1.

INTRODUCCIN

En nuestro pas, el cultivo del lilium como flor de corte tiene una importancia
econmica relevante dentro del mercado exportador de flores, alcanzando un valor de
US $ 1,6 millones durante el ao 2005, representando ms del 60% del total de
exportaciones (ODEPA, 2005).

En cultivos al aire libre de la IX y X regiones, y en invernaderos de la V regin, se ha

presentado una sintomatologa semejante a la descrita para Botrytis (VERDUGO,
2006)*.

Este gnero tiene la capacidad de ser agente patgeno del cultivo provocando dao
foliar, y la consecuente prdida econmica, debido a los costos que supone su control
preventivo y curativo, debido al alto nivel de exigencia sanitaria que se requiere para
exportar.

En la V regin, el cultivo para flor de invierno se realiza en invernaderos donde se

producen condiciones ptimas de humedad y temperatura para el desarrollo de esta
enfermedad, lo que favorece su propagacin espacial y temporal.

El conocimiento de la etiologa y epifitiologa permite determinar el ciclo de la

enfermedad, con lo cual es posible manejar estrategias de control eficientes basadas
en caractersticas definidas y estables del agente causal.

* Verdugo, G., Ing. Agrnomo. Ms. Cs. Profesora ctedra Floricultura Facultad de Agronoma PUCV.
Comunicacin personal.

De acuerdo a esto, la investigacin tuvo como objetivos:

Estudiar la etiologa y epifitiologa de las enfermedades causadas por el

gnero Botrytis en un cultivo de lilium bajo invernadero fro, con el fin de
evaluar la incidencia de este tipo de patologas en la zona de estudio.

Demostrar la capacidad de Botrytis cinerea y Botrytis elliptica de causar

enfermedad en plantas de Lilium sp.

2. REVISIN BIBLIOGRFICA

2.1. Antecedentes generales de la planta de Lilium sp.:

El gnero Lilium pertenece a la familia de las Liliceas, al igual que importantes

especies utilizadas como flores de corte, tales como tulipanes, narcisos y Allium.

El bulbo, carente de tnica, est formado por hojas modificadas que se agrupan en un
disco basal o tallo modificado. Estas hojas son gruesas, generalmente de color blanco
y de forma triangular, cuya funcin es almacenar sustancias de reserva para iniciar el
crecimiento vegetativo.

El sistema radicular es abundante, presentan races adventicias caulinares y otras de

tipo basal. Las races principales basales son carnosas con tonalidades marrones;
tienen grosores de 2 a 3 mm de dimetro y longitudes de 15 a 20 cm. Las races
adventicias aparecen en el tallo por sobre el bulbo y permiten el desarrollo areo al
complementar la funcin de las races basales.

El tallo surge del disco basal situado en el interior del bulbo. Las hojas son
lanceoladas u oval-lanceoladas, de dimensiones variables (10 a 15 cm de largo y
anchos de 1 a 3 cm), ssiles o mnimamente pecioladas. El color es generalmente
verde intenso.

Las flores se sitan en el extremo del tallo; sus spalos son de varios colores, y se
encuentran desplegados o curvados dando a la flor apariencia de trompeta. Se
disponen solitarias o agrupadas en inflorescencias (racimos o corimbos), mostrndose
erguidas o pndulas (BAON et al., 1993).

2.2. Antecedentes generales del cultivo:

El cultivo se puede efectuar todo el ao, incluso se pueden realizar hasta tres cultivos
dependiendo de las caractersticas de los cultivares.

La plantacin se hace generalmente en mesas, en suelos con buen drenaje, estructura

y con buen contenido de materia orgnica. Durante el perodo de cultivo es necesaria
la utilizacin de mallas plsticas que sirven de soporte, las cuales se elevan a medida
que ste crece (SEEMANN y ANDRADE, 1999).

2.3. Condiciones ambientales en el invernadero:

2.3.1 Temperatura.

Para obtener un producto de calidad es necesario conseguir una buena formacin de

races. Esto se consigue con temperaturas ambientales de 12 a 13 C durante el
primer mes de plantacin. Temperaturas ms bajas alargan innecesariamente el
perodo de crecimiento.

Durante el desarrollo del cultivo, en el caso de los hbridos asiticos, deben

mantenerse temperaturas promedio de 14 a 15C. Para obtener la mxima calidad se
requiere que las temperaturas alcancen los 20 a 25C durante el da y de 8 a 10 C
durante la noche. Con temperaturas nocturnas superiores a 15-20C se reduce la
calidad de las flores. Si las temperaturas nocturnas son superiores a 20 C, se afecta la
calidad de la vara. Temperaturas muy bajas prolongan el cultivo.

Para los hbridos orientales, el manejo de temperaturas es ms delicado, debindose

lograr una temperatura constante ente 15 a 17C. Temperatura por debajo de los 15C
pueden causar amarillamiento o cada de la hoja.

Lilium longiflorum necesita temperaturas ptimas de 14C a 16C, pudiendo alcanzar

durante el da los 20 a 22 C. Si las temperaturas disminuyen de 14C se observan
grietas en los ptalos (CENTRO INTERNACIONAL DE BULBOS DE FLOR, s. f).

2.3.2 Humedad

El nivel correcto de humedad relativa es de 80 a 85%. Es importante evitar

oscilaciones para evitar quemaduras de las hojas en cultivares sensibles. La
ventilacin es fundamental para reducir la alta humedad relativa y para el control de
la temperatura. Se debe evitar que la humedad relativa baje demasiado rpido para
evitar daos en las hojas y ocasionar prdidas de calidad. La humedad relativa alta
favorece la presencia de enfermedades, como las ocasionadas por Botrytis sp.
(CENTRO INTERNACIONAL DE BULBOS DE FLOR, s. f).

2.4. Antecedentes fitopatolgicos :

Segn BAON et al. (1993), lilium es atacado por las siguientes enfermedades:
La podredumbre del pie puede estar asociada a Phytophthora parasitica o
Phytophthora nicotianae. Los daos provocados se observan a nivel de cuello,
causando un decaimiento repentino por la obstruccin de los haces vasculares.

El hongo Pythium ultimum produce una lesin al cuello que afecta el sistema
radicular adventicio. Las races se vuelven caf claro y de textura vidriosa, derivando
en una putrefaccin general que termina con el corte del tallo, dando muerte a la
planta.

Rhizoctonia solani produce su dao a nivel de suelo. Su presencia se distingue por

que el brote apical presenta retraso en la emergencia y las primeras hojas estn
podridas, las cuales caern dejando cicatrices en el tallo.

El hongo Fusarium oxysporum (f.sp.Lilii y f.sp. narcissi) es el agente causal de la

pudricin basal en bulbos. Los sntomas del ataque son una podredumbre pardo
oscura, que comienza en el disco basal para extenderse por toda la planta. La parte
externa presenta marchitez afectando incluso el botn floral, los cuales no sern
viables o tendrn antesis antes de su fecha de floracin.

Cylindrocarpon destructans y Cylindrocarpon radicicola producen pudricin de

escamas y en el interior del bulbo.

Otros hongos que afectan al bulbo, principalmente en almacenaje, son Penicillium sp.
y Rhizopus nigricans.

Las especies de Botrytis, por ser parte fundamental de este estudio sern descritas
ms adelante.

Lilium tambin es atacado por bacterias, siendo la principal especie Erwinia

carotovora que provoca manchas traslcidas en las escamas y posterior pudricin del
bulbo que termina en marchites generalizada y muerte.

Los daos por virus se caracterizan por producir distorsiones, manchas jaspeadas a
nivel foliar y crecimiento enanizante. Existen variedades de lilium sensibles,
resistente e inmunes. Las resistentes pueden actuar como portadoras y contaminar
otras variedades sensibles. El LSV (Lily Simtomless Virus) es particularmente
importante por provocar manchas clorticas en las hojas, alargadas paralelamente a
las nervaduras y posteriormente se vuelven necrticas.

2.5. Antecedentes fitopatolgicos en Chile:

En nuestro pas el cultivo ha tenido condiciones ptimas para su desarrollo. Sin

embargo, tambin se han detectado problemas de carcter patolgico que pueden
frenar el cultivo si no se detectan a tiempo.

Los problemas ms graves en multiplicacin y produccin de bulbos son los virus. En

la zona sur (VIII a X regin) se realizaron estudios demostrando que el cultivo puede
infectarse principalmente por LSV (Lily Simtomless Virus), TVB (Tulip Break Virus)
y TRV (Tobacco Rattle Virus) (MUOZ y FERNNDEZ, 2000).

En la zona norte, principalmente en el valle de Azapa, se detect Fusarium sp.,

provocando clorosis y prdida de turgencia en las zonas basales (SEPLVEDACHAVERA et al., 2004)

2.6. Botrytis cinerea:

Botrytis pertenece al Phylum Ascomycota, clase Ascomycetes, orden Helotiales,

familia Sclerotiniaceae, gnero Botrytis (ITIS, 2005).

Dentro de este gnero, la especie Botrytis cinerea Pers. es la nica especie polfaga,
afectando a ms de 200 tipos de plantas. Todas las dems especies son consideradas
especficas, con un rango de hospederos estrecho. (VAN BAARLEEN, STAATS y
VAN KAN, 2003). Segn AGRIOS (1996), es una de las enfermedades ms comunes
y ms ampliamente distribuidas de hortalizas, plantas ornamentales, frutales, cultivos
tradicionales y por sobre todo, en plantas cultivadas bajo invernadero.

2.6.1. Sntomas

En plantas de lilium, se presenta produciendo el caracterstico micelio gris,

afectndolas en cualquier estado de desarrollo, incluso en postcosecha, llegando a
producir muerte de plntulas, pudricin en la base de las varas, pudricin de bulbos y
tizn de la flor, donde adems se observa abundante esporulacin y desarrollo de
esclerocios si se producen condiciones adversas. B. cinerea puede ser aislada de
lesiones en hojas de lilium, pero no presenta lesiones tan extendidas como las
provocadas por Botrytis elliptica (GOULD, 1963).

VAN BAARLEN, STAATS y VAN KAN (2004), comprobaron la escasa

patogenicidad de B. cinerea, a travs de la inoculacin de plantas sanas de lilium.
Despus de nueve das, se generaron pequeas manchas oscuras, evidencia de escasas
clulas muertas. Las lesiones no se extendieron y a travs del microscopio no
encontraron micelio, pese a observar germinacin de conidias en el lugar de
infeccin. Tambin demostraron que al aumentar la concentracin del inculo era
posible obtener sntomas.

2.6.2. Caractersticas morfolgicas

Entre las caractersticas objetivas para distinguir a B.cinerea de otras especies de

Botrytis estn: el crecimiento y forma del micelio, el tamao y color del conidiforo,
la forma, tamao y color de las conidias, y tamao del esclerocio.

2.6.2.1. Micelio y estructuras reproductivas asexuales

Las colonias al principio son hialinas, luego se tornan gris a caf grisceo con el
desarrollo de las conidias (CMI, 1974). Las hifas son septadas y ramificadas
(JARVIS, 1977).

Los conidiforos son erguidos, simples o ramificados (ALEXOPOULOS, 1966).

Miden 750 m hasta 2 mm de longitud y 16-30 m de ancho, tienen una
protuberancia apical con ramificaciones alternas. Presentan color caf oscuro y tienen
la pared lisa (CMI, 1974). En las clulas apicales se producen racimos de conidias
unicelulares y multinucleadas (CMI, 1974). Los conidiforos y los racimos de
conidias se asemejan a un racimo de uvas (AGRIOS, 1996). En la superficie de las
hojas infectadas se elevan uno a dos mm.

Las conidias son ovales o esfricas, hialinas o de color caf plido, hidrfobas, de
pared lisa y miden entre 8-14 m de largo y 6-9 m de ancho (CMI, 1974, HSIANG
y CHASTAGNER, 1991).

2.6.2.3. Esclerocios

Este hongo produce esclerocios irregulares, planos, duros y de color negro (AGRIOS,
1996). Segn HSIANG y CHASTAGNER (1992) el tamao vara entre 3,5 y 5 mm.
stos consisten en una mdula densamente empaquetada con un pseudoparnquima
color caf a negro y una capa cortical de clulas de 5-10 m de dimetro. La parte
externa est compuesta por una malla de hifas entramadas unindose en un cuerpo
compacto que va madurando por la acumulacin de pigmentos de melanina.

10

2.6.3. Reproduccin sexual.

El teleomorfo es Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel . Este estado se caracteriza

por la produccin de apotecios de color caf claro que emergen del esclerocio durante
la primavera o a principios del verano. El apotecio se caracteriza por poseer una
superficie poco hendida, casi llana. El estipe mide entre 3 a 15 mm. Las ascosporas
que se originan del apotecio miden 8-12 m de largo y 4-6 m de ancho (CMI,
1974).

2.6.4. Desarrollo de la enfermedad.

2.6.4.1 Infestacin

La infestacin o inoculacin es el proceso mediante el cual un patgeno y su

hospedero entran en contacto. En el caso de B. cinerea se produce cuando la conidia
diseminada entra en contacto con el hospedero. Tambin ocurre cuando una
superficie infestada con micelio entra en contacto con un tejido sano (AGRIOS,
1996).

2.6.4.2. Penetracin

La conidia, despus de haber sido incubada unas horas bajo condiciones favorables a
la germinacin, se adhiere fuertemente a un sustrato vivo o descompuesto mediante la
produccin de

secreciones (DOSS et al., 1995). Una vez adherida penetra

directamente al perforar mecnica y/o enzimticamente la cutcula e indirectamente

por heridas o por aberturas naturales (principalmente estomas y estigmas)
(LATORRE, 1986).

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La penetracin mecnica de B. cinerea se realiza travs del apresorio que nace del
extremo distal de la conidia germinada. De este apresorio surge el estilete de
infeccin, el cual penetra directamente la cutcula hasta las clulas epidermales
(AUGER, 1988). En lilium, las conidias que han germinado rara vez penetran
directamente en los tejidos que muestran un crecimiento activo, pero si lo hacen a
travs de heridas o despus de que se han desarrollado durante un cierto tiempo y han
formado micelio sobre ptalos de flores senescentes, follaje senescente, escamas de
bulbos muertos, etc. (HSIEH, HAUNG y HSIANG, 2001).

La penetracin enzimtica de la cutcula, se produce gracias a la produccin de

enzimas como pectinasas y polygalacturonasas (VERHOEFF, 1974). Adems, el
patgeno produce cido oxlico que acidifica el tejido de la planta para facilitar la
hidrlisis de la pared celular (VAN BAARLEN, STAATS y VAN KAN, 2004).

Durante la penetracin, en las clulas del tejido de la hoja se produce perxido de

hidrgeno y xido ntrico, que permiten el ingreso del tubo de germinacin de las
conidias (VAN BAARLEN, STAATS y VAN KAN, 2004). Sin embargo, este
proceso de infeccin se bloquea durante la penetracin de la pared celular, debido a
que la planta es capaz de generar una respuesta en defensa al ataque de este patgeno
(HSIEH, HAUNG y HSIANG, 2001).

2.6.4.3. Infeccin

La enfermedad puede manifestarse en forma sintomtica o latente. La infeccin

sintomtica corresponde a la infeccin comn, en la cual el patgeno ha penetrado
directamente o por heridas. LATORRE (1986) seala que si las condiciones son
ptimas, la incubacin ocurre en pocas horas y rpidamente se producen
reinfecciones, debido a las conidias producidas luego del desarrollo de los primeros
sntomas de Botrytis.

12

La infeccin latente o asintomtica es aquella en la que el patgeno ha cesado de estar

agresivo temporal o permanentemente y los sntomas no estn presentes. Segn
VERHOEFF (1974), la infeccin puede permanecer latente hasta un punto en el cual
el estado agresivo nunca se activa o lo hace muy tarde como para afectar gravemente
a la planta.

La presencia de B. cinerea en forma latente en lilium es particularmente daina, ya

que durante el traslado o la exportacin, si se producen las condiciones ptimas de
crecimiento, provocaran una pudricin (MILLER, 1992).

Esta fase es un mecanismo de sobrevivencia y de alguna forma podra influir en las

epidemias. Adems le permite mantenerse hasta que el tejido se vuelva senescente y
no oponga resistencia al ataque (BRAUN y SUTTON, 1988).

2.6.4.4. Resistencia a la enfermedad

Un estudio realizado en lilium al inocular flores con conidias demostr que una
secrecin de fitotoxinas lograban bloquear la infeccin en el interior del ovario, al
crear deficientes condiciones para el desarrollo del hongo. Se observo un aumento de
la accin de la peroxidasa cerca del crecimiento del micelio, adems de un
incremento de la concentracin alrededor en las paredes celulares. La peroxidasa
acta lignificando la pared celular lo que provocara una mayor resistencia
(GEORGIEVA, EDREVA y RODEVA, 2003).

Esta respuesta defensiva no es propia de lilium. En estudios realizados en tomate se

comprob la presencia de un aumento de la peroxidasa frente al ataque de Botrytis
cinerea. Este efecto es una respuesta frente a la presencia de hongos, bacterias y virus
(GEORGIEVA et al., 2003)

13

2.6.4.5. Dispersin

En clima hmedo, el hongo libera fcilmente sus conidias y stas son diseminadas
por el viento (AGRIOS, 1996). Segn LATORRE (1986) la lluvia, por el fenmeno
de salpicado, tiene tambin importancia en la liberacin y diseminacin de conidias.
Al interior de un invernadero, las conidias son liberadas al ambiente por un
mecanismo higroscpico asociado a un cambio rpido en la humedad relativa
(DAUGHTREY y BENSON 2005).

MILLER (1992) seala que es fundamental el manejo de los desechos del cultivo, ya
que ellos provocan una dispersin de esporas si no son tratados adecuadamente.

2.6.4.6. Sobrevivencia

B. cinerea puede sobrevivir como saprfito en un gran nmero de plantas cultivadas y

malezas, o en materias en descomposicin (AUGER, 1988). Las conidias pueden
sobrevivir por ms de 14 meses en almacenamiento, aunque disminuye su viabilidad.
(SALINAS et al., 1989). Sin embargo, sobre la tierra no son capaces de lograrlo. En
el suelo el hongo inverna en forma de esclerocios producidos sobre restos orgnicos
dejados luego de cosechar las flores, o de micelio que se desarrolla en restos de
plantas en proceso de descomposicin (BERG y LENTZ, 1968).

2.6.4.7. Fuente de inculo

DAUGHTREY y BENSON (2005), descubrieron que los esclerocios pueden

sobrevivir bastante tiempo y ser tiles como fuente de inculo para la siguiente
estacin. El tiempo que pueden sobrevivir flucta entre cinco y nueve meses.
Prcticas de control de malezas tanto qumicas como mecnicas no tienen efecto en
su sobrevivencia.

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2.6.5. Efecto de los factores ambientales

Para que una enfermedad se produzca y se desarrolle ptimamente, debe haber una
combinacin de tres factores: hospedero susceptible, patgeno infectante y un medio
ambiente favorable (AGRIOS, 1996).

2.6.5.1. Temperatura de crecimiento

JARVIS (1977) encontr que la temperatura ptima de crecimiento de micelio de

Botrytis cinerea en medio PDA es de 22C. En condicionas ambientales controladas,
no se detect produccin de micelio areo ni de conidias a temperaturas de 30C.

El micelio requiere de un clima hmedo y moderadamente fro (18 a 23C) para que
se desarrolle adecuadamente, esporule, libere y germine sus esporas y para que
produzca infeccin (DAUGHTREY y BENSON, 2005).

2.6.5.2. Temperatura de esporulacin

Existen diferencias notables de acuerdo al hospedero del cual se obtiene la cepa.

THOMAS, MAROIS y ENGLISH (1988) estudiando cepas del patgeno obtenidas
de uva; sealan que la mayor produccin de conidias bajo condiciones ambientales
controladas se logr a 21C. Sin embargo, JARVIS (1977), define la temperatura
ptima para la esporulacin en 15C.

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2.6.5.3. Temperatura de germinacin e infeccin

Segn LATORRE y RIOJA (2002) la germinacin de conidias ocurre en un

amplio rango de temperaturas (5 a 30C), con un ptimo de 20C.

La infeccin puede ocurrir a bajas temperaturas cuando las plantas permanecen

mojadas por largos perodos de tiempo (RIES, 1995). JARVIS (1992) seala que la
temperatura ptima de germinacin de esporas es de 20C y la temperatura ptima de
crecimiento del tubo germinativo es de 30C.

2.6.5.4. Temperatura para la formacin de esclerocios.

De acuerdo con JARVIS (1992) los esclerocios se forman en otoo-invierno cuando

las temperaturas fluctan entre 11 y 13C y germinan con temperaturas de 22 a
24C.

2.6.5.5 Humedad

El efecto ms importante de la humedad ocurre sobre la germinacin de las conidias

de los hongos y sobre la penetracin del tubo germinativo en el hospedero. Tambin
influye al incrementar la suculencia del hospedero, aumentando as su susceptibilidad
a ciertos patgenos (AGRIOS, 1996).

La humedad relativa necesaria para que ocurra infeccin es mayor al 90%, que
provoca condensaciones producto de la evapotranspiracin, difciles de medir, pero
suficientes para iniciar la germinacin e infectar al hospedero. Los eventos de
infeccin en el campo se inician en respuesta a lluvias, lloviznas o presencia de
neblinas que condensan sobre el rgano afectado (LATORRE y RIOJA, 2002).

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2.7. Botrytis elliptica:

La especie Botrytis elliptica (Berk.) Cooke es infecciosa en la mayora de las

variedades de lilium, incluso algunas pueden llegar a la muerte si las condiciones
favorecen su desarrollo ( GOULD, 1963).

Su distribucin a nivel mundial se debe a la introduccin de material vegetal

proveniente de zonas endmicas ( Holanda) hacia pases donde el cultivo ha tenido
una buena perspectiva comercial. HUANG et al., (2000) descubrieron variabilidad
gentica entre aislados de zonas tan distante como Norteamrica y Asia (Taiwn),
pero no se encontr evidencia de que algn morfotipo sea especfico para una regin
geogrfica.

2.7.1. Sntomas.

La enfermedad provocada por este hongo, produce inicialmente manchas en hojas

con bordes bien delimitados, que al necrosarse toman una coloracin caf oxidado
con formacin de anillos concntricos, caractersticas que la diferencian de B.
cinerea. La superficie del tejido limitada por el anillo, visible tanto por el haz como
por el envs, se degrada poco a poco, se arruga y finalmente se seca. La hoja puede
ser atacada por el borde o el interior del limbo, al ingresar por el borde la hoja se
deforma y es fcilmente confundida con sntomas de virus (GOULD, 1963, MILLER,
1992, SEEMANN y ANDRADE, 1992).

CABRERA, ALVAREZ y SOSA DE CASTRO (2005) destacan su forma elptica,

ms anchas en el centro y con los extremos aguzados, que al envejecer adquieren
color grisceo y aspecto velloso por la presencia de las estructuras reproductivas. Esta
necrosis comienza generalmente en el extremo de la hoja o en la parte media y luego
se extienden hasta el tallo. Sealan adems que las infecciones ms agudas se

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observan preferentemente sobre las hojas ms jvenes donde los sntomas son ms
severos.

GOULD (1963) y BAON et al. (1993) concuerdan que, en plantas jvenes, cuando
el dao se produce en el pice, puede detener el crecimiento. El hongo puede atacar
los tallos cerca del nivel del suelo, provocando una amarillez en el follaje.

VAN BAARLEN, STAATS, y VAN KAN (2004) observaron como primer sntoma
la traslucides de la epidermis, anterior a la lesin necrtica, luego de un da de la
inoculacin experimental. A travs de microscopio ptico visualizaron plasmlisis de
las clulas, luego de tres das de infeccin ubicada en la zona adyacente a la lesin.

Las flores senescentes son un punto de entrada para la enfermedad. MILLER (1993)
menciona que stas presentan manchas de color caf y que en condiciones fras y
hmedas se pudren rpidamente cubrindose de esporas. En condiciones secas las
lesiones dejan de crecer y se secan. Cuando los botones florales son infectados en sus
primeras fases de desarrollo, los ms externos evidencian protuberancias y en los
tpalos aparecen una serie de punteaduras, de color gris que al tacto se manifiesta
como una podredumbre blanda. Si las flores no son removidas, se inclinan sobre las
hojas superiores reteniendo humedad, dando las condiciones apropiadas para el
ataque. Los hbridos orientales son menos susceptibles que los asiticos.

En algunas ocasiones, en lilium asiticos, la hoja presenta estras amarillas o rojas en

sentido longitudinal a la lesin. DOOS, CHASTAGNER y RILEY (1988) sealaron
que esto era provocado por una aceleracin de la senescencia en la zona adyacente al
punto de infeccin. Demostraron adems que esto ocurra en plantas maduras y en
hojas basales.

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2.7.2

Caractersticas morfolgicas

2.7.2.1. Micelio y estructuras reproductivas asexuales.

Las colonias se presentan blanquecinas, expansivas, de aspecto algodonoso y denso,

que luego se tornan gris, caf grisceo o negro. Las hifas son septadas y ramificadas
(CABRERA, ALVAREZ y SOSA DE CASTRO, 2005).

Esta especie se caracteriza por producir conidiforos formndose a partir del micelio,
ramificados en los extremos, formando estructuras fialdicas pequeas (CABRERA,
ALVAREZ y SOSA, 2005). Los conidiforos son abundantes, de color caf claro y
de 500 m a 2 mm de largo (GRIGALIUNAITE, 2001).

En cada pice de las filides del conidiforo nacen conidias hialinas o tenuemente
coloreadas, que se oscurecen a la madurez, de forma elipsoide a ovoide (SMITH et
al., 1992). Bajo condiciones favorables el conidiforo se desarrolla sobre las lesiones,
produciendo conidias que maduran en 9 horas (GOULD, 1963).

Segn DOSS, CHASTAGNER y RILEY (1984) este patgeno no produce conidias

en forma abundante en condiciones de laboratorio. Sin embargo, ellos lograron
obtener microconidias. stas son hialinas, de dimetro entre 2 a 3,4 m y son
formadas en cortas fialides que miden entre 5,9 a 10,7 m de largo. Segn JARVIS
(1977) todas las especies de Botrytis tienen la capacidad de producir microconidias.
Las dimensiones de las conidias varan entre 18 a 32 m de largo y 13 a 24 m de
ancho (DOSS, CHASTAGNER y RILEY, 1984).

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HSIANG y CHASTAGNER (1991) midieron el tamao de conidias sensibles a

fungicidas y las compararon con aquellas resistentes. El tamao de las conidias
provenientes de cepas sensibles promedio 17,8 m de largo y 10 m de ancho
mientras que las cepas resistentes promediaron los 26,4 m de largo y 19,2 m de
ancho.

2.7.2.2. Esclerocios

B. elliptica produce esclerocios blancos en un principio, posteriormente se vuelven

negros, de forma redonda, elptica o irregular. Bajo condiciones favorables germinan
en la primavera siguiente para producir micelio que dar origen a otro ciclo de
infeccin. Al madurar en las hojas afectadas caen a la tierra durante el verano. Estos
raramente se producen en el bulbo. (GOULD, 1963, VAN DEN ENDE y
PENNOCK-VOS, 1997). El dimetro vara entre 1 y 2,1 mm (HSIANG y
CHASTAGNER, 1992).

2.7.3. Reproduccin sexual

Despus de muchos ensayos, DOSS, CHASTAGNER, y RILEY (1992) fueron los

primeros en producir un estado sexual en laboratorio, al producir apotecios de los
cuales se originan ascosporas. Sin embargo, no se encontr evidencia suficiente de su
ocurrencia natural en el ambiente.

20

2.7.4. Desarrollo de la enfermedad

2.7.4.1. Penetracin

A travs de estudios histolgicos se ha podido determinar que la penetracin ocurre

en el envs de la hoja a travs del estoma (DOSS, CHASTAGNER y RILEY, 1984).

HSIEH, HAUNG y HSIANG (2001) observaron que a 20C y 100% de humedad

relativa las conidias germinan en ambas superficies de la hoja de lilium, pero los
tubos de germinacin no invaden las clulas epidermales del haz. El apresorio, de
poca longitud (menor a 20 m), puede penetrar a travs de la apertura estomtica,
directamente en las clulas epidermales, pero el mayor porcentaje de penetracin
ocurre en la epidermis de las clulas de guarda (52%). Bajo estas condiciones
controladas, luego de nueve horas el 60% de las conidias germinadas lograba la
penetracin. GOULD (1963) seala que las primeras lesiones aparecen luego de 10
horas despus de ocurrida la penetracin si las condiciones favorables estn presentes
en forma continua.

2.7.4.2. Infeccin

VAN BAARLEN, STAATS y VAN KAN (2004) sealan que la patogenicidad y

especializacin de Botrytis elliptica para infectar plantas de lilium se demuestra por el
mecanismo denominado muerte celular programada. Una de las etapas es la
induccin de la fragmentacin de ADN, proceso especfico en la infeccin de B.
elliptica, el cual no ocurre durante el ataque de B. cinerea. Sin embargo, el rea de
infeccin provocada permite a B. cinerea infectar y colonizar a la planta. El contenido
celular es ocupado como fuente nutritiva por el patgeno para continuar su avance

21

por los tejidos. Otra diferencia sustancial es que B. elliptica afecta principalmente
tejido sano, mientras que B. cinerea afecta tejido daado o muerto.
Esta enfermedad presenta un perodo muy breve de incubacin, expandindose
rpidamente sobre hojas jvenes o ptalos, debido a que estos rganos presentan
tejidos ms dbiles y suculentos. Destaca su carcter necrotrfico debido al rpido
avance y abundante esporulacin sobre los tejidos muertos cuando tiene condiciones
ambientales favorables como las de un invernadero (ALVAREZ, CABRERA y
SOSA DE CASTRO, 2005).

2.7.4.3. Diseminacin

La diseminacin ocurre principalmente cuando, en condiciones favorables, los

esclerocios o el micelio producido en tejidos muertos producen conidias que son
transportadas por el viento, y por salpicaduras de agua hacia el follaje que se
encuentra en desarrollo durante la primavera ( HUANG et al., 2001).

2.7.4.4. Sobrevivencia

El patgeno perdura como saprfito en los residuos vegetales enfermos. (VAN DEN
ENDE y PENNOCK-VOS,1997)

Segn GOULD (1963) sobrevive durante el invierno a travs de los esclerocios. En

algunas ocasiones se ha demostrado que puede pudrir los bulbos, lo que significara
otra forma de supervivencia, pero el autor seala que rara vez ocurre esto en la
naturaleza.

22

2.7.4.5. Fuente de inculo

VAN DEN ENDE y PENNOCK-VOS (1997) mencionan que los esclerocios

formados en los tallos muertos de lilium luego de la cosecha juegan un rol importante
en la epidemiologa. Ellos determinaron que los esclerocios que permanecen latentes
en el verano corresponden al inculo primario para la infeccin de la prxima
temporada.

2.7.5. Resistencia a fungicidas.

El uso intensivo de fungicidas para el control de esta enfermedad ha provocado la

aparicin de cepas resistentes. HSIANG y CHASTAGNER (1991) aislaron cepas
resistentes a Dicarboximidas y Benzimidazoles. Las primeras crecen ms lento en
medio de cultivo, sus conidias son ms largas y el doble de ancho que las conidias
normales. Los autores determinan que esta caracterstica le confiere una capacidad de
sobrevivir ms tiempo y ser ms infectiva. Las cepas resistentes a Benzimidazoles
producen menos conidias y los esclerocios son de mayor tamao y ms numerosos
que los de las cepas sensibles.

2.7.6. Efecto de los factores ambientales

2.7.6.1. Temperatura de crecimiento

La temperatura ptima de crecimiento es de 15 C (GOULD, 1963). Este autor seala

adems que a dicha temperatura y humedad relativa alta la enfermedad se repite en
ciclos en pocos das durante todo el perodo de crecimiento del cultivo, produciendo
esclerocios en las partes enfermas. HSIANG y CHASTAGNER (1991) demostraron
experimentalmente que B. elliptica crece ms lento que B. cinerea en medio de
cultivo a 20C.

23

2.7.6.2. Temperatura de esporulacin.

En laboratorio se ha demostrado que un rango de 5-20C, acompaada de una

humedad relativa mayor al 90% produce la esporulacin a partir de micelio. Las
temperaturas ptimas para la produccin de conidias son aquellas menores a 10C
( HUANG et al., 2001).

2.7.6.3. Temperatura de germinacin e infeccin

La germinacin de las conidias sobre el tejido ocurre a una temperatura ptima de

15C, pero una vez que el hongo ha ingresado a la planta se desarrolla mejor a 21 C
(GOULD, 1963). DOSS, CHASTAGNER y RILEY (1984) demostraron que la
infeccin es ms rpida a 20 C que a 25 C, manteniendo las hojas con una pelcula
de agua por 48 horas.

2.7.6.4. Humedad

Adems de la amplitud trmica, la humedad relativa del ambiente es muy importante

para el desarrollo de la enfermedad. La humedad ambiente elevada (mayor al 90%)
presente en los invernaderos es un factor decisivo para los ataques de este hongo,
favoreciendo la germinacin de las conidias ( VAN DEN ENDE y PENNOCK-VOS,
1997).En condiciones de baja humedad ambiental la lesin se seca y el patgeno deja
de extenderse. En cambio, bajo condiciones hmedas las lesiones se unen y afectan
toda la hoja, la cual se cubre de micelio grisceo y acaba pudrindose, afectando
luego a toda la planta. (GRIGALIUNAIT, 2001).

Una humedad relativa mayor al 90% permite la esporulacin del esclerocio (VAN
DEN ENDE y PENNOCK-VOS, 1997).

24

3. MATERIALES Y MTODOS

3.1. Ubicacin del muestreo:

El muestreo se realiz en un predio perteneciente a una empresa dedicada a la

produccin y exportacin de flores, ubicado en la comuna de Olmu, V regin.

Se analizaron plantas con una misma fecha de plantacin hasta la cosecha, de las
variedades asiticas: All Round, Black Out, Tresor y Valdisole, entre los meses de
abril y julio de 2005, y luego un segundo perodo desde la segunda semana de julio
hasta septiembre de 2005 con las variedades asiticas: Algarve, Black Out, Madrid,
Navona, Umbra, Menorca, Gironde y Wiener Blut.

El cultivo se encontraba bajo invernadero fro en mesas de 36 m de largo y 1,2 m de

ancho en las cuales existan 60 bulbos por metro cuadrado, correspondiente a un
calibre 12-14 cm. En la zona de muestreo existan 42.000 plantas en 21 mesas del
sector analizado durante del primer perodo. En el sector del segundo perodo existan
58.500 en 30 mesas aproximadamente ( Anexo 1).

Las labores realizadas corresponden al manejo propio de este cultivo a escala

comercial. Un detalle de la aplicacin de fungicidas se describe en el Anexo 2.

3.2. Metodologa de muestreo:

Las muestras fueron obtenidas semanalmente mediante un muestreo sistemtico con

arranque aleatorio del 0,2%. El nmero de la primera planta fue elegido al azar, a la
cual se le sum 500 en la misma mesa para obtener el nmero de la segunda planta a
muestrear y as sucesivamente. Para ello se utilizaron planillas en las cuales se

25

registr la incidencia anotando la presencia o ausencia del sntoma o signo del agente
causal Botrytis sp. (Anexo 3). Las muestras de hojas con lesiones eran recolectadas y
colocadas en bolsas plsticas con cierre hermtico para su traslado al laboratorio.

3.3. Determinacin de la incidencia de Botrytis.

Esta se realiz mediante la observacin de sntomas presentes en la superficie de la

hoja. Para corroborar la presencia del agente causal se realizaron cmaras hmedas. A
partir de esta informacin se calcul la incidencia de Botrytis de acuerdo a la
siguiente frmula:

Incidencia de Botrytis ( %) = N de plantas con sntomas de Botrytis en hojas X 100

N total de plantas muestreadas.

La incidencia fue calculada por variedad, para el caso de B. cinerea y B. elliptica.

Adems, para esta ltima especie se calcul la incidencia sin considerar la variedad,
para observar la tendencia general de la enfermedad durante el perodo de estudio.

3.3.1. Correlacin entre la incidencia de Botrytis y factores ambientales.

Para lograr correlacionar la incidencia de Botrytis con la temperatura y humedad

relativa en los sectores analizados, se dispusieron sensores calibrados para registrar
estos datos cada una hora. Una vez finalizado el muestreo, los datos fueron obtenidos
mediante el programa computacional Termocron. Las temperaturas mximas,
mnimas y humedad relativa diarias fueron utilizadas para obtener las medias
semanales. Estos datos se correlacionaron con la incidencia de Botrytis mediante
grficos y el posterior anlisis de los mismos.

26

3.4. Estimacin del ndice de dao:

Para calcular el ndice de dao causado por ambas especies de Botrytis, este se
calcul mediante la siguiente frmula:

ndice de dao: ID =

(nv )100
VN

donde:

n : n de plantas por nivel de la escala

v : nivel de la escala ( grado de ataque)
N : n total de plantas observadas.
V : Rango mximo de la escala

El grado de ataque vari de 0 a 3, utilizndose la siguiente escala de evaluacin:

0 = Ausencia de sntomas (lesin caf circular o elptica)

1 = 1-2 lesiones presentes en la hoja.
2 = 3-6 lesiones presentes en la hoja.
3 = 7 o ms lesiones.

Para corroborar la presencia del agente causal, algunas hojas con sntomas colectadas
en el predio se colocaban siete das en cmaras hmedas, las que fueron
confeccionadas con envases de plstico en cuya tapa se registr la fecha de
recoleccin y la variedad muestreada. La bandeja era previamente desinfectada con
alcohol y luego se le cubra interiormente con papel absorbente estril (toalla Nova)
humedecida con agua estril. En cada una se colocaba una hoja. Estas bandejas
fueron colocadas a temperatura ambiente. Una vez obtenido el crecimiento de micelio
y la presencia de estructuras reproductivas, se pasaba a la etapa de aislamiento.

27

3.5. Pruebas de patogenicidad:

El desarrollo de esta parte del taller se realiz en el laboratorio e invernadero

climatizado de Fitopatologa de la Facultad de Agronoma de la Pontificia
Universidad Catlica de Valparaso, ubicado en el sector de La Palma, comuna de
Quillota, V regin.

Para ambas especies se realizaron los postulados de Koch por no tener referencias a
nivel nacional de la presencia de estos patgenos infectando plantas de lilium.

3.5.1. Aislamiento

Una vez obtenidas las muestras con sintomatologa en el campo se procedi a aislar
en el medio nutritivo agar papa dextrosa acidulado (APDA) con el fin de obtener
aislados, purificarlos y describir las caractersticas que presentaban los hongos as
obtenidos. De las muestras a aislar se extrajeron trozos mediante bistur, de 0,5 a 1
cm2 de la zona de avance de las lesiones. Los trozos de tejido enfermo fueron
sumergidos en una solucin de hipoclorito de sodio al 1% por 15 segundos para
eliminar poblaciones de bacterias y otros saprfitos, luego fueron lavados en agua
estril, dejndolos secar en papel absorbente cerca de un mechero dentro de una
cmara de flujo laminar. Posteriormente eran colocados cuatro trozos en forma
equidistante en el medio anteriormente descrito.

Para las hojas colocadas en cmara hmeda, al observar conidias se pasaba

superficialmente un asa, con la cual se realizaba un estriado en placas con el mismo
medio.

28

Los aislados se incubaron a 23 C en cmara de crecimiento hasta observar el

crecimiento del micelio. Los patgenos obtenidos se purificaron a partir de repiques
de trozos de hifas desde el margen de las colonias. Una vez crecidas las colonias
purificadas se describieron sus caractersticas y se conservaron en tubos de ensayo
con agua estril a 5C. Dos placas por cepa fueron puestas bajo luz cercana a UV (luz
negra) para estimular la produccin de conidias.

3.5.2. Recuperacin de aislados.

A partir de los aislados 786, 787 y 911 guardados durante el ao 2003, clasificados
como Sclerotinia sp. por presentar micelio blanco, esclerocios pequeos de forma
elptica y no producir esporas, se comenz a investigar la posibilidad de producir
apotecio en laboratorio, utilizando la metodologa propuesta por GUTIERREZ y
SHEW (1995) con el fin de corrobar la presencia de este patgeno y obtener
ascosporas para su posterior inoculacin en las plantas.

Los aislados fueron recuperados de tubos de ensayos guardados a 5C, luego

cultivados en placas con medio de cultivo (APDA) y colocados en cmara de
crecimiento a 25C. Posteriormente fueron retirados para colocarlos a temperatura
ambiente hasta observar la presencia de esclerocios. Una vez obtenidos, se
dispusieron en frascos con arena esterilizada y humedecida con agua estril. Se
incubaron a 4C durante un mes. Posteriormente fueron transferidos a una cmara de
crecimiento a 12C.

Los esclerocios puestos bajo estas condiciones, dieron origen a micelio y produccin
de conidias, descartando la presencia de Sclerotinia sp., siendo reclasificados estos
aislados como pertenecientes a la especie Botrytis elliptica.

29

3.5.3. Inoculacin en plantas de lilium.

Luego de aislados los patgenos, se procedi a inocular plantas sanas que fueron
cultivadas en bolsas plsticas, a partir de bulbos previamente desinfectados, de las
variedades Algarve, Wiener Blut, Gironde y Navona. El sustrato utilizado tambin
fue previamente desinfectado. El control ambiental fue dado por la utilizacin de aire
forzado obteniendo condiciones de temperatura entre 15 y 20C. La humedad relativa
igual o superior al 90%, fue conseguida mediante aspersin de agua sobre las hojas,
los pasillos y las paredes.

Se inocularon seis cepas elegidas al azar, tres correspondientes a la especie B. cinerea

(1010,1014 y 1016) y tres a la especie B. elliptica ( 786,787 y 911).

Cada inculo fue preparado mediante el raspado de cinco placas por cepa, el que fue
depositado en 600 ml de agua estril. Luego se agit por cinco minutos y se agrego
una gota de Tween 20 para disminuir la tensin superficial del agua. El inculo se
concentr a 1 x 106 conidias o propgulo (fragmentos de micelio)/ ml.

Las plantas fueron inoculadas al azar. El ensayo se llev a cabo con 84 plantas en
total, 21 plantas por variedad. Por cada variedad de lilium se inocularon tres plantas
por cepa, dejndose tres plantas como testigo.

Los patgenos fueron inoculados mediante un asperjador manual, rociando las plantas
con una suspensin de conidias para el caso de las cepas de B. cinerea, y de
fragmentos de micelio para el caso de las cepas de B. elliptica (debido a su dificultad
para esporular in vitro). Los testigos fueron rociados con agua estril. Luego de la
inoculacin, las plantas fueron cubiertas con una bolsa plstica de polietileno
transparente, cerrando con elstico a la maceta para evitar el contagio entre

30

tratamientos y lograr un efecto de cmara hmeda. Estas se mantuvieron por 48 horas

para ser posteriormente retiradas.

Las plantas fueron observadas en forma peridica, con el fin de monitorear la

aparicin de sntomas, realizando una evaluacin final de las plantas luego de tres
semanas de inoculadas. La evaluacin se realiz usando una escala de ndice de dao
distinta a la usada en el muestreo, ya que se observ mayor dao debido a que las
condiciones eran favorables y la enfermedad se manifest con mayor expresin de
sntomas (Anexo 4).

3.5.3.1. Anlisis estadstico.

El anlisis estadstico de los datos proporcionados por los resultados de las

inoculaciones, se llevo a cabo a travs de un anlisis de varianza multifactorial
usando un diseo completamente al azar (DCA). Para comparar entre tratamientos se
realiz el test de Duncan para el nivel de significancia del 5 %.

3.5.4. Reaislamiento.

Se debe reaislar el hongo de las plantas inoculadas siguiendo el mismo procedimiento

del aislamiento anterior, para corroborar la presencia de las especies de Botrytis y su
correspondiente identificacin.

3.5.5. Identificacin de cepas de Botrytis obtenidas:

Para identificar las especies de Botrytis aisladas a partir de sntomas, se observ el

color de la colonia, el tamao de las conidias, conidiforo y esclerocios y se compar
con literatura.

31

Por cada cepa se midi a travs de microscopio ptico ( 40 X) el largo y ancho de 50

conidias y 10 conidiforos. Estos resultados se promediaron y se obtuvo el tamao
por especie. En el caso de los esclerocios, fueron medidos 20 por cepa.

32

4. PRESENTACIN Y DISCUSIN DE RESULTADOS

4.1. Incidencia de Botrytis cinerea por variedad:

La presencia de Botrytis cinerea en las plantas se manifest en forma de lesiones

necrticas circulares, de un color caf oscuro a negro, encontrndose algunas con el
caracterstico micelio grisceo.

Al analizar la Figura 1, se observa que la presencia de la enfermedad ocurre en forma

puntual durante el perodo comprendido desde abril a julio, sin presentar algn tipo
de tendencia.

Las variedades All Round y Tresor son las primeras en presentar la patologa durante
la ltima semana del mes de abril. La humedad relativa media es de un 85%,
condicin desfavorable para provocar infeccin (LATORRE y RIOJA, 2002,
GOULD, 1963). Es probable que el patgeno hubiera entrado por heridas sufridas
durante la emergencia de la planta, y que la humedad del tejido facilite su
germinacin y posterior penetracin.

Luego de un mes sin presencia de la enfermedad, aparece en la variedad Valdisole,

verificndose un aumento en las temperaturas mximas, aptas para la germinacin y
el desarrollo del micelio. A su vez las temperaturas mnimas media descendieron,
favoreciendo la esporulacin del micelio, manifestndose el patgeno durante la
semana siguiente en las variedades All Round y Black Out, registrndose condiciones
ptimas para el crecimiento del micelio como para la germinacin de las conidias.

% Valdisole

% Black Out

% All Round

% Tresor

TMn. media sem.

TMx. media sem.

% H.R. media sem.

30

90
25

80
70

C ( T )

20

60
15

50
40

10

30
20

10
0

0
4

5
ABRIL

MAYO

3
JUNIO

1
JULIO

Semanas

FIGURA 1. Incidencia de Botrytis cinerea en plantas de lilium durante abril a julio de 2005. Olmu, V regin.

% ( H.R.), % ( Incidencia)

100

Nuevamente ocurre un perodo sin incidencia, a pesar de presentar condiciones de

temperatura aptas para esporulacin. El factor determinante es la humedad
relativa,que no logra superar el 90%. Esta es controlada en el predio mediante
extractores de aire y la apertura de cortinas a travs de un sistema que permite regular
la altura de las mismas permitiendo una ventilacin adecuada en cada momento.

La primera semana de julio y la ltima correspondiente al muestreo efectuado, se

observa presencia en Valdisole y Black Out. La humedad relativa alcanza el mximo
valor del perodo (93%), lo que puede provocar condensaciones encima de la
superficie foliar estimulando la germinacin de conidias (LATORRE y RIOJA,
2002). Adems, algunas flores antes de cosecha presentaron antesis y liberaron polen
al ambiente, el que segn SALINAS et al. (1989) puede ser usado por B. cinerea
como fuente nutritiva inicial.

El patgeno, al ser de naturaleza polfaga y actuar adems como saprfito, puede

provenir de mltiples focos. El predio se encuentra inserto en una zona de intensa
produccin agrcola, donde los desechos de los cultivos no son manejados
correctamente para evitar la diseminacin. Sin embargo el intensivo uso de fungicidas
permite un control eficiente de esta enfermedad, evidencindose en su nula incidencia
durante el segundo perodo de muestreo.

La presencia de B. cinerea es muy particular durante el desarrollo del cultivo. Es

probable que la penetracin ocurriera a travs del dao provocado por el roce de las
mallas de soporte y al pasar entre las mesas durante las labores propias del cultivo. La
infeccin en las variedades se observa en perodos diversos, al inicio con plantas
pequeas y susceptibles a dao (All Round y Tresor), en un perodo intermedio entre
vegetativo y aparicin de primeras flores (Valdisole, All Round y Black Out) y
cercano al perodo de cosecha antes de antesis (Tresor, Black Out y Valdisole).

36

4.2. ndice de intensidad de dao de B. cinerea:

El grado de ataque provocado por B. cinerea en hojas de lilium, fue de una a dos
lesiones por hoja. Si se analizan los ndices, se encuentran en un nivel bajo
alcanzando el mximo valor de 3,3% en la variedad Black Out. El detalle de los
ndices se encuentra el Anexo 5.

Al analizar en forma conjunta la incidencia y el ndice de dao, es posible inferir que

la enfermedad provocada por este patgeno no fue un problema significativo durante
el perodo estudiado.

4.3. Incidencia de Botrytis elliptica en el cultivo:

Durante el primer perodo observado no se detect su presencia en el cultivo. Las

condiciones de humedad relativa mayor al 95% favorables para la germinacin de las
conidias slo se presentan al final del perodo (Figura 1). Adems las temperaturas
mximas no descendieron de los 20 C, lo cual s ocurri durante el segundo perodo
de evaluacin.

De acuerdo a los sntomas observados en terreno y al posterior anlisis efectuado en

laboratorio, este patgeno comenz su desarrollo entre la segunda y tercera semana
de julio, pasando de un 0% de incidencia hasta alcanzar el valor mximo de 45%
(Figura 2).

Al observar los datos de humedad y temperatura mnima, se desprende que existi

una condicin predisponente durante esa semana para la germinacin de conidias
sobre las hojas y su posterior infeccin, observando perodos del da superiores al
95% de humedad relativa, con temperaturas mnimas que fluctuaron entre 3 y 8C,
con

una

mnima

media

de

5C.

INCIDENCIA (%)

T Mn. media sem.

T Mx. media sem.

H.R. media sem.

100

30

80
70

C ( T)

20

60
50

15

40
10

30
20

% ( H.R ), % (Incidencia)

90
25

10
0

0
2

3
JULIO

AGOSTO

SEPTIEMBRE

Semanas

FIGURA 2. Incidencia de Botrytis elliptica en cultivo de lilium bajo invernadero, Olmu, julio a septiembre de 20

La variacin de las condiciones entre la semana anterior y en la cual se observ la

lesin es muy notoria, visualizndose claramente un descenso en la temperatura. Al
analizar detenidamente estos datos, se deduce que debi haber condensacin sobre las
superficies de las hojas. Estas condiciones contribuyeron a formar una pelcula de
agua que junto a temperaturas que bordean los 15 favorecen la germinacin de
conidias (GOULD, 1963).

Las temperaturas mximas mayores al 20 C durante algunas horas del da,

favorecieron el posterior desarrollo de la enfermedad ya que el patgeno una vez
ingresado a la planta crece mejor a 21C (GOULD, 1963).

Las probables fuentes de infeccin pueden ser esclerocios originados durante la

temporada anterior, que permanecen en el suelo de los alrededores, en los pasillos o
en potreros cercanos. Adems, algunos restos del cultivo eran depositado en
quebradas cercanas, y al encontrar condiciones adversas el micelio produce este tipo
de estructuras de resistencia. Las bajas temperaturas y la alta humedad relativa
invernal dada por las lluvias (mayor al 90%) fuera de los invernaderos, permiten
suponer que los esclerocios encontraron las condiciones para esporular, y estas
conidias lograron ser diseminadas por el viento (VAN DEN ENDE y PENNOCK
VOS, 1997).

La diseminacin de las conidias dentro el invernadero es probable que se produzca a

travs del movimiento de aire que ocurre al levantar las cortinas para bajar la
humedad relativa ( HUANG et al., 2001).

Al igual que B. cinerea, las conidias tienen una fuente nutritiva al contar con polen
proveniente de los cultivos anteriores que se encuentran en perodo de cosecha. A
pesar de que la vara se cosecha en botn cerrado, algunas flores abren antes de

39

tiempo, liberan el polen que se dispersa por el viento y se deposita en la superficie de

las hojas de plantas cercanas.

En forma general, se observa un descenso paulatino durante el perodo comprendido

entre julio y septiembre, debido probablemente a la aplicacin semanal y rotacin de
tratamientos qumicos que frenan el desarrollo del hongo. Sin embargo, a medida que
se desarrolla el cultivo presenta una mayor rea foliar que impide el ingreso de
productos a zonas ms bajas.

Durante las primeras semanas de agosto se observa un descenso de un 10% de

incidencia respecto al mes anterior, dado probablemente por un aumento de las
temperaturas mnimas que impidieron la formacin de pelculas de agua permanentes
para la germinacin de conidias. Se registr un leve aumento de la incidencia durante
la tercera semana, condicin dada por un aumento de las temperaturas mnimas
medias de las semanas anteriores, observndose adems un aumento de la humedad
con respecto a las dos primeras semanas, pasando de un 88 a un 91% promedio
semanal, lo que favorece la germinacin de conidias que no alcanzaron a germinar en
julio o probablemente a un nuevo ciclo de infeccin dado por la formacin de
conidiforos sobre las lesiones anteriores (GOULD, 1963).

En el mes de septiembre, durante la primera semana se mantiene la tendencia de

agosto a pesar de que la temperatura mxima descendi considerablemente y la
humedad relativa media alcanz su mximo valor (94%). En las ltimas semanas se
distingue un aumento progresivo de la temperatura y un descenso de la humedad,
coincidiendo con las mnimas incidencias. Estas condiciones son muy distintas a las
que dieron origen a la infeccin.

Cabe destacar que no se encontr sntomas en flores o tallos, solamente en hojas

principalmente en la mitad superior de la planta.

40

4.4. ndice de intensidad de dao de B.elliptica:

En forma general, la intensidad de dao de B. elliptica, al igual que su incidencia, va

disminuyendo durante el perodo. Analizando los datos (Anexo 6), es posible inferir
que la enfermedad no afect a la planta en forma agresiva, alcanzando en forma
general una a dos lesiones presentes en la hoja, encontrndose en forma puntual el
ndice 2 (tres a seis lesiones por hoja) al inicio del perodo, momento en el cual se
encontraban las condiciones ambientales favorables para su desarrollo.

No se encontraron plantas con ms de siete lesiones y que comprometieran el estado

general de la planta, y como se seal anteriormente, debido al fuerte uso de
pesticidas para frenar las enfermedades y lograr una mejor calidad de la vara.

4.5. Incidencia de Botrytis elliptica por variedad:

De acuerdo a la Figura 3, las variedades ms afectadas corresponden a Algarve,

Wiener Blut, Menorca, Madrid y Umbra. Cabe destacar que estas variedades
presentan un ancho de hoja mayor que las otras variedades, lo que permite captar una
mayor cantidad de inculo, adems de dificultar la ventilacin, originando
condiciones favorables para la presencia de agua libre sobre su superficie.

La tendencia presentada en las variedades Navona y Gironde es notoriamente

diferente. Existe una menor incidencia al comienzo de la infeccin, la que se
mantiene constante hasta la ausencia de sntomas al final del perodo. Es preciso
sealar que sus hojas son de forma alargada y con inclinacin de los pices hacia el
suelo, lo que dificulta la permanencia de gotas de agua necesarias para la germinacin
de las conidias (GOULD,1963). Esto adems favorece una ventilacin ms adecuada
en

zonas

bajas.

NAVONA
W. BLUT
T Mn. media sem.

UMBRIA
MADRID
T Mx. media sem.

GIRONDE
ALGARVE
H.R. media sem.

MENORCA
B. OUT
100

30

25

80
70

C ( T)

20

60
15

50
40

10

30

% ( H.R ), % (Incidencia)

90

20

10
0

0
2

3
JULIO

AGOSTO

SEPTIEMBRE

Semanas

FIGURA 3. Incidencia de Botrytis elliptica por variedad en cultivo de lilium. Julio a septiembre 2005. Olmu, V regin

A diferencia de Algarve y Umbra, y usando la misma densidad de plantacin es

posible divisar el suelo desde la parte superior ya que las variedades anteriormente
mencionadas formaban una barrera que dificultaba el paso del aire, y mantena el
suelo hmedo luego de los riegos.

Black Out, nica variedad cultivada en ambos perodos de muestreo, no present

sntomas asociados a este tipo de enfermedades.

4.6. ndice de intensidad de dao por variedad:

Las variedades Algarve, Menorca y Wiener Blut presentan su mayor ndice de dao
(Figura 4) en el momento en que ocurre la mayor incidencia del perodo (tercera
semana de julio). Estas tres variedades alcanzan hasta seis lesiones por hoja,
disminuyendo considerablemente el rea fotosinttica. La tendencia observada es una
disminucin de este ndice a medida que se aproxima la cosecha. El mayor ndice lo
presenta Wiener Blut alcanzando el 35,4 %. Al igual como se mencion en la
incidencia, estas variedades presentan una mayor superficie por hoja y una gran
cantidad de follaje que favorece al patgeno para encontrar una pelcula de agua para
germinar y provocar infeccin.

En el caso de la variedades Madrid, Navona Umbra y Gironde, el ndice vara

durante el perodo o se mantiene constante, no presentando una tendencia general. En
estas variedades el grado de ataque alcanz una a dos lesiones por hoja.

NAVONA
W. BLUT
T Mn. media sem.

UMBRIA
MADRID
T Mx. media sem.

GIRONDE
ALGARVE
% H.R. Media sem.

MENORCA
B. OUT
100

30

25

80
70

C ( T)

20

60
50

15

40
10

30
20

% ( H.R ), % (Indice de dao)

90

10
0

0
2

3
JULIO

AGOSTO

SEPTIEMBRE

Semanas

FIGURA 4. ndice de dao de Botrytis elliptica por variedad durante el cultivo de lilium. Julio a Septiembre 2005.
Olmu,

regin.

4.7. Identificacin de cepas obtenidas:

Los aislados anteriores (786,787 y 911) y los encontrados en el predio de Olmu,

fueron identificados a travs de caractersticas proporcionada por literatura, poniendo
nfasis a las estructuras reproductivas como tamao de conidias, tamao del
conidiforo, tamao de los esclerocios. Adems se estudiaron las caractersticas de la
colonia y sintomatologa observada en terreno como la realizada en las pruebas de
patogenicidad.

La examinacin microscpica de las caractersticas morfolgicas y la observacin

visual de las colonias crecidas en medio de cultivo, permitieron corrobar que las
cepas aisladas durante el primer perodo de muestreo corresponden a la especie
Botrytis cinerea (Anexo 7).

Las caractersticas de la lesin provocada en la hoja, las caractersticas de la colonia y

de los esclerocios permitieron identificar como Botrytis elliptica a las cepas aisladas
durante el segundo perodo (Anexo 7). Estas cepas no lograron esporular dada su
dificultad de producir conidias in vitro, incluso sometindolas a los mismos
tratamientos de luz UV-A de B. cinerea.

Las cepas 786, 787 y 911 lograron producir conodiforos y conidias luego de colocar
hojas con lesiones, obtenidas de las pruebas de patogenicidad, en cmaras hmedas.

4.7.1. Color de la colonia

Las colonias de B. cinerea cultivadas en medio APDA presentaron un micelio

blanquecino que luego de colocarlas en luz negra (UV-A, 320 nm) se torn grisceo y
caf grisceo (Figura 5c). Esta caracterstica concuerda por lo descrito por la
descripcin n 431 del CMI (1974). Por su parte, las colonias de B. elliptica tiene

45

aspecto algodonoso, con micelio denso creciendo sobre la superficie del agar, de
color blanco sin cambio aparente luego del tratamiento de luz (Figura 5d). stas no
presentaron color grisceo como lo observado por CABRERA, ALVAREZ y SOSA
(2005). Es probable que la falta de coloracin sea debido a que no desarroll
estructuras reproductivas en las placas, debido a su dificultad para esporular bajo
condiciones de laboratorio, segn lo observado por DOSS, CHASTAGNER y RILEY
(1984).

4.7.2. Caractersticas de estructuras reproductivas

Las conidias de B. cinerea se observaron lisas, de forma oval. Miden en promedio

10,05 m de largo y 6,27 m de ancho. Los conidiforos de 10 cepas fueron medidos
al microscopio ptico, encontrando un promedio de 1.422 m largo y de 11,6 m de
ancho. Los conidiforos se presentan en forma libre y ramificados. (Figura 5a). Las
dimensiones de ambas estructuras se encuentran dentro de los rangos presentados por
la descripcin n 431 del CMI (1974).

Las conidias de B. elliptica se observaron de forma elipsoide a ovoide, de

dimensiones 23,7 m de largo promedio y de 16,5 m de ancho promedio. Los
conidiforos de Botrytis elliptica presentan 955 m de largo y 86 m de ancho. Estos
se encuentran poco ramificados en los extremos (Figura 5b). Estas caractersticas
concuerdan con la informacin presentada por DOSS, CHASTAGNER y RILEY
(1984), para describir esta especie.

46

FIGURA 5. a) Conidiforo y conidias de Botrytis cinerea. Barra = 20 m.

b) Conidiforo y conidias de Botrytis elliptica. Barra = 20 m.
c)Colonia correspondiente a Botrytis cinerea, luego de 6 das puesta bajo luz negra.
d) Colonia de Botrytis elliptica, expuesta a la misma condicin.

47

4.7.3. Caractersticas del esclerocio.

Los esclerocios de B. cinerea son de color negro, de forma y tamao irregular, miden
de 3 a 5 mm de dimetro, promediando 3,85 mm. Estas dimensiones concuerdan con
las observadas por HSIANG y CHASTAGNER (1992). Se les encuentra aglomerados
o creciendo en forma individual.

Los esclerocios de B. elliptica son de forma redondeada y elptica, de color negro, en

su mayora creciendo en forma individual, de 1 a 2 mm de dimetro. El promedio es
de 1,49 mm. Las dimensiones tambin concuerdan con lo observado por HSIANG y
CHASTAGNER ( 1992).

4.8. Pruebas de patogenicidad:

4.8.1. Sntomas observados

Luego de dos das, las plantas inoculadas con B. elliptica comenzaron a mostrar
sntomas en el envs de la hoja, con presencia de manchas de un color caf oxidado a
naranjo, y de forma alargada (Figura 6c). Posteriormente en el haz, se coloc
traslcida la zona afectada. Este sntoma tambin fue observado por VAN
BAARLEN, STAATS y VAN KAN, 2004. Esa lesin evolucion hasta colocarse de
color caf oxidado, alcanzando entre 1 a 2 cm de largo y 0.5 cm de ancho. Sin
embargo, algunas hojas mantuvieron la mancha traslcida y en otras qued un orificio
en el lugar de la infeccin.

El sntoma caracterstico de la lesin necrtica, se observa primero en la variedad

Algarve, la cual presenta lesiones de forma alargada en las hojas superiores, que
luego de seis das comenzaron a expandirse. Estos mismos sntomas se observaron en
las variedades Gironde, Wiener blut y Navona luego de 10 das.

48

FIGURA 6. a) Lilium infectado por Botrytis elliptica durante el segundo perodo.

b) Lesiones necrticas presentadas en var. Algarve en las pruebas de patogenicidad.
c) Sntoma inicial de B. elliptica observado en el envs. d) Manchas necrticas
puntiformes asociadas a B.cinerea en hojas de lilium artificialmente inoculadas.

49

A los 20 das de inoculacin, dos plantas de la variedad Algarve inoculadas con las
cepas 786 y 911 presentaron marchitez total de la planta, con hojas y tallos secos
donde se aprecian en forma muy ntida de un color ms oscuro el lugar de las lesiones
iniciales y los anillos concntricos. Las dems variedades presentan slo algunas
hojas con lesiones que al extenderse se unan, provocando marchites y posterior
desecamiento ( Figura 6b).

En las plantas inoculadas con B. cinerea, se observaron lesiones muy puntuales, de un

color caf oscuro de no ms de un cm, no extendidas y en menor nmero que las
generadas por B. elliptica. Un sntoma muy distintivo fue observado en el envs de la
hoja, la cual presentaba puntuaciones superficiales de color negro, que luego de
aislarlas en APDA confirmaron la presencia de este patgeno (Figura 6d).

Gironde y Navona adems de presentar las lesiones caractersticas, manifestaron en

las hojas inferiores estras amarillas continuas a la lesin, observadas anteriormente
por DOSS, CHASTAGNER y RILEY(1988).

4.8.2. Evaluacin de la enfermedad.

Luego de 20 das se evaluaron las plantas. Los datos obtenidos fueron sometidos al
anlisis estadstico correspondiente para demostrar la capacidad patognica de ambos
tipos de Botrytis.

Al ser reaisladas las cepas de ambas especies de Botrytis desde las plantas inoculadas,
stas mantuvieron las mismas caractersticas de los aislados originales. Mediante esta
comparacin se cumplen los postulados de KOCH, con lo cual se logr aislar e
identificar las especies Botrytis elliptica (cepa 786,787 y 911) y Botrytis cinerea
(cepa 1010,1014 y 1016) como causantes de enfermedad en lilium cultivados en
invernaderos de la zona de Olmu.

50

Todas las plantas inoculadas con B. elliptica originaron sntomas de lesin expansiva
y necrtica, en mayor o menor grado, por lo cual se reconoce como hongo capaz de
provocar enfermedad en cultivares asiticos de Lilium sp.

Las cepas de B. cinerea, a diferencia de B. elliptica, no lograron ser patognicas para

todas las plantas, lo que sumado a la baja incidencia en el muestreo realizado (Figura
1), se reconoce como un patgeno poco agresivo, pero capaz de provocar
enfermedad.

Las plantas testigos permanecieron sanas durante el ensayo.

Segn el anlisis de varianza existe interaccin entre la cepa de Botrytis y la variedad

en el desarrollo de la enfermedad. Si se compara el efecto de ambas patgenos, se
distingue claramente un mayor dao de B. elliptica por sobre B. cinerea (Figura 7).

Segn los resultados de las pruebas de patogenicidad, Wiener blut no present

diferencias significativas de acuerdo a la cepa de B.elliptica. inoculada.

La variedad Algarve se vio ms afectada que Navona, independiente de la cepa

utilizada.

Las otras variedades tuvieron diferentes efectos dependiendo de la cepa.

Es importante mencionar que no se tienen antecedentes a nivel bibliogrfico de la

susceptibilidad o tolerancia a B. elliptica. de las variedades empleadas.

7
a

ab

abc

abcd
5
Escala

de

bcd

cd

cd

4
fg

3
fgh

gh

2
hhhh

hh

ef

fg

GIRONDE

fgh

ALGARVE
NAVONA
W.BLUT

1
0
Test

1016

1014

1010

911

787

786

Tratamientos

FIGURA 7.

ndice de dao observado en

estadsticamente

significativas,

las pruebas de patogenicidad. Letras distintas indican diferencias

al

5%,

segn

Duncan.

5. CONCLUSIONES

De acuerdo a las pruebas de patogenicidad efectuadas, se demuestra que Botrytis

cinerea y Botrytis elliptica son patgenos capaces de generar enfermedad en lilium
cultivados en invernaderos, aunque los aislados correspondientes a la especie Botrytis
elliptica son los que provocan un mayor dao.

Conforme al estudio epidemiolgico realizado, la incidencia de Botrytis elliptica se

inici en el mes de julio, desarrollndose la enfermedad hasta septiembre, en cultivos
bajo invernadero fro ubicados en Olmu, V regin. La incidencia mxima alcanzada
fue de un 45%, la que ocurri en el mes de julio, asociadas a temperaturas mximas
inferiores a los 20C y humedades relativas superiores al 90%.La especie Botrytis
cinerea aparece en forma dispersa durante el perodo comprendido entre abril y julio,
con un nivel de de incidencia mxima de un 10%.

53

6. RESUMEN

Durante el ao 2003, se observaron lesiones necrticas en hojas de lilium cultivados

bajo invernadero fro en la zona de Olmu, V regin. En la presente investigacin, los
aislados producidos y conservados en ese perodo fueron recuperados para determinar
su patogenicidad.. Al mismo tiempo se realizaron dos muestreos entre abril y
septiembre en la misma zona para determinar la incidencia e ndice de dao
provocada por el patgeno. Esto se relacion con la temperatura y humedad relativa
presente en el invernadero.
La identificacin de los aislados obtenidos se realiz comparando las caractersticas
con literatura. Esto permiti corroborar la presencia de Botrytis cinerea y Botrytis
elliptica.
Botrytis cinerea se detect slo durante el primer muestreo (abril-julio), en forma
puntual y sin presentar algn tipo de tendencia. De los resultados de la incidencia e
ndice de dao, se demuestra que Botrytis cinerea no afecta significativamente al
cultivo. Por el contrario, Botrytis elliptica, no se present en el primer muestreo,
apareciendo en el mes de julio. La incidencia y el ndice de dao disminuyen a
medida que transcurre el muestreo, debido a que varan las condiciones de
temperatura y humedad relativa.
Para realizar las pruebas de patogenicidad, se eligieron los aislados 1010,1014 y 1016
correspondientes a Botrytis cinerea, y 786,787 y 911 correspondientes a Botrytis
elliptica, los cuales fueron inoculados en las variedades Algarve, Wiener Blut,
Gironde y Navona cultivadas bajo condiciones ambientales controladas. Escasas
plantas mostraron sintomatologa asociada a Botrytis cinerea. Todas las variedades
presentaron, en distintos grados, lesiones asociadas a Botrytis elliptica.

De acuerdo al anlisis efectuado, se concluye que ambos patgenos son capaces de

generar enfermedad en plantas de lilium cultivados en invernadero, pero la especie
Botrytis elliptica es la que provoca un mayor dao al cultivo.

54

7. ABSTRACT

During the year 2003, necrotic lesions were observed on lily (lilium sp.) leaves, from
plants cultivated an unheated greenhouse, in Olmu, 5th Region, Chile. In this study,
isolates that were collected and stored were then re-introduced to determine their
pathogenicity. In the same area, between April and September, two samplings were
done to determine the incidence and damage levels provoked by the pathogens. These
were than related to the temperature and relative humidity conditions of the
greenhouse.
The identification of the isolates was done by comparing their characteristics with
previous descriptions from the literature, thus permitting to confirmation of the
presence of Botrytis cinerea and Botrytis elliptica. Botrytis cinerea was detected only
in the first sampling (April-July), and did not show a pattern. The results of the
incidence and damage index show that Botrytis cinerea did not significantly affect the
lilies. On the other hand Botrytis elliptica was not present in the first sampling; it
appeared in the month of July. The incidence and damage index diminished over the
sampling time, due to the variability of temperature and relative humidity conditions.
The Botrytis cinerea isolates 1010,1014 and 1016, and Botrytis elliptica 786, 787,
and 911, were chosen for inoculating the lily varieties Algarve, Wiener Blut, Gironde
and Navona cultivated under controlled environmental conditions. Few plants showed
the symptomatology associated with Botrytis cinerea. All of the varieties had, in
varying degrees, lesions associated with Botrytis elliptica.
As a result of these analyses, it was concluded that both pathogens are capable of
producing disease in greenhouses- grown lilies, but the Botrytis elliptica species
provokes greater damage in this crop.

55

8. LITERATURA CITADA

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ANEXOS

ANEXO 1

N de plantas por variedad de lilium muestreadas.

Variedades del primer perodo.

N de plantas

All Round

6400

Black Out

4400

Tresor

12400

Valdisole

18800

Total

42000

Variedades del segundo perodo

N de plantas

Algarve

12500

Madrid

6000

Wiener Blut

8000

Menorca

6500

Navona

3000

Umbria

12000

Gironde

8500

Black Out

2000

Total

58500

63

ANEXO 2

Fungicidas aplicados durante el primer muestreo.( abril-julio)

3 de mayo

Sumisclex

6 de mayo

Switch

27 de mayo

Sumisclex

10 de junio

Vangard

15 de junio

Aliette

23 de junio

Bemex

Fungicidas aplicados durante el segundo muestreo ( julio-septiembre)

9 de julio

Actara

14 de julio

Switch

19 de julio

Vangard

27 de julio

Sumisclex

5 de agosto

Switch

13 de agosto

Vangard

22 de agosto

Aliette

5 de septiembre

Sumisclex

16 de septiembre

Bemex

64

ANEXO 3

Fecha:
Variedad:
N de plantas:
N de planta
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

Incidencia

ndice de dao

65

ANEXO 4

Escala para determinar ndice de dao en plantas inoculadas bajo condiciones

controladas.

ndice

Dao por planta

0 lesin

1-5 lesiones

6-10 lesiones

11-15 lesiones

16-20 lesiones

> 21 lesiones

66

ANEXO 5

ndice de dao (%) por variedad causado por Botrytis cinerea, durante el perodo
abril-julio 2005.

Valdisole

Black Out

All Round

Tresor

19/4

26/4

2.2

1.3

8/5

10/5

17/5

24/5

31/5

2.6

7/6

3.3

2.2

14/6

21/6

28/6

1.3

5/7

0.8

3.3

67

ANEXO 6.

ndice de dao general (%) provocado por B.elliptica, durante el perodo julioseptiembre.

Fecha

ndice de dao(%)

12/7

19/7

17.62

26/7

11.08

2/8

11.39

9/8

10.82

16/8

11.96

23/8

12.53

30/8

10.53

6/9

9.21

13/9

8.34

20/9

8.15

27/9

4.21

68

ANEXO 7

Cepas correspondientes a Botrytis cinerea y Botrytis elliptica encontradas entre abril

y septiembre de 2005.

Cepa (Aislado)

Especie

998

Botrytis cinerea

1005

Botrytis cinerea

1010

Botrytis cinerea

1011

Botrytis cinerea

1012

Botrytis cinerea

1013

Botrytis cinerea

1014

Botrytis cinerea

1015

Botrytis cinerea

1016

Botrytis cinerea

1017

Botrytis cinerea

1018

Botrytis cinerea

1031

Botrytis elliptica

1032

Botrytis elliptica

1033

Botrytis elliptica

1034

Botrytis elliptica

1035

Botrytis elliptica

1036

Botrytis elliptica

1037

Botrytis elliptica

1038

Botrytis elliptica

1039

Botrytis elliptica