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IMPLEMENTACIÓN Y VALIDACIÓN DE UNA METODOLOGÍA ANALÍTICA

PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO (Hg) POR ESPECTROSCOPIA


DE ABSORCIÓN ATÓMICA-VAPOR FRIO EN EL LABORATORIO
AMBIENTAL DE LA CORPORACIÓN AUTÓNOMA REGIONAL DEL CAUCA
C.R.C.

FABIÁN ANDRÉS MUÑOZ PERDOMO

UNIVERSIDAD DEL CAUCA


FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS Y DE LA EDUCACIÓN
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
POPAYAN
2016
IMPLEMENTACIÓN Y VALIDACIÓN DE UNA METODOLOGÍA ANALITÍCA
PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO (Hg) POR
ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ATÓMICA-VAPOR FRIO EN EL
LABORATORIO AMBIENTAL DE LA CORPORACIÓN AUTÓNOMA
REGIONAL DEL CAUCA C.R.C.

FABIÁN ANDRÉS MUÑOZ PERDOMO

Proyecto de Trabajo de Grado en Modalidad de Pasantía


Requisito Parcial Para Optar el Titulo de Químico

DIRECTOR
Ph D. EDIER HUMBERTO PEREZ
DIRECTOR GRUPO DE INVESTIGACION EN AGROQUIMICA

ASESORES
M Sc. ISABEL BRAVO REALPE
Químico. DIEGO ZULUAGA VERA
DIRECTOR LABORATORIO AMBIENTAL C.R.C.

UNIVERSIDAD DEL CAUCA


FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES EXACTAS Y DE LA EDUCACIÓN
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
POPAYAN
2016
Nota de Aceptación
___________________________________

___________________________________

___________________________________

___________________________________

___________________________________

Director ___________________________________
Ph D. EDIER HUMBERTO PEREZ

Jurado ___________________________________
René Zúñiga Rengifo

Jurado ___________________________________
Rodrigo Andrés Sarria

Popayán, 2 Septiembre 2016


DEDICATORIA

Esta tesis se la dedico a Dios quien supo guiarme por el buen


camino, darme fuerzas para seguir adelante y levantarme en los
problemas que se presentaron, por darme fuerza para con el tiempo,
obtener el conocimiento y sabiduría para cumplir esta meta.

Dedico este trabajo de grado a la memoria de mi abuela Evangelina


Muñoz y a mi tía Libia Perdomo, quienes así ya no estén a mi lado,
estarán orgullosas de mí por haberles cumplido la promesa de
conseguir esta meta.
AGRADECIMIENTOS

A Dios todo poderoso por darme la oportunidad de lograr este


triunfo personal, darme salud, sabiduría y entendimiento para
cumplir esta meta.
A mi querida madre Idaly Perdomo Muñoz por ser siempre
incondicional y darme su apoyo, a mi hermano Harold Fernando
Muñoz Perdomo y a mi familia. Gracias por existir y que Dios los
bendiga siempre.
A la Universidad del Cauca y al departamento de Química.
A los profesores Edier Humberto Pérez e Isabel Bravo Realpe por
guiarme, por todas sus atenciones y su valiosa colaboración
prestada para llegar y conseguir mis objetivos trazados.
Al director del laboratorio de la CRC Diego Zuluaga Vera gracias
por abrirme las puertas del laboratorio y haberme dado esta
oportunidad, a Mauricio Vidal, Nayiber Buitrón y Clara Garcés
gracias por brindarme su apoyo y amistad.
A todos mis amigos y compañeros por su apoyo y a todos los
profesores que me brindaron su conocimiento.
A los jurados por su recepción y colaboración en el mismo.
Finalmente quiero agradecer a todas y cada una de las personas que
de una u otra manera fueron partícipes y me brindaron su
colaboración desinteresadamente en la realización de este trabajo.

Muchas gracias por todo.


CONTENIDO

Pág.

1. RESUMEN 13
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 14
3. OBJETIVOS 16

3.1 OBJETIVO GENERAL 16


3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 16

4. FUNDAMENTO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE 17

4.1 NORMATIVIDAD NACIONAL E INTERNACIONAL 19


20
4.2 ACREDITACIÓN
4.3 ESTANDARIZACIÓN 20
4.4 PROCESO DE VALIDACIÓN 21
4.5 FIGURAS DE MERITO ANALÍTICO 21

4.5.1 Exactitud 21
4.5.2 Precisión 22
4.5.3 Linealidad 22
4.5.4 Límite de cuantificación (LOQ) 23
4.5.5 Límite de detección (LOD) 23
4.5.6 Sensibilidad 24
4.5.7 Repetibilidad 24
4.5.8 Precisión Intermedia 24
4.5.9 Incertidumbre 24

4.6 PRUEBAS DE DESEMPEÑO 30


4.7 ANÁLISIS ESTADISTICO 30

4.7.1 Pruebas de normalidad 31


4.7.2 Pruebas paramétricas 31
4.7.3 Pruebas no paramétricas 32
4.7.4 Análisis de regresión lineal simple 33

4.8 DETERMINACIÓN DE METALES POR ESPECTROSCOPIA DE 33


ABSORCIÓN ATÓMICA

4.8.1 Espectroscopia de Absorción Atómica con llama directa 34


4.8.2 Espectroscopia de Absorción Atómica- Vapor Frio 34
4.8.3 Espectroscopia de Absorción Atómica con generador de hidruros 35

4.9 CARACTERISTICAS QUÍMICAS Y DE TOXICIDAD DEL MERCURIO 35

5. METODOLOGÍA 37

5.1 PREVALIDACIÓN 37
5.2 EQUIPOS Y REACTIVOS 38

5.3 VALIDACIÓN 38

5.3.1 Lavado del material 38


5.3.2 Metodología de calibración de material utilizado en la validación. 39
5.3.3 Implementación de metodologías en la determinación de mercurio 39
5.3.4 Validación de la metodología en residuos 40
5.3.5 Preparación de las muestras 40

6. APLICACIÓN DEL MÉTODO 1311 DE LA EPA US SW-846 40

6.1 Determinación del porcentaje de sólidos en el residuo 41


6.2 Determinación de porcentaje de sólidos secos 41
6.3 Evaluación del requerimiento de reducción de tamaño de partículas 41
6.4 Determinación del fluido de extracción de metales en la fase sólida del 42
residuo según su pH
6.5 Preparación de los fluidos de extracción 42
6.6 Metodología de extracción TCLP para la fase sólida del residuo 42
6.7 Análisis de los residuos que contienen un porcentaje de sólidos menor 43
al 0,5%
6.8 Determinación del contenido de mercurio en ambas fases del residuo 43

7. DIGESTIÓN DE LAS MUESTRAS PARA EL ANÁLISIS POR 44


ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ATÓMICA CON GENERADOR
DE HIDRUROS EAA-GH

7.1 DIGESTIÓN DE LOS RESIDUOS LÍQUIDOS Y LOS LIXIVIADOS 44


OBTENIDOS DE LOS SEDIMENTOS PARA LA DETERMINACIÓN Y
ANÁLISIS DE MERCURIO
7.2 ADICIÓN Ó DOPAJE DE LAS MUESTRAS 45
7.3 ANÁLISIS DE MUESTRAS POR EAA CON GENERADOR DE 47
HIDRUROS
7.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS 48

8. RESULTADOS Y ANÁLISIS

8.1 IMPLEMENTACIÓN Y VALIDACIÓN PARA ANÁLISIS DE MERCURIO 48

8.1.1 Linealidad instrumental 49


8.1.2 Precisión instrumental 54
8.1.3 Determinación de límites críticos 56

8.2 VALIDACIÓN DE LA METODOLOGÍA 57

8.2.1 Linealidad 57
8.2.2 Precisión y exactitud de la metodología 61
8.2.3 Validación del método para las muestras de residuos 62
8.2.4 Validación de las muestras con residuos Líquidos 63
8.2.5 Validación de muestras con residuos sólidos 64
8.2.6 Pruebas de desempeño para análisis de mercurio con muestras 65
certificadas
8.2.7 Estimación de la incertidumbre en la determinación de mercurio en 65
residuos mediante la metodología de fuentes globales

9. RESUMEN DE LA METODOLOGÍA VALIDADA 70

10. CONCLUSIONES 71

BIBLIOGRAFIA 73

ANEXOS 77
NDICE DE TABLAS

Pág.

Tabla 1 Codificación de muestras de residuo líquido y sedimentos. 46

Tabla 2 Absorbancia niveles de concentración Vs días curvas de 49


calibración para análisis de linealidad instrumental.

Tabla 3 Evaluación de la normalidad de los datos en función de la 49


concentración.

Tabla 4 Evaluación de la normalidad de los datos en función del día. 50

Tabla 5 ANOVA para absorbancia Vs día. 50

Tabla 6 ANOVA para absorbancia Vs nivel de concentración. 50

Tabla 7 Prueba de Tukey. 51

Tabla 8 Pendientes, interceptos y coeficientes de correlación 52


(Linealidad Instrumental).

Tabla 9 Correlación de Pearson para la regresión lineal de curvas de 53


calibración de la estandarización.

Tabla 10 Resultados obtenidos en la evaluación estadística de la 53


pendiente y el intercepto.

Tabla 11 ANOVA: Regresión lineal en la curva de calibración. 54

Tabla 12 Curvas de calibración bajo condiciones de repetibilidad. 54

Tabla 13 Absorbancias curvas de calibración para análisis de precisión 55


intermedia.

Tabla 14 Precisión instrumental bajo condiciones de repetibilidad y 56


precisión intermedia.

Tabla 15 Cálculo del LOD y LOQ. 56

Tabla 16 Resultados para la determinación experimental LOQ. 57

Tabla 17 Curvas de calibración para muestras reales. 58

Tabla 18 Pruebas de normalidad Vs día muestras reales. 58

Tabla 19 Pruebas de normalidad Vs concentración muestras reales. 58

Tabla 20 ANOVA: Absorbancia vs días para muestras reales. 59


Tabla 21 ANOVA: Absorbancia vs nivel de concentración para 59
muestras reales.

Tabla 22 Prueba de Duncan. 59

Tabla 23 Correlaciones de Pearson curvas de calibración para 60


precisión intermedia.

Tabla 24 Pendiente, intercepto y coeficiente de correlación para las 60


curvas de muestras reales.

Tabla 25 Precisión y exactitud. 61

Tabla 26 Prueba de homogeneidad de varianza para evaluar %R. 61

Tabla 27 Exactitud y precisión para la metodología global en la 62


determinación de Hg con base en la mediana.

Tabla 28 Procedencia y Codificación Interna de las Muestras en el 63


Laboratorio ambiental de la C.R.C.

Tabla 29 Resultado de análisis de residuos líquidos. 64

Tabla 30 Resultado de análisis de residuos sólidos. 65

Tabla 31 Resultados Pruebas de Desempeño y Codificación Interna. 65

Tabla 32 Incertidumbre del método para estándares de residuos 66


líquidos.

Tabla 33 Incertidumbre del método para residuos sólidos. 67

Tabla 34 Reporte de resultados teniendo en cuenta la incertidumbre de 68


la medición por fuentes globales.

Tabla 35 Resumen de la validación para el método implementado y 70


validado.
INDICE DE FIGURAS

Pág.

Figura 1 Ciclo del mercurio. 14

Figura 2 Espectrofotómetro de absorción atómica y generador de 35


hidruros de la CRC.

Figura 3 Lavado del material de vidrio. 38

Figura 4 Extracción y digestión a muestras de sedimentos y aguas 44


para la validación.

Figura 5 Material de referencia certificado para aguas y sedimentos. 47

Figura 6 Respuesta lineal absorbancia Vs concentración. 51

Figura 7 Linealidad y reproducibilidad de las curvas de calibración. 52

Figura 8 Curvas de calibración para repetibilidad. 55

Figura 9 Curvas de calibración para evaluar la linealidad instrumental 60


de la metodología.

Figura 10 Cuantificación para las fuentes de incertidumbre para 67


residuos líquidos.

Figura 11 Cuantificación para las fuentes de incertidumbre para 68


residuos sólidos MS1AD1.

Figura 12 Cuantificación para las fuentes de incertidumbre para 68


residuos sólidos LMS2AD1.
ACRÓNIMOS

AA. Aire-Acetileno.

ANOVA. Análisis de varianza.

b. Intercepto de la curva en el eje Y.

CRC. Corporación Autónoma Regional del Cauca.

CV. Coeficiente de variación.

EAA. Espectroscopia de Absorción Atómica.

EPA. Environmental Protection Agency.

GH. Generador de hidruros ó Generación de hidruros.

gl. Grados de libertad.

Ha. Hipótesis alternativa.

Ho. Hipótesis nula.

ICONTEC. Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación.

IDEAM. Instituto de Hidrología, Metrología y Estudios Ambientales.

IEC. International Electrotechnical Commission.

ISO. International Organization for Standarization.

IT. Instructivo Técnico.

IUPAC. International Union of Pure and Applied Chemistry.

LOD. Límite de detección.

LOQ. Límite de cuantificación.

m. Pendiente de la curva.

NTC. Norma técnica colombiana.

OA. Oxido Nitroso-Acetileno.

ONAC. Organismo Nacional de Acreditación de Colombia.

PEA. Procedimientos de Ensayos de Aguas.

PER. Procedimiento de Ensayo de Residuos.


PES. Procedimientos de Ensayos de Sedimentos.

PGC. Proceso de gestión de calidad.

PNUMA. Programa de las Naciones Unidas Para el Medio Ambiente.

r. Coeficiente de correlación.

r2. Coeficiente de regresión.

RSD. Desviación estándar relativa.

RSDt. Desviación estándar relativa total.

S. Desviación estándar.

Sig. Significancia.

SM. Standard Methods.

SPSS. Statistical Product and Service Solutions.

SRp. Desviación estándar relativa de los recuperados.

SW. Solid Waste`s.

TCLP. Toxicity Characteristic Leaching Procedure.

µ. Incertidumbre.

VF. Vapor frio.


1. RESUMEN

Mediante convenio entre la Universidad del Cauca y el laboratorio ambiental de


la Corporación Autónoma Regional del Cauca C.R.C, se implementó y validó
una metodología analítica para la determinación de mercurio (Hg) por
Espectroscopia de Absorción Atómica-Vapor Frio (EAA-VF) teniendo en cuenta
los niveles permitidos por la norma EPA SW-846 para muestras de aguas y
sedimentos, lográndose contribuir en el proceso de ampliación del alcance de
la acreditación del laboratorio de la C.R.C.

Los procesos de minería del oro mediante la utilización de mercurio, generan


residuos con altos contenidos de este metal pesado, que debe ser retirado
mediante tratamientos antes de su deposición final al ambiente (ley No 1658
del 15 de julio de 2013) [1]. Este trabajo se inició con la elaboración e
implementación de las curvas de calibración de Hg y los respectivos procesos
de digestión para la determinación de la linealidad, repetibilidad y el rango de
trabajo; seguidamente se trabajó con estándares de concentración conocida y
muestras reales teniendo en cuenta las características analíticas típicas en la
validación como son: linealidad, límite de detección, límite de cuantificación,
precisión, exactitud, repetibilidad, reproducibilidad, porcentajes de recuperación
e incertidumbre. Durante la etapa de validación, se obtuvieron de forma
experimental los valores estadísticos que sirvieron como criterios de confianza
del método analítico cumpliendo con la norma ISO/IEC 17025 y procedimientos
del sistema de gestión de calidad del laboratorio.

Las metodologías implementadas cumplen las normas internacionales como


“Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater” y la “EPA”, y
se validaron con muestras de referencia suministradas por el IDEAM como
parte de una prueba de desempeño auditada por dicha entidad para garantizar
resultados analíticos confiables.

Para el análisis de los datos obtenidos se utilizó el paquete estadístico SPSS


versión 22.0 para el respectivo tratamiento y estudio de los resultados.

La metodología validada cumplió con los parámetros estadísticos requeridos


como linealidad y precisión instrumental registrando coeficientes de variación
menores al 3%,determinados en el laboratorio, un límite de cuantificación de
0,35ppb y porcentajes de recuperación entre el 97,26 y 101,62% logrando
validar una metodología sensible y lineal bajo los parámetros trabajados.

13
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La minería del oro en Colombia mediante el uso de mercurio genera lodos,
arenas y desechos que son residuos y generalmente son vertidos a las fuentes
hídricas o depositados en fosas sin tratamiento adecuado que pueden dar
origen a polución con vapor de mercurio o, bajo ciertas condiciones
ambientales la producción de metilmercurio.
Aún se desconoce el porcentaje de mercurio liberado al ambiente durante el
beneficio del oro que se constituye efectivamente en contaminante; sin
embargo, la fuente principal de polución en la industria minera corresponde a
las emanaciones de mercurio gaseoso, mayormente como mercurio metálico
(Hg0) adicionado durante la quema de amalgamas y que se precipita con la
lluvia sobre los suelos circundantes como mercurio divalente (Hg2+); una vez
llega a la superficie del suelo, mediante procesos de oxido-reducción se genera
mercurio elemental gaseoso (Hg0). Según el Programa de las Naciones Unidas
Para el Medio Ambiente PNUMA de 2013 [2], Colombia es uno de los países de
más altas emisiones de mercurio antropogénico por minería de oro (180
ton/año) [3]. La figura 1 muestra el ciclo antropogénico del mercurio donde se
puede ver la incorporación de este metal a las cadenas tróficas por esta vía.
Las principales fuentes antropogénicas del mercurio son la minería, el uso
industrial como catálisis, manufactura de equipos eléctricos, pinturas,
fabricación de plaguicidas etc, y en el uso agrícola en el uso de fungicidas
pasando al ambiente en semillas, raíces, bulbos, e incluso sobre la planta
misma, puede ir a la atmosfera por los vertidos industriales atmosféricos o por
la combustión de carbones, desde donde se introduce en las cadenas tróficas
por el ciclo del agua o bien se inhala directamente. También entra directamente
en el ciclo del agua, mediante el vertido de residuos a las aguas de residuos y
mares, y a través de vertidos industriales y domésticos.

Figura 1. Ciclo del Mercurio

14
El método 1311 (TCLP) de la EPA nos permitió determinar si la parte residual
de los procesos de lixiviación resultantes de la minería en Colombia representa
peligros en base a la concentración de Hg lixiviado, y se aplicará bajo la norma
técnica colombiana NTC-ISO/IEC 17025 [4] analizando las mejores condiciones
para el desarrollo experimental y la estandarización instrumental del equipo de
espectroscopia de Absorción Atómica con generador de hidruros (EAA-GH) con
el fin de llevar a cabo y realizar el proceso de validación y acreditación para el
laboratorio ambiental de la CRC.

15
3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GENERAL

Implementar y validar la metodología para la determinación de mercurio en


agua y sedimentos provenientes de sitios donde se trabaja la minería de oro,
utilizando la técnica analítica de Espectroscopia de Absorción Atómica-Vapor
Frio con generador de hidruros en el laboratorio de la Corporación Autónoma
Regional del Cauca (CRC).

3.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Implementar y validar la metodología 1311 de la EPA SW-846 para la


determinación analítica de Mercurio por Espectroscopia de Absorción
Atómica con Generador de Hidruros (EAA-GH).
 Implementar los procesos de digestión establecidos por el “Standard
Methods” a los lixiviados de sedimentos y aguas superficiales, para la
determinación de Hg por EAA-GH.
 Establecer los parámetros de calidad como: exactitud, precisión
(repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad) límites de detección y
de cuantificación e intervalo lineal para la metodología a validar.
 Elaborar los respectivos protocolos procedimientos de ensayos de
sedimentos (PES) y procedimientos de ensayos de aguas (PEA) tanto para
la digestión como para la determinación de mercurio.
 Realizar el proceso de validación de la metodología debidamente
implementada ante el IDEAM llevándose a cabo mediante las pruebas de
evaluación y desempeño, con muestras certificadas.
 Contribuir con la ampliación del alcance de acreditación del laboratorio
ambiental de la CRC bajo la norma ISO/IEC 17025 mediante la
implementación y validación de la metodología analítica para la
determinación de Hg por EAA-GH.

16
4. FUNDAMENTO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE

El uso de mercurio, para la amalgamación del oro en la minería colombiana, es


una práctica para la explotación aurífera. La amalgama producida entre
mercurio y el oro, es una mezcla no homogénea producida por la alta densidad
de estos metales donde el oro rompe las fuerzas de tensión superficial del
mercurio para quedar atrapado dentro de éste [5].

La minería en Colombia constituye uno de los principales motores económicos,


en los últimos años el país ha intensificado su explotación minera en razón de
la llegada de inversionistas extranjeros por la posición privilegiada como
metalogénico direccionando la importancia del oro hacia el sector minero y en
la economía nacional, donde ha tenido una participación importante desde
1974, cuando el país se acoge a la medida de pagar el oro al precio
internacional del mercado libre.

Los departamentos de mayor producción de oro en Colombia son: Antioquía,


Chocó, Nariño, Caldas, Tolíma y Cauca.

El mercurio es un metal que se caracteriza por ser líquido inodoro a


temperatura ambiente. Es uno de los metales pesados más peligrosos como
contaminante a la salud humana y al medio ambiente, es un componente
natural de la tierra, con una abundancia promedio en la corteza terrestre de
aproximadamente 0,05 mg/kg. Los minerales de mercurio que se extraen
tienen alrededor de 1% de Hg, y, aunque se conocen unos 25 minerales
principales de mercurio, prácticamente los únicos depósitos económicamente
explotables son los de cinabrio (HgS) [6]. El mercurio también está presente en
niveles muy bajos en toda la biosfera. Su absorción por las plantas puede
explicar la presencia de mercurio en combustibles fósiles como carbón,
petróleo y gas, cuyo origen está asociado con la transformación geológica de
residuos orgánicos. Por sus propiedades fisicoquímicas, el mercurio ha sido
utilizado históricamente en múltiples aplicaciones y en varios procesos
productivos como catalizador, en aparatos eléctricos, electrónicos y de
medición, para la extracción de metales, amalgamas dentales, etc. Se ha
utilizado principalmente para la extracción de oro y plata desde la antigüedad.
Se puede encontrar en diversas formas físicas y químicas, existe en el estado
elemental Hg0 y los estados iónicos Hg+1 y Hg+2 donde ha perdido uno y dos
electrones respectivamente.

Una vez que el mercurio ingresa al ambiente como contaminante, es


sumamente nocivo, dada su persistencia; movilidad (en la atmósfera puede
transportarse a largas distancias); capacidad para formar compuestos
orgánicos, bio-acumulación (se acumula en los seres vivos) y bio-magnificación
(aumenta la concentración a medida que se asciende en la cadena trófica); y,
dados sus efectos negativos en la salud humana [7]. Los daños a la salud
incluyen alteraciones permanentes en el sistema nervioso, y en particular al
sistema nervioso en desarrollo. Debido a ello, y al hecho de que el mercurio
puede ser transferido de una madre a su hijo durante el embarazo, los bebés,
niños y mujeres embarazadas, son considerados las poblaciones más

17
vulnerables. La especie más tóxica es el metilmercurio (CH3Hg) en cuyo origen
intervienen bacterias sulfato reductoras en ambientes sedimentarios que
permiten su ingreso a la cadena alimenticia. Sin embargo, este proceso está
controlado por las condiciones ambientales; en ambientes ricos en sulfatos la
producción de sulfuro de hidrógeno inhibe el crecimiento de las bacterias y por
lo tanto la metilación [8].

En Colombia Núñez. A. et al reporta que 24 departamentos enfrentan la


contaminación por mercurio y en especial el área cercana a los Andes, donde
se desarrolla la minería ilegal. En esta investigación se determinó que el nivel
de Hg presente en los ecosistemas acuáticos estudiados supera en 87 veces el
nivel permitido por el propio Estado Colombiano [9]. Según la investigación, se
determinaron niveles de mercurio que oscilan entre los 0.0012-0.0087 mg Hg/L.

Hacia el norte del país, en la región de La Mojana (departamento de Córdoba)


se evaluaron los efectos genotóxicos y su relación con la concentración de
metales pesados (mercurio, cadmio y plomo) en muestras de sangre de la
población expuesta a procesos de contaminación relacionados con la minería
de oro, por la presencia de mercurio en los ríos San Jorge, Magdalena y
Cauca. Las concentraciones de mercurio se establecieron mediante
espectrometría de absorción atómica con vapor frío; encontrando que las
concentraciones de mercurio, en la mayoría de las muestras de sangre del
grupo expuesto, sobrepasaron los límites permisibles según la OMS 2004
(15µg/L Hg) [10].

La contaminación de aguas y sedimentos con mercurio y sus compuestos


constituye un grave problema ambiental, debido a la elevada toxicidad de estas
especies.

Debido al alto riesgo que representan los ambientes contaminados con Hg,
surge la necesidad de tratarlos de manera efectiva, lo cual se puede realizar
utilizando estrategias de saneamiento ambiental tales como la remediación
biológica, que comprende a la bio-, fico-, fito- y rizorremediación, como una
forma de solucionar los problemas que el mercurio y demás metales pesados
traen al ambiente se tiene la fitorremediación como alternativa eficaz y
económica para garantizar que estos residuos sólidos no contengan cargas tan
altas de contaminantes[11].

La fitorremediación es un proceso que utiliza plantas para remover, transferir,


estabilizar, concentrar y/o destruir contaminantes (orgánicos e inorgánicos) en
suelos, lodos y sedimentos, y puede aplicarse tanto in situ como ex situ [12]. Los
mecanismos de fitorremediación incluyen la rizodegradación, la fito-extracción,
la fitodegradación y la fitoestabilización [13].

El guarumo ha sido utilizado como fitorremediador en suelos contaminados por


mercurio donde se ha encontrado que la tasa de remoción de mercurio en
suelo, después de 4 meses de crecimiento, los porcentajes de remoción
estuvieron entre 15,7% y 33,7% debido a la capacidad del guarumo para
acumular grandes cantidades del metal sin presentar efectos tóxicos
considerables, así como al alto contenido de mercurio biodisponible en los

18
suelos contaminados, [14] lo que conllevó también a que el ácido cítrico no
tuviera una influencia significativa sobre la recuperación de Hg; por lo cual se
concluyó, que el guarumo es una especie con capacidad fitorremediadora.

Una alternativa muy prometedora a los métodos tradicionales para el


tratamiento de aguas contaminadas con Hg es la fotocatálisis heterogénea con
dióxido de titanio donde se ha demostrado que es posible con este tipo de
procesos disminuir la concentración de Hg (II) en disoluciones acuosas desde
100ppm hasta valores inferiores a 100ppb. El mercurio eliminado de la
disolución queda depositado en forma de mercurio metálico y calomelano sobre
la superficie del catalizador empleado, a partir del cual puede recuperarse
fácilmente. Además, la posibilidad de utilizar radiación solar en el proceso de
irradiación añade beneficios ambientales al proceso, ya que permite
aprovechar una forma de energía ampliamente disponible.

4.1. NORMATIVIDAD NACIONAL E INTERNACIONAL

Las emisiones y liberaciones de mercurio al medio ambiente debidas a


actividades humanas tales como minería, uso de mercurio en diferentes
procesos y productos químicos, han aumentado notablemente la exposición a
dicho metal, lo cual puede tener importantes efectos adversos para la salud
humana y el medio ambiente. Los perjuicios que ocasiona el mercurio en el
medio ambiente y en el ser humano han hecho que se hayan emprendido
acciones para controlar su producción, usos y emisiones, y gestionar sus
residuos, haciéndose necesario reducir los niveles de mercurio en el medio
ambiente y la exposición de los seres humanos, se ha propuesto reducir la
puesta en circulación de mercurio en el ambiente restringiendo la producción, la
oferta y la demanda, los usos, el mercurio presente en productos, y las
emisiones, teniendo en cuenta también los residuos. Dicha Estrategia ha dado
lugar a formalizar normatividades que rigen su uso y niveles máximos
permisibles para este metal.

 Resolución 2115 de 2007 del ministerio de ambiente y de la


protección social. Las características químicas del agua para consumo
humano de los elementos, compuestos químicos y mezclas de
compuestos químicos diferentes a los plaguicidas y otras sustancias que
al sobrepasar los valores máximos aceptables tienen reconocido efecto
adverso en la salud humana, deben enmarcarse dentro de los valores
máximos aceptables, para el mercurio se toma como valor máximo
permisible 1µg/L.

 Decreto 4741 de 2005 del ministerio de ambiente, vivienda y


desarrollo territorial. Se considera residuo o desecho tóxico aquel que,
al realizársele una prueba de lixiviación para característica de toxicidad
(conocida como prueba TCLP), contiene mercurio además de otros
residuos químicos en concentraciones superiores a los niveles máximos
permisibles en el lixiviado, 0,2mg/L para mercurio.

19
 Normatividad internacional.

La EPA en Estados Unidos: 0,15mg/kg Hg para sedimentos y se han fijado


límites de 2µg/L Hg en agua de consumo humano; se recomienda que los
niveles de mercurio inorgánico en ríos, lagos y corrientes de agua no exceda
144ng/L (partes por trillón) para proteger la salud humana.

ECMDEPQ, 2007 En Canadá: 0,094 mg/kg Hg y 1µg/L para agua potable [15].

4.2. ACREDITACIÓN

La acreditación es la herramienta establecida a escala internacional para


generar confianza sobre la actuación de un tipo de organización que se
denominan de manera general organismos de evaluación de la conformidad y
que abarca a los laboratorios de ensayo, laboratorios de calibración, entidades
de inspección, entidades de certificación y verificadores ambientales. [16] El
proceso de acreditación de un laboratorio ante una organización como el
IDEAM o por el Organismo Nacional de Acreditación de Colombia ONAC
proporciona reconocimiento y mayor confianza y los servicios ofrecidos
garantizan la adopción de un sistema de gestión de calidad a todos sus
procesos organizativos, además asegura su competencia técnica dando peso a
unos resultados satisfactorios. [17, 18, 19]

ISO/IEC 17025 La norma internacional ISO/IEC 17025 fue ratificada por el


consejo directivo en 2005-10-26. En esta norma se establecen los requisitos
generales para la competencia de laboratorios en la realización de muestreos,
ensayos y calibraciones, que al cumplirlos se debe demostrar que funcionan
con un sistema de calidad, que son técnicamente competentes y que están
capacitados para generar resultados válidos y confiables [16]. Esta norma
proporciona herramientas y la estructura para que el laboratorio pueda generar
resultados confiables a sus usuarios mejorando su competitividad y
productividad, además se debe implementar en los laboratorios cuando
desarrollan sistemas de gestión de calidad para sus actividades administrativas
y técnicas y para acreditar, confirmar y reconocer las competencias de los
laboratorios.

4.3. ESTANDARIZACIÓN

Estandarizar consiste en verificar y documentar un método analítico y que éste


conduzca con un alto grado de seguridad, a la obtención de resultados precisos
y exactos dentro de las especificaciones y los atributos de calidad previamente
establecidos como precisión, límite de detección y cuantificación, sensibilidad,
linealidad y exactitud.

La estandarización de las metodologías analíticas, junto a otras actividades


englobadas en la gran área del aseguramiento de la calidad permite conseguir
calidad, otorgando la confianza necesaria a la vez que confiere un grado
elevado de afinidad entre los resultados de los análisis químicos [20].

20
4.4. PROCESO DE VALIDACIÓN

La validación es la obtención de evidencia objetiva de un proceso por medio del


cual se puede concluir de que se cumplen requisitos parciales para ejecutar
dicho proceso, puede incluir procedimientos de muestreo, manejo y transporte
de muestras.[21, 22]

La norma internacional ISO/IEC 17025 no establece el requerimiento de la


validación de métodos normalizados aplicados en un laboratorio específico,
pero sí establece la obtención de datos sobre el rendimiento de su propio uso,
es decir que siempre resulta apropiado contar con ensayos de confirmación,
incluso cuando se utilicen métodos normalizados.

Los métodos normalizados se pueden aplicar directamente obteniéndose


resultados similares a los publicados en el método, pero es común que varíen
los resultados esperados debido a condiciones particulares del laboratorio
como los reactivos, el equipo, el analista y las condiciones climáticas, por tal
motivo, se deben practicar las metodologías propuestas para verificar que su
funcionamiento sea competitivamente aceptable y que el laboratorio tenga las
condiciones requeridas para cumplir el propósito requerido. El laboratorio
ambiental de la CRC tiene Procesos de Gestión de Calidad (PGC) de
validación de metodologías analíticas, que permiten establecer el grado de
validación requerido de acuerdo con los servicios ofrecidos, con las políticas de
calidad, con la naturaleza de los cambios realizados a un método validado o
con las metas de calidad que se haya trazado como parte de los procesos de
mejoramiento continuo del sistema de calidad, adicionalmente cuenta con un
procedimiento de estimación de Incertidumbre con base en fuentes globales[23].

4.5. FIGURAS DE MERITO ANALITICO

Durante el proceso de validación se obtiene evidencia que puede ser tratada


estadísticamente para arrojar resultados o figuras de mérito analítico, que
permiten concluir la funcionalidad de la técnica aplicada. A continuación se
citan dichos parámetros [14, 25, 26].

4.5.1. Exactitud

Refleja la concordancia entre el resultado de una medición y un valor


verdadero. La exactitud mide el error sistemático del método y se puede
expresar en términos del porcentaje de error o porcentaje de recuperación [27,
28]. Es la proximidad entre el resultado de una medición y la media de un

conjunto de datos.

Se puede medir a partir de la comparación de los valores obtenidos por medio


de las metodologías disponibles, respecto a los emitidos por la empresa
proveedora de las soluciones, o por medio del porcentaje de recuperación o de
error [24,25].

21
𝑹𝒆𝒔𝒖𝒍𝒕𝒂𝒅𝒐𝑶𝒃𝒕𝒆𝒏𝒊𝒅𝒐𝑬𝒙𝒑𝒆𝒓𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒂𝒍
% 𝑹𝒆𝒄𝒖𝒑𝒆𝒓𝒂𝒄𝒊ó𝒏 = × 𝟏𝟎𝟎 Ecuación 1
𝑹𝒆𝒔𝒖𝒍𝒕𝒂𝒅𝒐𝑹𝒆𝒂𝒍𝑬𝒔𝒑𝒆𝒓𝒂𝒅𝒐

4.5.2. Precisión

Es la medida del grado de concordancia entre análisis repetidos de una


muestra [27]. Se puede determinar por el grado de reproducibilidad (precisión
intermedia) o de repetibilidad del método analítico bajo condiciones normales
de operación. Los parámetros de calidad de la precisión son: El coeficiente de
variación CV y la desviación estándar S ecuación 2 y ecuación 3
respectivamente [21, 24].

Una forma de expresarla es calculando el coeficiente de variación, el cual


proporciona una interpretación porcentual del grado de variabilidad de la
desviación estándar.

𝑺
𝑪𝑽 = 𝑿 × 𝟏𝟎𝟎 Ecuación 2

Donde 𝑿 es el valor medio obtenido de una serie de datos y la desviación


estándar, S, expresa la desviación de los valores con respecto el valor medio.

𝒏
∑ (𝑿𝒊 −𝑿) 𝟐
𝑺 = √ 𝒊=𝟏𝒏−𝟏 Ecuación 3

Donde 𝑿𝒊 es el valor individual obtenido para cada una de las diferentes


determinaciones y n es el número de determinaciones o repeticiones.

4.5.3. Linealidad

Es el grado de proporcionalidad directa entre un par de variables de un método


analítico. Generalmente se reporta como la variación de la pendiente de la
línea de regresión [24,25,29]. Para medirse se realiza una “curva de calibración”
con la cual se establece la proporcionalidad existente entre la concentración y
la respuesta del método analítico, es calculada por el método de ajuste de
mínimos cuadrados (Ecuación 4).

𝒚 = 𝒎𝒙 + 𝒃 Ecuación 4

Dónde x, es la concentración del analito; m es la pendiente de la recta; y es la


respuesta del método (absorbancia) y b es el intercepto con el eje y. Los
términos my b se calculan a través de las ecuaciones 5 y 6.

22
∑𝒙∑𝒚
∑ 𝒙𝒚−
𝒏
𝒎= (∑ 𝒙)𝟐
Ecuación 5
𝟐
∑𝒙 −
𝒏

∑ 𝒚−𝒎 ∑ 𝒙
𝒃= Ecuación 6
𝒏

Donde n: es el número de soluciones patrón. Se calcula además el coeficiente


de regresión (r2) el cual refleja el grado de ajuste de los puntos a la recta, y el
coeficiente de correlación o proporcionalidad (r), que demuestra la relación
entre las variables.

Finalmente, la viabilidad del método de curva de calibración queda establecida


por el valor del cuadrado del coeficiente de determinación, el cual debe ser
superior a 0,995 [17].

4.5.4. Límite de cuantificación

Es la menor concentración de un analito o sustancia en una muestra que puede


ser cuantificada con precisión y exactitud aceptables bajo las condiciones en
que se lleva a cabo el método. El LOQ se expresa mediante la ecuación 7 [24, 25,
29].

𝟏𝟎𝑺𝒃
𝑳𝑶𝑸 = Ecuación 7
𝒎𝒑𝒓𝒐𝒎𝒆𝒅𝒊𝒐

Donde mpromedio es el promedio de las pendientes de las curvas de calibración


realizadas; Sb es la desviación estándar promedio de los interceptos de las
curvas y se puede estimar ya sea por el análisis de un numero apropiado de
muestras de blanco (muestra sin analito o con concentración cercana a cero) o
a partir de los interceptos de las curvas realizadas.

4.5.5. Límite de detección [21, 30]

El límite de detección se define como la menor concentración de un elemento


en la solución que se puede detectar con un 95% de certeza, por lo tanto, la
concentración que produce una desviación igual a 3 veces la desviación
estándar de un conjunto de lecturas se puede definir como el límite de
detección. Históricamente se ha definido como la concentración de un analito
que produce la desviación de la línea base de un registrador gráfico que es
igual al doble del pico de la línea base. Este parámetro es una cifra teórica y no
debería tratar de medirse rutinariamente. También es definido como se observa
en la Ecuación 8.

23
𝟑 𝑺𝒃
𝑳𝑶𝑫 = Ecuación 8
𝒎𝒑𝒓𝒐𝒎𝒆𝒅𝒊𝒐

Donde Sb es la desviación estándar promedio de los interceptos de las curvas


realizadas y mpromedio es el promedio de las pendientes de las curvas de
calibración realizadas.

4.5.6. Sensibilidad [26,27].

Es la medida de la capacidad del instrumento para detectar pequeñas


variaciones en la concentración de un analito y se expresa como la pendiente
de la curva de calibración. Como valor se puede utilizar el promedio de las
pendientes obtenidas en las rectas de los ensayos de estandarización,
indicando su desviación estándar o CV. Se considera que a mayor pendiente,
mayor sensibilidad y que mientras más pequeño sea el coeficiente de variación
de la pendiente mayor será la linealidad.

4.5.7. Repetibilidad

Refleja la precisión de un método, cuando se desarrolla bajo las mismas


condiciones, utilizando la misma muestra homogénea, analizada por el mismo
analista, en el mismo laboratorio, con los mismos equipos y reactivos y durante
una misma sesión de trabajo en un período corto de tiempo (mismo día). El
parámetro estadístico que caracteriza a este estudio es la desviación estándar
o preferiblemente el coeficiente de variación [21, 30].

4.5.8. Precisión Intermedia

Resultados obtenidos dentro del laboratorio por el mismo analista, con los
mismos equipos, en un intervalo largo de tiempo (días distintos) y con la misma
muestra homogénea [24, 25].

4.5.9. Incertidumbre

La palabra “incertidumbre” significa duda, y por lo tanto, en un sentido más


amplio “incertidumbre de medición” significa duda en la validez del resultado de
una medición. La incertidumbre es un parámetro asociado con el resultado de
una medición que caracteriza la dispersión de los valores, que en forma
razonable se le podría atribuir a una magnitud por medir [24, 31].

 Incertidumbre tipo A (µ𝒊 ): Es aquella que puede ser evaluada a partir


de distribuciones estadísticas de una serie de observaciones (n). Se
expresa en términos de la desviación estándar (ecuación 9)[32].
𝒔𝒊
µ𝒊 = Ecuación 9
√𝒏

24
 Incertidumbre tipo B: Es aquella que se obtiene mediante el uso de
información externa u obtenida por experiencia. Estas fuentes de
información pueden ser: certificados de calibración, manuales del
instrumento de medición, especificaciones del instrumento, normas o
literatura, valores de mediciones anteriores, conocimiento sobre las
características o el comportamiento del sistema de medición [32].

 Trazabilidad: Propiedad del resultado de una medición o del valor de un


patrón, por la cual pueda ser relacionado a referencias determinadas,
generalmente patrones nacionales o internacionales, por medio de una
cadena ininterrumpida de comparaciones, teniendo todas incertidumbres
determinadas.

 Incertidumbre Estándar: Incertidumbre del resultado de una medición


expresada como una desviación estándar [30, 32, 33].

 Incertidumbre Estándar Combinada: Es la incertidumbre estándar del


resultado de una medición, cuando el resultado se obtiene a partir de los
valores de algunas otras magnitudes, igual a la raíz cuadrada positiva de
una suma de términos, siendo esto las varianzas o covarianzas de esas
otras magnitudes ponderadas de acuerdo a como varían los resultados
de la medición con estas cantidades [30, 32, 33].

 Incertidumbre Expandida: Magnitud que define un intervalo en torno al


resultado de una medición, que puede esperarse para abarcar una
fracción grande de la distribución de los valores que podrían
razonablemente ser atribuidos al mensurando. La incertidumbre
expandida se calcula multiplicando por un factor de cobertura (k= 2) la
incertidumbre combinada. Con lo cual se obtiene un nivel de confianza
de 95,0% aproximadamente.

 Calibración: Conjunto de operaciones que establecen, bajo condiciones


específicas, la relación entre los valores de una magnitud indicados por
un instrumento o sistema de medición, o los valores representados por
una medida materializada y los valores correspondientes de la magnitud,
realizados por los patrones.

Pasos en el proceso de evaluación de la incertidumbre

Expresar matemáticamente la relación entre la magnitud 𝒀 y magnitudes de


entrada 𝑿𝒊 . (Ecuación 10)

𝒀 = 𝒇(𝑿𝟏 , 𝑿𝟐 , … , 𝑿𝒏 ) Ecuación 10

Determinar el valor 𝑿𝒊 de cada una de las magnitudes de entrada 𝑿𝒊


mencionados anteriormente.

Evaluar la incertidumbre estándar 𝑼(𝑿𝒊 ) con que fue determinado cada valor 𝑿𝒊
e identificar fuentes de incertidumbre.

25
Existen 2 tipos de incertidumbre estándar:

 Evaluación de la Incertidumbre Estándar Tipo A. Se denomina


“incertidumbre estándar” 𝑼𝒊 , a la desviación estándar experimental del
valor medio de una serie de mediciones 𝑺(𝑿𝒊 ).

𝑺∗(𝑿𝒊 )
𝑼𝒊 = Ecuación 11
√𝒏

Donde 𝒏 es el número de mediciones efectuadas.

𝑺∗(𝑿𝒊 ) 𝟏 ∑𝒏 ̅
𝒋=𝟏 𝑿𝒊 𝑱−𝑿𝒊 𝑱
𝑼𝑨(𝑿 ) = = √𝒏−𝟏 ∗ Ecuación 12
𝒊 √𝒏 √𝒏

Donde:

𝑿𝒊 𝑱 Es el valor de la magnitud 𝑿𝒊 en la medición 𝑱.


̅ 𝒊 𝑱 Es el valor medio de los valores obtenidos para la magnitud 𝑿𝒊 con 𝑱=1
𝑿
hasta 𝒏.

 Evaluación de la Incertidumbre Estándar Tipo B. Cuando la


incertidumbre no se obtiene a partir de valores obtenidos en una serie de
mediciones si no de informaciones preexistentes de diferente tipo,
decimos entonces que se trata de una incertidumbre tipo B.

Según la fuente de la que se obtiene esa incertidumbre tipo B, ésta se


estimará de distinta manera. Algunos ejemplos de evaluación tipo B son:

Caso 1: La incertidumbre asciende a la resolución de un instrumento de medida


y se expresa mediante la ecuación 13

𝑹𝒆𝒔𝒐𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏
µ𝑩.𝑹𝑬𝑺𝑶𝑳𝑼𝑪𝑰Ó𝑵 = Ecuación 13
𝟐∗√𝟑

Caso 2: La especificación de incertidumbre de un elemento de medición se


indica respecto de un nivel de confianza. En este caso la incertidumbre
expandida se divide por el factor de cobertura especificado en el certificado de
calibración (ecuación 14).
𝒖𝑬
µ𝒄𝑩 = Ecuación 14
𝒌

Caso 3: La especificación de incertidumbre no es explicita si no que se da un


límite máximo para el error del instrumento (+/- a). En este caso el analista
debe asociar a la variable aleatoria (a) con una distribución a priori, distribución
triangular (ecuación 15) o rectangular (ecuación 16) de probabilidad.

26
𝒂
µ𝑩 = Ecuación 15
√𝟔

𝒂
µ𝑩 = Ecuación 16
√𝟑

Igualmente se evalúan las covarianzas asociadas a todas las magnitudes que


estén correlacionadas, calcular el valor de medición “y” de la magnitud “Y”,
utilizando las estimaciones 𝑋𝑖 , determinar la incertidumbre estándar compuesta
𝑈𝑐(𝑦) a partir de las incertidumbres estándar y de las covarianzas asociadas a
las magnitudes de entrada, hallar el numero efectivo de grados de libertad 𝛾𝐸𝑓 y
determinar mediante la fórmula de WELCH-SATTERTH WAITE (ecuación 17):

𝑼𝟒𝑪(𝒚)
𝜸𝑬𝒇 = 𝑼𝒊(𝒚) Ecuación 17
∑𝒏
𝒊=𝟏 𝜸𝒊

Donde:

i= Numero efectivo de grados de libertad de cada contribución 𝑈𝑖(𝑦) , cuyo valor
se obtiene aplicando las siguientes reglas:

i= n –1 Para evaluaciones tipo A


i=  Cuando se apliquen distribuciones rectangulares.
i= 50 si se deduce de una distribución normal.

Se debe entonces multiplicar la incertidumbre estándar compuesta𝑈𝑐(𝑦) por el


factor k de cobertura correspondiente al número efectivo de grados de libertad
(𝛾𝐸𝑓 ) y de nivel de confianza deseado.

Cálculo de la Incertidumbre Teniendo en Cuenta las Fuentes Globales de


Incertidumbre

Se calcula con base en los resultados de evaluaciones de repetibilidad,


reproducibilidad y exactitud, de la siguiente forma:

Se calcula inicialmente el promedio de los resultados obtenidos tanto a


concentraciones bajas de analíto, como a altas concentraciones mediante la
ecuación 18.

∑ 𝑿𝒊
𝑿𝒑𝒓𝒐𝒎 = Ecuación 18
𝒏

Se calcula la desviación de los resultados obtenidos aplicando ecuación 19

𝟐
∑(𝑿𝒊 −𝑿𝒑𝒓𝒐𝒎 )
𝑺=√ (𝒏−𝟏)
Ecuación 19

27
Posteriormente se calcula la desviación estándar relativa de cada grupo de
datos Ecuación 20.

𝑺
𝑹𝑺𝑫 = 𝑿 Ecuación 20
𝒑𝒓𝒐𝒎

Finalmente mediante ecuación 21 se calcula la Desviación Estándar Relativa


del total de datos (RSDt)

𝟐 𝟐
𝑺 𝑺
((( 𝟏 ) 𝑿(𝒏−𝟏))+(( 𝟐 ) )𝑿(𝒏−𝟏))
√ 𝑿𝒑𝟏 𝑿𝒑𝟐

𝑹𝑺𝑫𝒕 = (𝒏−𝟏)𝟏 +(𝒏−𝟏)𝟐


Ecuación 21

Y adicionalmente se calcula la recuperación en función de porcentajes (%R) de


los patrones con base en la ecuación 22

𝑪𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒊ó𝒏𝑬𝒙𝒑𝒆𝒓𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒂𝒍𝑶𝒃𝒕𝒆𝒏𝒊𝒅𝒂
%𝑹 = ∗ 𝟏𝟎𝟎 Ecuación 22
𝑪𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒊ó𝒏𝑹𝒆𝒂𝒍𝑷𝒓𝒆𝒑𝒂𝒓𝒂𝒅𝒂

Se calcula el promedio de los porcentajes de recuperación con ecuación 23

̅ 𝒑 = ∑ %𝑹𝒊
𝑹 Ecuación 23
𝒏

La desviación estándar de los recuperados (SRp) con ecuación 24

𝟐
∑(𝑹𝒊 −𝑹𝒑𝒓𝒐𝒎 )
𝑺𝑹𝒑 = √ (𝒏−𝟏)
Ecuación 24

También se debe calcular la incertidumbre en la recuperación promedio,


mediante la ecuación 25:

𝑺𝑹𝒑
𝑼𝑺𝑹𝒑 = Ecuación 25
√𝒏

Se evalúa si el factor de recobro es significativamente diferente de 1 para un


nivel de significancia (a) del 5% y un nivel de confianza del 95%, para (n-1)
grados de libertad (gl). Para determinar si hay diferencia estadísticamente
significativa entre el valor obtenido de recuperación y 1.

Se establece la hipótesis nula (𝑯𝒐 ). El factor de recobro es significativamente


diferente de 1.
28
Se calcula el t experimental (𝒕𝒆𝒙𝒑 ) y se compara con el t critico (𝒕𝒄𝒓𝒊𝒕 ).

Si 𝒕𝒆𝒙𝒑 >𝒕𝒄𝒓𝒊𝒕 se rechaza la 𝑯𝒐 .

Si 𝒕𝒆𝒙𝒑 <𝒕𝒄𝒓𝒊𝒕 se acepta la 𝑯𝒐 .

|𝑹 − 𝟏| ∗ √𝒏
𝒕𝒆𝒙𝒑 =
𝑺

Donde texp es el t experimental; R es el factor de recobro experimental; S es la


Desviación estándar y n es el número de datos.

La incertidumbre se calcula mediante las ecuaciones 26, 27 y 28.

Incertidumbre Combinada Total (𝑼𝒄𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 ).

𝑼𝑹𝒑 𝟐
𝑼𝒄𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍 = √(( 𝑹𝒑 ) + 𝑹𝑺𝑫𝒕𝟐 ) Ecuación 26

Incertidumbre Expandida del Método (𝑼𝒆𝒙𝒑 𝒎𝒆𝒕) (±)

𝑼𝒆𝒙𝒑 𝒎𝒆𝒕 = 𝟐 ∗ 𝑼𝒄𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍 Ecuación 27

La incertidumbre expandida en la medición 𝑼(±) se expresa:

𝑼 = ∓𝑪 ∗ 𝑼𝒆𝒙𝒑𝒎𝒆𝒕 Ecuación 28

4.6. PRUEBAS DE DESEMPEÑO

La prueba de evaluación de desempeño consiste en el análisis de muestras


certificadas, en algunos casos con dos niveles de concentración diferentes por
cada parámetro. La calidad de las muestras adquiridas se garantiza mediante
la adquisición a proveedores acreditados internacionalmente para la producción
de muestras certificadas bajo las guías ILAC G13 e ISO/IEC Guide 43-1. Los
valores de referencia que se utilizarán para la evaluación de los resultados
reportados son certificados por el proveedor, se refiere a la evaluación
periódica del desempeño de laboratorios individuales y grupos de laboratorios
las cuales se realizan mediante la distribución de materiales típicos por un
organismo de prueba independiente, para que sean analizados por los
participantes sin supervisión [30].

29
Mediante este tipo de pruebas de evaluación de desempeño se evidencia la
competencia técnica que cada uno de los laboratorios que participan tiene
sobre las metodologías analíticas y a su vez estas pruebas constituyen un
requisito para acceder y mantener la acreditación otorgada por el IDEAM, en la
cual se debe participar como mínimo una vez al año. Estas pruebas ayudan a
resaltar el desempeño de la reproducibilidad entre laboratorios y los errores
sistemáticos, es decir, el sesgo.

Las pruebas de desempeño y otros tipos de inter-comparaciones se aceptan


como medios importantes para dar seguimiento a la trazabilidad a niveles
nacionales e internacionales. Los cuerpos de acreditación reconocen el
beneficio de estos esquemas y alientan a los laboratorios a participar en
pruebas de aptitud como parte integral de sus protocolos de aseguramiento de
calidad. Es importante dar seguimiento a los resultados de estas pruebas como
una forma de verificar el aseguramiento de calidad y tomar las acciones
necesarias. En ciertos casos, los cuerpos de acreditación pueden especificar la
participación en un esquema de prueba de aptitud en particular, como un
requisito para la acreditación [18].

4.7. ANALISIS ESTADISTICO

Este análisis se realizara mediante el paquete estadístico SPSS versión 22.0,


un software que facilita el análisis estadístico de los datos, como su ilustración
gráfica. Entre las pruebas más utilizadas aplicadas para el análisis de datos
están:

4.7.1. Pruebas de Normalidad

La distribución normal es, probablemente, la distribución teórica más


importante en estadística y sirve como punto de referencia para describir cómo
se distribuyen muchos de los datos de los análisis que realizamos. Se utilizan
dos pruebas, la de Shapiro-Wilk para un tamaño de muestra menor o igual a
50, y la prueba de Kolmogorov-Smirnof que se utiliza para un mayor número de
datos, mayores a 50. Ambas pruebas permiten contrastar la hipótesis nula de
que los datos de los resultados de los análisis proceden de poblaciones
normales. Rechazaremos la hipótesis de normalidad cuando el nivel crítico o
significancia (Sig.) sea menor que el nivel de significación establecido
(generalmente 0,05). Cuando los valores presentan una distribución normal, se
acepta la hipótesis nula y se aplican pruebas paramétricas. Cuando ocurre lo
contrario, se aplican pruebas no paramétricas.

4.7.2. Pruebas Paramétricas

Son pruebas de hipótesis estadísticas que asumen cierto comportamiento de


muestras obtenidas aleatoriamente, distribución normal de las observaciones y
donde existe un parámetro de interés que buscamos estimar. Son un tipo de
pruebas de significación estadística que cuantifican la asociación o

30
independencia entre una variable cuantitativa y una categórica. Las pruebas
paramétricas exigen ciertos requisitos previos para su aplicación: la distribución
normal de la variable cuantitativa en los grupos que se comparan y la
homogeneidad de varianzas en las poblaciones de las que proceden los
grupos.

 Análisis de Varianza (ANOVA) de un Factor: El análisis de la varianza


permite contrastar la hipótesis nula de que las medias de K poblaciones
(K >2) son iguales, frente a la hipótesis alternativa de que por lo menos
una de las poblaciones difiere de las demás en cuanto a su valor
esperado. Este contraste es fundamental en el análisis de resultados
experimentales, en los que interesa comparar los resultados de K
'tratamientos' o 'factores' con respecto a la variable dependiente o de
interés, la hipótesis es evaluada de la siguiente forma: Si el nivel crítico
asociado al estadístico F es menor que 0,05, se rechaza la hipótesis de
igualdad de medias y se concluye que no todas las medias
poblacionales comparadas son iguales. En caso contrario, no se puede
rechazar la hipótesis de igualdad y no se puede afirmar que los grupos
comparados difieran en sus promedios poblacionales. En otras palabras,
nos ayuda a comparar varios grupos en una variable cuantitativa. A la
variable categórica (nominal u ordinal) que define los grupos que
deseamos comparar la llamamos independiente o factor. A la variable
cuantitativa (de intervalo o razón) en la que deseamos comparar los
grupos la llamamos dependiente [24, 25, 31].

 Prueba de Tukey – Prueba de Duncan: Son test de comparaciones


múltiples. Permiten comparar las medias de los t niveles de un factor
después de haber rechazado la hipótesis nula de igualdad de medias
mediante la técnica ANOVA. Todos los test de comparaciones múltiples
son test que tratan de perfilar, tratan de especificar, tratan de concretar
una hipótesis alternativa genérica como la de cualquiera de los test
ANOVA.

 Prueba T: Esta Prueba permite contrastar hipótesis con base a una


media poblacional, ajustándose a un modelo de distribución de
probabilidad t de student cuando la población muestreada es normal. La
realización de esta prueba con el paquete estadístico SPSS permite
contrastar dos muestras independientes o relacionadas según sea el
caso.

Prueba T Para Muestras Independientes: Permite contrastar hipótesis referidas


a la diferencia entre dos medias independientes. Si la probabilidad asociada al
estadístico de Levene es mayor que 0,05, podremos suponer que las varianzas
poblacionales son iguales; si la probabilidad asociada al estadístico de Levene
es menor que 0,05, rechazaremos la hipótesis de igualdad de varianzas y
supondremos que son distintas.

Prueba T Para Muestras Relacionadas: Permite contrastar hipótesis referidas a


la diferencia entre dos medias relacionadas. Si el valor del nivel crítico ˂ 0,05
se rechaza la hipótesis de igualdad de medias.

31
 Coeficiente de Correlación de Pearson (r): Es una prueba paramétrica
que mide el grado de asociación lineal entre dos variables cuantitativas,
tomando valores entro -1 y +1. Los valores próximos a +1 indican una
fuerte asociación lineal positiva; los valores próximos a -1 indican una
fuerte asociación lineal negativa; valores próximos a 0 indican que no
existe asociación lineal entre las variables [25].

4.7.3. Pruebas No Paramétricas

Una prueba no paramétrica es una prueba de hipótesis que no requiere que la


distribución de la población se caracterice en función de determinados
parámetros. Por ejemplo, numerosas hipótesis se basan en el supuesto de que
la población sigue una distribución normal con los parámetros μ y σ. Las
pruebas no paramétricas no tienen este supuesto, de modo que son útiles
cuando sus datos sean firmemente no normales y resistentes a
transformaciones.

Sin embargo, las pruebas no paramétricas no están completamente exentas de


supuestos sobre los datos. Por ejemplo, las pruebas no paramétricas requieren
que los datos sean una muestra aleatoria independiente. Se aplican a una gran
variedad de situaciones, ya que no se requiere que cumplan ciertas
condiciones como lo es el de la distribución normal de los datos como es el
caso de los métodos paramétricos. Los resultados estadísticos se obtienen de
procedimientos de ordenación o en otros casos de recuento, donde el
parámetro de centralización es la mediana que se define como un punto donde
el valor de X está el 50% de las veces por debajo y el 50% por encima. Como
pruebas no paramétricas se tiene:

 Prueba de Kruskal Wallis: Es un método para probar si un grupo de


datos proviene de la misma población. Esta prueba es paralela al
ANOVA con los datos reemplazados por categorías. Para determinar las
diferencias significativas se aplica la prueba U de Mann-Whitney.

 Prueba de U Mann Whitney: Es una excelente alternativa a la prueba t


sobre diferencia de medias cuándo:

1) no se cumplen los supuestos en los que se basa la prueba t (normalidad y


homocedasticidad).

2) no es apropiado utilizar la prueba t porque el nivel de medida de los datos es


ordinal.

 Coeficiente de Correlación de Spearman (Rho): Es una prueba que


mide la asociación o interdependencia entre dos variables discretas
medidas, al menos una de ellas, en escala ordinal. Los valores próximos
a +1 indican una correlación fuerte y positiva. Los valores próximos a -1
indican una correlación fuerte y negativa. Los valores próximos a 0
indican que no hay correlación lineal.

32
4.7.4. Análisis de Regresión Lineal Simple

En estadística, la regresión lineal o ajuste lineal es un modelo matemático


usado para aproximar la relación de dependencia entre una variable
dependiente Y, las variables independientes Xi y un término aleatorio ε. El
procedimiento implica, básicamente, obtener la ecuación mínimo-cuadrática
que mejor expresa la relación entre la variable dependiente y la variable
independiente y estimar mediante el coeficiente de determinación la calidad de
la ecuación de regresión obtenida [24].

4.8. DETERMINACIÓN DE METALES POR ESPECTROSCOPIA DE


ABSORCIÓN ATÓMICA

La espectroscopia de absorción atómica EAA es una técnica donde por un


fenómeno fisicoquímico, los átomos de los metales absorben energía
proveniente de la radiación ejercida por una lámpara de cátodo hueco fabricada
con un cátodo del metal de interés. Esta técnica se fundamenta en la
capacidad que tienen los elementos, en su estado atómico basal, de absorber
radiación electromagnética a longitudes de onda específica para cada
elemento. La cantidad de energía absorbida es directamente proporcional a la
concentración de los átomos del metal analizado, de acuerdo con la Ley de
Lambert-Beer; los límites de detección logrados son del orden de partes por
millón (ppm). En esta técnica, los metales disueltos son llevados a su forma
atómica elemental mediante calentamiento por una llama generada por una
mezcla de gases combustibles. Las mezclas más empleadas son: aire-
acetileno (AA) y óxido nitroso-acetileno (OA). Las temperaturas de la llama van
de 1900 °C a 2800 °C. Los átomos en forma de nube gaseosa, son irradiados
por un haz de luz de una longitud de onda específica, de acuerdo con el metal
analizado; esto se logra mediante el empleo de lámparas con cátodo del metal
de interés o con lámparas de descarga sin electrodo. Los átomos absorben una
fracción de la radiación proveniente de la lámpara y la fracción restante es
captada por un foto-detector y un dispositivo transductor, que la convierten en
una señal eléctrica, que posteriormente es registrada por un software. El valor
de señal obtenido es proporcional a la concentración de los átomos presentes
en la nube de gases; de este modo es posible construir una curva de
calibración analizando soluciones patrón de concentración conocida y midiendo
la magnitud de la absorción de cada una de ellas.

En la determinación cuantitativa de metales, se hace necesario lograr una


disolución homogénea de los metales presentes en la matriz de estudio, como
lo es en este caso matrices de residuos sólidos y líquidos, para posteriormente
utilizar un método analítico de EAA adecuado para su determinación. La
disolución total de metales se puede lograr aplicando un tratamiento a la matriz
en medio ácido y calor o digestión [34, 35]. Los ácidos comúnmente usados en
dicho proceso son el HNO3, HCl, y el H2SO4, su mezcla o su uso con agentes
oxidantes neutros como el peróxido H2O2, persulfato de potasio K2S2O8 y el
permanganato de potasio KMnO4, produce una oxidación y degradación total
de la materia orgánica presente en las matrices sólidas y coloides presentes en
las matrices líquidas. Las condiciones de digestión utilizadas para la

33
degradación de las diversas matrices influyen en el grado de disolución de los
metales presentes en la matriz. La digestión puede realizarse en un recipiente
abierto o en un sistema a reflujo o en equipos de digestión que utilizan las
ondas microondas [25,29,], como fuente de energía para calentar la mezcla de
ácidos y la muestra, dentro de un recipiente cerrado. Esta metodología permite
lograr una digestión más eficiente de las muestras gracias a la combinación de
presión alta y temperatura alta [25].

4.8.1. Espectroscopía de Absorción Atómica con Llama Directa (EAA-Ll)

La Espectroscopia de Absorción Atómica por llama directa, es una técnica


analítica que permite la detección y la cuantificación de metales en solución
haciendo de esta técnica la indicada para determinar elementos alcalinos,
alcalinotérreos y metales pesados presentes en cualquier tipo de muestra a la
cual sea posible transformar a una matriz soluble [29].

4.8.2. Espectroscopía de Absorción Atómica - Vapor Frio (EAA-VF)

Esta es una técnica aplicable solamente a la determinación de mercurio, ya que


es el único elemento metálico de la tabla periódica con la característica
especial de ser líquido y a que tiene una alta presión de vapor a temperatura
ambiente. Existen numerosas formas químicas de mercurio, incluyendo
vapores de mercurio elemental (Hg), cationes mercurioso (Hg (I)), mercúrico
(Hg (II)) y compuestos de mercurio orgánico [35]. Con este método todo el
mercurio en forma iónica es reducido para formar vapor de mercurio elemental
usando un reductor como el cloruro estañoso SnCl2, bajo condiciones estándar
de reacción [36]. Los átomos de mercurio en vapor absorben la radiación de la
lámpara de mercurio para su determinación por EAA-VF, donde el flujo del
vapor de mercurio transportado por el gas a una celda dual situada a lo largo
del paso óptico del espectrofotómetro el cual estando acoplado al equipo de
generación de hidruros (figura 2), me permite cuantificar por Absorción Atómica
a 253,7nm de longitud de onda.

Figura 2. Espectrofotómetro de Absorción Atómica y generador de hidruros de la CRC.


Fuente: Fabián Andrés Muñoz Perdomo

34
4.8.3. Espectroscopía de Absorción Atómica con Generador de Hidruros
(EAA-GH)

Esta técnica permite cuantificar en el orden de ppb o ultra trazas elementos


como As, Se, Hg, Sn, Sb, Ge, Bi y Te, que tiene la propiedad de formar el
hidruro correspondiente, elementos que son difíciles de volatilizar con una
llama u horno de grafito, o que generan vapores como en el caso del Hg [37]. La
generación de vapor aumenta la sensibilidad de la técnica de absorción
atómica, especialmente en estos elementos que tienen importancia como
contaminantes ambientales o en toxicología [38]. La muestra disuelta en acido
diluido [39] se mezcla con un agente reductor, tal como una solución de zinc y
acido clorhídrico, cloruro de estaño (SnCl2) o boro hidruro de sodio (NaBH4).
Una vez formado el hidruro gaseoso éste es separado de la solución y
transportado por un gas portador hasta una celda de cuarzo, donde es
calentado produciéndose la descomposición térmica (atomización). Como la
celda está en el paso óptico de la radiación emitida por la lámpara de cátodo
hueco, se produce una absorción de la luz por parte de los átomos del analito
que será proporcional a su concentración.

4.9. CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS Y DE TOXICIDAD DEL MERCURIO

El mercurio tiene unas características químicas que son perjudiciales


toxicológicamente para el ser humano, su exposición a elevadas
concentraciones, se debe a la contaminación de matrices ambientales debido a
los residuos depositados en suelos, sin una previa caracterización toxicológica
que permita establecer un tratamiento adecuado antes de su desecho. La
toxicidad del mercurio depende de su forma química y, por lo tanto, los
síntomas y signos varían según se trate de exposición al mercurio elemental, a
los compuestos inorgánicos de mercurio, o a los compuestos orgánicos de
mercurio (en particular los compuestos de alquilmercurio como sales de
metilmercurio y etilmercurio, y el dimetilmercurio). Las fuentes de exposición
también varían notablemente de una a otra forma de mercurio. En cuanto a los
compuestos de alquilmercurio, de los cuales el metilmercurio es, el más
importante, la fuente de exposición más significativa es la dieta a base de
pescados y mariscos. En el caso del vapor de mercurio elemental, la fuente
más importante para la población en general son las amalgamas dentales, pero
a veces la exposición en el ambiente de trabajo puede ser mayor.

El mercurio se encuentra en el aire, el agua y el suelo, la forma principal de


mercurio en la naturaleza es el cinabrio (HgS), el que constituye la principal
fuente de obtención de este metal. Otras formas minerales incluyen la
corderoita (Hg3S2Cl2), la livingstonita (HgSb4S8), y formas supergénicas tales
como el mercurio nativo (Hg0), el calomelano (HgCl2), y la schuetteita
(Hg3(SO4)O2). Su origen puede ser natural, de actividades volcánicas, suelos o
aguas, naturalmente ricos en minerales de mercurio o de emisiones humanas
al ambiente [40].

El mercurio en su forma inorgánica existe en la naturaleza en tres estados de


oxidación Hg0 (metálico), Hg1+ (mercurioso) y Hg2+ (mercúrico), los estados

35
mercurioso y mercúrico pueden formar numerosos compuestos químicos tanto
orgánicos como inorgánicos. Las formas orgánicas son aquellas en las que el
mercurio está unido covalentemente al menos a un átomo de carbono. En su
forma elemental, el mercurio es líquido a temperatura ambiente, y su elevada
tensión de vapor (0,0012mmHg) hace que esté presente en todas partes una
atmósfera saturada de mercurio, a 20°C contiene 15mg/m 3 de mercurio [23].
También algunas formas de mercurio tales como los derivados de metil y
etilmercurio tienen una elevada presión de vapor a temperatura ambiente, por
ejemplo la del cloruro de metilmercurio es 0,0085mmHg y la del dimetilmercurio
varias veces mayor. La solubilidad en agua difiere mucho de unos compuestos
a otros y aumenta en el siguiente orden: cloruro mercurioso> mercurio
elemental > cloruro de metilmercurio> cloruro mercúrico. Las constantes de
distribución entre aire y agua de los distintos compuestos de mercurio son muy
diferentes, siendo mayores las correspondientes a Hg0 y Hg(CH3)2, 0,29 y 0,31
respectivamente, unos cuatro órdenes de magnitud superiores a las del resto
de los compuestos, por lo que es mucho más probable encontrarlos en la
atmósfera. [41, 19].

La vía principal de exposición al mercurio elemental es por inhalación de sus


vapores. Cerca del 80% de los vapores inhalados es absorbido por los tejidos
pulmonares. Este vapor también penetra con facilidad la barrera de sangre del
cerebro y su neurotoxicidad está bien documentada. La absorción intestinal de
mercurio elemental es baja. El mercurio elemental puede oxidarse en los
tejidos corporales a la forma divalente inorgánica. Se han observado trastornos
neurológicos y de comportamiento en seres humanos tras inhalación de vapor
de mercurio elemental. Algunos de los síntomas son: temblores, labilidad
emocional, insomnio, pérdida de la memoria, cambios en el sistema
neuromuscular y dolores de cabeza. Se han observado asimismo efectos en el
riñón y la tiroides. Las exposiciones altas también han ocasionado mortalidad.

5. METODOLOGÍA

5.1. PRE VALIDACIÓN

Siguiendo los procesos establecidos en el laboratorio ambiental del


Corporación Autónoma Regional del Cauca CRC, se dio inicio a la etapa de pre
validación de la siguiente manera:

 Se seleccionó el método analítico y se realizaron los procedimientos


necesarios para la determinación de mercurio en las matrices de aguas y
sedimentos a tratar, de acuerdo a los materiales y reactivos que existen
en el Laboratorio Ambiental de la CRC.

 Se realizó un inventario de equipos, reactivos necesarios para el


proceso de estandarización y validación (identificación, cantidad, calidad,
pureza), del material de vidrio y demás, señalando las cantidades
necesarias para lograr un procedimiento exitoso.

36
 Se definió el intervalo de trabajo para la determinación de mercurio
teniendo en cuenta: protocolos, normas establecidas, ensayos
preliminares realizados en el laboratorio y rangos de concentración
esperados en muestras de residuos líquidos y sólidos.

 Se verificó el correcto funcionamiento de los equipos, agitador rotatorio,


espectrofotómetro de absorción atómica, equipos de medición de
volúmenes, hornos de secado, neveras, campana extractora generador
de hidruros destilador, desionizador y elementos del laboratorio (material
de vidrio). En algunos casos mediante ensayos preliminares de acuerdo
al protocolo de verificación y calibración para cada uno, en otros casos
se emplearon los certificados.

 Se optimizaron las condiciones y parámetros instrumentales, donde se


incluye digestiones y curvas de calibración utilizadas para el
procedimiento descrito.

 Se crearon los formatos para consignar la información hallada a medida


que avance el proceso de validación, siendo congruentes con el PGC de
elaboración y control de documentos del laboratorio ambiental de la
CRC.

 Se creó un procedimiento detallado para la aplicación del método 1311


de la EPA US, que contiene: la separación de las fases sólidas y líquidas
de un residuo, su porcentaje de sólido seco y la obtención del lixiviado,
preparación de soluciones estándar y análisis de las muestras por
espectroscopia de absorción atómica-vapor frio con generador de
hidruros [42].

5.2. EQUIPOS Y REACTIVOS

Se utilizó un equipo de Espectroscopia de Absorción Atómica


ThermoScientificiCE 3000 con su respectiva lámpara de cátodo hueco de
mercurio de 253,7nm, el generador de hidruros VP100, el patrón de mercurio
fue de 1000 mgL-1 marca Panreac, el agua desionizada utilizada cumplió con
una conductividad menor a 2 µScm-1, el software usado en el equipo fue el
SOLAAR y el paquete estadístico es el SPSS 22.0.

5.3. VALIDACIÓN

El proceso de validación y verificación de un método de análisis consiste en


demostrar experimentalmente la funcionalidad del método para las aplicaciones
analíticas propuestas, como también en obtener la evidencia documentada del
procedimiento seguido, lo cual debe corresponder a un diseño experimental, un
tratamiento estadístico apropiado y unos criterios de aceptación de acuerdo
con los atributos que describen cada técnica analítica, para lo cual se
establecen las variables químicas e instrumentales que permitan conseguir las
mejores condiciones de selectividad, exactitud, precisión, límite de detección,
límite de cuantificación y linealidad basándose en los PGC de validación

37
desarrollados sobre los residuos en el laboratorio, además de bibliografía
aportada por el IDEAM [21,26,43].

5.3.1. Lavado del Material

Se debe garantizar que todo el material a utilizar debe estar completamente


limpio. El material de vidrio se lava en una solución de jabón neutro o
detergente no iónico, donde se deja durante 6 horas aproximadamente, luego
se enjuaga con abundante agua de la llave y en seguida con abundante agua
desionizada. Posteriormente se deja en acido nítrico (HNO 3) al 10% durante 4
horas aproximadamente, luego se enjuaga con abundante agua desionizada,
de tal forma que el pH del agua del lavado final sea igual al pH del agua
desionizada. Finalmente se deja secar el material en un sitio apropiado para
evitar la contaminación [21]. Figura 3

Figura 3. Lavado del Material de Vidrio


Fuente: Fabián Andrés Muñoz Perdomo

5.3.2. Metodología de Calibración del Material Utilizado en la Validación

Se calibró el material de vidrio volumétrico de acuerdo al PGC de calibración y


verificación de material de vidrio existente en el laboratorio ambiental de la
CRC y se revisaron sus respectivos certificados de calidad suministrados por
los proveedores. Se verificó la calibración de una transfer-pipeta (25 – 250 µL)
y una balanza analítica de 4 cifras decimales.

5.3.3. Implementación de la Metodología en la Determinación de Mercurio

 Preparación de las Curvas de Calibración: Inicialmente a partir de


soluciones patrón de marca PANREAC de 1000 mg/L se preparó
soluciones de trabajo con el propósito de obtener curvas de calibración

38
en un rango lineal para la determinación de mercurio, graficando
absorbancia en función de concentración y determinando el respectivo
coeficiente de correlación.

 Validación del Sistema Instrumental: La validación del sistema


instrumental se llevó a cabo con curvas de calibración en agua
desionizada, las cuales fueron sometidas al proceso de digestión para
análisis de mercurio [24]. Se evaluó la linealidad, precisión en términos de
precisión intermedia y límites críticos [24]. Para la confiabilidad de los
resultados se aplicó un tratamiento estadístico mediante el software
estadístico SPSS (Versión 22.0).

 Linealidad Instrumental: Para analizar la linealidad instrumental se


evaluaron 7 niveles de concentración durante 7 días diferentes. Se
prepararon 7 curvas de calibración durante los 7 días, una curva de
calibración por día, las cuales fueron sometidas al método descrito en la
metodología. Los resultados obtenidos en las pruebas estadísticas para
la evaluación de linealidad, permitieron concluir la linealidad instrumental
en el rango utilizado [24].

 Precisión Instrumental: Se evaluó bajo condiciones de repetibilidad (el


mismo día) y precisión intermedia (días diferentes). En condiciones de
repetibilidad se prepararon 3 curvas de calibración con los 7 niveles de
concentración, las cuales se analizaron el mismo día bajo las mismas
condiciones. Para el ensayo de precisión intermedia se prepararon 7
curvas de calibración durante 7 días diferentes, una curva de calibración
por día. Se calculó el coeficiente de variación en términos de porcentaje
(%C.V) por nivel de concentración bajo condiciones de repetibilidad y
precisión intermedia [24].

 Límites Críticos: Se prepararon 3 curvas de calibración las cuales se


analizaron el mismo día, bajo las mismas condiciones. Seguidamente,
se calculó mediante el método de mínimos cuadrados las ecuaciones de
las líneas de tendencia en cada curva, obteniendo de esta forma los
interceptos y las pendientes para cada una de las tres curvas de
calibración, con estos datos se determinó la desviación estándar de los
interceptos (Sinterceptos) y el promedio de las pendientes (mprom).
Finalmente se aplicó la ecuación 7 para establecer teóricamente el valor
para el límite de cuantificación (LOQ).

5.3.4. Validación de la Metodología

De acuerdo con el método 1311 TCLP [44] y el PGC de validación en residuos


desarrollado en el laboratorio ambiental de la CRC se utilizaron muestras de
aguas y de sedimentos provenientes de ríos y sitios del departamento del
Cauca cercanos a minas de explotación de oro mediante el uso de mercurio;
muestras que se sometieron a la metodología descrita anteriormente. Dichas
muestras fueron ingresadas al laboratorio de acuerdo al Instructivo Técnico (IT)
de ingreso de muestras de residuos y de codificación existente en el laboratorio

39
de la CRC. Se aplicó un método de filtración para separar las fases líquidas y
sólidas, para posteriormente determinar el porcentaje de sólido seco y la
cuantificación total del metal que puede ser lixiviado en toda la masa del
residuo.

El análisis de las muestras de se realizó por triplicado durante siete días


diferentes, una curva de calibración por día y los resultados obtenidos para las
muestras se interpolarán en la curva de calibración correspondiente. Se realizó
la corrección en el contenido del metal obtenido para cada muestra teniendo en
cuenta el Porcentaje de Recuperación (%R) del método. Se determinó la
precisión en términos del % C.V para las muestras.

5.3.5. Preparación de las Muestras

 Codificación: La codificación de las muestras de la validación


incluyendo blancos, patrones, estándares de chequeo y muestras se
basó teniendo en cuenta los PGC de validación y elaboración de
documentos y el IT de manejo de muestras del Laboratorio ambiental de
la CRC.

 Conservación de las Muestras: La fase líquida del residuo o los


residuos líquidos con porcentajes de sólidos menor a 0,5%, se recolecta
después de la filtración por un filtro de tamaño de poro de 0,7μm, se
acidifica con ácido nítrico concentrado hasta un pH <2 y se almacena a
4°C máximo durante 15 días para prevenir cambios en el volumen por
evaporación [37].

6. APLICACIÓN DEL MÉTODO 1311 (TCLP) DE LA EPA US SW-846 [42]

Para residuos semisólidos o de múltiples fases se empezó el procedimiento


descrito desde el ítem 6.1. Para realizar un análisis del porcentaje de sólidos
de la muestra, para residuos 100% sólidos remitirse al ítem 6.1 y para residuos
líquidos con un porcentaje de sólidos menor al 0,5% dirigirse al ítem 6.7.

6.1. DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE SÓLIDOS EN EL RESIDUO

Se pesó el filtro de 0,7µm de poro, después de haber sido lavado con ácido
nítrico 1:1 y agua desionizada; también se pesó el envase que recibirá el
líquido filtrado de aproximadamente 100g del residuo. Cuantitativamente se
transfiere la muestra del desecho al retenedor del filtro, el material retenido es
definido como la fase sólida del desecho y el filtrado como la fase líquida.

Se determinó el peso de la fase líquida y el peso de la fase sólida después del


proceso de filtración. Con estos datos se calculó el porcentaje de sólidos
aplicando la ecuación 29

40
𝑾𝒔
%𝑺ó𝒊𝒍𝒊𝒅𝒐𝒔 = ∗ 𝟏𝟎𝟎 Ecuación 29
𝑾𝒕

Dónde:

Ws = Peso sólido.
Wt = Peso total de la muestra.

6.2. DETERMINACIÓN DE PORCENTAJE DE SÓLIDOS SECOS

Después de la filtración se removió la fase sólida y el filtro del equipo de


filtración, se dejó secar la fase sólida y el filtro a 100 ± 20°C, hasta peso
constante con una incertidumbre de 0,01%, registrando el peso final para el
cálculo del porcentaje de sólido seco mediante ecuación 30

𝑾𝒅 −𝑷𝒆𝒔𝒐𝑰𝒏𝒊𝒄𝒊𝒂𝒍𝒅𝒆𝒍𝑭𝒊𝒍𝒕𝒓𝒐
%𝑺ó𝒍𝒊𝒅𝒐𝒔𝑺𝒆𝒄𝒐𝒔 = ∗ 𝟏𝟎𝟎 Ecuación 30
𝑾𝒇

Dónde:

Wd = Peso del filtro y del desecho seco.


Wf = Peso inicial del desecho.

Si el porcentaje de sólidos secos es menor de 0,5%, entonces se procede a la


determinación de mercurio por EAA, sin embargo, si el porcentaje de sólidos
secos es mayor a 0,5%, iniciar el método de reducción de tamaño de partícula
si es necesario para la fase sólida para que el proceso de digestión sea más
eficiente (siguiente numeral).

6.3. EVALUACIÓN DEL REQUERIMIENTO DE REDUCCIÓN DE TAMAÑO


DE PARTÍCULAS

Se requiere una reducción de tamaño de partículas, cuando los residuos


presentan un porcentaje de sólidos superior a 0,5% o cuando son 100% sólidos
con área superficial igual o superior a 3,1cm2/ gramo, o si los sólidos presentan
un tamaño superior a 0,95cm. Se puede realizar la evaluación a la vista, ó en
caso de tener dudas pasar la fase sólida a través de un tamiz estándar de
9,5mm (0,375pulgadas), si quedan partículas retenidas, se requiere la
reducción de tamaño, machacándola, cortándola, moliéndola hasta llegar al
área superficial o tamaño requerido [42].

41
6.4. DETERMINACIÓN DEL FLUIDO DE EXTRACCIÓN DE LOS METALES
EN LA FASE SÓLIDA DEL RESIDUO SEGÚN SU pH

Se pesaron 5 gramos de la fase sólida del residuo, después de su reducción de


tamaño, se agregaron 96,5mL de agua desionizada, se agitó vigorosamente
durante cinco minutos utilizando un agitador magnético para medir y registrar el
pH. Si el pH es inferior de 5, el fluido de extracción a utilizar con la muestra es
el No.1, si el pH es superior de 5 se agregan 3,5mL de HCl 1N, se mezcla
brevemente calentando hasta 50°C y se mantuvo la temperatura por 10
minutos.

Luego se llevó la solución a temperatura ambiente y se determinó nuevamente


el pH. Si el pH es menor a 5, se utiliza el fluido de extracción No. 1, si el pH se
mantiene mayor a 5 utilizar el fluido de extracción No. 2.

6.5. PREPARACIÓN DE LOS FLUIDOS DE EXTRACCIÓN.

Fluido de extracción No. 1 Se tomaron 5,7mL de Ácido acético glacial


grado reactivo (17,5N), se disolvieron en 200mL de agua desionizada,
luego se agregaron 64,3mL de NaOH 1N llevando a un volumen de un
litro en un balón aforado con agua desionizada, al final se verifico que el
pH sea de 4,93±0,05.
Fluido de extracción No. 2 Se tomaron 5,7mL de Ácido acético glacial
grado reactivo (17,5N), se lleva a un volumen de un litro en un balón
aforado verificando que el pH sea de 2,88±0,05.

6.6. METODOLOGÍA DE EXTRACCIÓN TCLP PARA LA FASE SÓLIDA DEL


RESIDUO

Para evaluar la movilidad de los metales (mercurio), se transfirieron 100g de la


fase sólida del residuo o el residuo 100% sólido al recipiente de extracción de
polietileno de alta densidad, junto con el filtro usado en la separación. Luego se
agregó lentamente 2 litros del fluido de extracción 1 o 2 según corresponda, se
cerró de forma ajustada con tapas de teflón para asegurar el sello y asegurarse
de que no ocurran derrames en el equipo de agitación. Conjuntamente se
realizó un blanco, con el fluido de extracción, por cada 20 muestras.

El equipo de agitación rotatoria se calibró para tener una velocidad angular de


30 rpm durante 18 horas a temperatura ambiente del laboratorio (22°C), como
lo establece la EPA US [42]. Después de las 18 horas de extracción se separan
las fases líquida y sólida por filtración al vacío, a través de un nuevo filtro de
fibra de vidrio de 0,7µm, previamente lavado con ácido nítrico 1:1 y agua
desionizada.

42
6.7. ANÁLISIS DE LOS RESIDUOS QUE CONTIENEN UN PORCENTAJE DE
SÓLIDOS MENOR AL 0,5%

Para el análisis de residuos líquidos con porcentaje de sólidos inferior al 0,5%,


o la fase líquida del residuo después de la separación, el líquido es filtrado
nuevamente con papel filtro con tamaño de poro de 0,7μm lavado previamente
con ácido nítrico 1:1 y agua desionizada para eliminar interferencias, luego son
preservados máximo durante 15 días, con ácido nítrico 1:1 hasta pH 2 hasta su
posterior digestión y análisis por Espectroscopia de Absorción Atómica.

6.8. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE MERCURIO EN AMBAS


FASES DEL RESIDUO

Si el residuo contiene fase líquida y sólidos superiores al 0,5%, se verifica si el


líquido obtenido en la filtración inicial y el lixiviado obtenido después de la
extracción TCLP de la fase sólida son compatibles, para combinarlos y calcular
el contenido de mercurio del residuo; si no son compatibles se registra el
volumen de cada uno y se analizan por separado, ambos son extractos TCLP y
al final se suman los resultados, usando la ecuación 31

𝑪𝟏 𝑽𝟏 +𝑪𝟐 𝑽𝟐
𝑪𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒊ó𝒏𝑭𝒊𝒏𝒂𝒍𝒅𝒆𝒍𝒂𝒏𝒂𝒍𝒊𝒕𝒐 = Ecuación 31
𝑽𝟏 +𝑽𝟐

Dónde:

V1 = Volumen primera fase.


C1= Concentración primera fase.
V2 = Volumen segunda fase.
C2 = Concentración segunda fase.

Los extractos TCLP deben preservarse con ácido nítrico HNO 3 a pH 2 y


refrigerados a 4°C hasta su digestión según el procedimiento de ensayo de
residuos (PER) del laboratorio de la CRC y su posterior análisis por EAA con
generador de hidruros por vapor frio para Mercurio Hg. (Anexo A).

7. DIGESTIÓN DE LAS MUESTRAS PARA EL ANÁLISIS POR EAA-GH [34]:

7.1. DIGESTIÓN DE RESIDUOS LÍQUIDOS Y LOS LIXIVIADOS OBTENIDOS


DE LOS SEDIMENTOS PARA DETERMINACIÓN Y ANÁLISIS DE
MERCURIO

Se tomó una alícuota de 100 mL de muestra líquida o del lixiviado, se le


agregó 5 mL de H2SO4 concentrado, 2,5mL de HNO3 y 15 mL de permanganato
de potasio KMnO4 al 5%, se somete a baño maría a 92±4°C durante 15
minutos, luego se agregan 8mL de peroxidisulfato de potasio K2S2O8 al 5% y se
calienta en el baño maría durante dos horas más. Una vez terminado el

43
proceso de digestión y justo antes de comenzar el análisis por espectroscopia
de absorción atómica por vapor frio, se le agrega una solución de Cloruro de
Hidroxilamina al 5% para eliminar el exceso de permanganato de potasio y
garantizar la reducción del mercurio de Hg2+ a Hg1+, luego con el boro hidruro
de sodio reducir el mercurio a Hg0 y obtenerlo como un vapor frio [25,37]. (Anexo
B). En la figura 4 se observa parte del procedimiento descrito.

Figura 4. Extracción y digestión a muestras de sedimentos y aguas para la validación.


Fuente: Fabián Andrés Muñoz Perdomo.

A B

C D

A) Muestra de sedimentos y su respectivo Fluido de extracción.


B) Sedimentos en reposo luego de la agitación con el fluido de extracción.
C) Muestra de agua con los reactivos para la adición del persulfato de potasio.
D) Muestras puestas a digestión.

7.2. ADICIÓN O DOPAJE DE LAS MUESTRAS

Se realizó la validación para mercurio sobre matrices de residuos líquidos y


sedimentos. Para las matrices líquidas y los lixiviados obtenidos de los
sedimentos por la metodología TCLP, se realizó el procedimiento de digestión
para determinar metales (mercurio) en las muestras, de acuerdo con la
metodología propuesta por el SM [34].

Para el proceso de validación, se cuantificó la cantidad de mercurio presente


en lixiviados obtenidos de dos muestras de sedimentos, aplicando la
metodología TCLP y también se cuantificó la cantidad de mercurio en dos
muestras de aguas, con esa información se hicieron adiciones o dopajes
buscando evaluar todo el rango de trabajo, por tanto a la muestra líquida 1 o

44
ML1 como la concentración fue menor que el límite de cuantificación se
realizaron dos dopajes, una para un rango bajo que es de 2ppb y la otra adición
para un rango alto de 10ppb respectivamente, la muestra líquida 2 o ML2 si
tenía 5,6ppb de mercurio por lo tanto solo se le hizo una adición de 2ppb. Para
las muestras de residuos sólidos se realizaron adiciones tanto a la muestra
sólida seca, como al lixiviado obtenido después de aplicar la metodología
TCLP. Se determinó 6,8ppb en el lixiviado de la muestra sólida 2 o LMS2
donde se adicionó 2ppb, en la muestra sólida 1 o MS1 la concentración de
mercurio en el lixiviado era menor al límite de cuantificación por la cual se dopó
tanto la muestra sólida como el lixiviado a 10ppb, también se trabajó con dos
estándar de concentraciones conocidas y el estándar de chequeo de 6ppb
preparados dentro del laboratorio ambiental STDB, STDBA y STDCh rango
bajo, rango alto y estándar de chequeo respectivamente. En la tabla 1 se
muestran las muestras utilizadas para la validación debidamente codificadas.

Para los residuos sólidos se aplicaron dos fluidos de extracción como lo indica
la metodología TCLP de la EPA [44, 45], para muestras con un pH inferior a 5 se
utiliza el fluido de extracción No 1 y para muestras con un pH superior a 5 se
utiliza el fluido de extracción No.2, en nuestro caso, la muestra sólida 1
presentó un pH < 5 por lo tanto se trató con fluido de extracción No. 1 y nuestra
muestra sólida 2 presentó pH> 5 por lo cual fue tratada con el fluido de
extracción No 2.

45
Tabla1. Codificación de Muestras de Residuos Líquidos y Sedimentos.

MUESTRAS Dopaje de las muestras


TIPO DE Hg
CODIFICACIÓN
MUESTRA [μgL-1]

Estándar de rango
STDB
bajo
2

Estándar de rango
STDA
alto
10

Muestra
ML1
Líquida 1
<1

Muestra
ML1AD1
Líquida 1 Adición 1
4,0

Muestra líquida 1
ML1AD2
adición 2
8,0

ML2 Muestra Líquida 2 5,6

Muestra líquida 2
ML2AD1
adición1
7,6

Estándar de
STDCh
chequeo
6,0

MS1 Muestra sólida 1 ----

LMS1 Lixiviado MS1 <1

Muestra sólida 1
MS1AD1
adición 1
10

Lixiviado MS1
LMS1AD1
Adición 1
10

MS2 Muestra Sólida 2 ----

LMS2 Lixiviado MS2 6,8

Lixiviado MS2
LMS2AD1
Adición 1
8,8

Para realizar el proceso de validación, se trabajo con material de referencia


certificado obtenido comercialmente ante el IDEAM. Se realizaron las pruebas
de desempeño con muestras certificadas para lograr acreditación del
laboratorio de calidad ambiental de la C.R.C. se trabajo con dos muestras de
agua, una para aguas y otra para sedimentos. Figura 5.

46
Figura 5. Material de referencia certificado para aguas y sedimentos.
Fuente: Fabián Andrés Muñoz Perdomo.

A B

A: Material de referencia certificado para aguas.


B: Material de referencia certificado para sedimentos.

7.3. ANÁLISIS DE MUESTRAS POR EAA-GH

 Preparación de estándares para elaborar curva de calibración previo


cumplimiento del procedimiento 7.1.

 El tratamiento de muestras sólidas y líquidas se hace según el método


TCLP de la EPA US[45,46] para la determinación de mercurio en la parte
líquida del residuo y mercurio lixiviado de la fase sólida

 Ajuste de las condiciones del equipo de EAA: longitud de onda, equipo


de generador de hidruros y vapor frio para el análisis de Mercurio. En la
determinación se considera como blanco de reactivos agua desionizada
acidulada. El blanco de mercurio corresponde al extracto del
procedimiento de digestión aplicado en la determinación de metales
totales en los residuos líquidos y en los lixiviados de los residuos sólidos.

 Lectura de muestras, patrón y elaboración de curva de calibración. Se


realiza cada lectura por triplicado y los valores de absorbancia se
registran en el software del equipo.

47
 Terminada la lectura de los patrones, se aspira el blanco de reactivos y
se ajusta el cero de la lectura y se procede a leer las muestras
ambientales previamente tratadas según procedimientos 7.1. La lectura
se realiza por triplicado. Si la absorbancia o concentración de alguno de
las muestras ambientales está por fuera del intervalo de trabajo, se
realiza una dilución y se realiza nuevamente la lectura.

 Se procede a una lectura del blanco de reactivos y de uno o más


patrones de control cada diez determinaciones consecutivas, esto de
acuerdo al Proceso de Gestión de Calidad PGC de aseguramiento de la
calidad del laboratorio.

7.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS

Con el objetivo de validar las metodologías utilizadas, se aplicó un tratamiento


estadístico a todos los resultados obtenidos, utilizando el paquete estadístico
SPSS versión 22, aplicando pruebas de normalidad para determinar si los
resultados vienen de una población normal y aplicar pruebas paramétricas
como ANOVA o no paramétricas, según corresponda y así evaluar si los
resultados se encuentran en un 95% de confianza para los datos
experimentales obtenidos.

8. RESULTADOS Y ANÁLISIS

Los resultados obtenidos en la validación del método 1311 TCLP de la Norma


EPA SW-846, para la determinación de mercurio en aguas y sedimentos de
ríos cercanos a sitios donde se realiza la minería del oro en el departamento
del Cauca, mediante la técnica analítica de espectroscopia de absorción
atómica con generador de hidruros, EAA-GH para contribuir en el alcance de
los análisis en el laboratorio ambiental de la CRC, fueron tratados y analizados
estadísticamente con el programa SPSS versión 22,0 cumpliendo con los
requisitos de calidad establecidas por la Norma ISO/IEC 17025.

8.1. IMPLEMENTACIÓN Y VALIDACIÓN PARA ANÁLISIS DE MERCURIO

Se implementó el método TCLP descrito en la metodología 1311 del a EPAUS


SW-846, se prepararon curvas de calibración para mercurio en un rango entre
1 y 12ppb a partir de una solución stock de 1000mg/L, teniendo como blanco
de reactivos agua desionizada acidulada. Se lee la absorbancia a una longitud
de onda de 253,7nm.

Se evaluó la linealidad instrumental, precisión en términos de precisión


intermedia y límites críticos, para ello se aplicaron pruebas estadísticas como t
de student y análisis de varianza (ANOVA) empleando el software estadístico
SPSS (Versión 22).

48
8.1.1. Linealidad Instrumental

Se evaluaron 7 niveles de concentración durante 7 días diferentes. Se preparó


una curva de calibración por día, la cual se sometió al método descrito en la
metodología. Los resultados se presentan en la tabla 2.

Tabla 2. Absorbancia niveles de concentración Vs días curvas de calibración para


análisis de linealidad instrumental.

Nivel de Absorbancias
concentración
(ppb) Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7

1 0,012 0,012 0,013 0,014 0,013 0,013 0,014


2 0,025 0,024 0,024 0,025 0,025 0,024 0,025
4 0,046 0,046 0,046 0,047 0,047 0,048 0,048
6 0,071 0,071 0,070 0,072 0,073 0,070 0,071
8 0,095 0,093 0,093 0,095 0,096 0,094 0,095
10 0,117 0,118 0,116 0,119 0,118 0,116 0,119
12 0,140 0,138 0,138 0,142 0,140 0,139 0,141

A estos resultados se aplicó la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk


considerando que el número de datos es menor a 50, para determinar si se
aplican pruebas paramétricas o no paramétricas, de acuerdo a si el valor de
significancia (p) de la prueba es superior o no a 0,05, (Tabla 3 y 4 ). Se planteó
como hipótesis nula, Ho: “el conjunto de datos obtenidos provienen de una
población normal” y como hipótesis alternativa, Ha: “Los datos obtenidos no
provienen una población normal”. Los resultados se pueden ver en las tablas 3
y 4.

Tabla 3. Evaluación de Normalidad de los Datos en Función de la Concentración.

Nivel de Shapiro-Wilk
Concentración
(ppb) Estadístico gl Sig.
1 ,858 7 ,144
2 ,664 7 ,007
4 ,818 7 ,062
6 ,894 7 ,294
8 ,887 7 ,262
10 ,877 7 ,215
12 ,935 7 ,591

49
Tabla 4. Evaluación de Normalidad de los Datos en Función del Día.

Shapiro-Wilk
Día
Estadístico gl Sig.
1 ,960 7 ,822
2 ,957 7 ,791
3 ,957 7 ,796
4 ,957 7 ,793
5 ,958 7 ,800
6 ,960 7 ,818
7 ,957 7 ,794

Los datos registrados en la tabla 3 y tabla 4 se ajustan a la normalidad


(p>0.05), por lo tanto se acepta la hipótesis nula y se aplican pruebas
paramétricas de ANOVA con el fin de establecer si existen diferencias
significativas en los valores de absorbancia en términos de linealidad
instrumental Tabla 5.

Tabla 5. ANOVA Para Absorbancias Vs Día.

Suma de Media
Gl F Sig.
cuadrados cuadrática
Inter-grupos ,000 6 ,000 ,002 1,000
Intra-grupos ,095 42 ,002
Total ,095 48

La prueba de ANOVA para los valores de absorbancia de los diferentes niveles


de concentración en función del día, (Tabla 5) muestra que no existe diferencia
significativa entre los valores de absorbancia (p >0,05) en función del día, se
encuentra que los resultados provienen de una población con distribución
normal y se concluye que la absorbancia de cada concentración no presenta
variación con el tiempo y por tanto, se establece que la metodología aplicada
es reproducible. La normalidad de estos resultados permitió aplicar pruebas
paramétricas para su correspondiente análisis estadístico.

Ahora se aplica la prueba ANOVA para saber si existen diferencias


significativas entre los valores de absorbancia en función del nivel de
concentración. Los resultados se presentan en la tabla 6.

Tabla 6. ANOVA Para Absorbancias Vs Nivel de Concentración.

Suma de Media
Gl F Sig.
cuadrados cuadrática
Entre grupos ,095 6 ,016 13726,947 ,000
Dentro de grupos ,000 42 ,000
Total ,095 48

50
El resultado obtenido indica que las absorbancias difieren significativamente
(p<0,05) entre cada nivel de concentración. Para saber entre cuáles niveles de
concentración hay diferencia significativa, se aplica la prueba de Tukey tabla 7.

Tabla 7. Prueba de Tukey.

Nivel de concentración Subconjunto para alfa = 0.05


N
ppb 1 2 3 4 5 6 7
1 7 ,01300
2 7 ,02457
4 7 ,04686
6 7 ,07114
8 7 ,09443
10 7 ,11757
12 7 ,13971
Sig. 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000

La prueba deTukey tabla 7, indica siete grupos en donde cada absorbancia es


significativamente diferente, lo que indica que la absorbancia de cada nivel de
concentración tiene un valor de significancia de p>0,05, es decir, el incremento
en el nivel de concentración produce incremento significativo y proporcional en
el valor de la absorbancia, indicando que hay una relación lineal directa entre la
absorbancia y la concentración en los niveles de las curvas de calibración para
mercurio. Cada uno de los 7 subconjuntos homogéneos tiene dentro las medias
en que difieren.

Como los datos de absorbancia difieren significativamente para cada nivel de


concentración y a medida que incrementa el nivel de concentración incrementa
la absorbancia. Los datos se evaluaron a través del gráfico relacionando la
absorbancia respecto a la concentración de Hg (ppb), la gráfica obtenida se
muestra en la figura 6.

Figura 6.Respuesta lineal absorbancia Vs concentración.

51
La tendencia de los datos presentados en la tabla 2 se evaluó a través de un
gráfico relacionando la absorbancia respecto a la concentración de Hg (ppb),
donde se observa la tendencia lineal de los resultados, por lo que se aplicó el
método de mínimos cuadrados para hallar una ecuación lineal que relaciona la
cantidad o concentración de Hg con la absorbancia figura 7.

Figura 7. Linealidad y reproducibilidad de las curvas de calibración. (1 a 12ppb)

Absorbancia en Función de la Concentración de Hg


Para Precisión Intermedia Día 1 y = 0.0116x + 0.0008
0.16 R² = 0.9997
0.14 Día 2 y = 0.0116x + 0.0007
R² = 0.9995
0.12
Día 3 y = 0.0114x + 0.0012
R² = 0.9999
0.1
Absorbancia

Día 4 y = 0.0117x + 0.0015


0.08 R² = 0.9998

0.06 Día 5 y = 0.0116x + 0.0018


R² = 0.9995
0.04 Día 6 y = 0.0115x + 0.0015
R² = 0.9999
0.02
Día 7 y = 0.0116x + 0.0019
0 R² = 0.9999
0 2 4 6 8 10 12 14
Concentración (ppb)

Se calcularon los valores para la pendiente, el intercepto y el coeficiente de


correlación, y se hallaron sus correspondientes desviaciones estándar,
obteniendo los resultados que se muestran en la tabla 8.

Tabla 8. Pendientes, Interceptos y Coeficientes de correlación. (Evaluación de la


Linealidad Instrumental)

Parámetro Símbolo Valor

Coeficiente de Correlación r 0,9999


Pendiente b 0,0116
Intercepto a 0,00134
Desviación Estándar para el intercepto sa 0,00046
Desviación Estándar para la pendiente sb 0,000095

El coeficiente de correlación se evaluó estadísticamente mediante Correlación


de Pearson teniendo como Ho: “No existe correlación significativa entre x e y”.
Como se observa en la tabla 9, la prueba es significativa (Sig. 0,000 < 0,01),

52
por lo que se rechaza la hipótesis nula y se concluye que existe correlación
altamente significativa entre la concentración y la respuesta brindada por el
equipo (absorbancia) con una correlación de Pearson de 0.997.[47, 48]

Tabla 9. Correlación de Pearson regresión lineal de la estandarización.

Nivel de
Correlaciones Absorbancia
Concentración

Nivel de concentración Correlación de Pearson 1 ,997(**)


Sig. (bilateral) . ,000
N 49 49
Correlación de Pearson ,997(**) 1
Absorbancia
Sig. (bilateral) ,000 .
N 49 49
** La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral).

Para la evaluar estadísticamente la pendiente y el intercepto se tienen las


siguientes hipótesis:

 Ho (Pendiente): “b no es significativamente diferente de cero”, la cual se


rechaza cuando la prueba estadística es significativa, es decir cuando sig.
< 0,05.

 Ho (Intercepto): “a no es significativamente diferente de cero”, la cual se


rechaza cuando la prueba estadística es significativa, es decir cuando sig.
< 0,05.

En la tabla 10 se pueden observar los resultados obtenidos de la evaluación


estadística de la pendiente y el intercepto.

Tabla 10. Resultados Obtenidos en la Evaluación Estadística de la Pendiente y el


Intercepto.

Coeficientes no Coeficientes 95,0% intervalo de


Modelo estandarizados estandarizados confianza para B
T Sig.
Error Límite Límite
B Beta
estándar inferior superior
pendiente ,012 ,000 131,685 ,000 ,011 ,012
Intercepto ,001 ,000 5,240 ,000 ,001 ,002

La significancia estadística tanto para la pendiente como para el intercepto son


inferiores a 0,05, por lo que se deben rechazar las hipótesis nulas, y concluir
que la pendiente y el intercepto son significativamente diferentes de cero.

53
Mediante análisis de varianza (ANOVA) se evaluó estadísticamente la
regresión en las curvas de calibración de la tabla 2, los resultados se muestran
en la tabla No 11.

Tabla 11. ANOVA Para Evaluar la Regresión Lineal en la Curva de Calibración.

Suma de Media
Modelo gl F Sig.
cuadrados cuadrática
Regresión ,094 1 ,094 7698,029 ,000
Residuo ,001 47 ,000
Total ,095 48

Para evaluar la regresión se tiene como hipótesis nula: “No hay regresión
significativa en la curva de calibración (R2 = 0)”, y como hipótesis alternativa
“Hay regresión significativa en la curva de calibración (R2≠ 0)”. Se observa que
la significancia para la regresión es menor de 0,05 por lo que se rechaza la
hipótesis nula y se acepta la alternativa, concluyendo que existe regresión
significativa en la curva de calibración.
Los resultados que se obtuvieron en las pruebas estadísticas para la
evaluación de linealidad, permiten concluir que el método instrumental
empleado para determinación de mercurio es lineal en el rango de 1 a 12ppb,
con un coeficiente de correlación superior a 0,995 como lo exige la norma para
la determinación de metales por EAA[34], cumpliendo así la ley de Beer-
Lambert.

8.1.2. Precisión Instrumental

Se evaluó bajo condiciones de repetibilidad (el mismo día) y precisión


intermedia (días diferentes). En condiciones de repetibilidad se prepararon 3
curvas de calibración con 7 niveles de concentración, las cuales se analizaron
el mismo día bajo las mismas condiciones. Los resultados obtenidos se
presentan en la tabla 12 y se grafica en la figura 8.

Tabla 12. Curvas de Calibración Bajo Condiciones de Repetibilidad.

Absorbancias
Concentración
Hg (ppb) Curva 1 Curva 2 Curva 3
1 0,012 0,014 0,013
2 0,025 0,025 0,024
4 0,046 0,047 0,048
6 0,071 0,072 0,07
8 0,095 0,095 0,094
10 0,117 0,119 0,116
12 0,140 0,142 0,139

54
Se observa que hay una buena repetibilidad de las curvas de calibración
debido a que la variación de las absorbancias es mínima.

Figura 8. Curvas de Calibración Repetibilidad.

Curvas de Calibración Para Determinación de


Límites Críticos
0.16
0.14
0.12 Curva 1 y = 0.0116x + 0.0008
Absorbancia

0.1 R² = 0.9997
0.08 Curva 2 y = 0.0117x + 0.0015
0.06 R² = 0.9998
0.04 Curva 3 y = 0.0115x + 0.0015
0.02 R² = 0.9999
0
0 2 4 6 8 10 12 14
Concentración (ppb)

Para el ensayo de precisión intermedia se prepararon 5 curvas de calibración


durante 5 días diferentes, una curva de calibración por día, los resultados
obtenidos se presentan en la tabla No. 13.

Tabla 13. Resultados Absorbancias de Curvas de Calibración Para Análisis de Precisión


Intermedia.

Nivel de Absorbancias
concentración
ppb Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5

1 0,012 0,013 0,014 0,013 0,014


2 0,024 0,024 0,025 0,025 0,025
4 0,046 0,046 0,047 0,047 0,048
6 0,071 0,070 0,072 0,073 0,071
8 0,093 0,093 0,095 0,096 0,095
10 0,118 0,116 0,119 0,118 0,119
12 0,138 0,138 0,142 0,140 0,141

Se calculó el CV en términos de porcentaje por nivel de concentración bajo


condiciones de repetibilidad y precisión intermedia. Los resultados se
presentan en la tabla 14.

55
Tabla 14. Precisión Instrumental Bajo Condiciones de Repetibilidad y Precisión
Intermedia.

Repetibilidad Precisión Intermedia


NIVEL
DESV. EST % C.V DESV. EST % C.V
N1 0,0010 7,69 0,0008 6,281
N2 0,0006 2,34 0,0005 2,175
N3 0,0010 2,13 0,0009 1,920
N4 0,0010 1,41 0,0011 1,503
N5 0,0006 0,61 0,0011 1,201
N6 0,0015 1,30 0,0013 1,082
N7 0,0015 1,09 0,0015 1,071

Donde se observan unos C.V bajos. El primer nivel (1 ppb) presenta mayor
variabilidad tanto en condiciones repetibilidad como en condiciones de
precisión intermedia, sin embargo, el CV en ambos casos es inferior al 8%
debido a que los datos de absorbancia a esta concentración son muy bajos, se
debe tener en cuenta que el SM al igual que el laboratorio ambiental de la CRC
propone que los coeficientes de variación deben ser inferiores a 10% [34]. Para
los otros niveles no se observa una mayor variabilidad en los resultados
obtenidos en días diferentes (precisión intermedia) respecto a los obtenidos el
mismo día (repetibilidad), en ambos casos los C.V son inferiores al 3% lo que
demuestra la precisión y reproducibilidad del método implementado.

8.1.3. Determinación de Límites Críticos

Los límites de detección y cuantificación se determinaron teóricamente [24,25].


Se prepararon 3 curvas de calibración de 1 a 12ppb las cuales se analizaron el
mismo día, bajo las mismas condiciones (Tabla No 12), con los resultados se
elaboró un gráfico que relaciona la absorbancia y la concentración, el cual se
ilustró en la Figura 8.

Se calculó mediante el método de mínimos cuadrados las ecuaciones de las


líneas de tendencia en cada curva, obteniendo de esta forma los interceptos y
las pendientes para cada una de las tres curvas de calibración, con estos datos
se determinó la desviación estándar de los interceptos (Sinterceptos) y el promedio
de las pendientes (mprom). Finalmente se aplicaron las ecuaciones 7 y 8 para
establecer teóricamente los valores para el límite de detección (LOD) y el límite
de cuantificación (LOQ), los resultados se muestran en la tabla 15.

Tabla 15. Calculo del Límite de Detección (LOD) y el Límite de Cuantificación (LOQ).

LOD LOQ
Parámetro Curva 1 Curva 2 Curva 3 SInterc m prom
(ppb Hg) (ppb Hg)
Pendiente 0,0116 0,0117 0,0115 0,0116 0,10 0,35
Intercepto 0,0008 0,0015 0,0015 0,00040415

56
El límite de cuantificación LOQ teórico se evaluó de forma experimental
preparando 3 réplicas de una solución al nivel de concentración LOQ calculado.
Estas soluciones se analizaron de acuerdo a la metodología descrita para el
método. Las absorbancias obtenidas para cada solución se promediaron e
interpolaron en una curva de calibración preparada y analizada el mismo día,
con estos resultados se halló la precisión y la exactitud al LOQ como se
muestra en la Tabla 16.

Tabla 16. Resultados Para la Determinación Experimental de LOQ.

Conc.
Conc. Teorica C.V
Absorbancia Experimental %R
(ppb) (%)
(ppb)
0,006
0,005
0,006 0.35 0,38 108,57 5,81
0,006
0,005

Como se observa el sistema instrumental brinda una exactitud y precisión


adecuadas al LOQ con un %C.V. menores a un 6%.

8.2. VALIDACIÓN DE LA METODOLOGIA

Para la validación de la metodología se evaluaron los parámetros linealidad,


exactitud, precisión y limites críticos. Para la evaluación estadística de estos
parámetros se empleó el software estadístico SPSS (Versión 22.).

Se utilizaron dos muestras de aguas provenientes de ríos cercanos a sitios de


minerías del Departamento del Cauca, y dos muestras de Sedimentos de las
cuales se sometieron a la metodología descrita anteriormente.

8.2.1. Linealidad

Correspondiente a la linealidad instrumental, se evaluaron 5 curvas de


calibración de Hg en agua desionizada sometidas a la metodología planteada
durante 5 días diferentes para la cuantificación total en las muestras de
residuos tabla 17.

57
Tabla 17. Curvas de Calibración Para Muestras Reales.

Nivel de Absorbancias
concentración
ppb Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5

1 0,011 0,013 0,012 0,011 0,012


2 0,024 0,024 0,024 0,025 0,025
4 0,045 0,045 0,049 0,046 0,048
6 0,070 0,071 0,073 0,072 0,071
8 0,094 0,092 0,096 0,096 0,095
10 0,118 0,117 0,119 0,119 0,119
12 0,138 0,138 0,141 0,140 0,141

A los resultados de la Tabla 17 se les aplicó la prueba de normalidad en


función del día y el nivel de concentración, considerando la absorbancia como
variable dependiente (Tabla 18 y 19). En ambos casos se observa que los
datos se ajustan a la normalidad (p > 0,05), por tanto se aplican pruebas
paramétricas de ANOVA con el fin de establecer si existen diferencias
significativas en los valores de absorbancia en términos de linealidad de la
metodología.

Tabla 18. Pruebas de Normalidad absorbancia Vs día muestras reales.

Día Shapiro-Wilk
Estadístico gl Sig.
1 ,957 7 ,790
2 ,955 7 ,779
3 ,960 7 ,820
4 ,959 7 ,811
5 ,961 7 ,829

Tabla 19. Pruebas de Normalidad Absorbancia VsConcentración muestras reales.

Nivel Conc Shapiro-Wilk


(ppb) Estadístico gl Sig.
1 ,881 5 ,314
2 ,684 5 ,006
4 ,867 5 ,254
6 ,961 5 ,814
8 ,881 5 ,314
10 ,771 5 ,046
12 ,803 5 ,086

Los valores de significancia (p > 0.05) de la Tabla 20 indican que no existen


diferencias significativas y se concluye que la absorbancia de cada
concentración no presenta variación con el día, por lo que las metodologías
aplicadas son reproducibles.

58
Tabla 20. ANOVA en función del día para muestras reales.

Suma de Media
gl F Sig.
cuadrados cuadrática
Inter-grupos ,000 4 ,000 ,003 1,000
Intra-grupos ,069 30 ,002
Total ,069 34

En cuanto a la variable nivel de concentración, la prueba de ANOVA (Tabla 21)


muestra que los valores de absorbancia difieren significativamente (p < 0,05)
para cada nivel de concentración. Aplicando la prueba de Duncan (Tabla 22) se
determinó que existen 7 grupos, en donde la absorbancia difiere
significativamente y es proporcional al nivel de concentración. Además, el
coeficiente de correlación de Pearson (Tabla 23) altamente significativo
(1,000** con Sig = 0,000) confirma lo anterior e indica una relación lineal.

Tabla 21. ANOVA Absorbancia Vs nivel de concentración muestras reales.

Suma de Media
gl F Sig.
cuadrados cuadrática
Inter-grupos ,069 6 ,011 6983,606 ,000
Intra-grupos ,000 28 ,000
Total ,069 34

Tabla 22. Prueba de Duncan

Nivel Conc Subconjunto para alfa = .05


N
(ppb) 1 2 3 4 5 6 7
1 5 ,01180
2 5 ,02440
4 5 ,04660
6 5 ,07140
8 5 ,09460
10 5 ,11840
12 5 ,13960
Sig. 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000

Tabla 23. Correlaciones de Pearson curvas de calibración para precisión intermedia.

Nivel
Correlaciones Absorbancia
Conc
Nivel Conc Correlación de
1 ,997(**)
Pearson
Sig. (bilateral) . ,000
N 35 35
Absorbancia Correlación de
,997(**) 1
Pearson
Sig. (bilateral) ,000 .
N 35 35

59
Se evaluó la tendencia utilizando un gráfico que relaciona la absorbancia en
función de la concentración de mercurio, ver Figura 9. Por medio del método de
mínimos cuadrados se halló una ecuación de la línea recta, los valores de la
pendiente, el intercepto, el coeficiente de correlación y su correspondiente
desviación estándar se ilustran en la Tabla 24.

Al comparar los datos de la Tabla 24 con los de la Tabla 8, se observa que los
valores de la pendiente e intercepto son muy similares, lo que nos indica buena
reproducibilidad de resultados en el equipo.

Figura 9.Curvas de Calibración para evaluar la linealidad Instrumental de la metodología.

0.16
Día 1 y = 0.0116x + 0.0007
0.14 R² = 0.9995
0.12 Día 2 y = 0.0114x + 0.0012
R² = 0.9999
Absorbancia

0.1
Día 3 y = 0.0117x + 0.0015
0.08
R² = 0.9998
0.06 y = 0.0116x + 0.0018
Día 4
0.04 R² = 0.9995

0.02 Día 5 y = 0.0116x + 0.0019


R² = 0.9999
0
0 2 4 6 8 10 12 14
Concentración (ppb)

Tabla 24. Pendiente, Intercepto y Coeficiente de Correlación Para las Curvas de Muestras
Reales.

Parámetro Símbolo Valor


Coeficiente de Correlación R 0,9995
Pendiente B 0,0117
Intercepto A 0,00062
Desviación Estándar para el intercepto sa 0,000563
Desviación Estándar para la pendiente sb 0,000122

8.2.2. Precisión y exactitud de la metodología analítica implementada

Con los datos de la Tabla 17 (las 5 curvas de calibración) se evaluó la precisión


y exactitud de la metodología por nivel de concentración en términos del %CV y
porcentaje de recuperación Anexo C, los resultados se ven en la Tabla 25. Los
%CV obtenidos son bajos menores del 5%, demostrando alta reproducibilidad y
se demuestra que a medida que la concentración de analito disminuye, mayor
es la variación en el coeficiente de variación. También se puede ver que los
porcentajes de recuperación son apropiados y se encuentran dentro de un
rango adecuado (95 – 105%).

60
Tabla 25. Precisión y Exactitud.

PRECISION INTERMEDIA
NIVEL
DESV. EST %C.V %R
N1 0,00055 4,722 97,26
N2 0,00055 2,245 101,62
N3 0,00182 3,892 98,25
N4 0,00114 1,597 100,83
N5 0,00167 1,769 100,40
N6 0,00089 0,755 100,67
N7 0,00152 1,086 98,99

Con el fin de determinar la exactitud y precisión para la metodología global se


aplicó la prueba estadística de homogeneidad de varianzas (Estadístico de
Levene), teniendo para ella como hipótesis nula que “El nivel de concentración
no afecta la variabilidad en los porcentajes de recuperación”. Los resultados de
esta prueba se muestran en la tabla 26 donde la significancia estadística
basándose en la media para el estadístico de Levene es menor a 0,05, por lo
que se concluye que el nivel de concentración sí afecta la variabilidad en los
%R obtenidos. Es decir, para cada nivel de concentración se debe tener en
cuenta su porcentaje de recuperación, siendo lógico puesto que a
concentraciones bajas hay mayor variación en los volúmenes tomados para la
preparación de las curvas.
.

Tabla 26. Prueba de Homogeneidad de la Varianza Para Evaluar %R.

Estadístico
Basándose en… gl1 gl2 Sig.
de Levene

La media 2,610 6 28 ,039

La mediana. 1,510 6 28 ,211

La mediana y con gl
1,510 6 13,377 ,248
corregido

La media recortada 2,659 6 28 ,036

Por otro lado la significancia estadística basándose en la mediana para el


Estadístico de Levene es mayor a 0,05 (Sig = 0,211), por lo que la prueba
estadística es no significativa y por lo tanto se acepta la hipótesis nula,
concluyendo que el nivel de concentración no afecta la variabilidad en los % R
obtenidos. Esto permite calcular un %Rprom basándose en la mediana de los
datos del porcentaje de recuperación para cada nivel (ver tabla 27) y un %C.V
para la metodología global.

De esta manera se calcula un porcentaje de recuperación promedio basándose


en la mediana de los datos del porcentaje de recuperación para cada nivel y un

61
%CV para la metodología global. Los resultados se muestran en la Tabla 27,
donde los bajos CV muestran la precisión y el porcentaje de recuperación
promedio, la exactitud ya que se encuentra en el rango apropiado (95 – 105 %).

Los %R obtenidos en base a la mediana y el %R promedio son aceptables,


encontrándose dentro del intervalo normal (95%-105%), de igual forma los
%CV son inferiores al 5%.

Tabla 27. Exactitud y Precisión Para la Metodología Global en la Determinación de Hg


con Base en la Mediana.

Nivel de concentración %R S %CV


1 2 3 4 5 6 7 prom
%R Hg 97,26 99,91 96,97 100,26 100,83 101,18 99,27 99,38 1,67 1,68

8.2.3. Validación del Método Para las Muestras de Residuos

El análisis de residuos, se realizó tanto para muestras líquidas como para


muestras sólidas durante cinco días diferentes (2 muestras líquidas y 2
muestras de sedimentos), dichas muestras fueron ingresadas al laboratorio de
acuerdo al Instructivo Técnico (IT) de ingreso de muestras de residuos y de
codificación existente en el laboratorio de la CRC (tabla 28), los análisis se
realizaron por triplicado, donde se preparó una curva de calibración por día y
los resultados obtenidos para las muestras se interpolaron en la curva de
calibración correspondiente. Las muestras fueron sometidas a la metodología
descrita, en la Tabla 29 se reportan los resultados de las concentraciones
obtenidas durante los cinco días de ensayo. Una vez obtenidos estos
resultados, a cada concentración se le realizó la corrección teniendo en cuenta
el porcentaje de recuperación promedio del método, así como la precisión y
exactitud en términos del CV y %R, para cada una de las muestras.

Tabla 28. Procedencia y Codificación Interna de las Muestras en el Laboratorio ambiental


de la C.R.C.

Tipo de Codificación Procedencia de la Muestra Referencia Para


Muestra Interna Validación
Líquida 1 0087 Pozo profundo Brisas del Pacifico ML1
Municipio de Guapi.
Líquida 2 0240 Entrada PETAR Los Noguera ML2
Municipio de Morales.
Sedimento 1 0268 Rio San Bingo Municipio de MS1
Mercaderes.
Sedimento 2 0825 Vereda la Martha Municipio de MS2
Rosas.

Las muestras de aguas y sedimentos presentadas en la tabla 28 provienen de


sitios afectados por la minería aurífera ejercida en el departamento del Cauca.

62
8.2.4. Validación de las Muestras con Residuos Líquidos

Se utilizaron muestras de residuos proveniente de 4 sitios del Departamento


del Cauca cercanos a minerías, las cuales se sometieron a la metodología
descrita anteriormente, se aplica la metodología 1311 TCLP de la EPA SW-
846, obteniendo la fase líquida del residuo y aplicando el procedimiento de
digestión para muestras líquidas según el Standard Methods (SM). Se aplicó el
método de validación estipulado en el laboratorio ambiental de la CRC para
muestras líquidas bajo los niveles de concentración siguientes: dos estándares
de concentración conocida (un estándar bajo STDB y un estándar alto STDBA)
preparados internamente por el laboratorio ambiental, una muestra líquida la
cual no presentó ninguna concentración de Hg (ML1) que concierne a la
concentración del metal en la matriz, se realizaron dos adiciones a ML1 para
comparar el efecto matriz en un rango bajo y un rango alto (ML1AD1 y
ML1AD2) respectivamente, una muestra líquida la cual contenía Hg (ML2),
también se le realizó una adición de 2ppb marcada como ML2AD1 para
analizar el efecto matriz, y un blanco (BK). Se analizaron tres réplicas de estas
muestras durante cinco días diferentes, preparando una curva de calibración
por día y los resultados obtenidos para las muestras se interpolaron en la curva
de calibración correspondiente, en la que los patrones fueron sometidos al
mismo tratamiento que las muestras. Se realizó la corrección en la
concentración del metal obtenido para cada muestra, teniendo en cuenta el %R
del método se determinó la precisión en términos del %C.V para cada una de
las tres muestras, obteniendo los resultados mostrados en la tabla 29.

Tabla 29.Resultados de Análisis de Residuos Líquidos.

Promedio
Muestra S %CV Exactitud (% R)
(ppb)
STDB 2,11 0,062 2,94 105,5
STDA 10,02 0,266 2,69 99,1
ML1AD1 4,10 0,185 4,50 102,5
ML1AD2 8,09 0,336 4,16 101,13
ML2 5,52 0,258 4,67 100,36
ML2AD1(+2) 7,47 0,214 2,86 98,68
STDCh 6,14 0,191 3,11 102,33

Con estos resultados se corrobora que los métodos implementados generan


resultados exactos, con porcentajes de recuperación entre el 95 – 105%. El
error relativo es bajo, < a 2 %. Los bajos coeficientes de variación en términos
de precisión intermedia, cumplen con el criterio de aceptación de Horwitz (%CV
< %CV Horwitz)[49], demostrando que no existen variación entre los ensayos,
es decir que los resultados obtenidos corresponden a las adiciones efectuadas.
Además, se comprueba que a concentraciones bajas el coeficiente de Horwitz
tiende a ser mayor, dado que se requieren volúmenes muy pequeños para la
preparación.

63
8.2.5. Validación con Muestras de Residuos Sólidos

Se utilizaron dos muestras de sedimentos de sitios cercanos a minerías, donde


el procedimiento de muestreo fue desarrollado por parte del laboratorio
ambiental de la CRC, se determinó la concentración de mercurio total en los
lixiviados obtenidos bajo la metodología 1311 TCLP de la EPA US. Se
analizaron tres réplicas de estas muestras durante cinco días diferentes,
preparando una curva de calibración por día y los resultados obtenidos para las
muestras se interpolaron en la curva de calibración correspondiente, en la que
los patrones fueron sometidos al mismo tratamiento que las muestras,
analizando muestras sólidas con pH ácido (MS1) y básico (MS2), aplicando los
dos fluidos de extracción que exige la norma EPA (F1 y F2), para este tipo de
matrices. Se realizó la corrección en la concentración del metal obtenido para
cada muestra teniendo en cuenta el % R del método y se determinó la
precisión en términos del % C.V.

La concentración de mercurio en una de las dos muestras de sedimentos, fue


inferior al límite de cuantificación establecido, por lo tanto se hizo un adición de
10ppb a la muestras sólida, la cual se rotulo como MS1AD1 y un dopaje
también a 10ppb al extracto TCLP marcado como LMS1AD1 antes de someter
las muestras al proceso de digestión, la otra muestra marcada como LMS2 si
contenía mercurio en una concentración de 6,8ppb, a la cual se adicionaron
2ppb para analizar el efecto matriz, muestra que se rotuló como LMS2AD1. Los
resultados se muestran en la tabla 30.

Tabla 30. Resultado de Análisis de Residuos Sólidos.

Promedio Exactitud (%
Muestra S CV %
(ppb) R)
LMS2 6,80 0,10 1,26 NA
LMS1AD1 10,14 0,22 2,16 101,40
LMS2AD1 8,78 0,15 1,74 NA
MS1AD1 9,87 0,18 1,85 98,7

En las tablas 29 y 30 observamos que los resultados tienen un coeficiente


variación inferior al 5%, lo que nos indica que son resultados confiables y que
a su vez tienen un porcentaje de recuperación entre los intervalos de confianza
globales del método (tabla 27), establecido en la validación de la técnica.

8.2.6. Pruebas de desempeño para análisis de mercurio con muestras


certificadas

Se realizaron las pruebas de desempeño con muestras certificadas por parte


del IDEAM para la acreditación del laboratorio de calidad ambiental de la
C.R.C. Las muestras certificadas tanto de agua como de sedimento tienen
concentraciones desconocidas de mercurio, el resultado o valor certificado es
confidencial por parte del IDEAM hasta que se envían los resultados de cada

64
muestra, luego de lo cual dicha entidad evalúa y compara el resultado real de
las muestras entregadas y emite una calificación para la técnica analítica,
donde se da un rango de error; si el resultado presentado por el laboratorio
está dentro de este intervalo se supera la prueba de desempeño y se obtiene la
acreditación. La tabla 31 muestra los resultados obtenidos.

Tabla 31. Resultados Pruebas de Desempeño y Codificación Interna.

Tipo de Codificación Día 1 Día 2 Día 3 Promedio


Muestra Interna (µg/L) (µg/L) (µg/L) (µg/L)

Líquida 0013 8,83 8,45 8,60 8,63

Sedimento 0012 4,68 4,87 4,3 4,62

8.2.7. Estimación de la Incertidumbre en la Determinación de Mercurio en


Residuos Mediante la Metodología de Fuentes Globales

Para la metodología validada de mercurio, se determinó la incertidumbre a


partir de estándares preparados internamente y muestras de residuos líquidos
y sedimentos con concentraciones cercanas al nivel bajo, intermedio y alto de
la curva de calibración (se empleó dopaje).

En el anexo D se registran los datos necesarios para calcular las fuentes de


incertidumbre a los dopajes de rango alto y rango bajo. Inicialmente se realiza
el cálculo de las fuentes aleatorias, siendo entonces necesario encontrar un
valor promedio (Xprom), una desviación estándar (S) y una desviación estándar
relativa (RSD) de cada grupo de datos con los cuales se calcula la desviación
estándar relativa (RSDt) del total de los datos. Los resultados se presentan en
la tabla 23.

Teniendo en cuenta que el material volumétrico empleado para la


estandarización de la metodología analítica es un material clase A marca
SCHOTT DURAN el cual ya se encontraba calibrado al iniciar el proceso de
estandarización, se considera una fuente de incertidumbre mínima por lo cual
no se tiene en cuenta para el cálculo de incertidumbre global del método
analítico.

Posteriormente, se evalúan las fuentes sistemáticas en la incertidumbre del


método con los porcentajes de recuperación de la concentración baja, media y
alta, donde se hace necesario calcular el promedio de los recuperados (Rp) y
su desviación estándar (SRp) para poder calcular la incertidumbre en la
recuperación promedio (µRp).

Finalmente, empleando la prueba t, se evalúa si el factor de recobro es


significativamente diferente de 1 para un nivel de significancia del 5 % y un
nivel de confianza del 95 % para (n-1) grados de libertad, es decir; para ver si
hay diferencia estadísticamente significativa entre el valor obtenido de
recuperación. Como hipótesis nula, Ho, se plantea: “el factor de recobro es

65
significativamente diferente de 1”,para esto se calcula el ΙtexpΙ y se compara con
el ΙtcritΙ, siendo que, si |texp|˃ |tcrit| se debe rechazar Ho, pero si |texp| ˂ |tcrit| se
acepta, indicando diferencia estadísticamente significativa entre el valor
obtenido de recuperación y el factor de recobro.

En la tabla 32 y 33 se muestran los resultados de acuerdo a los cuales se


observa que, el t experimental es menor que el t crítico, por lo tanto se utiliza la
fórmula de incertidumbre combinada total, con la que se calcula la
incertidumbre expandida del método como se muestra, aceptando la hipótesis
nula. La cuantificación de las incertidumbres se observan en las figuras 10, 11
y 12.

Tabla 32. Incertidumbre del método para estándares de residuos líquidos

Hg

Precisión (fuentes aleatorias) RSDt 0,0302


Sesgo (fuentes sistemáticas) Incertidumbre en la 0,0107
recuperación promedio µ(Rp)
t exp (valor absoluto) 2,044
t critico (valor absoluto) 2,160
Incertidumbre combinada total (µctotal) 0,032
Incertidumbre expandida del método (U): ±0,064

Figura 10. Cuantificación para las fuentes de incertidumbre para residuos líquidos.

Incertidumbre expandida 0,064

Incertidumbre combinada 0,032

Sesgo (Fuentes sistemáticas) 0,010

Precisión (Fuentes aleatorias) 0,0302

0.000 0.005 0.010 0.015 0.020

66
Tabla No 33. Incertidumbres del método para residuos sólidos.

MERCURIO

Precisión (fuentes aleatorias) RSDt 0,0206

Sesgo (fuentes sistemáticas) Incertidumbre 0,0078


en la recuperación promedio U(Rp)

MS1AD1 t exp (valor absoluto) 0,6420

t critico (valor absoluto) 2,1604

Incertidumbre combinada total (Uctotal) : 0,0220

Incertidumbre expandida del método 0,0440


(Uexpmét): ±

Precisión (fuentes aleatorias) RSDt 0,0159

Sesgo (fuentes sistemáticas) Incertidumbre 0,0130


en la recuperación promedio U(Rp)

LMS2AD1 t exp (valor absoluto) 0,1579

t critico (valor absoluto) 2,1604

Incertidumbre combinada total (Uctotal): 0,0205

Incertidumbre expandida del método 0,0410


(Uexpmét): ±

Figura 11. Cuantificación para las fuentes de incertidumbre para residuos Sólidos
MS1AD1.

Incertidumbre expandida 0,0440

Incertidumbre combinada 0,0220

Sesgo (Fuentes sistemáticas) 0,0078

Precisión (Fuentes aleatorias) 0,0206

0.000 0.010 0.020

67
Figura 12. Cuantificación para las fuentes de incertidumbre para residuos Sólidos
LMS2AD1.

Incertidumbre expandida 0,0410

Incertidumbre combinada 0,0205

Sesgo (Fuentes sistemáticas) 0,0130

Precisión (Fuentes aleatorias) 0,0159

0.000 0.010 0.020

El reporte de la incertidumbre en un análisis se realiza de la forma cómo se específica


en la Tabla 34.

Tabla 34. Reporte de Resultados Teniendo en cuenta la incertidumbre de la medición


(por fuentes globales)

Método Expresión incertidumbre

Líquidos Valor medido ± (valor medido * 0,064)

Sólidos Ácidos Valor medido ± (valor medido * 0,044)

Sólidos Básicos Valor medido ± (valor medido * 0,041)

Se observa que la principal fuente de incertidumbre en la medida del análisis


de las muestras, es por fuentes aleatorias las cuales se deben a limitaciones
del instrumento de medida y otras variables inevitables que están fuera de
control del experimentador, mientras que las fuentes sistemáticas que pueden
ser las del equipo o las del operario no presentan un efecto mayor en la
medida.

Con los datos de las incertidumbres para las muestras de residuos, se concluye
que hay aproximadamente un 95% de probabilidad de que el valor verdadero
de la concentración de mercurio en una muestra de residuo, se encuentre
dentro del intervalo dado por el valor obtenido al analizar la muestra y su
incertidumbre.

Con los resultados y teniendo referencia de la utilidad del método para


clasificar los residuos como peligrosos [45,46,47].Se deduce que el método 1311
TCLP para la determinación de mercurio en aguas y sedimentos queda
debidamente implementado en el laboratorio Ambiental de la CRC, siendo un
método robusto, sensible preciso exacto y lineal. La plantilla de validación de
la metodología se encuentra en el anexo E.

68
9. RESUMEN DE LA METODOLOGIA VALIDADA

En la Tabla 35 se resumen las figuras de mérito analítico del método validado.

Tabla 35. Resumen de la validación para el método implementado y validado.

Longitud Rango
Método de Onda Trabajo LOD LOQ %
Linealidad %R
(nm) (ppb) (ppb) (ppb) CV

1311
Mercurio TCLPEPA 253,7 1 –12 0,10 0,35 0,9998 99,38 1,68
SW-846

Se muestra el resumen general del método validado en la cual se describen


parámetros como la metodología estandarizada utilizada, el rango de trabajo, el
patrón de verificación, el estándar de chequeo y la absorbancia a la cual este
debe llegar y la longitud de onda.

69
10. CONCLUSIONES

1. Se implementó y estandarizó la metodología 1311 (TCLP) de la EPA US


para la determinación de Mercurio en aguas y sedimentos mediante la
técnica analítica de Espectroscopia de Absorción Atómica con
Generador de Hidruros.

2. Se implementó el proceso de digestión según el SM en las muestras de


agua y en los lixiviados de los sedimentos para la determinación de
mercurio total extraído por TCLP.

3. Los resultados de las muestras están dentro de los intervalos del


porcentaje de recuperación del método global, afirmando que la técnica
es adecuada para la determinación de Mercurio para este tipo de
matrices (aguas y sedimentos) con %C.V. entre los rangos permitidos
por la EPA (<20%).

4. La incertidumbre para el análisis de las muestras se calcula con un t


experimental menor a un t crítico obtenido de los resultados estadísticos
aplicados para el método validado, calculando la incertidumbre
expandida a partir de la incertidumbre total combinada, observando que
la incertidumbre del método proviene con mayor proporción de las
fuentes aleatorias que de las fuentes sistemáticas.

5. Se concluye que el método 1311 TCLP para la determinación de


mercurio en aguas y sedimentos queda debidamente implementado en
el laboratorio ambiental de la Corporación Autónoma Regional del Cauca
CRC siendo un método robusto, sensible, preciso, lineal y reproducible.

6. Se elaboraron los respectivos formatos de captura de datos, protocolos


de ensayo e instructivos técnicos en residuos, necesarios para llevar a
cabo de manera clara la determinación de mercurio en aguas y
sedimentos.

7. Con la actual validación el laboratorio ambiental de la Corporación


Autónoma Regional del Cauca CRC solicitó la extensión del alcance en
su actual acreditación para el análisis de mercurio en aguas y
sedimentos ante el ente acreditador, el IDEAM.

70
Aporte al Laboratorio Ambiental De la CRC para la Acreditación de la
Variable Mercurio (Hg) en Aguas y Sedimentos ante el IDEAM.

Instructivo de operación del equipo de absorción atómica y generador de


hidruros.

Elaboración de protocolos para la determinación de mercurio en aguas y


sedimentos.

Guía de validación.

Elaboración de carta de control.

Presentación pruebas de desempeño.

Presentación auditoría ante el IDEAM.

Actualmente el laboratorio ambiental de la Corporación Autónoma Regional del


Cauca CRC se encuentra en espera de reconocimiento formal de la
acreditación por parte del IDEAM de acuerdo al oficio No 20166010013831del
18 de julio de 2016. Copia de este oficio se encuentra en el anexo F.

71
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76
ANEXOS

Anexo A. Esquema para el tratamiento de sedimentos por TCLP.

Filtración y determinación Determinación del Determinación si se


del porcentaje de sólidos porcentaje del sólido requiere
del residuo >0,5% del seco reducción del tamaño de
100% sólido
partícula
<del 0,5%

Filtrar la muestra, filtro de Tomar 5g de la muestra pH> 5


Agregar 3,5mL de HCl 1N
fibra de vidrio, extracto sólida, adicionar 96,5mL
agitar a 50 ºC 10min dejar
TCLP preservar con HNO3 de agua destilada, agitar enfriar y medir pH
a 4 ºC. 5min y medir pH.

pH< 5

Filtrar el lixiviado, filtro de Utilizar fluido de extracción Si el pH < 5 utilizar fluido de


fibra de vidrio. Preservar la Nº 1 (acido acético y extracción Nº 1, si el pH > 5
muestra con HNO3 a 4 ºC y NaOH). se utiliza el fluido de
extracción Nº 2.
desechar el sólido.

Tomar 100g de muestra y agregar 2L


de fluido de extracción al recipiente
Digestar la muestra como de extracción, someterlo a agitación
lo dice el Standard Methods rotacional a 250 rpm por 18h.
y determinar por EAA.

77
Anexo B. Tratamiento de aguas para la digestión y análisis de mercurio
residuos acuosos.

15mL KMnO4 5mL H2SO4 3.) Tapar


2.) 8mL de K2S2O8
100mL de muestra 2,5mL HNO3 Conc.

Se tiene que ver el color


Baño maria Calentar
violeta, si no se observa,
95 ºC Baño maria 95 ºC adicionar en porciones
(15-30 min) (2h) de 5mL hasta
permanencia
del color violeta.
ERLENMEYER DE 250mL 1.) Enfriar Tº ambiente

Luego de
2h
*Cloruro de
hidroxilamina.
Tapar para posterior
determinacion de Hg. retirar de baño maria y
Realizar la determinacion enfriara temp. ambiente
dentro de las 2 siguientes
horas a la adicion de la
hidroxilamina.
*Elimina el exceso de
KMnO4

78
Anexo C: Porcentajes de recuperación para las curvas de calibración.

MERCURIO

[ ] ppb [ ] ppb [ ] ppb [ ] ppb [ ] ppb %R %R %R %R %R %R


curva 1 curva 2 curva 3 curva 4 curva 5 CURVA 1 CURVA 2 CURVA 3 CURVA 4 CURVA 5 prom
0,98 1,03 0,96 0,99 0,97 98,00 103,00 96,00 99,00 97,00 98,6
2,01 2,00 1,92 2 1,99 100,5 100,00 96,00 100,00 99,50 99,2
3,82 3,84 4,06 3,81 3,97 95,5 96,00 101,50 95,25 99,25 97,5
5,97 6,12 6,11 6,05 5,96 99,5 102,00 101,83 100,83 99,33 100,70
8,04 7,96 8,08 8,12 8,02 100,5 99,5 101,00 101,50 100,25 100,55
10,11 10,16 10,04 10,10 10,09 101,1 101,6 100,40 101,00 100,90 101
11,84 12 11,92 11,91 11,99 98,67 100,00 99,33 99,25 99,92 99,43

79
Anexo D: Datos de las muestras para el cálculo de la incertidumbre.

Mercurio
CONC
Dopaje NB %R
REAL
Muestra Rango Bajo 4,00 3,9020 97,55
Muestra Rango Bajo 4,00 4,2164 105,41
Muestra Rango Bajo 4,00 4,3540 108,85
Muestra Rango Bajo 4,00 3,9639 99,10
Muestra Rango Bajo 4,00 4,0742 101,86
Muestra Rango Bajo 4,00 4,1421 103,55
Muestra Rango Bajo 4,00 3,8999 97,50
x 4,0789 101,97
s 0,1709
%cv 4,1889

CONC
Dopaje NA %R
REAL
Muestra Rango Alto 8,00 7,8962 98,70
Muestra Rango Alto 8,00 8,0814 101,02
Muestra Rango Alto 8,00 8,6634 108,29
Muestra Rango Alto 8,00 8,0216 100,27
Muestra Rango Alto 8,00 7,8029 97,54
Muestra Rango Alto 8,00 8,0733 100,92
Muestra Rango Alto 8,00 7,8099 97,62
x 8,0498 100,62
S 0,2946
%cv 3,6605
Promedio, Xp 4,0789 8,0498
Desv estándar, s 0,1709 0,2946
RSD 0,021 0,002
RSDt 0,145 0,045
No. de datos, n 7 7

NB: Dopaje de Nivel Bajo.


NA: Dopaje de Nivel Alto.

80
Anexo E. Plantilla de validación para determinación de mercurio por EAA-
GH.

MERCURIO
Identificación de la
muestra BK RB RA STDCh STDB(2) STDA(10)
Día
23/10/2015 0,00 0,911 12,000 6,242 2,0636 9,9842
24/10/2015 0,00 0,992 11,836 6,312 2,1549 9,6208
25/10/2015 0,00 0,992 11,692 6,193 2,173 9,6354
26/10/2015 0,00 1,154 12,010 5,819 2,1303 10,1931
27/10/2015 0,00 0,911 11,914 6,133 2,0271 10,1065
28/10/2015 0,00 0,992 11,957 5,912 2,1193 9,9782
30/10/2015 0,00 1,073 11,991 6,369 2,0709 10,6254
Promedio (xprom) 0,00 1,0036 11,914 6,140 2,1056 10,021
Desviación estándar (s) 0,00 0,0866 0,1153 0,2043 0,0531 0,3450
CV, % 0,00 8,6284 0,9677 3,3266 2,5206 3,4432
% Error 0,00 0,36 0,72 2,33 5,28 0,21
% Recuper N.A 100,4 99,28 102,33 105,28 100,21
Número de datos 7 7 7 7 7 7
Mínimo 0,00 0,911 11,692 5,912 2,0271 9,6208
Máximo 0,00 1,154 12,010 6,369 2,1730 10,6254
Intervalo 0,00 0,243 0,318 0,457 0,146 1,0046
T bajo 0,00 1,069 1,928 1,572 1,479 1,159
T alto 0,00 1,737 0,830 1,121 1,270 1,753

BK: Blanco, RB: Rango Bajo, RA: Rango Alto.

81
Anexo F. Oficio IDEAM respuesta a la auditoría.

82