V Congreso Internacional

Alimentacin, nutricin y diettica

Conferencias Seccin A: Nutricin y Diettica

AMINAS HETEROCCLICAS
EN ALIMENTOS COCINADOS.

M Teresa Galceran
Departament de Qumica Analtica. Facultat de
Qumica. Universitat de Barcelona

Introduccin
Diversos estudios epidemiolgicos han puesto de manifiesto que existe una estrecha relacin entre el tipo
de vida y la incidencia del cncer en los seres humanos [1,2].As, ms de un 30% de los cnceres,
especialmente de pulmn se han asociado con el consumo de tabaco [3]. Sin embargo, es la dieta el
factor que contribuye en una mayor proporcin al desarrollo de tumores y de hecho, entre un 35% y un
45% de los cnceres se asocian a este factor. Hora bien, el efecto de la dieta vara en funcin del tipo de
alimento, del modo de coccin, de su valor nutricional y de su composicin. Por lo que hace referencia a
los mutgenos presentes en los alimentos hay que indicar que pueden provenir de distintas fuentes; as,
pueden ser de origen natural como por ejemplo, las micotoxinas, las hidracinas y algunos alcaloides y
flavonoides o bien pueden encontrarse en los alimentos como resultado de una contaminacin de los
mismos como es el caso de los pesticidas, herbicidas o disolventes. Existe adems, una tercera
categora de compuestos genotxicos entre los que se pueden citar las nitrosaminas, las nitrosoamidas,
los hidrocarburos aromticos policclicos y las aminas heterocclicas y que son productos que se generan
durante el procesado y coccin de los alimentos. Los compuestos pertenecientes a esta tercera categora
presentan una caracterstica especial que los diferencia de otros contaminantes alimentarios y que hay
que tener en cuenta en la evaluacin de la seguridad de los alimentos. Esta caracterstica se refiere a
que para minimizar el riesgo de ingesta de los mismos puede ser necesario modificar algunos de los
hbitos culinarios de la poblacin o bien los procedimientos de preparacin industrial de algunos
alimentos.
Las aminas heterocclicas: formacin e importancia
Los primeros compuestos cancergenos que se detectaron en alimentos procesados trmicamente fueron
los hidrocarburos aromticos policclicos. Sin embargo, a finales de los aos 70 Sugimura y
colaboradores [4] descubrieron que en determinadas condiciones, el humo procedente de la coccin de
alimentos ricos en protenas contena cantidades apreciables de sustancias mutgenas. Estudios
posteriores pusieron de manifiesto que las partes ms tostadas de carnes y pescados asados
presentaban un actividad mutgena notable debida a la presencia de unas substancias bsicas.
Actualmente se han identificado 23 de estas substancias, todos ellas pertenecientes al grupo genrico de
las aminas heterocclicas (HAs). Dependiendo del mecanismo de generacin y de los precursores, las
HAs se pueden clasificar en dos grandes grupos, las carbolinas y los aminoimidazoazarenos. En la
Figura 1 se muestran las estructuras de algunas de las aminas ms importantes. Las carbolinas tambin
conocidas como aminas pirolticas, se forman a temperaturas superiores a los 300C por pirlisis de
aminocidos o protenas va reacciones radicalarias. Estas aminas contienen en su estructura grupos
piridoindol (Trp-P-1, Trp-P-2, A C, MeA C, harman, norharman) o piridoimidazol (Glu-P-1, Glu-P-2). El
segundo gran grupo, los aminoimidazoazarenos (AIA), recibe el nombre genrico de aminas trmicas ya
que se forman al cocinar alimentos ricos en protenas, como la carne o el pescado, a temperaturas
inferiores a los 300C. Todas ellas contienen en su estructura el grupo 2-aminoimidazo y una quinolina
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(IQ, MeIQ), una quinoxalina (MeIQx, DiMeIQx) o un anillo de piridina (PhIP, DMIP). En general, los
imidoazoazarenos son compuestos algo ms polares que las carbolinas, caracterstica que se utiliza para
la agrupacin de las aminas heterocclicas en dos familias. Desde el punto de vista de su actividad
mutagnica, y por tanto de su potencial cancergeno, se ha establecido, utilizando el test de Ames, que
algunas de las aminas presentan un ndice de mutagenicidad ms de 1000 veces superior al del
benzo(a)pireno lo que pone de manifiesto su elevada toxicidad potencial. De hecho, existen datos que
demuestran que estos compuestos son cancergenos en ratones, ratas y primates en los que se han
detectado tumores en diversos rganos como por ejemplo el hgado, los intestinos, el estmago, el
pulmn, la piel y las glndulas mamarias [5].

Aminoimidazoazaarenos (AIAs)

NH2

NH2

N
IQ

N
MeIQ

N CH3 C H 3

N CH3

N
N

N
MeIQx

CH 3

4,8-DiMeIQx
NH2

C H3

N C H3 C H
3

N
N
7,8-DiMeIQx

C H3

N
PhIP

NH2

N
N
H
MeA
C

C H3

N
H

Harman

N H2

N
TriMeIQx

N
DMIP

N
H
Norharman

CH3

CH 3

N CH 3

N
NH2
H
CH 3
Trp-P-1

CH3

CH 3
N
NH2

CH3
N

NH 2

N
C H3

N
H
A
C

CH3

NH 2

NH2
N

C H3

N CH3

N CH3

CH3

Carbolinas

NH2

NH 2

N
C H3 Glu-P-1

N
H
Trp-P-2

N H2

NH 2

N
Glu-P-2

Figura 1.- Estructuras de las aminas heterocclicas ms importantes

La formacin de las aminas heterocclicas durante el procesado industrial y/o culinario de los alimentos
crnicos puede estar influida por algunos factores composicionales como la creatina presente en el tejido
muscular, la grasa o el agua as como los azcares y los aminocidos. As, diversos estudios han puesto
de manifiesto que la creatina es necesaria para la formacin de los aminoimidazoazarenos y que existe
una relacin directa entre la cantidad de aminoacidos o pptidos de cadena corta y la actividad
mutagnica resultante. En cuanto a los azcares, se ha demostrado que su presencia es necesaria para
la formacin de las aminas aunque algunos autores han puesto de manifiesto que la adicin de glucosa o
lactosa a la carne inhibe en parte la formacin de aminas y en consecuencia, disminuye la actividad
mutagnica generada por la coccin. En la Tabla 1 se indican los precursores de algunas de las aminas
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heterocclicas ms frecuentemente estudiadas. El agua y los lpidos que contienen los alimentos parece
que tambin tienen importancia en la generacin de compuestos mutagnicos dado que durante el
proceso de coccin los precursores solubles en agua migran junto con sta a la superficie de los
alimentos donde son expuestos a temperaturas relativamente altas que favorecen la reaccin de
formacin de dichos compuestos. Esto explica que el nivel de actividad mutagnica de la superficie de la
carne frita sea superior a la de la zona central, donde la temperatura es normalmente ms baja. El papel
desempeado por los lpidos no est tan claro dado que algunos estudios sugieren que las grasas
pueden hacer aumentar la formacin de las aminas heterocclicas al favorecer la transmisin del calor
mientras que otros indican que la posible dilucin de los precursores en las grasas puede hacer disminuir
la produccin de estos compuestos. Los antioxidantes tanto naturales como sintticos, como por ejemplo
el butilhidroxianisol, parece que hacen disminuir la actividad mutagnica de la carne frita.
TABLA 1.- PRINCIPALES PRECURSORES DE LA AMINAS
HETEROCCLICAS

Acrnimo
IQ
MeIQ
MeIQx
4,8-DiMeIQx
7,8-DiMeIQx
PhIP
Trp-P-1
Trp-P-2
Glu-P-1
Glu-P-2
A C
MeA C

Precursores
creatina, glicina, fenilalanina, serina, prolina,
fructosa, glucosa
creatina, lanina, fructosa
creatina, glicina, alanina, treonina, lisina, fructosa,
glucosa, ribosa
creatina, alanina, treosina, lisina, fructosa, glucosa,
ribosa
creatina, glicina, glucosa
creatina, fenilalanina, glucosa
triptfano
triptfano
cido glutmico
cido glutmico
globulina de semillas de soja
globulina de semillas de soja

Diversos estudios llevados a cabo con modelos fisico-qumicos han puesto de manifiesto que la creatina
y los productos de la reaccin de Maillard, originados a partir de la glucosa y algunos aminocidos tienen
un papel importante en la formacin de los aminoimidazoazarenos. En la Figura 2 se muestra el proceso
de formacin de estos compuestos propuesto por Jgerstad [6] donde se sugiere que la parte
aminoimidazlica de la amina es aportada por la creatinina originada por ciclacin de la creatina mientras
que el resto de la molcula proviene de la condensacin aldlica de una piridina o una piracina con un
aldehdo, ambos generados a partir de la degradacin de Strecker de una hexosa y un aminocido.
Adems de los factores composicionales, la aparicin de estos contaminantes en el tratamiento trmico
de los alimentos proteicos est influida por otros factores como por ejemplo el material en el que se lleva
a cabo el tratamiento, el tiempo, la temperatura y el tipo de coccin. Se ha observado que las aminas
heterocclicas se empiezan a formar a los 100C y que la actividad mutagnica aumenta con la
o
temperatura hasta los 170 C - 200C. As en general, los tipos de coccin que implican temperaturas
alrededor de los 100C como hervir en agua, hacer al vapor o estofar generan pocos agentes
mutagnicos. Sin embargo, los tratamientos trmicos que implican un calentamiento mediante procesos
conductivos como frer o asar conducen a un aumento de la actividad mutagnica.

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OR

C 6 H 12 O 6

NH 2
HN
N CH 3
HOOC

+NH
3

hexosa

creatina

aminocido

- H 2O

Degradacin de Strecker
Y
X

Z
N

H
CH 3

O C R

piridina o pirazina

aldehdo

N H2
N CH 3

creatinina

NH 2

N CH 3

R, X e Y pueden ser H o CH 3

Z puede ser CH o N

aminoimidazoazaareno
Figura 2.- Formacin de los aminoimidazoazarenos (AIA)

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Mtodos de determinacin de las aminas heterocclicas

Para evaluar el riesgo que supone la presencia de aminas heterocclicas en los alimentos es
imprescindible disponer de metodologas analticas capaces de identificar y determinar estos compuestos
a niveles de concentracin muy bajos, del orden de los ppb. Pero no es suficiente que la metodologa
analtica utilizada sea sensible, tambin debe ser lo ms selectiva posible ya que los alimentos contienen
una elevada cantidad de compuestos interferentes. Adems, la complejidad de las muestras requiere
frecuentemente la utilizacin de etapas de preconcentracin y purificacin laboriosas que hacen
aumentar el tiempo de anlisis y disminuir la reproducibilidad de los resultados. Por ello, es necesario
establecer mtodos de anlisis que adems de ser selectivos y sensibles, sean rpidos, robustos e
independientes de la matriz de la muestra.
Las estrategias para conseguir una buena preconcentracin de las aminas heterocclicas y una adecuada
limpieza de la muestra han sido ampliamente estudiadas en los ltimos aos [7] y el resultado ha sido el
establecimiento de complejas metodologas analticas que incluyen varias etapas generales. En la
primera de ellas se procede a una homogeneizacin y dispersin de la muestra utilizando disolventes
orgnicos o bien disoluciones acuosas cidas, bsicas o neutras. El siguiente paso consiste en la
separacin de las proteinas mediante centrifugacin, filtracin o adsorcin y a continuacin, las aminas
heterocclicas se extraen con disolventes orgnicos y el extracto se somete a una limpieza ms
exhaustiva utilizando varias etapas de particin cido-base o bien sorbentes suficientemente especficos,
como por ejemplo adsorbentes polimricos, resinas de intercambio inico, fases de otadecilsilano sobre
slice, inmunoadsorbentes y ms recientemente polmeros de huella molecular (imprinted polymers).
Finalmente, se debe concentrar el extracto a fin de conseguir un nivel de concentracin de los analitos
adecuado a la tcnica de determinacin a utilizar.
De todos los mtodos de tratamiento de muestra propuestos en la bibliografa, el de ms amplia
aceptacin es el que propuso Gian Gross [8] el ao 1990 y que utiliza una serie de columnas en tndem
que permiten llevar a cabo las distintas etapas del proceso de tratamiento de la muestra con una cierta
rapidez y seguridad. En la primera columna se coloca la muestra que se ha dispersado en hidrxido de
sodio y mezclado con tierra de diatomeas. Al eluir con diclorometano los analtos quedan retenidos en
una segunda columna que contiene propilsulfonato sdico (PRS). Posteriormente se activa el
intercambior inico, se conecta la columna con una de octadecilsilano (C18), y se eluyen las aminas
heterocclicas con acetato de amonio. En el extracto obtenido se encuentran los aminoimidazoazarenos.
En la bibliografa se encuentran numerosas variantes de este mtodo de entre las cuales la ms utilizada
es la propuesta por G. Gross y A. Grter en 1992 [9] que ha sido modificada por nuestro grupo de trabajo
[10] y que es la que se indica en la Figura 3. En este mtodo se recogen los lavados procedentes de la
columna de PRS y se procede a su tratamiento en una columna de C18 lo que permite recoger la fraccin
denominada de las aminas apolares que contiene las carbolinas. As, adems de las ventajas aportadas
por el tndem original, este mtodo permite el anlisis de las dos familias de aminas heterocclicas.
Otra variante introducida por nuestro grupo de investigacin en el mtodo original consiste en la
activacin del intercambior inico previamente a la retencin de los analitos [11], de manera que se
preconcentran todas las aminas heterocclicas en una nica fraccin. Esta propuesta supone una
reduccin tanto de material utilizado como del tiempo de anlisis aunque hay que sealar que el extracto
es menos limpio que el obtenido utilizando el procedimiento comentado previamente. Algunos autores
[12] recomiendan utilizar una etapa adicional de clean-up con resinas de intercambio inico que aunque
consigue una mayor limpieza de los extractos tambin provoca un aumento del tiempo de anlisis y una
disminucin en las recuperaciones ya de por s bastante bajas, entre el 40 y el 100% dependiendo del
compuesto y del procedimiento.

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Extracto de carne
12 ml NaOH 1 M
Extraccin con Extrelut-20
Elucin con 75 ml DCM
Extraccin con PRS , 500 mg
1 elucin:
a) 6 ml HCl 0,01 M
b) 15 ml MeOH:HCl 0,1 M
(60:40)
c) 2 ml H 2 O
Neutr. con 500l NH 3
Adic. 25 ml H 2 O
Preconc. con C18, 500 mg
Lavado con 2 ml H 2 O
Elucin: 1,4 ml MeOH:NH 3
(9:1)

2 elucin:
20 ml AcONH 4 0,5 M
pH=8

Preconc. con C18 , 100 mg

Lavado con 5 ml H2 O
Elucin: 0,8 ml MeOH:NH 3
(9:1)

Cambio de disolvente,
50l MeOH

Cambio de disolvente,
50l MeOH
HPLC
Aminas Polares

HPLC
Aminas Apolares

Figura 3.- Esquema del procedimiento de clean-up.

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En cuanto a las tcnicas utilizadas para el anlisis de los extractos purificados, es de destacar el uso de
la cromatografa de lquidos (LC) con deteccin espectrofotomtrica (UV), fluorimtrica o electroqumica y
ms recientemente su acoplamiento a la espectrometra de masas [13]. De todos estos sistemas de
deteccin el que se ha utilizado tradicionalmente es la espectrofotometra UV con instrumentos de series
de diodos que permiten obtener informacin de los compuestos analizados [14]. Sin embargo, la
selectividad y sensibilidad de los espectrofotmetros es baja y por esta razn con frecuencia, se utilizan
simultneamente con un detector fluorimtrico que proporciona una mayor selectividad y sensibilidad
para las aminas fluorescentes que son algunas carbolinas (Glu-P-1, Glu-P-2, Trp-P-1, Trp-P-2) y la PhIP
[15]. Dado que las aminas heterocclicas pueden ser fcilmente oxidadas, la deteccion electroqumica es
tambin una buena opcin para la determinacin de estos compuestos [16] aunque hay que sealar que
con este tipo de deteccin no se puede obtener fcilmente informacin adicional que ayude a la
identificacin. Sin embargo, la sensibilidad es elevada como puede observarse en la tabla 2 donde se
dan los lmites de deteccin obtenidos con un detector amperomtrico y uno espectrofotomtrico (UV).

Tabla 2 - Lmites de deteccin obtenidos con distintos detectores (pg

inyectados).
Compuesto
LC-EC
LC-UV
LC-MS (ESI-IT)
DMIP
IQ
MeIQx
MeIQ
4,8-DiMeIQx
Trp-P-2
Trp-P-1
PhIP
A
C
MeA
C

16
40
44
65
41
5
54
11
22
33

1300
1400
200
1300
200
200
200
1500
800
1000

67
22
9
8
5
7
4
13
27
15

Durante los ltimos aos y a raz del desarrollo de las tcnicas de ionizacin a presin atmosfrica (API),
el acoplamiento de la cromatografa de lquidos a la espectrometra de masas (LC-MS) ha pasado a ser
la tcnica ms recomendada para la determinacin de aminas heterocclicas en alimentos [17,18]. La
ventaja ms importante del acoplamiento LC-MS es que permite la identificacin inequvoca de los
analtos a partir del espectro de masas pero es que adems, los lmites de deteccin son muy buenos y
similares o incluso mejores que los que pueden obtenerse por ejemplo con deteccin electroqumica
como puede observarse en los valores recogidos el la tabla 2 que se han obtenido utilizando una fuente
de ionizacin de electrospray y un ion-trap como analizador. Aunque la espectrometra de masas es una
tcnica de elevada selectividad, cuando las concentraciones son muy bajas y las muestras son complejas
puede resultar difcil cuantificar los analtos y en estos casos, resulta ventajoso trabajar con
espectrometra de masas en tndem (LC-MS/MS) aunque este modo de trabajo requiere la utilizacin de
instrumentos ms complejos que los espectrmetros de masas convencionales de un nico cuadrupolo.
Niveles de aminas heterocclicas en alimentos cocinados
Las aminas heterocclicas se han detectado en carnes de distinto origen (bovino, ovino, porcino y aves de
corral) y en pescados fritos, a la plancha o a la parrilla y procedentes tanto de restaurantes como de
casas particulares as como en productos precocinados, en extractos de carne, en aromatizantes
comerciales y en los residuos que quedan en las sartenes o las planchas despus de la coccin.
Tambin se ha descrito su presencia en muestras medioambientales y en algunas bebidas alcohlicas
como el vino o la cerveza aunque lo ms frecuente es encontrarlas en alimentos proteicos que han sido
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sometidos a tratamientos trmicos a elevadas temperaturas. En la Tabla 3 se dan a modo de ejemplo, los
intervalos de concentracin de las aminas heterocclicas que con ms frecuencia se encuentran en
algunos tipos de alimentos, carnes y pescado, sometidos a diferentes procedimientos de coccin [19,
20]. Aunque los niveles de concentracin son muy variados, oscilan entre los 0.1 y los 40 ng/g, es de
inters sealar que los valores ms elevados corresponden siempre a alimentos tratados a temperaturas
altas y en algunos de estos casos, las concentraciones, especialmente para la PhIP, pueden alcanzar los
400 ng/g. En general, las cantidades de aminas producidas aumentan con la temperatura y el tiempo y se
ha demostrado que para algunos compuestos, por ejemplo la PhIP, su formcin est favorecida a
temperaturas elevadas. Tambin es interesante remarcar que las temperaturas relativamente bajas y los
tiempos de coccin relativamente largos, favorecen la presencia de las aminas en los residuos de la
sartn lo que es explicable por el transporte de los precursores de las aminas desde la carne a la sartn
lo que produce como consecuencia una disminucin de estos compuestos en la superficie de los
alimentos y un aumento en los residuos. Algunos estudios recientes indican que la concentracin de
estos compuestos en la superficie de la carne puede disminuir si se cocina a temperatura relativamente
baja y girando con frecuencia la carne.
Uno de los problemas a remarcar en relacin con los datos de la bibliografa es que en la mayor parte de
los trabajos en los que se indican los niveles de estos compuestos en alimentos no se describe con
exactitud el procedimiento de coccin utilizado y adems, en algunos casos sobre todo en los trabajos
ms antiguos, la temperatura se ha aumentado a fin de favorecer la formacin de las aminas y as
poderlas detectar. Cabe destacar tambin que los mtodos de anlisis utilizados por los laboratorios que
generan los datos pueden ser distintos y con frecuencia no han sido validados. Por ello, los valores de la
bibliografa son difcilmente comparables entre s lo que lleva a pensar que pueden resultar poco
representativos de la cantidad real de aminas heterocclicas que contienen los alimentos y que por tanto,
puede afectar a la poblacin.

Tabla 3.- Contenido (ng/g) de varias HAs en diferentes muestras de alimentos cocinados.
Muestra
IQ
MeIQx
4,8-DiMeIQx
PhIP
Ternera
Frita
n.d.-1.9
n.d.-12.3
n.d.-3.9
n.d.-67.5
A la plancha
n.d-0.2
n.d.-6.0
n.d.-1.2
n.d.-290
a la parrilla
n.d.-1.6
n.d.-4.4
n.d.-2.7
n.d.-38
Extracto
n.d.-15
n.d.-20
n.d.-4.0
n.d.-10
Pollo
Frito
n.d.
n.d.-3.0
n.d.-2.0
n.d.-70
A la plancha
n.d.
n.d.-6.1
n.d.-4.0
n.d.-315
a la parrilla
n.d.
n.d.-9.0
n.d.-3.1
n.d.-390
Cerdo
Frito
n.d.-0.1
n.d.-4.6
n.d.-3.3
n.d.-13.4
A la plancha
n.d.
n.d.-0.6
n.d.-0.2
n.d-6.6
Cordero
Frito
n.d.
n.d.-0.6
n.d.-0.6
n.d.-2.3
A la plancha
n.d.
n.d.-1.6
n.d.-0.7
n.d.-11
Pescado
Frito
n.d.-0.2
n.d.-6.4
n.d.-0.1
n.d.-6.4
A la plancha
n.d.-1.0
n.d.-4.6
n.d.-0.1
n.d.-51
n.d.: no detectado

En Espaa no existen estudios sobre la concentracin de estos compuestos en los alimentos y en este
campo incide el trabajo que estamos llevando a cabo en nuestro grupo de trabajo que pretende
establecer y validar metodologa analtica para la determinacin de las aminas heterocclicas en
alimentos. Adems, tambin se pretende llevar a cabo una estimacin de la ingesta de aminas
heterocclicas basada en encuestas sobre los platos de carne y pescado ms frecuentemente
consumidos por la poblacin y en el anlisis de muestras de alimentos cocinados de modo tradicional y
con distintos grados de coccin tanto en domicilios particulares como en restaurantes.
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Bibliografa
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