiacin de
longitudes de onda en la zona del visible, del cual se puede medir
espectrofotomtricamente su concentracin.
Otro reactivo de acoplamiento es la N-(1-naftil) etilendiamina (Reactivo de
Bratton-Marshall).
B. Mtodo colorimtrico para aminas primarias alifticas con salicilaldehido
Fundamento
Las aminas alifticas primarias reaccionan con salicilaldehdo como reactivo
para generar una salicilimina que forma un complejo imino-cprico, con una sal
de cobre que se extrae en n-hexanol. Se determina colorimtricamente el cobre
por reaccin con cido N,N-di (hidroxietil) ditiocarbmico, dando un complejo
de cobre ditiocarbamato determinndose su absorbancia a 420 nm.
213
tensioactivos
aninicos,
tales
como
laurilsulfato
de
sodio
Qorg + X
aq
QXorg
QXorg
coloranteorg + LSNa aq
colorante.LSNaorg
Tambin puede usarse un indicador que forme par inico con la sal de amonio
o la amina valorada:
Q+aq
Qorg
+ coloranteorg
Q coloranteorg
214
se
R1
R4
R2
N+
R3
Reactivos empleados
Solventes: agua, cloroformo o benceno.
Colorantes: pueden ser cidos: azul de timol, azul de bromofenol, prpura
de bromocresol o bsicos: azul de metileno, amarillo de dimetilo.
Agente tensioactivo: laurilsulfato de sodio, que es una mezcla de
alquilsulfatos de sodio constituida principalmente por dodecilsulfato de sodio.
La solucin de laurilsulfato de sodio se debe estandarizar con papaverina
como patrn primario.
Tcnica
Disolver la muestra (se disolver en una u otra fase segn est libre o
salificada)
en
una
mezcla
de
volmenes
iguales
de
los
solventes
216
Interferencias
Pueden llegar a interferir los cidos orgnicos y los fenoles pues suelen formar,
sobre todo con los colorantes bsicos, una sal entre el anin y el catin
colorante.
Muchas aminas y compuestos de amonio cuaternario forman pares inicos con
colorantes cidos, determinndose la concentracin de las mismas por
extraccin con un solvente determinado y leyendo su absorbancia al visible.
Compuestos carbonlicos
Los aldehdos y cetonas tienen un grupo carbonilo, es decir un tomo de
carbono unido a un tomo de oxigeno por medio de un doble enlace, ese
enlace se encuentra altamente polarizado debido a la alta electronegatividad
del oxgeno, siendo ste nucleoflico, mientras que el carbono porta una carga
positiva parcial, siendo un sitio electroflico y reacciona con los nuclefilos.
217
Fundamento
El bisulfito se adiciona
OH
|
R - C - R
|
HSO3-
SO3-
Tcnica
En este mtodo el bisulfito no se usa directamente como reactivo dada su
inestabilidad. Se trabaja con un exceso de sulfito de sodio al que se aade
antes de incorporar la muestra, un volumen conocido de cido sulfrico que
genera el bisulfito in situ, completada la reaccin de adicin se valora con
lcali, el exceso de bisulfito. Se debe hacer un ensayo en blanco.
Interferencias
Las metilcetonas y las cetonas alicclicas y las cetonas voluminosas que
adicionan bisulfito con bastante lentitud.
cidos o bases que impurifiquen la muestra.
2. Mtodo de oxidacin
Fundamento
Se pueden oxidar los grupos aldehdos a los correspondientes cidos
carboxlicos con agentes oxidantes tales como xidos de plata (AgO2) Reactivo
de Tollens.
R-CHO + Ag2O RCOOH + 2Ag
218
Tcnica
Se determina por adicin de un exceso de Reactivo de Tollens. Se produce la
aparicin de un espejo de plata o una turbidez. Completada la oxidacin, se
determina el exceso de plata por valoracin con ioduro de potasio.
Tambin puede valorarse el cido producido con lcali estndar.
Se debe hacer un ensayo en blanco.
Fundamento
La formacin de hidrazona se lleva a cabo por condensacin entre el grupo
carbonilo y una hidracina.
O
||
RCH
R - NH NH2
N NH R
||
RCH
+
H2O
Tcnica
Se adiciona a la muestra un exceso de reactivo, culminada la reaccin el
exceso de dimetilhidracina se valora por retroceso con un cido estandarizado,
con deteccin potenciomtrica del punto final. Se debe hacer un ensayo en
blanco.
Interferencias
Los cidos fuertes.
Las cetonas son bastante bsicas y no podran diferenciarse del exceso de
hidracina (bsica) y no es posible distinguirlas potenciomtricamente del
reactivo.
219
Fundamento
La formacin de hidrazona se lleva a cabo por condensacin entre el grupo
carbonilo y una hidracina.
NH - NH2
H
O
||
R -C -H
NO2
C
R
NO2
N
N
H2O
NO2
NO2
Las
2,4-dinitrofenilhidrazonas
son
derivados
insolubles,
cristalinos
Tcnica
Se adiciona el reactivo 2,4-dinitrofenilhidracina a la muestra a analizar disuelta
en una solucin cida. Transcurrida la condensacin se filtra el slido obtenido
a travs de un crisol tarado, que posteriormente se seca y pesa.
Interferencia
Acetales y cetales ya que la reaccin se lleva a cabo en medio cido.
Fundamento
La formacin de hidrazona se lleva a cabo por condensacin entre el grupo
carbonilo y una hidracina (2,4-dinitrofenilhidracina).
Cuando se adiciona un lcali a la 2,4-dinitrofenilhidrazona, se produce un color
rojo vino, debido a la formacin de un compuesto quinoidal. Este color
proporciona un ensayo colorimtrico muy sensible leyndose la absorbancia a
480 nm.
220
Fundamento
El producto de Condensacin de un aldehdo o cetona con clorhidrato de
hidroxilamina NH2OH.HCl, se conoce con el nombre de oxima.
Tcnica
Se aade un exceso de clorhidrato de hidroxilamina a la muestra, culminada la
reaccin, se valora el cido formado con un lcali estandarizado utilizando
deteccin potenciomtrica del punto final (la deteccin potenciomtrica es
necesaria para diferenciar el consumo de lcali debido al HCl formado del
consumo por parte del exceso de NH2OH.HCl)
Interferencias
Acetales, cetales y teres vinlicos se hidrolizan fcilmente ya que la reaccin
se lleva a cabo en medio cido.
steres
Nu -
Reaccin de
Adicin
O|
R-C -X
|
Nu
221
X-
Reaccin de
Eliminacin
O
||
R - C - Nu
Cloruro de cido
Anhidrido
ster
Amida
Carboxilato
Mtodos de Anlisis
1. Saponificacin
Fundamento
Una base promueve la hidrlisis de los steres porque proporciona el reactivo
fuertemente nucleoflico oxidrilo que ataca al tomo de carbono electroflico y
desplaza al ion alcxido. La velocidad de la reaccin est controlada por los
dos primeros pasos.
O
||
R - C - OR
ONa
|
R - C - OR
|
OH
Na OH
O : Na
|
R - C - O R
|
OH
O
||
R - C - O- Na+
ROH
Tcnica
Se disuelve la muestra en el disolvente seleccionado (agua, alcohol). Se
adiciona un exceso conocido de lcali estndar, se calienta a reflujo.
Culminada la reaccin se deja enfriar la solucin, se agrega solucin indicadora
222
Interferencias
Cetonas y aldehdos.
Los steres vinlicos no pueden ser determinados debido a que stos
consumen hidrxido.
O
||
R - C -OR
RCONHOH
O
||
R - C -NHOH +
NH2OH
+ Fe3+
R - C - NH
|| |
O O
Fe
2+
R OH
+ H+
Amidas
Las amidas se forman por reaccin de cidos carboxlicos con amoniaco,
aminas primarias y secundarias. La reaccin se realiza bajo calefaccin,
predominando en estas condiciones el ataque nucleoflico que formar la
amida.
223
O
||
CH3 - C - O H
: NH3
O
||
CH3 - C - N H2
H2O
Cloranfenicol
Pirazinamida
Las lactamas son amidas cclicas obtenidas por condensacin, con prdida de
agua, de una molcula que contiene grupos cido y amino.
La Penicilina V es un agente antibitico que contiene un anillo -lactmico en
su estructura molecular:
Mtodos de Anlisis
1. Valoracin acido base
Tcnica
Las amidas son bases muy dbiles. Para valorarlas se usa como medio
anhdrido actico, como titulante solucin estndar de cido perclrico en cido
actico glacial o dioxano. El punto final se debe determinar por potenciometra
usando un electrodo de vidrio modificado. Se recomienda determinar el punto
final usando el mtodo de la derivada primera o segunda
(En el electrodo de vidrio modificado, se ha reemplazado la solucin acuosa
saturada de ClK por una solucin de ClO4Li 0.1M preparada en anhdrido
actico. El electrodo se estabiliza dejndolo sumergido 12 hs. en anhdrido
actico antes de usarlo).
224
2. Saponificacin
Las amidas son ms difciles de saponificar que otros derivados de cidos, las
condiciones deben ser ms drsticas. Se debe usar elevada temperatura y
calentamiento a reflujo en presencia de un exceso de lcali (ver Esteres).
Alquenos
Se considerar a los compuestos que contienen el doble enlace carbonocarbono. El tipo y grado de reactividad qumica conferido a una molcula por
una insaturacin carbono-carbono depende de la estructura molecular local.
Un dieno es un compuesto orgnico que tiene dos enlaces dobles.
Un polieno tiene ms de dos.
Dependiendo de su posicin relativa se distinguen tres tipos de compuestos:
CH2=CHCH2CH=CH2
Dieno conjugado
CH2=CHCH=CH2
Acumulados
CH2=C=CH2
Insaturaciones vinlicas
R-CH=CH2
, Insaturados
R-CH=CH-X
El doble enlace C=C tiene una nube electrnica p desde la que se pueden
ceder electrones a un atacante electrfilo. Por tanto, la reaccin ms
importante de los alquenos es la adicin electrfila.
Los dienos aislados no tienen propiedades especiales y se comportan como
alquenos normales. Los acumulados o alenos tienen propiedades estructurales
especiales. Pero los ms interesantes son los conjugados, que tienen una
reactividad muy caracterstica, como por ejemplo los -Carotenos
225
-Carotenos
Mtodos de Anlisis
1. Mtodo del acetato de mercurio (II)
Fundamento
Se adiciona acetato de mercurio (II) en medio de metanol a los alquenos con
dobles enlaces aislados y vinlicos, produciendo un compuesto de adicin y
cido actico.
HgOAc
R-CH = CH2 + Hg(OAc)2 + CH3OH
R-CH-CH2 +
AcOH
OCH3
Tcnica
Este mtodo se puede resolver de dos formas distintas:
Titulando el AcOH formando con HOK/CH3OH y fenolftalena. Se debe hacer
un blanco y determinar previamente tiempo y temperatura de reaccin
(generalmente se trabaja a bajas temperaturas o a temperatura ambiente).
Agregando un exceso conocido de Ac2Hg
226
Cl2Hg
+ 2AcOH
RO
|
H- C - C - H
|
Hg OAc
RO
|
H- C - C - H
|
Hg Cl
HCl
AcOH
y el
Interferencias
Los
dienos
conjugados
los
insaturados
reaccionan
pero
no
cuantitativamente.
Fundamento
Se produce la adicin del reactivo electroflico al doble enlace C=C presente
en alquenos, se pueden valorar compuestos insaturados aislados, conjugados
y vinlicos. No todos los dobles enlaces reaccionan de la misma forma, por
ejemplo en los compuestos aromticos los enlaces participan de un sistema
conjugado siendo entonces su reactividad menor que la de un sistema aislado.
Br
H2C
CH2
Br Br
Br
Tcnica
Se aade un exceso de bromo a la muestra, culminada la reaccin se adiciona
ioduro de potasio inmediatamente se titula con tiosulfato de sodio
estandarizado hasta desaparicin de color amarillento en el punto final.
Se debe hacer un ensayo en blanco
227
Fundamento
Cuando el doble enlace est situado en , respecto a un grupo aceptor de
electrones (X) la fuerte atraccin de electrones de este grupo induce una
densidad positiva en el C que es susceptible de ser atacado por reactivos
nucleoflicos, como la morfolina, una amina secundaria cclica, producindose
la adicin al doble enlace de la misma y obtenindose una amina terciaria.
H
|
RC=C-X
|
H
H
N
O
N -C RH - CH2 - X
Tcnica
Se aade un exceso de morfolina a la muestra, culminada la reaccin, que se
debe realizar a temperatura ambiente y a un tiempo entre 5-60 minutos, se
acila el exceso de morfolina con anhdrido actico en medio de acetonitrilo e
inmediatamente se titula con cido clorhdrico estandarizado la amina terciaria
formada. Se debe realizar un ensayo en blanco.
Interferencias
cidos y bases presentes en la muestra.
228
Tipo de
solvente
De carcter cido
para titulacin de
bases y sus sales
cido
actico
glacial
Anhdrido actico
Solvente
cido formica
cido propinico
Cloruro
de
sulfurilo
Relativamente
neutro
para titulacin
neutro
para titulacin de
para titulacin
cidos
diferencial de
cidos
Acetonitrilo
Alcoholes
Dimetilformamida
Cloroformo
n-butilamina
Benceno
piridina
Tolueno
etilendiamina
Clorobenceno
Acetato de etilo
morfolina
Acetona
Acetonitrilo
Metil etil cetona
Metil
isobutyl
cetona
Alcohol ter-butlico
Dioxano
Rojo de quinaldina
Rojo de metilo
p-naftolbenceina
Naranja de metilo
alfazurina 2-G
p-naftolbenceina
verde de malaquita
Vidrio/calomel
Electrodos
De carcter bsico
diferencial de bases
Cristal violeta
Indicador
Relativamente
Vidrio/plata/cloruro
Vidrio/calomel
de plata
Calomel/plata/cloruro
Mercurio/acetato
de plata
Azul de timol
Azo violeta
Timolftaleina
Azul
Azo violeta
bromotimol
o-nitroanilina
p-
p-
hidroxiazobenceno
hidroxiazobenceno
azul de timol
Antimonio/calomel
Antimonio/vidrio
Antimonio/antimonio
Platino/calomel
de mercurio
Vidrio/calomel
229
de
Antimonio/calomel
Vidrio/calomel
Vidrio/platino
Preguntas Orientadoras
1.
2.
3.
4.
5.
Test de Autoevaluacin
Las opciones son Verdadero (V) o Falso (F)
>
Amida >
Carboxilato
V / F
5. Para valorar una amina aromtica primaria presente en una materia
prima se utiliza la volumetra en fase heterognea
V / F
6. Para valorar la funcin amida presente en un principio activo se
utiliza una volumetra cido base en medio acuoso.
V / F
230
Bibliografa
1.
Buenos Aires.
2.
Macimillan.
3.
2. Edicin Espaola.
4.
Revert, S.A.
231
CAPITULO 10
LA PRUEBA DE DISOLUCIN
Mara Esperanza Ruiz
Introduccin
La evaluacin de la disolucin tiene aproximadamente un siglo de desarrollo.
Sin
embargo,
en
las
ltimas dcadas ha
suscitado
mayor inters,
232
233
234
CS
S
LI
D
O
h
C
Figura 1. Esquema de la disolucin de una partcula esfrica en un flujo laminar que permita
suponer la existencia de una capa de lquido estanca de espesor uniforme h adsorbida
alrededor de cada partcula. Cs es la concentracin de la droga en la capa estanca
(concentracin de saturacin) y C es la concentracin en el seno de la solucin
235
de
disolvente
que
se
desplazan
hacia
el
slido,
De Noyes-Whitney a la actualidad
236
Figura 2. Esquema de un equipo de disolucin. Los vasos que contienen el medio donde se va
a disolver el principio activo (al menos seis) se sumergen en un bao de agua con control de
temperatura y se agitan a la velocidad deseada (50 rpm, por ejemplo) mediante un vstago
central (en el esquema, con forma de paleta).
237
Agitacin
De acuerdo con la teora de Nernst y Brnner, el espesor de la capa lquida que
rodea a las partculas es inversamente proporcional a la velocidad de agitacin.
Por lo tanto, si aumenta la intensidad de la agitacin, disminuye el espesor del
film, favoreciendo la difusin de las molculas al seno de la solucin.
Se han desarrollado otros modelos ms complejos para explicar la relacin
entre la velocidad de la disolucin y la intensidad de la agitacin, sobre todo en
los casos donde no se puede suponer flujo laminar. Pero en todos los casos, la
relacin entre estas variables es directa: mayor disolucin a mayor agitacin.
Temperatura
Segn la ley de Le Chatellier, un proceso endotrmico es favorecido por el
aumento de temperatura: como la mayora de los slidos presentan calores de
disolucin positivos, el aumento de temperatura favorece su solubilidad y
velocidad de disolucin.
Por otro lado, la ecuacin de Nernst-Brunner (ecuacin 2) muestra la relacin
directamente proporcional entre velocidad de disolucin y coeficiente de
difusin de una molcula que, acorde a la ecuacin de de Stokes-Einstein,
aumenta con la temperatura (ecuacin 4):
Avogadro.
238
239
iii)
Solubilidad
Es un parmetro termodinmico que representa la concentracin de la solucin
de un frmaco en equilibrio con el soluto. Segn la ecuacin de Noyes-Whitney
(ecuacin 1) la solubilidad (Cs) es el factor ms importante en la velocidad de
disolucin. Varios factores pueden modificar la solubilidad de una sustancia
slida:
La solubilidad depende principalmente de la naturaleza qumica del slido.
Los electrolitos se disuelven fcilmente en agua, mientras que en el caso de
sustancias que contienen a la vez grupos polares y no polares, su solubilidad
en agua depende de la relacin entre esos grupos. Por otro lado, en el caso de
sustancias cidas o bsicas, tambin se puede modificar la solubilidad segn
se utilice la forma libre (genricamente denominada forma base) o una sal.
El polimorfismo, es decir la capacidad de una sustancia de cristalizar en ms
de un sistema, tambin incluye en la solubilidad, ya que cada polimorfo posee
propiedades fsicas diferentes, entre ellas el punto de fusin, la solubilidad y la
velocidad de disolucin.
En algunos casos, la presencia de impurezas o trazas de impurezas, no
detectables por los mtodos qumicos que suelen ser aceptados por las
farmacopeas, pueden inhibir la disolucin.
rea superficial
Depende principalmente del tamao de las partculas, aunque tambin de su
porosidad y forma geomtrica. Al disminuir el tamao de las partculas aumenta
su rea superficial S, y con ella la velocidad de disolucin (ver ecuacin 2).
240
sino
solamente
en
la
etapa
de
preformulacin.
Tanto
los
Excipientes
Mtodo de granulacin
De acuerdo con el mtodo empleado pueden obtenerse comprimidos de
diversa resistencia mecnica, la cual influye en la velocidad de disolucin del
principio activo.
241
Fuerza de compresin
Durante la compresin es difcil mantener las caractersticas granulomtricas
de los principios activos. La velocidad de disolucin, segn algunos autores,
aumenta con el aumento de la fuerza de compresin, llega a un mximo y
luego decrece hasta un nivel constante. Otros autores consideran que cuando
se aplica una fuerza dbil, las partculas se aglomeran, y disminuyen la
velocidad de disolucin, pero si aumenta la fuerza llega un punto en que las
partculas se rompen, y la velocidad de disolucin aumenta hasta un mximo
para luego disminuir.
Envejecimiento
La velocidad de disolucin de comprimidos envejecidos puede ser menor que
la de los recin elaborados. Este efecto se puede deber a diferentes causas,
como la presencia de ciertos excipientes que aumentan la dureza de los
comprimidos en el tiempo, o al efecto del agua residual del granulado.
242
Las anteriores, sin embargo, no son las nicas aplicaciones de este ensayo. La
valiosa informacin que se obtiene al evaluar el desempeo de disolucin de
los productos farmacuticos, como as tambin la estrecha relacin entre dicha
informacin y el posterior desempeo in vivo del producto, dan lugar a otra
serie de aplicaciones biofarmacuticas de estos ensayos, las cuales sern
brevemente discutidas al final de este captulo.
Equipos de disolucin
La USP codifica siete aparatos de disolucin:
1) Canastillo
2) Paleta rotatoria
3) Cilindro reciprocante
4) Celda de flujo
5) Paleta sobre disco
6) Cilindro rotatorio
7) Disco reciprocante
Los ms usados son los equipos 1 y 2, y son los nicos incluidos en la FA VII
Ed. Ambos equipos constan de un bao de agua en el que se sumergen al
menos seis vasos de 1 litro de capacidad, los que contienen el medio de
disolucin. Durante el ensayo, la temperatura de dicho bao se fija en 37 0,5
C (productos de administracin oral). Por otro lado, los equipos poseen un
motor giratorio (velocidad variable entre 25 a 200 rpm, aproximadamente) que
acciona elementos de agitacin o vstagos sumergidos en el centro de cada
243
Figura 3. Esquemas de los equipos (las medidas son en mm). A: vstago correspondiente al
aparto 1 o canastillo, B: aparato 2 o paleta.
244
Respecto a este ltimo punto, la USP ofrece dos tipos de calibradores: tabletas
o comprimidos desintegrables (Prednisona 50 mg) y no desintegrables (cido
Saliclico 300 mg), los cuales poseen tiempos fijos de disolucin bajo
determinadas condiciones experimentales.
Test de disolucin
Para el control de calidad de productos orales de liberacin inmediata las
farmacopeas indican, en las monografas correspondientes, las condiciones en
las que se debe realizar el test de disolucin. Bajo dichas condiciones
experimentales, se ensayan seis unidades del producto en cuestin y, a un
tiempo que tambin se encuentra especificado en dicha monografa, se toma
una muestra de cada vaso y se cuantifica el principio activo disuelto, el cual
debe haber superado cierto porcentaje de disolucin para cumplir con dicho
245
test. Por lo tanto, se trata de un ensayo a un nico tiempo, que slo permite
determinar si el producto evaluado cumple con los requisitos de disolucin
establecidos en la monografa correspondiente.
Las condiciones que se encuentran en el apartado correspondiente al test de
disolucin en la monografa individual de un producto son las siguientes:
Equipo: tpicamente, aparatos 1 o 2.
Temperatura: para productos de administracin oral, siempre es 37 0,5 C
Medio de disolucin: se indica qu medio utilizar y qu volumen del mismo. Si
el medio es una solucin buffer, se debe ajustar el pH hasta 0,05 unidades
del valor establecido.
Agitacin: expresada en rpm
Especificacin o tolerancia: se expresa como dos datos. Un valor Q, que es un
%Disuelto (sobre valor declarado SVD-) a un tiempo dato t (tiempo al que se
debe alcanzar dicho %D.
Tipo de muestreo: en la mayora de los casos el muestreo es individual, es
decir se toma una muestra de cada vaso y se analizan por separado,
obtenindose seis valores de %Disuelto (%D). Pero en algunos casos las
farmacopeas pueden requerir muestreo unificado, segn el cual las seis
muestras obtenidas se juntan para formar una nica muestra que se analiza.
Mtodo analtico: empleado para la determinacin del %D en las alcuotas
extradas del equipo de disolucin.
246
Se deben separar todas las partculas slidas que pudieran estar presentes
en las muestras, por lo que las mismas deben ser filtradas o centrifugadas.
En el caso de filtracin, se debe verificar previamente (durante la validacin)
que el sistema de filtracin no adsorba al principio activo ni libere sustancia
al filtrado.
247
Criterios de Aceptacin
Etapa
Unidades
ensayadas
E1
E2
12
E3
Criterios de aceptacin
Etapa
Unidades
ensayadas
E1
E2
E3
12
Criterios de aceptacin
248
Eta
pa
Unidades
ensayadas
E1
12
E2
E3
Criterios de aceptacin
249
Etapa
Unidades
ensayadas
E1
E2
E3
12
Criterios de aceptacin
Perfil de disolucin
A pesar de que el test de disolucin es el ensayo oficial codificado, una nica
determinacin (nico tiempo de muestreo) no permite caracterizar la forma
farmacutica, y por lo tanto resulta de inters evaluar y comparar perfiles de
disolucin: registros del %Disuelto (SVD) en funcin del tiempo. Adems de los
objetivos generales ya mencionados, la obtencin de un perfil de disolucin
tambin permite:
-
250
Por otro lado, el muestreo puede hacerse con o sin reposicin, segn se
reemplace o no el volumen extrado de cada vaso, a cada tiempo, por un
volumen igual de medio fresco. En el caso de ser con reposicin, es necesario
que el equipo cuente con al menos 7 vasos, de manera de disolver las 6
unidades simultneamente y tener medio fresco para reponer (en iguales
condiciones de agitacin y temperatura) en el sptimo vaso.
En cuanto a los clculos, cuando se cuantifica la concentracin del principio
activo disuelto en cada vaso, se debe tener en cuenta que:
-
251
Los perfiles se consideran similares si el valor del f2 entre ellos es mayor o igual
a 50, y el f1 menor a 15. Requisitos para el clculo del factor de similitud f2:
252
Los %D de los dos productos a comparar deben haber sido obtenidos bajo
las mismas condiciones experimentales, y los tiempos de muestreos deben
haber sido los mismos en ambos casos.
Para el clculo, se considerarn todos los valores por debajo y slo uno por
encima del 85% disuelto, como mnimo 3 tiempos sin considerar el cero.
Otro mtodo consiste en calcular el rea bajo la curva (ABC), por el mtodo de
los trapecios por ejemplo, y/o la eficiencia de disolucin (ED), dada por la
ecuacin 10:
253
A pesar de que se han postulado otros modelos matemticos para ajustar los
datos de %Disuelto vs. tiempo, los cuatro descriptos en la tabla anterior son los
ms utilizados por su mejor ajuste a datos provenientes de formas slidas de
liberacin inmediata.
254
255
Productos del mismo productor que han sufrido algn cambio posterior a su
aprobacin: escalado, cambio de composicin, de sitio de produccin, de
equipamiento, etc.
256
del BCS), la velocidad total del proceso quedar supeditada a la del primero.
Se dice, en ese caso, que la liberacin es el factor limitante de la absorcin.
Sin embargo, una intensa discusin se ha desarrollado recientemente acerca
de la posibilidad de ampliar los criterios de elegibilidad de bioexenciones. En
nuestro pas, la Disp. 758/2009 establece los criterios para eximir de la
realizacin de estudios de BE a determinados medicamentos slidos orales de
liberacin inmediata: en base al BCS y en funcin de los resultados de ensayos
de disolucin, son candidatos a bioexenciones aquellos productos conteniendo
principios activos considerados de riesgo intermedio (segn la clasificacin
original establecida en la Disp. 3185/99) cuando los mismos pertenecen a las
clases I o III del BCS.
D/S = 250 ml
Solubles
Permeables
Permeables
FA = 90%
Solubles
Permeables
Permeabilidad
Solubles
Permeables
Solubles
Solubilidad
Preguntas Orientadoras
1. Por qu es importante el estudio de la disolucin de los principios
activos slidos?
2. Principal modelo propuesto para explicar el proceso de disolucin y
ecuaciones derivadas.
257
Test de Autoevaluacin
1. Qu ensayo de calidad le realizara a comprimidos para evaluar in
vitro su biodisponibilidad?
(a) Ensayo de friabilidad
(b) Ensayo de uniformidad de dosis
(c) Ensayo de estabilidad
(d) Ensayo de disolucin
258
259
Bibliografa
1.
Shargel
L,
Yu
ABC.
(1993)
Applied
biopharmaceutics
and
FDA/CDER.
(2003)
Guidance
for
Industry:
Bioavailability
and
Disposicin
3185
(disponible
en
http://www.anmat.gov.ar/webanmat/
Legislacion/Medicamentos/Disposicion_ANMAT_3185-1999.pdf).
4.
Chile.
6.
FDA/CDER.
(2000)
Guidance
for
Industry:
Waiver
of
In
Vivo
260
11.
261
CAPITULO 11
UNIFORMIDAD DE UNIDADES DE DOSIFICACIN
Susana Mabel Gmez
Introduccin
El ensayo de uniformidad de unidades de dosificacin, es uno de las pruebas
que garantiza la calidad de un producto terminado. Permite verificar que cada
unidad de dosificacin de un lote en estudio, contenga una cantidad de
principio activo dentro de un intervalo estrecho alrededor de la cantidad
declarada, y as, inferir la homogeneidad del mismo. Se entiende como
unidades de dosificacin las formas farmacuticas que contienen una nica
dosis o parte de una dosis de un frmaco en cada unidad.
Uniformidad de peso
Uniformidad de contenido
262
Comprimidos
Comprimidos
con
cubierta
flmica:
Se
pesan
263
264
Criterios de aceptacin:
Se aplican estos criterios, a menos que se especifique de otro modo en la
monografa correspondiente.
Criterio A: Si el promedio de los lmites especificados en la definicin de
potencia
(Xp)
de
cada
producto
en
la
monografa
correspondiente
265
266
de
cada
producto
(Xp)
en
la
monografa
correspondiente
267
blandas:
se
pesan
con
exactitud
10
cpsulas
intactas
268
ellas. Se cortan y abren las mismas con ayuda de un elemento cortante seco,
limpio y adecuado y se retira el contenido lavando con un disolvente adecuado.
Se espera que el disolvente ocluido se evapore de las cubiertas a temperatura
ambiente por 30 minutos aproximadamente. Se pesan las cubiertas y se
calcula el contenido neto. Luego, el contenido de principio activo en cada
cpsula a partir del peso neto del contenido de la cpsula individual y del
resultado de la valoracin, y por ltimo, el valor de aceptacin.
Formas farmacuticas slidas diferentes de tabletas y cpsulas: se procede del
mismo modo que para cpsulas duras.
Formas farmacuticas lquidas: se pesan con exactitud la cantidad de lquido
que se retira de cada uno de 10 envases individuales en condiciones normales
de uso. Se calcula el contenido de principio activo en cada envase a partir de la
masa de producto retirada de los envases individuales y del resultado de la
valoracin, y luego, el valor de aceptacin.
269
M = X y VA = k s
M = 98,5% y VA = 98,5 - X + k s
M = 101,5% y VA = X 101,5 + k s
M = 98,5% y VA = 98,5 - X + k s
M = X y VA = k s
M = T y VA = X T + k s
Criterios de aceptacin
Se cumple el ensayo de uniformidad de unidades de dosificacin si:
270
(segunda
Preguntas Orientadoras
1. Indique el objetivo del ensayo de Uniformidad de Unidades de
Dosificacin
2. describa los mtodos mediante los cuales se puede verificar la
Uniformidad de Unidades de Dosificacin
3. Indique los criterios en los que se basa la aplicacin de los mtodos
descriptos en la pregunta anterior
4. En qu se basan los criterios de aceptacin del Ensayo de
Uniformidad de Unidades de Dosificacin de Farmacopea Argentina
VII Ed
5. Cmo se calcula el valor de aceptacin segn USP 35 y cules son
los criterios de aceptacin?
Test de Autoevaluacin
1. El ensayo de uniformidad de unidades de dosificacin es una prueba
de calidad para:
a) materia prima
b) producto terminado
c) materia prima y producto terminado
2. El ensayo de Uniformidad de Unidades de Dosificacin permite:
a) verificar que cada unidad de dosificacin de un lote en estudio,
contenga una cantidad de principio activo dentro de un
intervalo estrecho alrededor de la cantidad declarada
b) inferir la homogeneidad de cada unidad de dosificacin de un
lote
c) verificar que cada unidad de dosificacin de un lote en estudio,
contenga una cantidad de principio activo dentro de un
intervalo estrecho alrededor de la cantidad declarada y as
inferir la homogeneidad del mismo
271
272
b) Criterio B
c) Criterio C
8. Segn FA VII Ed Si el promedio de los lmites especificados en la
definicin de potencia de cada producto en la monografa
correspondiente es mayor de 100,0 %, se aplica:
a) Criterio A
b) Criterio B
c) Criterio C
Bibliografa
1. Ministerio de Salud ANMAT. Farmacopea Argentina. VII ed. (2003) Buenos
Aires.
2. Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica (USP 35) (2011) Rockville.
273
CAPITULO 12
ESTABILIDAD DE DROGAS Y MEDICAMENTOS
Mara Guillermina Volont
Introduccin
Qu se entiende por estabilidad en trminos generales? Es la cualidad de
mantenerse sin peligro de cambiar, caer o desaparecer.
Por ello, cuando hablamos de medicamentos podremos decir que estabilidad
es el grado en el que un medicamento retiene, dentro de lmites especificados y
durante todo su perodo de almacenamiento y utilizacin, las mismas
propiedades y caractersticas que posea en el momento de la preparacin
Y cul ser, entonces, el objetivo de un estudio de estabilidad?
El propsito general de los estudios de estabilidad es proveer evidencia de
cmo la calidad de una materia prima o un medicamento vara con el tiempo
bajo la influencia de factores de naturaleza ambiental tales como temperatura,
humedad, luz, gases atmosfricos y factores relacionados con el medicamento
en s, como ser los componentes de la formulacin y su envase.
Los Estudios de Estabilidad son necesarios para asegurar que una materia
prima o una formulacin mantenga su integridad, identidad, potencia, calidad y
pureza, frente a dichos factores, durante el perodo de vida til asignado.
Bsicamente los objetivos de los estudios de estabilidad son dos:
274
Qumica
Fsica
Microbiolgica
Teraputica
Toxicolgica
Definicin
Condiciones de almacenamiento
Clima templado
21 C 45 % humedad relativa
II
25 C 60 % humedad relativa
III
30 C 35 % humedad relativa
IV
30 C 45 % humedad relativa
Temperatura
ambiente
controlada:
es
la
temperatura
mantenida
276
277
Almacenaje
Temperatura
Humedad relativa
Tiempo
40C 2 C
75% 5%
6 meses
Heladera
25C 2 C
60% 5%
6 meses
Freezer
5C 3 C
6 meses
Temperatura
ambiente
controlada
deben
ser
suficientes para
cubrir
la
distribucin,
278
Almacenaje
Temperatura
Humedad relativa
Tiempo
25C
25C 2C
60% 5%
12 meses
Heladera
5C 3C
12 meses
Freezer
-20C 5C
12 meses
Protocolo de estabilidad
Deben considerarse:
Tipo, tamao, nmero de lotes, orientacin del envase y cierre: los estudios
de estabilidad a largo plazo deben llevarse a cabo por lo menos en tres
lotes de igual formulacin, proceso de elaboracin y envase. Dichos lotes
deben estar elaborados en planta piloto que simule la planta de produccin.
279
280
La degradacin
es apreciable
No se aplica el estudio
estadstico.
La comparacin de
rectas de regresin
lineal muestra igualdad
en las pendientes y la
ordenada al origen de
las rectas de cada
lote? Se verifica
igualdad de varianza
en los lotes para cada
punto de muestreo?
SI
Pueden
combinarse
las rectas
de regresin
de los tres
lotes
NO
No pueden
combinarse
las rectas
de regresin
de los tres
lotes
281
282
Respecto a los primeros, los factores ambientales que pueden afectar a las
drogas y a los medicamentos son:
-
Luz: este factor es una amenaza para los compuestos fotolbiles. Para
evitar esto se utilizan, en los envases primario y secundario, materiales
opacos o que bloqueen radiaciones de ciertas longitudes de onda
particularmente nocivas (por ejemplo, frascos de color carameloinactnicos).
Gases atmosfricos: Si bien el oxgeno es el que ms inconvenientes
puede causar, dado que favorece la oxidacin de muchas sustancias, el
dixido de carbono tambin debe ser tomado en cuenta, ya que puede
alterar el pH de las soluciones (con la subsecuente precipitacin
potencial de algn compuesto de caractersticas cidobase) y dar lugar
a la formacin de carbonatos insolubles. El uso de envases fabricados a
partir de materiales impermeables y de cierres hermticos es una buena
estrategia para evitar las consecuencias de la exposicin a la atmsfera,
al mismo tiempo que se minimiza la prdida de sustancias voltiles
presentes en la formulacin. En el caso de formas farmacuticas
multidosis slidas (por ejemplo comprimidos) conviene recurrir a envases
con compartimentos separados para cada una de las dosis. En el caso
de formas farmacuticas lquidas (por ejemplo un jarabe) interesa que el
cierre mantenga su caracterstica hermtica con el uso sucesivo, es decir
que siga siendo efectivo al cerrarlo luego de la primera vez de uso.
Recordemos que una estrategia adicional de naturaleza farmacotcnica
es, en el caso de sustancias de alto potencial de oxidacin, la inclusin
en la formulacin de sustancias antioxidantes.
283
cpsula
endurecimiento
de
un
comprimido),
como
qumico
Hay factores que dependen del envase, para comprenderlos se deben tener en
cuenta los distintos tipos de envase, funciones, etc.
Envases Clasificacin
Envases
284
toxicolgicos,
con
el
objeto
de
conseguir
una
de
atencin
farmacutica
figura
que,
al
dispensar
un
lote
de
fabricacin,
fecha
de
vencimiento,
va
de
285
Va de administracin.
Fecha de vencimiento.
Precauciones
que
deben
tenerse
en
cuenta
para
su
adecuada
conservacin.
por
ejempl,:
formacin
286
de
complejos,
de
pares
inicos,
E
N
V
A
S
E
S
P
R
I
M
A
R
I
O
S
C
L
A
S
I
F
I
C
A
D
O
S
S
E
G
U
N
T
I
P
O
D
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Q
U
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D
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S
F
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R
M
A
S
S
E
M
I
S
O
L
I
D
A
S
F
O
R
M
A
S
S
O
L
I
D
A
S
287
de
almacenamiento
establecidas
por
la
monografa
dentro
del
envase
es
evidencia
de
condiciones
Las
cpsulas
no
288
debern
mostrar
evidencia
de
289
Se debe recordar que los medicamentos una vez vencidos no se deben utilizar
bajo ningn concepto y que se transforman en un tipo de residuos que pueden
ser considerados peligrosos, pudiendo contener sustancias txicas o de
especial cuidado.
Los medicamentos vencidos pueden provocar los siguientes efectos:
Contaminacin del agua potable
Perjuicio de la vida acutica
Muerte de microorganismos claves para el ecosistema
Resistencia a microorganismos patgenos
Liberacin de contaminantes cuando son quemados en forma
inapropiada
Bioacumulacin en tejidos de seres vivos
Pasar a la cadena de distribucin informal e ingresar nuevamente al
mercado
Es muy importante recordar que la OMS establece que el concepto de
Intercambiabilidad de medicamentos se debe aplicar no slo a la forma
farmacutica sino tambin a las instrucciones de uso y a las especificaciones
de los envases, cuando stas son criticas para la estabilidad y vencimiento. Por
ello es imprescindible que la informacin que aparece en los envases
secundarios y en los prospectos de los medicamentos sea coherente y
completa, respecto a condiciones de conservacin: temperatura, luz, humedad.
Sera deseable lograr una unificacin de criterios en este sentido lo cual no
creara incertidumbre, ni en los farmacuticos oficinales u hospitalarios, ni en
los pacientes, respecto de cmo almacenar los productos.
290
Cadena de Fro
Se define la cadena de fro como la serie de elementos y actividades
necesarios para garantizar que, a lo largo de los procesos de distribucin,
almacenamiento y manipulacin, las drogas, medicamentos y vacunas sean
conservados dentro de los rangos de temperatura establecidos para que
mantengan su potencia o, en el caso de las vacunas, su poder inmunolgico.
291
292
293
294
295
Menor sensibilidad
Preguntas Orientadoras
1. Objetivos de un estudio de estabilidad. Cmo se determina la fecha
de vencimiento de una especialidad y cmo se estima el perodo til
de una preparacin magistral?
296
Test de Autoevaluacin
1. Cul de estos factores afecta la estabilidad de una forma farmacutica
lquida?
(a) Humedad
(b) pH
(c) Solubilidad
(d) Indice de refraccin
297
Bibliografa
1.
Buenos Aires.
2.
Rockville.
4.
Evaluation and Research, Center for Biologics Evaluation and Research, ICH.
Guidance for industry Q1A: Stability Testing of New Drug Substances and
Products, Revision I. (2001)
5.
298
7.
299
CAPITULO 13
ENSAYOS BIOLGICOS
Pablo Quiroga
Introduccin
En general, los sistemas de control de calidad para productos biofarmacuticos
son muy similares a los utilizados rutinariamente en productos farmacuticos
de bajo peso molecular, la diferencia fundamental entre estos sistemas de
control de calidad para productos obtenidos por biotecnologa y productos
farmacuticos tradicionales reside en el tipo de mtodos que se emplean para
determinar la identidad del producto, su uniformidad, su pureza y el perfil de
impurezas. La complejidad de los sistemas de control de calidad para los
productos biofarmacuticos est relacionada con el tamao y con
las
Biofarmacuticos/Bioteraputicos
Agentes teraputicos producidos a partir de organismos vivos o sus productos
(incluyendo
tecnologa
ADN
recombinante,
procesos
de
manufactura
300
preparaciones
cuya
potencia
no
puede
garantizarse
301
la
utilizacin
de
preparaciones bien
302
Estmulo (Dosis/
Concentracin)
Respuesta
(medicin)
Una vez
la dosis/concentracin vs la
Ensayos
Directos
Ensayos Indirectos:
Ensayo Directo: es aquel en el cual se mide la dosis de la preparacin
Estndar y Desconocido que producen una respuesta biolgica especfica y
bien definida, la respuesta es fija, y la dosis variable llamada dosis umbral. El
cociente entre la dosis umbral media para la preparacin Estndar y la dosis
umbral media para la preparacin Test proporciona directamente la potencia.
La dosis umbral se determina dos veces en cada animal, una con el Estndar y
304
305
306
Preparacin
Estndar (E)
Desconocido (D)
Dosis (MU)
(n)*
(r)
P= r/n
40 (E1)
24
21
0.88
24 (E2)
24
0.33
40 (T1)#
24
20
0.83
24 (T2)#
24
10
0.42
Tabla 1. * N de ratones por grupo, N de ratones por grupo que presentaron respuesta,
# Las dosis de la preparacin Desconocida fueron preparadas basndose en la potencia
declarada.
307
Lnea de Regresin
308
309
Z: representa la dosis/concentracin
: potencia relativa de la muestra Desconocida relativa al Estndar
Los modelos estadsticos para la estimacin de en los ensayos cuantitativos
pueden ser:
Relacin de pendientes (I)
Modelos estadsticos
Lneas Paralelas (II)
y del
310
311
Y= a + b DE
Como hemos comprobado que el ensayo es vlido podemos asegurar que las
rectas tienen una ordenada al origen (a) igual, pero difieren en el valor de la
pendiente (b y b1), si consideramos DE y DD frente a la misma respuesta Y,
igualando ambas ecuaciones tenemos:
a +b DE = a +b1 DD
DE / DD = b1 / b
PR = DE / DD
PR = b1 / b=
La Potencia relativa () de la preparacin Desconocida est dada por la
relacin de pendientes de ambas rectas, debido a esto este tipo de modelo se
denomina Modelo de Relacin de Pendientes.
II. Modelo de lneas paralelas, para aplicar este modelo deben cumplirse las
siguientes condiciones:
A. La relacin entre el logaritmo de la dosis y la respuesta se representa por
una lnea recta en el intervalo de Dosis/Concentracin utilizadas
B. Para cualquier preparacin Test en el ensayo, la lnea recta es paralela al
Estndar, lo cual demuestra la similitud estadstica.
312
Para que el ensayo sea estadsticamente vlido deben cumplirse las siguientes
condiciones:
1. Hiptesis de regresin: La pendiente de la curva log Dosis/Concentracin vs.
Respuesta difiere significativamente de cero.
2. Hiptesis de paralelismo: Para cualquier preparacin Desconocida en el
ensayo, la lnea recta es paralela al Estndar.
3. Hiptesis de linealidad: La relacin entre el logaritmo de la dosis/
concentracin y la respuesta debe representarse por una lnea recta en todo el
intervalo de dosis utilizadas. Una vez establecida la validez estadstica, se
procede a estimar la potencia relativa y el intervalo de confianza del 95 % de
probabilidad.
Hemos demostrado que el trmino de linealidad es
significativo entonces
a1 = a + b log PR
Reemplazando en (1) obtengo:
a + b log DE = a + b log PR + b log DD
b log. DE = b (log PR + log DD)
log. DE= log PR + log DD
log PR = log DE - log DD
log PR = log (DE / DD) = log
Podemos observar que cuando las lneas Dosis/Concentracin vs. Respuesta
son paralelas, la separacin horizontal corresponde para una misma respuesta
313
Modelo de lneas
Paralelas
Regresin
Linealidad
Interseccin
Paralelismo
314
315
la dosis dentro del rango de dosis utilizadas, es decir que siempre crece o
siempre decrece. Muchos errores pueden cometerse cuando los ensayos son
realizados con pocas dosis y sobre reactivos biolgicos no bien conocidos
como ser la cepa o colonia de rata que se emplea etc. Entonces con dosis muy
grandes pueden obtenerse respuestas que pueden ser menores que las
correspondientes respuestas a dosis ms bajas, por lo tanto debe conocerse el
sistema biolgico de manera de asegurar que las respuestas que se est
evaluando invaliden el ensayo en lo fundamental, este hecho puede no ser
detectado con los test estadsticos.
C.
316
Preguntas Orientadoras
1. Indique cuando es necesario recurrir a un ensayo biolgico.
2. Describa como se clasifican las respuestas en un ensayo indirecto.
3. Describa como demuestra la similitud en un modelo estadstico de
lneas paralelas
4. Qu parmetros evaluara durante la validacin de un bioensayo?
5. Qu condiciones se deben cumplir para calcular la potencia relativa
en un modelo estadstico de relacin de pendientes.
Test de Autoevaluacin
1. Los ensayos biolgicos pueden ser solo realizados en:
(a) Animales
(b) Clulas
(c) Clulas y animales
(d) Animales, clulas y tejidos
317
de
varios
ensayos
independientes,
con
resultados no homogneos
318
Bibliografa
1.
Buenos Aires
3.
(2000)
Analysis of
Chapter <1033>
7.
Chapter <1034>
8.
Michael. J.
319
320
CAPITULO 14
TRAZABILIDAD DE MEDICAMENTOS
Pablo Quiroga
Introduccin
La Organizacin Mundial de la Salud (OMS) conjuntamente con los diferentes
pases del mundo y a travs de sus Agencias Regulatorias, desde hace ms de
20 aos, lucha denodadamente para evitar el ingreso de medicamentos
falsificados a la cadena legtima de distribucin y que los mismos lleguen a los
pacientes, ocasionando diferentes problemas a la salud de los mismos y a los
sistemas de salud.
Los productos mdicos falsificados (medicamentos, vacunas, derivados
sanguneos, otros productos biolgicos, productos diagnsticos, dispositivos
mdicos, su combinacin y sus componentes) constituyen el mayor riesgo a la
salud pblica para todas las comunidades en el mundo.
Medicamento Falsificado
En 1992 se realiza el primer Workshop sobre Counterfeits Drugs- Medicinas
Falsificadas organizado por la OMS y la
International Federation of
321
322
323
Trazabilidad de Medicamentos
La Trazabilidad de Medicamentos puede ser dividida en: la trazabilidad de las
materias primas e insumos en los procesos de fabricacin, y la trazabilidad en
los procesos de distribucin o trazabilidad logstica, de esta ltima y de las
diferentes tecnologas antifalsificacin y autenticacin, nos encargaremos en el
desarrollo de este captulo.
La trazabilidad de productos farmacuticos es un elemento clave en una
solucin efectiva al problema de los medicamentos falsificados.
La palabra trazabilidad no existe en el idioma castellano, el trmino apropiado
sera rastreo y seguimiento (track and trace): rastreo es la habilidad de conocer
la ubicacin de un producto en cualquier momento y
seguimiento es la
logsticos
Capacidad de identificar el origen de una unidad en particular y/o la partida del
producto, y su localizacin dentro de la cadena (incluido el hospital) por
referencia a registros
productos son rastreados por propsitos tales como: retiro del mercado,
investigacin de quejas, y mantenimiento y mejoramiento del producto.
(Fuente: GS1 Gua de Trazabilidad, 2001).
324
Distribuidora
Produccin /
Embalaje
Serializar
Registro SMI y
ficha tcnica
Distribuidor
Farmacia
Rastrear el
Producto
Rastrear el
Producto
Rastrear el
Producto
Autenticar
Autenticar
Autenticar
IMPACT, est constituido entre otros por el grupo IMPACT Working Group on
Technology, el mismo tiene como finalidad la evaluacin o estudio de las
tecnologas disponibles de antifalsificacin, rastreo y seguimiento (proceso de
registro de todas las transacciones llevadas a cabo para un determinado envo
durante toda la cadena de distribucin). La identificacin del ciclo de vida de un
medicamento, desde el punto de fabricacin hasta la cama del paciente, con
todos los pasos y actores involucrados definidos, aumenta la seguridad del
proceso de administracin del medicamento, aumentando significativamente la
seguridad del paciente y reduciendo el riesgo de la cadena de distribucin.
La trazabilidad es parte de las Buenas Prcticas de Manufactura(IV)
(GMP)
(V)
325
326
Tecnologas Antifalsificacin
El objetivo o funcin primario de las tecnologas de antifalsificacin, es la
autenticacin del producto mdico, por las agencias regulatorias, la industria
farmacutica e idealmente por el pblico en general.
Las tecnologas antifalsificacin se pueden clasificar en las categoras
siguientes:
1. Visibles (Overt)
2. Ocultas (Covert)
3. Marcadores o Tcnicas Judiciales ( Forensic Techniques)
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Desventajas
Requieren
educacin
del
usuario/
paciente y no siempre es ampliamente
interpretada
Tecnologas nuevas ms seguras
Pueden ser fcilmente imitadas
Pueden agregar un atractivo decorativo
Pueden adicionar un costo significativo
Pueden actuar como disuasorios para los Pueden depender o basarse en
falsificadores
caractersticas
ocultas
para
su
autenticacin
Pueden ser reutilizadas
Pueden dar una Falsa seguridad
Tabla 1. Ventajas y desventajas de las tecnologas visibles de autenticacin
328
Ventajas
Desventajas
Desoxiribonucleco),
relaciones
isotpicas,
micromarcadores
microetiquetas.
4. Serializacin
La serializacin implica asignar una identidad nica a cada unidad de stock
durante la fabricacin, el cual se mantiene a lo largo de la cadena de
comercializacin hasta su consumo, esta identidad normalmente incluir
detalles del nombre del producto, concentracin/dosis, N de lote y fecha de
Vencimiento. El objetivo de la serializacin permite:
Rastrear un determinado medicamento, a travs de la cadena de
comercializacin, en cada punto donde es factible capturar datos.
Proveer trazabilidad a lo largo de la historia de cualquier medicamento,
(denominado Pedigree Electrnico) la cual est sujeta a los puntos de
control.
Permitir la autenticacin de los datos en cualquier momento y por lo
tanto del pack o unidad sobre el cual se aplic.
329
330
La
331
de la
Trazabilidad en Argentina
En el ao 2011, el Ministerio de Salud de La Nacin, establece por Resolucin
4357/2011 la implementacin del Sistema Nacional de Trazabilidad, y el 23 de
mayo del 2011, La Administracin Nacional de Medicamentos, Alimentos y
Tecnologa Mdica ( ANMAT) emite la Disposicin 3683/2011, en la cual se
describen los lineamientos para la implementacin del mismo, por otra parte se
da a conocer la Gua Tcnica Estndar de Codificacin y Trazabilidad de
Medicamentos, en la cual se describe la Identificacin Univoca de
Medicamentos, la cual es mandataria y corresponde a aquella que posibilitar
la identificacin de cada producto y deber ser asociada fsicamente a cada
unidad de producto, dicha identificacin
332
responde
a las
claves de
cdigos matriciales
de
los
medicamentos
adoptado,
corresponde
al
smbolo
333
334
Trazabilidad en Europa
El 4 de julio del 2011, se pblica en el Diario Oficial de la Unin Europea (UE),
la Directiva 2011/62/UE, sobre Medicinas Falsificadas, La nueva Directiva
modifica la 2001/83/CE, en lo relativo a la prevencin de la entrada en la
cadena de suministro legal de medicamentos que son falsificados en cuanto a
su identidad, su historial o su origen e introduce dispositivos de seguridad para
garantizar
la
identificacin,
la
autenticidad
la
trazabilidad
de
los
335
336
Combating
Counterfeit
Drugs
(FDA), emite el
(Combatiendo
las
Drogas
Trazabilidad en Brasil
El 14 de enero de 2009, Brasil, aprueba la Ley N 11903, la cual crea el
Sistema Nacional de Control de Medicamentos, La Ley establece el rastreo de
todo tipo de medicamentos existentes en el pas, desde el fabricante hasta su
venta al consumidor final. El control debe llevarse a cabo con tecnologas para
la captura electrnica, almacenamiento y transmisin de datos. Cada producto
mostrar un exclusivo cdigo de identificacin.
338
Conclusiones
La lucha contra los medicamentos falsificados es una estrategia de largo plazo,
respaldada por inversin y compromiso significativo de recursos cuyo objetivo
es: Minimizar el riesgo de que los medicamentos falsificados lleguen a los
pacientes. El seguimiento y rastreo de productos farmacuticos es un elemento
clave en una solucin efectiva al problema de medicamentos falsificados, una
accin Paneuropea sera necesaria para crear un sistema eficiente y viable.
La adopcin y el uso comn de tecnologas de rastreo y localizacin confiables
ayudaran a garantizar la integridad de la cadena de suministro de frmacos al
proporcionar el historial exacto de un frmaco, lo cual constituye un expediente
seguro que documenta que el frmaco fue fabricado y distribuido bajo
condiciones seguras (FDA 2004).
frmacos han sido perfeccionadas lo suficiente como para poder servir ahora
como un componente crtico de cualquier estrategia para proteger a los
productos contra la falsificacin. (FDA 2004).
339
Preguntas Orientadoras
1. Defina Trazabilidad Logstica y sus objetivos.
2. Describa las diferencias fundamentales entre Cdigo de barras 2D y
RFID.
3. Describa de manera resumida el Sistema de Trazabilidad de nuestro
pas.
4. Describa el Sistema de alerta temprana de la OMS y sus objetivos.
Test de Autoevaluacin
1. La tecnologa para serializacin son
(a) Cdigos de barras unidimensionales.
(b) Cdigos de barras 2D
(c) Identificacin por Radiofrecuencia (RFID)
(d) Ninguna de las anteriores es correcta
(e) Todas son correctas
340
(c)
Bibliografa
1.
Mdicos., EB 114/14.
2.
Mdicos, A62/13.
3.
341
7.
Sociedad
Farmacutica
Real
de
Gran
Bretaa.
MHRA.
Distribucin Farmacutica.
10.
11.
13.
Boletn
Drugs.
16.
de Control de Medicamentos.
19.
Stephen Barlas. (2011). Track- and -Trace Verification. P and T.36 (4).
20.
342
Notas
I
343
ANEXO I
Respuestas a los Test de Autoevaluacin
344
7. (c)
8. (a)
9. (b)
345
346
2. (b)
3. (a)
4. (a)
5. (b)
347
LOS AUTORES
de
Revistas
kv@biol.unlp.edu.ar
HU
Cientficas
nacionales
extranjeras.
E-mail:
Pablo Quiroga
Farmacutico y Licenciado en Ciencias Farmacuticas (Facultad de Ciencias
Exactas Universidad Nacional de La Plata). Experto Universitario en
Toxicologa y Master Universitario en Toxicologa (Rectorado Universidad de
Sevilla - Espaa). Profesor Adjunto en las asignaturas Control de Calidad de
Bag
S.A.
quirogapablo@yahoo.com.ar
HU
Reviewer
U
de
Revistas
Cientficas.
E-mail: