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Síntesis de Péptidos
Síntesis de Péptidos
Presenta:
Erandi Lira Navarrete
SNTESIS DE PPTIDOS
NDICE
CAPTULO I
INTRODUCCIN
ANTECEDENTES
CONCEPTOS GENERALES
Aminocidos.
Enlace peptdico.
Racemizacin.
CAPTULO II
GRUPOS PROTECTORES
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CAPTULO III
FORMACIN DEL ENLACE PEPTDICO
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Activacin y acoplamiento.
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Racemizacin.
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CAPTULO IV
SNTESIS DE PPTIDOS EN SOLUCIN
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La tcnica de Merrifield.
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La tcnica de Sheppard.
29
El soporte slido.
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Instrumentacin.
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CAPTULO VI
CASOS ESPECIALES DE SNTESIS
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Sntesis de glicopptidos.
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CAPTULO VII
PURIFICACIN DE PPTIDOS
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SNTESIS DE PPTIDOS
CAPTULO VII
HERRAMIENTAS PARA LA CARACTERIZACIN DE PPTIDOS SINTTICOS
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Anlisis de aminocidos.
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Degradacin de Edman.
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Electroforesis capilar.
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Espectrometra de masas.
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BIBLIOGRAFA
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ndice de tablas
Tabla 1. Estructura de los 20 aminocidos encontrados en las protenas.
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ndice de figuras
Figura 1. Uretano o carbamato.
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Figura 13. Proteccin selectiva del -amino mediante el bloqueo del -amino con
benzaldhedo.
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Figura 15. Proteccin selectiva de los grupos carboxilo de las cadenas laterales de los
aminocidos cidos.
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Figura 16. Ejemplos de grupos protectores usados para la cadena lateral del aminocido
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iii
SNTESIS DE PPTIDOS
cistena.
Figura 17. La racemizacin no se evitar si el grupo protector est en el N.
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Figura 23. Generacin del enlace peptdico po un anhdrido intermediario formado a partir
de un aminocido con cido difenilfosfnico.
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Figura 25. Formacin del enlace peptdico usando BOP como reactivo activador.
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Figura 38. Opciones para la formacin de pptidos cclicos por enlace amida.
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Figura 39. Formacin del puente disulfuro correcto mediante la proteccin de las cistenas
no participantes, con grupos protectores distintos a los usados para las cistenas
participantes.
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Figura 41. Esquema general de la sntesis de bibliotecas peptdicas por la tcnica de las
bolsas de t.
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Figura 42. Sntesis de una biblioteca de pptidos sobre una membrana de celulosa.
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iv
SNTESIS DE PPTIDOS
CAPTULO I
INTRODUCCIN.
La palabra protena proviene del vocablo griego proteion, que significa primero. Este nombre
fue dado a tales macromleculas para enfatizar el rango de importancia que tienen en un sistema
viviente. Si bien es difcil decidir cul de las biomolculas es la de mayor importancia, es innegable
que las protenas son los materiales que desempean el mayor nmero de funciones en las clulas
de todos los seres vivos, las cuales van desde formar parte de la organizacin estructural bsica de
la clula, hasta funciones metablicas y reguladoras. Toda esta variedad de actividades
bioqumicas son las que definirn la identidad de un ser vivo. En consecuencia, han sido el foco de
atencin de los cientficos a travs del tiempo. En el afn de comprenderlas mejor, se ha intentado
sintetizarlas en el laboratorio llegando a desarrollar la tcnica de sntesis de pptidos, que aunque
menos complejos que las protenas, han brindado informacin importante al poseer caractersticas
de las protenas naturales (por constituirse de la misma manera). Adems, los pptidos por s
mismos tienen roles significativos en la biologa como hormonas, factores de crecimiento,
antibiticos, toxinas y neuropptidos. Entre las aplicaciones de la sntesis de pptidos se
encuentran la de desarrollar pptidos de importancia mdica como lo son hormonas y vacunas,
tambin pueden sintetizarse pptidos para producir anticuerpos contra porciones especficas de
protenas o para modificar algunos pptidos naturales con el fin de hacerlos ms estables, entre
otras.
ANTECEDENTES.
La historia de la sntesis de pptidos comienza con Emil Fisher, quien al establecer la
qumica de las protenas obtuvo la sntesis del dipptido glicil-glicina en 1901, comprobando de
esta manera su hiptesis de que los aminocidos estaban unidos entre s mediante el enlace
peptdico. A partir de ah continu sintetizando tripptidos, tetrapptidos, etc., hasta finalmente
alcanzar la sntesis un polipptido de 18 residuos aminoacdicos. Despus de esto, la evolucin de
la tcnica fue lenta, los primeros polipptidos sintetizados fueron homopolmeros ya que se
presentaba un problema al momento de combinar aminocidos: deba protegerse el grupo amino de
un tipo para evitar que se uniera con un aminocido de su misma especie e impedir
contaminaciones de pptidos distintos. Encontrar un compuesto qumico capaz de bloquear el
grupo amino, pero que adems fuera removido fcilmente despus de la formacin del enlace
peptdico deseado, no fue logrado hasta 1932 por Max Bergmann y Leonidas Zervas, el grupo
SNTESIS DE PPTIDOS
carbobenzoxilo. A partir de esto los grupos protectores fueron perfeccionndose y en 1953 Vincent
du Vigneaud fue capaz de sintetizar el primer polipptido funcional, la hormona oxitocina, lo que le
llev a ganar el premio Nobel de qumica en 1955. Sin embargo, aislar y purificar un nuevo pptido
significaba invertir muchsimo tiempo para obtener una cantidad nfima de producto, por lo que
Bruce Merrifield pens que el mtodo poda mejorarse. En 1963 dio a conocer la sntesis del
tetrapptido leucilalanilglicilalanina y en 1969 Merrifield anunci la sntesis de la enzima
ribonucleasa pancretica bovina A de 124 residuos en 6 semanas, mediante la sntesis de pptidos
en fase slida (SPPS, de sus siglas en ingls), tcnica por la que recibi el premio Nobel de qumica
en 1984.
CONCEPTOS GENERALES.
Aminocidos.
Qumicamente las protenas son polmeros de elevado peso molecular compuestos por
unidades monomricas llamadas aminocidos, los cuales se unen entre s mediante un enlace
amdico, mejor conocido como enlace peptdico. Los aminocidos son slidos cristalinos no voltiles
que se funden con descomposicin a temperaturas relativamente elevadas, son insolubles en
disolventes no polares, pero apreciablemente solubles en agua. Existen 20 clases diferentes de
aminocidos que forman a las protenas, todos ellos coinciden estructuralmente en que llevan
unido un grupo carboxlico (-COOH ) y un grupo amino (-NH2 ) al mismo tomo de carbono
tetradrico denominado carbono , al cual tambin est unido un tomo de hidrgeno y una
cadena lateral (R), Es precisamente esta cadena lateral la que los identifica y le confiere
propiedades qumicas diferentes a cada aminocido.
Las estructuras presentadas en la tabla 1, muestran que todos los aminocidos contienen
al menos un centro quiral (con excepcin de glicina), debido a esto podemos encontrar dos
estereoismeros de cada aminocido, especficamente enantimeros, es decir, imgenes especulares
que no pueden superponerse una a la otra las cuales tienen propiedades fsicas idnticas
exceptuando la direccin en que desvan el plano de la luz polarizada. Si la rotacin del plano es a
la derecha se les denomina dextrgiros (D) y si es a la izquierda levgiros (L). Los L-aminocidos
son los que forman a la gran mayora de las protenas. sta caracterstica de los aminocidos es
importante recordarla para la sntesis de pptidos.
SNTESIS DE PPTIDOS
SNTESIS DE PPTIDOS
Enlace Peptdico.
La unin entre dos aminocidos se lleva a cabo por la reaccin que se presenta entre el
grupo carboxilo de un aminocido con el grupo amino de otro formando una amida mediante la
prdida de una molcula de agua. Esta unin covalente es a lo que se denomina enlace peptdico, el
cual tiene una geometra planar y caractersticas de doble enlace, debido a la resonancia existente.
Racemizacin.
El trmino racemizacin se refiere a la conversin de un enantimero en su imagen
especular, y una mezcla de partes iguales de enantimeros se denomina modificacin racmica, la
cual es pticamente inactiva, ya que cuando se hace incidir un haz de luz polarizada sobre la
mezcla la rotacin generada por un enantimero es cancelada por la misma rotacin que produce
en sentido opuesto el otro. Una mezcla racmica no puede ser separada por mtodos ordinarios,
por lo que se tiene que recurrir al uso de reactivos pticamente activos, en donde se observan
propiedades fsicas diferentes para cada enantimero.
SNTESIS DE PPTIDOS
CAPTULO II
GRUPOS PROTECTORES.
Uno de los principales pasos para la sntesis de pptidos es la proteccin de los grupos
funcionales de los aminocidos, stos deben protegerse para evitar la formacin de un enlace
peptdico no deseado, es decir, impedir que el grupo carboxilo de un aminocido reaccione con el
grupo amino de uno de sus anlogos. As mismo, al proteger las cadenas laterales de los
aminocidos tambin se est evitando que estos reaccionen con los grupos amino o carboxilo de
otros aminocidos, o que den lugar a reacciones secundarias. Los grupos protectores tambin
protegen el carbono alfa de ser susceptible a racemizacin.
Entre las caractersticas que debe tener un grupo protector se encuentran, la de ser
qumicamente estable en las condiciones en las que se da la sntesis peptdica, y la de ser
fcilmente removibles en condiciones suaves que no alteren la formacin del enlace peptdico al
final o en fases intermediarias de la sntesis. En este sentido, se pueden clasificar a los grupos
protectores como permanentes, los cuales son retenidos hasta que el pptido ha sido completado,
o temporales, los cuales se eliminan al final de cada etapa de sntesis.
SNTESIS DE PPTIDOS
Estas amidas, a diferencia de las amidas comunes, pueden degradarse por mtodos que
dejan intacto el enlace peptdico. El rompimiento puede darse por hidrogenacin cataltica o
por hidrlisis con HBr en cido actico fro.
La reaccin que por que se lleva a cabo el rompimiento con HBr/AcOH se muestra en la
figura 3.
SNTESIS DE PPTIDOS
hidrobromuro cuando se le agrega ter. Por otra parte, la integridad de algunos pptidos
sintetizados puede verse daada, especialmente si entre los aminocidos que conforman al
producto se encuentran algunos con cadenas laterales susceptibles, como es el caso de
triptfano, tirosina y metionina.
La hidrogenacin cataltica (figura 4), usualmente es llevada acabo con 80% de cido
actico y 10% de paladio a presin y temperatura ambiente. Es un mtodo bastante
confiable ya que slo presenta una limitacin: el catalizador puede ser degradado por la
existencia de azufre, el cual puede encontrarse si en la secuencia peptdica se encuentran
aminocidos como cisteina o metionina. Algunos procesos que implican el uso de amonio
como solvente o un exceso del catalizador en cido actico llevan a cabo esta reaccin sin
importar si hay azufre presente, no obstante, estas condiciones no se han tratado
adecuadamente.
SNTESIS DE PPTIDOS
se obtienen a
El grupo Fmoc es muy estable en presencia de agentes cidos, pero puede removerse
fcilmente en ciertas condiciones bsicas, usualmente se utiliza 20% de Piperidina en
dimetilformamida (DMF) para desproteccin de los aminocidos Fmoc, mecanismo que es
SNTESIS DE PPTIDOS
muy rpido a temperatura ambiente (figura 9). Este procedimiento no afecta a la mayora de
los grupos protectores, incluidos los grupos Z o Boc.
Existen otros grupos protectores que no son derivados de los uretanos, estos grupos
protectores tambin impiden la racemizacin y son aplicados en ciertas estrategias de sntesis,
entre ellos se encuentran el trifenilmetil , el 2-nitrofenilsulfonil y el ditiosuccinil
Trifenilmetil (trityl, Trt). El trifenilmetil es un radical libre muy estable. La produccin
de los Trt-aminocidos mediante trifenilclorometano es muy pobre en condiciones bsicas,
por lo que se requiere de un intermediario, el cual se obtiene al hacer reaccionar el aminocido, con trimetilclorosilano.
SNTESIS DE PPTIDOS
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SNTESIS DE PPTIDOS
protector es de manera similar a la aquella vista para los derivados del uretano, despus de todo,
son steres de un tipo especial.
Metil ster (-COO-CH3) y Etil ster (-COO-CH2-CH3). Fueron los primeros grupos
utilizados para enmascarar el -carboxilo. No hay una distincin importante entre estos dos,
por lo que se les trata como un mismo grupo protector. Pueden obtenerse haciendo
reaccionar al aminocido con el alcohol correspondiente directamente o por medio de un
halogenuro de acilo intermediario. No se ven afectados a temperatura ambiente por
HBr/AcOH, TFA, hidrogenacin cataltica, tioles o aminas en solventes orgnicos, de esta
manera puede combinrseles con cualquier grupo amino protector. Uno de los problemas de
estos grupos protectores se presenta cuando se est protegiendo a un dipptido ya que
tienden a ciclarse formando dicetopiperacinas. Son demasiado estables, debido a esto las
condiciones de desproteccin exigen un tratamiento vigoroso; en ocasiones la saponificacin
es confiable, pero se corre el riesgo de que la base utilizada pueda causar racemizacin.
Bencil ster (-COO-CH2C6H5).
este grupo protector se populariz por presentar menos problemas para la desproteccin que
el metil o etil ster, aunque al igual que estos ltimos, tienden a formar dicetopiperacinas.
Pueden ser eliminados por saponificacin, pero tambin por HBr/AcOH e hidrogenacin
cataltica, pero no por TFA (al igual que el grupo protector Z para el -amino), por esta razn
se les usa en combinacin con un grupo amino protector distinto al Z durante la etapa de
sntesis.
t-Butil ster (-COO-C-(CH3)3). Estos pueden ser preparados directamente de los
aminocidos pero el procedimiento estndar es indirecto (figura 12). A diferencia de los
grupos anteriores, los dipptidos de los t-Butil steres no forman dicetopiperacinas con
facilidad. La estabilidad y labilidad de este grupo es semejante a la del grupo Boc, aunque
son menos sensibles a acidlisis, por lo que es posible diferenciar entre el rompimiento de
un grupo Boc y un t Butil ster. Sin embargo, se recomienda utilizarlo en combinacin con
un grupo protector diferente al Boc.
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SNTESIS DE PPTIDOS
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t-butil ster. La diferenciacin de los grupos carboxilo puede hacerse como se muestra en la
figura 15 (aunque podran existir otras alternativas).
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CAPTULO III
FORMACIN DEL ENLACE PEPTDICO.
Activacin y Acoplamiento.
La formacin del enlace peptdico es una reaccin endergnica, una simple adicin de un
cido carboxlico con una amina dar como resultado la obtencin de la sal orgnica
correspondiente, por lo que, si lo que buscamos es la formacin de una amida, el grupo carboxilo
debe ser activado. El mecanismo que se sigue para el acoplamiento de dos aminocidos es
aminlisis y se resume en la figura 18. En donde X es cualquier agente activante de naturaleza
electroflica, el cual debe ser minuciosamente escogido, ya que una mala eleccin puede llevarnos
a racemizacin.
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SNTESIS DE PPTIDOS
Las reacciones secundarias que puede dar este mtodo es una de sus limitaciones, entre la
que destaca la transposicin de Curtius, obteniendo o bien una amina o un isocianato antes
que se d la formacin del enlace peptdico. Fueron muy usadas antes de los aos cincuenta,
debido a que no presentaban racemizacin.
Anhdridos. La formacin de anhdridos surgi de la necesidad que tiene la sntesis de
pptidos de la activacin del grupo carboxilo sin que haya liberacin de reacciones
secundarias, ya que los productos obtenidos son difciles de purificar.
Los anhdridos simtricos pueden obtenerse a partir del correspondiente acil aminocido
mediante el uso de una variedad de reactivos, entre los que se encuentran la
dicilohexilcarbodiimida. Los anhdridos simtricos de los aminocidos Boc, Z y Fmoc, son
generalmente sustancias cristalinas estables. La aminlisis de los anhdridos simtricos no
es ambigua, siempre obtendremos la amida deseada pero slo la mitad del componente ser
incorporado al producto final.
En la sntesis de pptidos se hace uso de distintos tipos de anhdridos mixtos, el primer
tipo es el obtenido a partir de un acil aminocido (o un acil pptido) y un cido carboxlico.
La aminlisis de este tipo de anhdridos a diferencia de los simtricos es un tanto ambigua,
pudiendo obtener distintos productos cuando se forma el enlace peptdico (figura 20).
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SNTESIS DE PPTIDOS
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SNTESIS DE PPTIDOS
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SNTESIS DE PPTIDOS
Mediante este agente acoplante se obtienen altos rendimientos con pocas reacciones
secundarias y todos los coproductos son fcilmente removibles. Presenta riesgo de
racemizacin y el coproducto hexametilfosforoamida es altamente txico.
Racemizacin.
Como se mencion anteriormente, racemizacin es el trmino dado a la conversin que
tiene un enantimero en otro, y ha sido profundamente estudiada en la sntesis de pptidos, dado
que 19 de los 20 aminocidos utilizados en protenas son compuestos ptimamente activos,
susceptibles a ella, y la conservacin de la configuracin L en los pptidos y protenas es esencial
para que preserven sus propiedades biolgicas. Por lo anterior, es trascendental impedir que este
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SNTESIS DE PPTIDOS
fenmeno ocurra, ya que si tenemos una mnima tasa de racemizacin en cada residuo aadido,
podemos obtener muchos productos distintos con aminocidos D, y purificar el pptido correcto
representa un serio problema.
La etapa de la sntesis en la que se presenta el riesgo de racemizacin, dado que esta
reaccin es casi exclusivamente inducida por una base, es en la de activacin y acoplamiento. Los
dos mecanismos por los que puede ocurrir son los siguientes:
Enolizacin directa. Puede presentarse cuando se prepara un aminocido para
activacin, el carbanin intermediario puede volver a protonarse en cualquier lado de la
molcula (figura 26). Ya que el carbanin es un ion plano, y dependiendo de cul cara elija
el protn, nos dar un enantimero o el otro.
En la prctica, no es una fuente importante de racemizacin, puesto que los factores de los
que depende, como la base que cataliza y el solvente pueden ser controlados. As mismo, la
velocidad de acoplamiento juega un papel importante, y este mecanismo se presenta en
acoplamientos que son extremadamente lentos, cosa que no es muy comn en la sntesis de
pptidos.
Mecanismo de oxazolona. Con excepcin de prolina, los acil aminocidos activados y los
pptidos acilados pueden dar un compuesto heterocclico bajo la influencia de una base.
Las oxazolonas formadas son activadas a travs de la aminlisis y la reaccin con un grupo
amino llevar eventualmente a la formacin de pptidos. Sin embargo, la velocidad de
racemizacin es mayor a la de la formacin del enlace peptdico, por lo que los pptidos
producidos se encontrarn racemizados .
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SNTESIS DE PPTIDOS
La sntesis de pptidos a partir del amino terminal (como son sintentizadas naturalmente
las protenas en las clulas), provee una oportunidad mayor para la formacin de una
oxazolona, por esta razn la sntesis de pptidos se lleva a cabo usualmente en el sentido
contrario, del grupo carboxilo hacia el amino. El riesgo de que se forme una oxazolona se
reduce cuando el aminocido est protegido por un derivado de uretano, y en el caso de que
se formara, sta sera ms resistente a racemizacin; de ah que el uso de grupos
protectores derivados de uretano sea muy popular en la sntesis de pptidos.
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SNTESIS DE PPTIDOS
CAPTULO IV
SNTESIS DE PPTIDOS EN SOLUCIN.
La sntesis de pptidos en solucin, tambin conocida como el mtodo clsico, fue la
tcnica utilizada para elaborar pptidos hasta la aparicin de la sntesis de pptidos en fase slida
(ver ms adelante), la cual ha venido a sustituir al mtodo clsico en casi todos los laboratorios,
esto debido a que en cada ciclo de la sntesis en solucin deba aislarse y purificarse el pptido
obtenido, por lo que el tiempo que consume es enorme y los rendimientos muy bajos. No obstante,
an es utilizada para la produccin a gran escala en la mayora de las aplicaciones industriales. Se
lleva a cabo en distintos solventes orgnicos, pero para prevenir formacin de oxazolonas se
recomienda el uso de acetato de etilo, tetrahidrofurano, t-butanol, y acetonitrilo.
La elongacin del pptido por el mtodo clsico puede llevarse a cabo de dos formas, por
elongacin gradual (figura
depender de las necesidades de cada pptido. El primer factor a considerar, es que un pptido
puede sintetizarse a partir del amino terminal o del carboxilo terminal, pero como ya se mencion
en el apartado anterior, es preferible hacerlo a partir del carboxilo terminal para reducir el riesgo de
racemizacin. Para comprender mejor las estrategias de elongacin, supongamos que tenemos un
tetrapptido a sintetizar ABCD, si se sigue la elongacin gradual, se pondran a reaccionar el
aminocido D con el C, se purifica el producto, posteriormente se le agregara el aminocido B,
ahora purificaramos BCD para finalmente adicionar el aminocido A. En la condensacin
fragmentada se sintetizaran el dipptido AB y el CD por separado, y los productos purificados se
haran reaccionar para de esta manera tener el producto esperado. Si suponemos un rendimiento
del 80% en cada etapa de purificacin, al final de la sntesis por elongacin gradual tendramos un
rendimiento del 51.2%, mientras que por el mtodo de condensacin fragmentada el rendimiento
total sera del 64%.
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SNTESIS DE PPTIDOS
continuacin se mencionan dos ejemplos para demostrar que las posibilidades de sintetizar un
pptido son varias.
Oxitocina (CYIQNCPLG). Sintetizada por du Vigneaud y sus colaboradores en 1953, esta
hormona est involucrada en el control de las contracciones uterinas durante el parto, y de
la liberacin de la leche despus de ste. La estrategia que siguieron fue elongacin gradual
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SNTESIS DE PPTIDOS
a partir del carboxilo terminal, cuyo grupo protector permanente era un etil ster, otros
grupos permanentes utilizados fueron bencil ter para la tirosina y bencil ster para las
cistenas. El grupo temporal del amino utilizado fue el benciloxicarbonil, el cual fue
removido por HBr/AcOH (figura 3).
Gastrina
porcina
(QGPWMEEEEEAYGWMDF).
Considerada
como
el ms potente
manera
emplear
hidrogenacin
cataltica
en
cada
preparacin.
Los
pptidos
Estrategia
Boc
Bencil ster
Ninguna
Elongacin gradual
benciloxicarbonil
Niguno
El carboxilo de los
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SNTESIS DE PPTIDOS
Condensacin fragmentada
Benciloxicarbonil
Metil ster*
El carboxilo de los
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SNTESIS DE PPTIDOS
CAPTULO V
SNTESIS DE PPTIDOS EN FASE SLIDA.
La tcnica de Merrifield.
Cuando Bruce Merrifield incursion en el rea de sntesis de pptidos se dio cuenta de lo
extenuante y largo que significaba obtener el producto deseado, por lo que imagin que el proceso
poda simplificarse. Su idea bsicamente consista en ensamblar en un soporte slido insoluble el
residuo C-terminal del pptido a sintetizar, con lo cual la cadena de aminocidos ira creciendo
anclada al soporte slido mediante una estrategia de elongacin gradual. Finalmente, el producto
deseado es desprendido del soporte, y su purificacin y caracterizacin se llevan a cabo en
solucin. Lo anterior permite que haya una rpida filtracin y lavados para deshacerse de reactivos
y productos secundarios despus de cada etapa de la sntesis, en consecuencia, no habr que
purificar cada pptido intermediario, lo que se traducir en una reduccin de tiempo y un aumento
en la produccin.
Su idea fue llevada a la realidad, y en 1963 report la obtencin del tetrapptido
leucilalanilglicilvalina mediante la adicin de Z-aminocidos a una resina de poliestireno. Sin
embargo, pareca que esta tcnica no prometa mucho para la construccin de pptidos ms
grandes, las reacciones de desproteccin y/o acoplamiento no llegaban a completarse y el
tetrapptido estaba contaminado con fragmentos ms pequeos. Entonces Merrifield realiz
importantes cambios para la sntesis del nonapptido bradiquinina, sustituy los Z-aminocidos
por Boc-aminocidos y en 1964 report la obtencin de un producto ms puro.
Aunque las reacciones se llevan a cabo en solventes orgnicos, como en el mtodo clsico,
el nombre de sntesis de pptidos en fase slida, fue dado por el hecho de que el pptido va
creciendo anclado a un soporte, un esquema detallado puede observarse en la siguiente figura:
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SNTESIS DE PPTIDOS
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SNTESIS DE PPTIDOS
Existe un problema que es importante tener en cuenta cuando se lleva a cabo esta tcnica,
si cualquier residuo N-terminal de una de las muchas cadenas polipeptdicas en crecimiento
adheridas a la resina permanece sin acilar despus de la etapa de acoplamiento, esto llevar a que
el producto final est contaminado por secuencias incompletas mediante dos eventos: a) El residuo
puede ser exitosamente acoplado en el siguiente ciclo, resultando en un pptido suprimido, o b) El
residuo puede no ser acoplado subsecuentemente, lo que dara un pptido truncado. Al aplicar
matemticas a esto, nos damos cuenta del grave problema que representa, si suponemos un 99%
de reacciones llevadas a trmino en la etapa de acoplamiento, al final de 10 ciclos tendremos un
90% del producto puro y un 10 % de secuencias incompletas contaminantes. Entre ms ciclos
existan, obviamente el rendimiento ser menor. Este problema puede solucionarse forzando a que
la etapa de acoplamiento se lleve a cabo en un 100%. Puede usarse un exceso del agente acilado o
incluso repetir esta etapa ms de una vez. Puede monitorearse si la etapa no se ha completado
mediante la prueba de Kaiser, la cual es una prueba basada en el cambio de color de la resina, si la
resina no cambia de color, nos indicara que la etapa de acoplamiento se ha completado, si el color
de la resina cambia a azul es indicativo de que an hay algunos grupos amino libres (este cambio
de color es el resultado de la reaccin entre la ninhidrina utilizada en la prueba y los grupos amino
libres). El acoplamiento tambin puede ser monitoreado por la prueba de azul de bromofenol, el
cual en presencia de grupos amino libres da una coloracin azul, y en ausencia de stos una
coloracin amarillo verdosa. Este procedimiento puede hacerse de manera continua agregando el
azul de bromofenol al agente acilante, o de manera discontinua tomando una muestra de la resina
y tratarla con el reactivo.
La tcnica de Sheppard.
El modelo propuesto por Merrifield no fue del agrado de muchos qumicos de la poca, les
preocupaba sobretodo la debilidad que presentaba y que no pudieran revisar el producto en cada
etapa sino tener que esperar hasta el final. Aunque ya se ha comentado en la seccin anterior
posibles soluciones al problema de contaminacin por pptidos truncados, las vigorosas
condiciones en las que se llevaba a cabo la tcnica de Merrifield no terminaban de convencerlos
acerca de obtener un 100% de acoplamiento. Por lo que, en 1971 Sheppard y colaboradores
estudiaron de nuevo el modelo de Merrifield para optimizarlo.
Sheppard
argumentaba
que
sera
deseable
que
el
acarreador
polimrico
fuera
qumicamente similar a la cadena polipeptdica creciente, de esta manera, ambos podan ser
solvatados por disolventes polares aprticos, lo que permitira crear un sistema en el que hubiera
acceso libre a las sustancias participantes a los sitios reactivos en cada etapa de la sntesis. Esto
no suceda con el soporte de poliestireno utilizado por Merrifield, el cual impeda la adecuada
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SNTESIS DE PPTIDOS
solvatacin del pptido en crecimiento, lo que reduca la disponibilidad de los sitios reactivos. La
propuesta de Sheppard era la introduccin de soportes de poliamida en sustitucin del poliestireno.
Otra caracterstica importante de esta tcnica, debido a la factibilidad de cambiar del solvente, es el
uso de Fmoc-aminocidos en lugar de los Boc utilizados por Merrifield, de ah que a la tcnica de
Sheppard tambin se le conozca como sntesis Fmoc-poliamida, la cual se resume en la figura 30.
En esta tcnica se usa preferentemente dimetilformamida como solvente, dado que provee
condiciones ms adecuadas para llevar a cabo la reaccin de acoplamiento. A partir de ah, surgi
la idea del cambio de resina, dado que para que el pptido formado fuera completamente solvatado
necesitaba de un acarreador que fuera de naturaleza polar, y aunque la poliacrilamida comercial
pareca no ser la adecuada para este propsito, s lo fue un derivado de sta, un soporte de
polidimetilacrilamida. Un brazo espaciador separa a el primer aminocido de la resina, e incrustado
en ste se encuentra un aminocido de referencia, usualmente Norleucina. La desproteccin de
Boc-aminocidos en la tcnica de Merrifield conlleva a una exposicin prolongada al cido, ya que
no hay una purificacin intermedia, y estas son precisamente las condiciones vigorosas que se
mencionaban anteriormente. Por esta razn, se dio la sustitucin de los Boc-aminocidos por los
30
SNTESIS DE PPTIDOS
El soporte slido.
Dadas las caractersticas de la sntesis de pptidos las resinas deben tener una serie de
requerimientos que imponen algunas de restricciones para el diseo adecuado de una resina.
Merrifield y Ericksson enlistaron algunas de ellas cuando se empezaba el desarrollo de la sntesis
de pptidos en fase slida: Un soporte til debe contener sitios reactivos en los cuales la cadena
polipeptdica pueda ser adjuntada y removida posteriormente, y debe ser estable a las condiciones
fsicas y qumicas de la sntesis. El soporte debe permitir un contacto rpido entre el pptido
creciente y los reactivos. Debe proveer suficientes puntos de adherencia para obtener una buena
produccin por unidad de volumen y debe minimizar las interacciones entre las cadenas peptdicas
unidas.
No todos estos requerimientos son fciles de cumplir, y algunos de ellos pueden ocasionar
conflictos al momento de seleccionar la mejor resina. A continuacin se mencionan los soportes
que han sido usados en SPPS :
Soportes de tipo gel. Son los soportes ms usados debido a la igual distribucin de los
grupos funcionales a travs de la red polimrica altamente solvatada e inerte, la cual es ideal
para el ensamblaje de los pptidos. La red polimrica es flexible y la resina puede expandirse
para acomodar a la molcula creciente dentro del gel. Para la sntesis de pptidos se han
desarrollado 4 tipos de resinas de gel:
1. La
resina
hidrofbica
de
poliestireno,
que
fue
la
desarrollada
por
Merrifield.
31
SNTESIS DE PPTIDOS
32
SNTESIS DE PPTIDOS
Geles soportados. Surgieron debido a que los geles de poliestireno y poliamida no eran
estables en las condiciones del flujo. Para incrementar su estabilidad mecnica los geles
fueron apoyados en matrices rgidas, el primer ejemplo utilizado fue la diatomita,
polimerizando la solucin de poliamida despus de la absorcin dentro de los grnulos de la
matriz inorgnica. Posteriormente la diatomita fue sustituida por una esponja de
poliestireno entrecruzado en cuyo interior se encontraba la poliamida incrustada mediante
un enlace covalente.
Cepillos polimricos.
33
SNTESIS DE PPTIDOS
para pptidos que tienen una amida en el C-terminal. El hecho de que sean estables a cidos
permite la desproteccin de grupos protegidos permanentemente sin liberar el pptido de la
resina, esto no suceda en la tcnica de Merrifield, donde la desproteccin de los grupos
permanentes y la liberacin del pptido de la resina se daba en un solo paso. Aminlisis
intramolecular, que conlleva a la liberacin del pptido de la resina, es una posible reaccin
secundaria en cualquier pptido, pero especialmente con este agente espaciador cuando se forma el
dipptido, esto sucede porque la desproteccin de un Fmoc-aminocido no libera el amino terminal
es su forma protonada, contrario a lo que sucede con la desproteccin de los Boc-aminocidos
(figuras 9 y 6, respectivamente). Razn por la que, como regla general, la desproteccin no se lleva
a cabo a menos que la reaccin de acoplamiento sea realizada inmediatamente.
El ster que se forma entre el primer aminocido y el cido 1,3 dimetoxi-4hidroximetilbenzoico, (figura 34), es mucho ms lbil al cido debido al segundo grupo alcoxi
introducido, no tiene muchas aplicaciones dado a las propiedades no favorables de solubilidad que
confiere a los pptidos protegidos.
34
SNTESIS DE PPTIDOS
La esterificacin del primer aminocido con el grupo hidroxilo del agente espaciador, es
ms benfica si se hace antes de que ste sea unido a la resina, aunque esto no es fcil de lograr.
Una manera de hacerlo, es mediante la conversin del grupo carboxilo del agente espaciador en un
ster activado moderadamente reactivo, como el triclorofenil ster, el cual es lo suficientemente
estable para no interferir con la esterficacin del grupo hidroxilo al primer aminocido, y son lo
suficientemente reactivos, para posteriormente poder acilar la resina. Aunque usualmente, el
espaciador es unido primero a la resina.
Existen casos especiales de pptidos en los que el extremo C-terminal contiene un grupo
amida al final, para estos casos puede romperse el enlace ster formado mediante aminlisis, como
se mencion en el ejemplo del cido 4-hidroximetilbenzoico, pero tambin, pueden utilizarse
espaciadores que contengan un grupo amino para la formacin del enlace amida con el primer
aminocido anclado a la resina, lo cual es ms recomendado. Un ejemplo de estos espaciadores es
la bencihidrilamina (BHA) que se muestra en la figura 35.
35
SNTESIS DE PPTIDOS
Instrumentacin.
La sntesis de pptidos en fase slida puede llevarse a cabo manualmente o de forma
automtica mediante el uso de equipos comerciales. El sistema ms simple y menos costoso se
trata de un contenedor cilndrico en donde se encuentra la resina, todos los reactivos son
adicionados manualmente y drenados de la resina mediante vaco.
Otro sistema consiste de un contenedor de la resina conectado a dos vlvulas, la vlvula A
llena el contenedor de la resina con el liquido correspondiente que es elegido mediante la vlvula B
y entra al contenedor mediante presin controlada por nitrgeno, o por vaco. Dado la simplicidad
del sistema, la vlvula B slo elige entre solvente para la reaccin de acoplamiento, y el reactivo
para la desproteccin temporal de los aminocidos (en la figura 36 se muestra piperidina, que sera
utilizada en caso del uso de Fmoc aminocidos). Cada etapa de la sntesis es llevada a cabo con
agitacin, una vez terminada la reaccin se vaca el contenedor de la resina con la vlvula A.
36
SNTESIS DE PPTIDOS
computadora est provista de un software que le permite controlar las velocidades de flujo, la
cantidad de aminocidos, los tiempos de desproteccin y acoplamiento de los mismos, los lavados y
si alguna de las etapas de la sntesis debe ser repetida. Algunos tambin cuentan con un
espectofotmetro el cual monitorea la concentracin de los reactivos en la corriente de salida. Las
botellas con los reactivos son presurizadas con nitrgeno slo para una purga inicial de los
reactivos para que stos no tapen la bomba.
37
SNTESIS DE PPTIDOS
CAPTULO VI
CASOS ESPECIALES DE SNTESIS.
Sntesis de pptidos cclicos.
Existen dos clases de pptidos cclicos,
38
SNTESIS DE PPTIDOS
aunque tambin se ha utilizado con xito las de poliamida que tengan una
de soporte. La
eleccin
39
SNTESIS DE PPTIDOS
grupos protectores que se haga, depender tambin la eleccin de la resina, pues no todas
son compatibles con los solventes utilizados en la desproteccin temporal, aunque las de
poliestireno con PEG incrustado pueden ser usadas independientemente si el grupo protector
temporal es Boc o Fmoc. Finalmente, la formacin del enlace amida se da con la ayuda de un
reactivo activador, como para la formacin del enlace peptdico, usualmente su ocupa DCC.
Pptidos cclicos por puentes disulfuro. Los puentes disulfuro juegan un papel
importante en el plegamiento y la estabilidad de algunas protenas, entre las que se incluyen
hormonas, enzimas, factores de crecimiento, toxinas, entre otras. Por lo tanto, la
introduccin artificial de este tipo de enlace a pptidos o protenas pequeas sintetizadas en
el laboratorio, servir para mejorar sus actividades biolgicas, as como su especificidad y
estabilidad.
Los puentes disulfuro intramoleculares unen porciones de la cadena polipeptdica que se
encuentran muy lejanas la una de la otra, estos pueden formarse en solucin o mientras el
pptido se encuentra adherido a la resina, pero al igual que en los pptidos cclicos de la
seccin anterior, cuando la formacin del enlace se da en solucin, sta debe estar altamente
diluida para evitar la formacin de puentes disulfuro intermoleculares y por consecuencia,
evitar formacin de dmeros u oligmeros.
Para la formacin de los puentes disulfuro, pueden tomarse dos caminos. El primero de
ellos es la oxidacin de los grupos tiol de las cistenas libres, es decir, al finalizar la sntesis
del precursor lineal, se realiza la desproteccin de todos los grupos protectores permanentes,
incluidos los de las cistenas presentes, posteriormente el pptido es sometido a diferentes
condiciones para lograr la formacin del puente disulfuro, entre las cuales destacan:
1. Por oxidacin con aire, que es la ms fcil de realizar, pues slo necesita el oxgeno
presente en la atmsfera. Generalmente se realiza bajo condiciones levemente
alcalinas. Entre las desventajas que presenta se encuentran: la cantidad de tiempo
que necesita el proceso para completar la reaccin (ms de cinco das), la inadecuada
solubilidad de algunos pptidos a pH bsico y acumulacin de productos secundarios
debido a que tambin pueden oxidarse residuos de metionina.
2. Por oxidacin en presencia de amortiguadores Redox, la cual aumenta la velocidad y
la produccin de la reaccin, con respecto a la oxidacin con aire.
3. Por oxidacin mediada por ferricianida de potasio, que es un reactivo oxidante muy
suave usado ampliamente. Es sensible a la luz, por lo que se logran mejores
40
SNTESIS DE PPTIDOS
41
SNTESIS DE PPTIDOS
Sntesis de glicopptidos.
Se han hecho muchos esfuerzos para la sntesis de glicopptidos dada la importancia
biolgica de estos junto a las glicoprotenas. En un inicio, la glicosilacin era aadida despus de
terminada la sntesis del pptido, y aunque esto poda ser logrado con los N-glicopptidos, era muy
difcil lograrlo para los O-glicopptidos. Afortunadamente, se han desarrollado mtodos eficientes
para la obtencin de aminocidos glicosilados, de esta manera, pueden incorporarse mediante
elongacin gradual a la cadena polipeptdica creciente sin temor al que el impedimento estrico
inhiba el acoplamiento, pues incluso se han acoplado aminocidos con heptasacridos con
resultados positivos.
Los grupos protectores de los aminocidos glicosilados deben ser escogidos considerando
que los enlaces glicosdicos son muy lbiles a cidos, y que pptidos glicosilados en serina y
treonina pueden perder la glicosilacin, mediante eliminacin . El grupo amino protector ms
utilizado para la incorporacin de aminocidos glicosilados, es el grupo Fmoc. El riesgo que corren
los aminocidos glicosilados serina y treonina a perder el azcar debido a que la desproteccin del
grupo Fmoc se lleva a cabo con piperidina, puede reducirse con el uso de morfolina, sin embargo,
es menos eficiente para la desproteccin que la piperidina, y algunos expertos en el tema
consideran que el temor a que suceda la eliminacin usando piperidina es exagerado. Por otro
lado, los grupos hidroxilo del carbohidrato pueden protegerse con cualquier grupo acilo,
42
SNTESIS DE PPTIDOS
preferentemente un bencil ter, o con un grupo silil o isopropilideno, aunque pudieran incluso
dejarse sin proteccin.
slida
para
43
SNTESIS DE PPTIDOS
44
SNTESIS DE PPTIDOS
4-metilbencilhidrilamina (MBHA),
aada bolsa se etiqueta para identificar el pptido que se va a sintetizar dentro de ella. Las
etapas de desproteccin y los lavados se realizan en un contenedor con todas las bolsas
juntas. Para el acoplamiento se separa cada bolsa para unir el aminocido respectivo, y as
sucesivamente hasta completar la secuencia (figura 41).
Sntesis sobre membranas de celulosa. Esta tcnica desarrollada por Ronald Frank,
consiste en la utilizacin de la superficie de una membrana de celulosa como soporte slido
para la sntesis de los distintos pptidos. Para la funcionalizacin de la superficie de la
membrana se fija Fmoc- alanina , usualmente por esterificacin del aminocido con los
grupos hidroxilo de la celulosa, de esta manera puede procederse ahora al ensamblaje de las
secuencias peptdicas. Las partes de la membrana en las que no se uni este aminocido,
quedan inactivadas por acetilacin. La membrana de celulosa es ahora marcada con un
lpiz para la identificacin de cada uno de los pptidos. Cada aminocido protegido se
45
SNTESIS DE PPTIDOS
disuelve
en
dimetilformamida
dimetilacetamida
es
colocado
sobre
la
marca
Sntesis
por
fotolitografa.
Esta
tecnologa
para
la
produccin
de
chips
para
los
cuales
deben
estar
forzosamente
protegidos
con
el
grupo
Nvoc
anteriores, utilizando este mtodo se desconocen las secuencias de los distintos pptidos
que se estn sintetizando. Esta tcnica se basa en el hecho de que cada perla de una resina
slo encontrar un aminocido para reaccionar. La resina ms utilizada es TentaGel,
46
SNTESIS DE PPTIDOS
aunque en general cualquier resina compatible con solventes orgnicos puede ser utilizada.
La resina entonces es dividida en 19 alcuotas, las cuales sern contenidas en frascos de
polipropileno, y se agrega a cada frasco un aminocido presente en las protenas (con
excepcin de cistena). Las alcuotas entonces se juntan y se lleva a cabo la desproteccin de
los aminocidos, vuelven a separarse 19 alcuotas y se les hacen pasar 1 de los 19
aminocidos. El proceso se repite juntando las alcuotas para llevar a cabo la etapa de
desproteccin, y separndolas para el acoplamiento.
47
SNTESIS DE PPTIDOS
CAPTULO VII
PURIFICACIN DE PPTIDOS.
Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).
Esta herramienta ha sido muy til para la purificacin y caracterizacin de pptidos. Es
capaz de separar el pptido de inters de una mezcla formada durante la SPPS, incluso si el
producto esperado se encuentra contaminado con un pptido al que slo le hace falta un
aminocido. Los tipos principales de HPLC utilizados para la separacin de pptidos son:
Cromatografa por exclusin de tamao. Este tipo de cromatografa tambin conocida
como filtracin en gel, no es una tcnica muy efectiva para separar pptidos contaminantes
del pptido de inters, a menos que haya una diferencia importante en el tamao (aunque ya
se han diseado columnas que pueden separar pptidos con masas moleculares del rango
de 100-7000 Da). Pese a ser la menos efectiva de las cromatografas utilizadas, puede ser
implementada en las primeras etapas del proceso de purificacin, sobretodo si lo que se
desea es deshacerse de otro tipo de contaminantes como los grupos protectores o agentes
acoplantes.
Cromatografa de intercambio inico. Es muy til para separar mezclas de pptidos,
particularmente cuando especies cargadas han sido removidas de la secuencias esperada.
Puede ser capaz de separar especies cargadas que difieren por slo una carga neta. Para
purificacin de pptidos sintticos es usada con mayor frecuencia una columna de
intercambio catinico.
Cromatografa de fase reversa. Es el mtodo ms utilizado para separar pptidos debido
a que es generalmente superior a los otros dos en velocidad y eficiencia. Ofrece un amplio
rango de manipulacin de las caractersticas de la fases mvil y estacionaria para mejorar
las separaciones peptdicas entre los que se encuentran:
1. Variacin de los grupos funcionales de la fase estacionaria. Los ligandos funcionales que
usualmente
se
encuentran
en
la
fase
estacionaria
de
RP-HPLC
con
cadenas
agentes
acoplantes
no
son
exitosamente
separados.
Pptidos
muy
hidrofbicos tambin presentan problemas para purificarse, ya que las interacciones con
los compuestos acoplados a la fase estacionaria son muy fuertes. Para solucionar ambos
48
SNTESIS DE PPTIDOS
49
SNTESIS DE PPTIDOS
CAPTULO VIII
HERRAMIENTAS
PARA
LA
CARACTERIZACIN
DE
PPTIDOS
SINTTICOS.
Anlisis de aminocidos.
Es el mtodo ms antiguo para la caracterizar pptidos, el cual an es comnmente
utilizado para determinar el estado de la sntesis antes de que sta llegue a trmino, y en caso de
que se presente algn error detener la sntesis y volver a fabricar el pptido. El anlisis de
aminocidos comprende tres etapas:
Preparacin de la muestra e hidrlisis. Cuando se desea conocer el contenido absoluto
del pptido, la muestra debe ser secada y pesada dentro de un tubo para hidrlisis. Si slo
desea conocer la composicin, entonces solamente se requiere un estimado inicial de la
cantidad de pptido. Las condiciones estndar para la hidrlisis del pptido son 6N de HCl a
110 C por 24 horas tanto en fase lquida como en fase gaseosa. Si lo que se va a analizar es
un pptido an unido a la resina, se utiliza una mezcla 1:1 de HCl/cido propinico 12 N a
150 C, reduciendo el tiempo a slo 90 minutos. No todos los aminocidos pueden ser
recuperados por las condiciones estndares de hidrlisis, cistena y triptfano son
totalmente destruidos. En caso de tener estos aminocidos en la secuencia es recomendable
utilizar otros mtodos de hidrlisis.
Separacin y derivatizacin. En la metodologa original, comnmente denominada
qumica postcolumna, los aminocidos son separados por cromatografa de intercambio
inico y su visualizacin es llevada a cabo por la reaccin con un cromforo. En la qumica
precolumna, los aminocidos son derivatizados directamente en el hidrolizado y la
separacin es llevada a cabo mediante RP-HPLC.
50
SNTESIS DE PPTIDOS
Degradacin de Edman.
Este mtodo para determinar la secuencia de aminocidos en un pptido o protena, puede
ser utilizado para analizar un pptido sinttico incluso si este aun se encuentra adherido a la
resina. Sin embargo, no produce datos tiles en la regin C-terminal. Consiste en la degradacin
repetitiva de los pptidos a partir de una reaccin con el grupo amino terminal libre y con fenil
isotiocianato (PITC) en condiciones alcalinas suaves formando feniltiocarbamilo, el producto es
entonces tratado con cido fluorhdrico para liberar el aminocido que ha reaccionado del resto de
la cadena peptdica mediante la formacin de un derivado de tiazolinona, el cual es convertido a un
derivado ms estable (un aminocido PHT) por la adicin de TFA. Como consecuencia el pptido
tiene ahora un nuevo residuo amino terminal listo para repetir el ciclo. La identificacin de los
PHT-aminocidos es usualmente llevada a cabo por RP-HPLC.
Los pptidos que ya han sido liberados de la columna y que son analizados por esta
metodologa no presentan ninguna consideracin especial, no as cuando el pptido analizado aun
se encuentra adherido a la columna. Debido a que este mtodo requiere del grupo amino libre, los
grupos protectores utilizados en la sntesis para proteger al -amino deben ser removidos o de otra
forma no ser posible analizar el pptido sintetizado mediante la degradacin de Edman. Con
respecto a los grupos protectores de las cadenas laterales, stas slo tendrn un efecto durante la
identificacin del aminocido, ya que los grupos protectores tienden a hacer las cadenas laterales
ms hidrofbicas; por la tanto el gradiente utilizado para eluir los PTH-aminocidos en RP-HPLC
deben extenderse, aunque esto no sucede si tales grupos protectores son derivados de Boc, pues
los aminocidos sern desprotegidos por el uso de TFA durante la fase final.
Los residuos de cistena no pueden ser detectados por este mtodo a menos que sean
modificados, usualmente se utiliza acrilamida o bromopropilamina para derivatizarlos. Cuando el
anlisis es hecho en la resina, estos residuos pueden ser muy problemticos, pues muchos de los
grupos protectores utilizados para cistena durante la sntesis no son estables a la qumica de
Edman. La glutamina se cicla en condiciones cidas para formar una estructura de piroglutamato,
lo que hace que el pptido sea bloqueado y el anlisis de la secuencia no pueda llevarse a cabo.
51
SNTESIS DE PPTIDOS
Electroforesis capilar.
Esta tcnica analtica basada en la separacin de molculas debido a su carga, y en menor
medida en su tamao, es ampliamente utilizada para la caracterizacin de pptidos, sobre todo
cuando es aplicada en combinacin con espectrometra de masas, HPLC y anlisis de aminocidos.
Gracias a los fenmenos de migracin electrofortica y el flujo electroosmtico que interactan, y a
que pueden aplicarse altos voltajes (dado a la capacidad que tiene el capilar para disipar calor),
hacen de sta, una tcnica muy verstil, rpida, eficiente y con una alta capacidad de resolucin.
En la sntesis de pptidos se utiliza para analizar si el producto final no presenta contaminantes
como pptidos con supresiones, o truncados. De igual manera, es utilizada para monitorear
remocin de los grupos protectores, esto es posible debido a que las separaciones en la
electroforesis capilar son llevadas a cabo en condiciones de pH bajo (usualmente un pH entre 2 y 3)
y mientras el pptido est protegido la carga neta del mismo difiere de cuando no lo est. Tambin
es aplicada para observar la formacin o rompimiento de un puente disulfuro, por un cambio en la
forma (ciclacin) del pptido.
Espectrometra de masas.
La espectrometra de masas es una herramienta muy apreciada para el anlisis de pptidos
sintticos, dada su sensibilidad, velocidad y alto grado de especificidad molecular. Las tcnicas de
ionizacin utilizadas para el anlisis de pptidos son el bombardeo rpido de tomos (FAB por sus
siglas en ingls), electrospray (ESI) y desorcin/ionizacin mediante lser asistida por matriz
(MALDI).
FAB. Fue la primera tcnica de ionizacin utilizada para la caracterizacin de pptidos
sintticos. La muestra es ionizada debido al impacto que recibe por un rpido haz de
partculas de xenn. La eleccin de la matriz es determinante para el evento de ionizacin,
toda vez que sirve de mediador de la transferencia de energa hacia el analito y reduce el
dao por radiacin que sufrira irremediablemente el analito en ausencia de la matriz, las
matrices comnmente utilizadas en FAB para el anlisis de pptidos sintticos son glicerol,
tioglicerol y alcohol nitrobenclico.
ESI. Para que los iones sean producidos mediante esta tcnica, se induce a la formacin
de gotas al hacer pasar las molculas en solucin por una boquilla en presencia de un
campo elctrico. Dado que el analito se encuentra disuelto en una sustancia muy voltil, los
iones se forman cuando el solvente se ha evaporado. Ha sido particularmente utilizada para
caracterizar bibliotecas de pptidos.
52
SNTESIS DE PPTIDOS
MALDI. En esta tcnica de ionizacin, los analitos son cocristalizados, por lo general, con
una matriz aromtica. Los iones se forman al irradiar un lser de nitrgeno de 337 nm
sobre la muestra. La matriz acta como intermediaria para transferir energa del lser al
analito, adems juega un papel fundamental en ceder protones al mismo. Las matrices ms
utilizadas son la matriz de cido -ciano-4-hidroxicinmico, para pptidos pequeos y para
pptidos ms grandes la matriz de cido 2-(4-hidroxifenilazol) benzoico.
Todas estas tcnicas de ionizacin son utilizadas para determinar el peso molecular del
pptido sintetizado con gran precisin. Es recomendable determinar el peso molecular del producto
antes de la purificacin, de esta manera, es posible conocer el estado de pureza del producto, si no
existen mezclas de pptidos truncados contaminantes, o si la desproteccin del pptido ha sido
satisfactoria (analizando el producto final, o monitoreando etapas intermedias de la sntesis). En
caso contrario, este anlisis previo por espectrometra de masas, puede dar informacin para volver
a sintetizar el pptido, cambiando las condiciones de desproteccin y/o acoplamiento. Para tener
una mejor caracterizacin del pptido sintetizado, una vez determinado el peso molecular del
producto en crudo, se purifica y se vuelve a determinarse el peso molecular. Adems, gracias a la
espectrometra de masas se puede monitorear la ciclacin de los pptidos por un puente disulfuro,
pues es factible observar la prdida de dos unidades de masa debido a la formacin de este tipo de
enlace.
Tambin es posible determinar la secuencia del pptido sintetizado, esto se lleva a cabo
mediante la espectrometra de masas en tndem, en donde un in producido previamente por una
de las tcnicas antes mencionadas, es disociado por colisiones con un gas. Los iones fragmentados
son obtenidos a partir del rompimiento de los enlaces de la cadena peptdica, generando iones con
el N-terminal y con el C-terminal, y a partir de una serie completa de los iones fragmentados la
secuencia de aminocidos puede ser deducida.
53
SNTESIS DE PPTIDOS
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