PRACTICA No.

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HIDRLISIS DEL ALMIDN POR AMILASA VEGETAL
OBJETIVO: Determinar la presencia de enzimas hidrolgicas durante la germinacin por el
mtodo colorimtrico tomado como factor el tiempo de actividad enzimtica.
MATERIAL:
-tubos de ensayo de (16 x 150)
-gradillas
-pipetas graduadas de 1ml (plstico)
-pipeta de 5 o 10 ml
-vaso de precipitado de 250 ml
-mechero
-soporte universal con anillo
-embudo de plstico
-mortero de porcelana con pistilo
-vaso de precipitado
-pipeta de 1 ml
-balanza granataria
-espectrofotmetros
-Celdas
-Semillas de maz, frijol o lenteja de 7-8 das de germinacin
-plumn indeleble.
-jabn y franela para limpiar
-hielo
-sobres de gasa
-Masking tape
-ligas
REACTIVOS:
-solucin de glucosa al 0.1 %
-agua destilada
-acido 3,5- Dinitrosalicilico (DNS) en frasco mbar
-solucin de yodo (I2KL en una solucin de HCL 0.05 N) en frasco mbar.
-Solucin de CaCl2 20 mM NaCl 200 mM
-solucin de almidn al 0.2%
-solucin Buffer pH 5
En esta parte de la prctica habr 5 equipos en los cuales dos trabajaron con amilasa
extrada, dos con amilasa pura y el ltimo equipo har la curva de calibracin de glucosa.

METODO:
1. Se le quito la parte ms blanca de la semilla que sera la raz y parte del tallo, de todo
tipo de semillas y lavarlas para quitar las impurezas, se pusieron todo dentro de un
recipiente y se peso en la balanza granataria...
2.-Se moli todo dentro del mortero usando como solvente 3 mililitros de agua destilada
por cada gramo de tejido.
3.-Se filtro la molienda con ayuda del embudo y de dos capas de gasa.
4.-Se paso lo filtrado en un tubo de ensaye. Y se dejo sedimentar, mantenindolo a una
temperatura ms baja que la ambiente, con ayuda de hielo.
5.-Se diluyo lo obtenido en una solucin 1: 10 con solucin amortiguadora de acetato pH
5, pero se sigui manteniendo frio.
6.-Se preparo en dos tubos de ensaye (13 x 150 mm) de la siguiente manera:
Tubo
AyB

Almidn 0.2% en buffer pH

5
4ml

Solucin CaCl-NaCl
4ml

ENSAYO A
1.-Se prepararon diez tubos de ensaye (13 x 150 mm) agregando a cada uno 1 ml de la
solucin de yodo.
2.-A un tubo se le agrego 3 ml de agua destilada, a este se le llamara tubo blanco este
servir para calibrar al espectrmetro al 100% de trasmitancia o cero de absorvancia
(densidad ptica).
3.-El primer tubo (tiempo 0) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos; a cada tubo se
le agrego un mililitro de la enzima diluida (extrada) a cada tubo que tiene la solucin de
yodo, en otras palabras por cada 5 minutos despus del primero que era en tiempo 0, se fue
agregando a cada tubo 1 ml de la enzima, con mucho cuidado para no afectar el rango de
tiempo.
4.-Agitar
5.-Se le agrego a cada tubo 2 ml de agua destilada y se agito con cuidado de no romper el
tubo.
6.-Se coloco en una celda los 11 tubos de ensaye para leerlos en el espectrofotmetro a una
absorbencia de 620mm. En el cual el tubo blanco (paso 2) se utilizo primero para calibrar a
una absorvancia ptica de 0. Y a continuacin se leyeron cada uno y se anotaron los
resultados.
7.-Se grafico la absorvancia a 620mm contra tiempo de reaccin, y se correlaciono con el
cambio de color de la serie B.
RESULTADOS:
TUBO
0
APARICIN 0
DE
GLUCOSA

1
0.452

2
0.483

3
0.552

4
0.563

5
6
7
8
9
0.664 0.526 0.452 0.419 0.201

ENSAYO B
1.-Se prepararon 10 tubos de ensaye (13 x 150mm) agregando a cada uno 1ml de la
solucin de DNS (cido 3,5 - Dinitrosalicilico)
2.-Adicione 2 ml de agua destilada a un tubo que servir para calibrar 575 nm en el
espectrofotmetro a 100% de transmitancia o cero de absorvancia (densidad ptica)
3.-Al primer tubo (tiempo O) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos; se tomo 1 ml
del tubo que contiene la enzima diluida y se agrego a cada uno de los tubos que contienen
solucin de DNS.
4.-En un recipiente de precipitacin se puso agua del grifo, a calentar hasta hervir (que
salgan burbujitas) y con los tubos se unieron con ligas para evitar que se fueran de lado y se
cayeran. Se pusieron a calentar los tubos durante 10 minutos a bao mara.
5.-Se le agrego a cada tubo 8ml de agua destilada y se agito, incluyendo al tubo para
calibrar ya que se sedimenta.
6.-Se dejaron enfriar los tubos a temperatura ambiente ya que podra romperse el tubo si se
cambia bruscamente la temperatura.
7.-Se tomo lectura en el espectrofotmetro a una absorvancia de 575nm cada uno,
calibrando la densidad ptica con el tubo blanco.
8.-A continuacin se graficaron los datos, absorvancia contra tiempo de reaccin.
9.-Correlacione los datos obtenidos con el cambio de color con la solucin de yodo.

RESULTADOS:
TUBO
0
APARICIN 0
DE
AMILASA
EXTRADA

1
0.015

2
0.024

3
0.022

4
0.027

5
6
7
8
9
0.032 0.041 0.043 0.045 0.068

POR OTRA PARTE

Se est trabajando con la amilasa pura, esta se puso en un tubo de ensaye (13 x 150 mm),
el tubo de ensaye se coloco en un recipiente con hielo.
A continuacin se diluyo (a la tercera vez) en una solucin 1:100 con una solucin
amortiguadora de acetato pH 5, pero aun mantenindolo al frio.
Se preparo en dos tubos de ensaye (13 x 150 mm) de la siguiente manera:
Tubo
Almidn 0.2% en buffer pH Solucin CaCl-NaCl
5
CyD
4ml
4ml
ENSAYO C
1.-Se prepararon diez tubos de ensaye (13 x 150 mm) agregando a cada uno 1 ml de la
solucin de yodo.
2.-A un tubo se le agrego 3 ml de agua destilada, a este se le llamara tubo blanco este
servir para calibrar al espectrmetro al 100% de trasmitancia o cero de absorvancia
(densidad ptica).
3.-El primer tubo (tiempo 0) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos; a cada tubo se
le agrego un mililitro de la enzima pura a cada tubo que tiene la solucin de yodo.
4.-Agitar
5.-Se le agrego a cada tubo 2 ml de agua destilada y se agito con cuidado de no romper el
tubo.
6.-Se coloco en una celda los 11 tubos de ensaye para leerlos en el espectrofotmetro a una
absorbencia de 620mm. En el cual el tubo blanco (paso 2) se utilizo primero para calibrar a
una absorvancia ptica de 0. Y a continuacin se leyeron cada uno y se anotaron los
resultados.
7.-Se grafico la absorvancia a 620mm contra tiempo de reaccin, y se correlaciono con el
cambio de color de la serie D.
RESULTADO:
TUBO
0
APARICIN 0
DE
GLUCOSA

ENSAYO D

1
0.454

2
0.494

3
0.504

4
0.466

5
6
7
8
9
0.502 0.520 0.576 0.488 0.528

1.-Se prepararon 10 tubos de ensaye (13 x 150mm) agregando a cada uno 1ml de la
solucin de DNS (cido 3,5 - Dinitrosalicilico)
2.-Adicione 2 ml de agua destilada a un tubo que servir para calibrar 575 nm en el
espectrofotmetro a 100% de transmitancia o cero de absorvancia (densidad ptica)
3.-Al primer tubo (tiempo O) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos; se tomo 1 ml
del tubo que contiene la enzima pura y se agrego a cada uno de los tubos que contienen
solucin de DNS.
4.-En un recipiente de precipitacin se puso agua del grifo, a calentar hasta hervir (que
salgan burbujitas) y con los tubos se unieron con ligas para evitar que se fueran de lado y se
cayeran. Se pusieron a calentar los tubos durante 10 minutos a bao mara.
5.-Se le agrego a cada tubo 8ml de agua destilada y se agito, incluyendo al tubo para
calibrar ya que se sedimenta.
6.-Se dejaron enfriar los tubos a temperatura ambiente ya que podra romperse el tubo si se
cambia bruscamente la temperatura.
7.-Se tomo lectura en el espectrofotmetro a una absorvancia de 575nm cada uno,
calibrando la densidad ptica con el tubo blanco.
8.-A continuacin se graficaron los datos, absorvancia contra tiempo de reaccin.
9.-Correlacione los datos obtenidos con el cambio de color con la solucin de yodo.
RESULTADO:
TUBO
DESAPARICI
N DE
AMILASA

0 1
0 0.98
1

2
0.81
2

3
0.51
8

4
0.32
0

5
0.16
4

6
0.
1

7
0.07
3

8
0.2
9

9
0.01
6

10
0.00
3

Y por ultimo.
METODO PARA ELABORAR LA CURVA DE CALIBRACIN CON GLUCOSA QUE
SERVIRA COM PATRN PARA HACER EL ANLISIS DE REGRESIN LINEAL,
INCLUYENDO EL COEFICIENTE DE COORELACIN (r)
Solucin
Glucosa
0.1%
Agua
Destilada
Reactivo
DNS

1
0ml

2
0.1ml

3
0.2ml

4
0.4ml

5
0.6ml

6
0.8ml

7
1ml

1ml

0.9ml

0.8ml

0.6ml

0.4ml

0.2ml

0ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1.-Se prepararon 7 tubos de ensaye (13 x 150mm) agregando a cada uno, de menor a
mayor, en el tubo uno se adiciona 0ml de glucosa, en el tubo 2 se le agrega 0.1ml de
glucosa, el tubo tres 0.2ml de glucosa, al tubo cuatro 0.4ml de glucosa, al tubo cinco 0.6ml
de glucosa, el tubo seis 0.8ml de glucosa y al tubo siete 1ml de glucosa, la glucosa es al
0.1%.
2.-Se agrego agua destilada, de igual manera de menor a mayor, en el tubo uno se le agrego
1ml, en el tubo dos 0.9ml, al tubo tres 0.8ml, al tubo cuatro 0.6ml, al tubo cinco 0.4ml, al
tubo seis 0.2ml y en el tubo siete 0ml.
3.-Al primer tubo (tiempo O) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos; se le agrega
1ml de solucin de DNS.
4.-En un recipiente de precipitacin se puso agua del grifo, a calentar hasta hervir (que
salgan burbujitas) y con los tubos se unieron con ligas para evitar que se fueran de lado y se
cayeran. Se pusieron a calentar los tubos durante 10 minutos a bao mara.
5.-Se le agrego a cada tubo 8ml de agua destilada y se agito, incluyendo al tubo para
calibrar ya que se sedimenta.
6.-Se dejaron enfriar los tubos a temperatura ambiente ya que podra romperse el tubo si se
cambia bruscamente la temperatura.
7.-Se tomo lectura en el espectrofotmetro a una absorvancia de 575nm cada uno,
calibrando la densidad ptica con el tubo blanco.
8.-A continuacin se graficaron los datos, absorvancia contra tiempo de reaccin.
9.-Correlacione los datos obtenidos con el cambio de color con las graficas de desaparicin
de glucosa.
RESULTADO:
TUBO
0
CURVA 0
PATRO
N
DE
GLUCO
SA

1
0.018

2
0.088

3
0.160

4
0.243

5
0.324

6
0.380

ANEXOS:

CUESTIONARIO:
1.- A qu grupo pertenece la enzima amilasa vegetal?
De tipo exohidrolasa especifica
2.- Qu diferencia bioqumica existe entre glucosa y almidn, y cul relacin hay entre
ellas?
la glucosa es una hexosa, es decir, que contiene 6 tomos de carbono, y es una aldosa, esto
es, el grupo carbonilo est en el extremo de la molcula.
El almidn es un polmero hecho de glucosa que se utiliza como sustancia
de
reserva
en las plantas, tiene dos tipos de polmeros de glucosa los que
constituyen el almidn ya que se trata de una mezcla de dos compuestos:
la amilosa (30 %) es una molcula lineal de glucosa con elaces glucosidicos (1-4) sin
ramificar.
la amilopectina (70 %) tambin adopta una posicin helicoidal similar a la amilosa pero
posee ramificaciones laterales originadas mediante enlaces a (1-6) cada 12 molculas de
glucosa.
3.- Por qu aparece la enzima en el germinado de maz?
La actividad enzimtica, es necesaria para la sntesis de glucosa para que pueda obtener
energa la misma semilla apartir de sus reservas energticas, usando estas reservas mientras
desarrolla sus rganos (hoja, raz y tallo).
4.- Cules son las condiciones que alteran las funciones de las enzimas?
Concentracin del sustrato.- A mayor concentracin del sustrato, a una concentracin fija
de la enzima se obtiene la velocidad mxima. Despus de que se alcanza esta velocidad, un
aumento en la concentracin del sustrato no tiene efecto en la velocidad de la reaccin.
Concentracin de la enzima.- Siempre y cuando haya sustrato disponible, un aumento en
la concentracin de la enzima aumenta la velocidad enzimtica hacia cierto lmite.
Temperatura.- Un incremento de 10C duplica la velocidad de reaccin, hasta ciertos
lmites. El calor es un factor que desnaturaliza las protenas por lo tanto si la temperatura se
eleva demasiada, la enzima pierde su actividad.
pH.- El pH ptimo de la actividad enzimtica optima es de 7 una variacin de este pH varia
la velocidad de reaccin o la desnaturalizacin de la enzima.
Presencia de cofactores.- Muchas enzimas dependen de los cofactores, sean activadores o
coenzimas para funcionar adecuadamente. Para las enzimas que tienen cofactores, la
concentracin del cofactor debe ser igual o mayor que la concentracin de la enzima para
obtener una actividad cataltica mxima.
5.- Cmo se distingue bioqumicamente la degradacin del almidn por amilasa y por
Fosforilasa?
Por amilasa lo que hace con el almidon es romperlo en azucares mas simples, mientras que
la fosforilasa va quitando de uno en uno la glucosa de las cadenas.