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Electroforesis: electroforesis en papel de

protenas sricas
Isaac Tnez Fiana
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de
Crdoba, Avda. Menndez Pidal s/n, 14004-Crdoba

RESUMEN

La electroforesis consiste en la separacin de partculas aprovechando su

traslado mediante la aplicacin de campos elctricos. La capacidad de
movimiento de las diferentes molculas depende de la intensidad del campo
aplicado, su carga y su peso molecular. Existen diferentes tipos, que se
engloban en dos: libre o de frente mvil y de zona. El objetivo ser clarificar
los conceptos con ella relacionados, la metodologa y prctica de la
electroforesis en papel, as como su relevancia en el estudio de las protenas
sricas.
Palabras Clave: acetato de celulosa, electroforesis, movilidad electrofortica,
protenas sricas.
Abreviaturas empleadas. PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida; SDSPAGE: electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida; SDS: dodecil
sulfato sdico

1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS
Se denomina electroforesis al transporte de partculas en un campo elctrico.
Cualquier in o molcula cargada elctricamente migrar cuando se someta a la
accin de un campo elctrico. A un pH determinado, muchas molculas biolgicas
poseen carga elctrica, cuya magnitud depende del pH y composicin del medio
en que se encuentren. Con tcnicas electroforticas, es posible separar los
diferentes componentes de una mezcla de aminocidos, protenas, cidos
nucleicos y otras biomolculas cargadas.
En el laboratorio clnico, la aplicacin ms importante de la electroforesis es la
separacin de protenas presentes en el suero, orina y otros fluidos biolgicos
como el lquido cefalorraqudeo y el lquido sinovial. El objetivo principal de la
prctica estar dirigido a la comprensin e identificacin de conceptos fsicos
tericos relacionados con este tipo de tcnicas, as como la descripcin de las
mismas y su uso.
1.2. Movilidad electrofortica
Si se aplica un campo elctrico a una mezcla de molculas cargadas, stas
migrarn al electrodo de polaridad opuesta. Cuando una molcula de carga q se
encuentra en un campo elctrico de magnitud E, la fuerza que provoca la
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aceleracin de la partcula ser qE. Dicha fuerza se ver contrarrestada por la

resistencia friccional f dando una velocidad resultante v, de forma que:
qE = fv
Aplicando las leyes de Stokes para una molcula esfrica de radio r que se
mueva a travs de un medio de viscosidad n, se cumple:
f= 6 nr
A partir de las anteriores expresiones se obtiene:
qE= 6nrv
La movilidad electrofortica V de una molcula se define como la migracin por
unidad de campo de fuerza, de modo que:
V=v/E=q/f= q/6 nr
Por tanto, la movilidad electrofortica depende de la carga de las partculas y
del coeficiente de friccin f, que es dependiente del tamao de la molcula, de su
forma y de la viscosidad del medio.
1.3. Tipos de electroforesis
1.3.1. Electroforesis de frente mvil o libre
Las sustancias a separar se introducen en un tubo en forma de U, disueltas en
un tampn de pH y fuerza inica adecuados. Se colocan dos electrodos en sendos
brazos del dispositivo, entre los que se crea un campo elctrico, provocando que
las molculas de protena cargadas emigren hacia los electrodos de polaridad
opuesta. Las diferentes protenas se desplazan a velocidades diferentes de
acuerdo con sus cargas y coeficientes de friccin respectivos, formndose nubes
(o frentes) que se desplazan en la disolucin tampn.
Este desplazamiento puede seguirse con diversos sistemas pticos que ponen
de manifiesto las sustancias segn se van separando. Para impedir la mezcla por
conveccin de las protenas que emigran se necesita un sofisticado aparato y a su
vez se precisa el empleo de muestras muy grandes. Esta es la razn por la que la
electroforesis de frente mvil ha sido sustituida por la electroforesis de zona.
1.3.2. Electroforesis de zona
En esta tcnica, la muestra est obligada a desplazarse sobre un soporte
slido de papel, celulosa o gel. La pequea cantidad necesaria de muestra permite
que las molculas migren en discretas zonas o bandas. La electroforesis zonal de
biomolculas cargadas, generalmente se lleva a cabo en una disolucin
estabilizada con un medio que sirve de soporte.

Electroforesis en papel

La muestra se aplica sobre una tira de papel de filtro humedecido con una
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disolucin tampn, bien en el centro o en cualquiera de los extremos del papel,

dependiendo de las sustancias a separar y del pH del tampn. Los extremos de la
tira se sumergen en dos recipientes separados que contienen la disolucin tampn
y en los que se hallan colocados los electrodos.
Se conectan los electrodos a una fuente de tensin continua y se aplica una
diferencia de potencial durante el tiempo adecuado. Al aplicar una corriente
directa, las molculas cargadas de la mezcla emigran hacia los electrodos de
polaridad opuesta formando bandas en el papel. La velocidad de emigracin de
una molcula, depende preferentemente de su carga. Completada la
electroforesis, se desconecta la fuente de tensin y se secan las tiras sobre una
superficie, limpia, seca y lisa (cristal, azulejo, etc...).
El revelado se realiza empleando los mismos mtodos que los utilizados en
cromatografa sobre papel, mediante la accin de los colorantes adecuados.
La electroforesis y la cromatografa en papel tienen ciertas similitudes. Sin
embargo, mientras que la electroforesis separa las molculas fundamentalmente
en funcin de su carga, la cromatografa lo hace en base a una amplia gama de
caractersticas (ejemplos, solubilidad en la cromatografa de reparto, polaridad en
la de adsorcin, carga en la de intercambio inico, etc.).
La electroforesis en papel se emplea principalmente en la separacin de
sustancias de bajo peso molecular como aminocidos y pptidos. La difusin que
se produce puede disminuirse aumentando la diferencia de potencial entre los
electrodos con lo que se reduce el tiempo de desarrollo. Este tipo de electroforesis
se denomina de alto voltaje. El revelador para localizar las sustancias sera la
ninhidrina en el caso de pptidos y aminocidos.
Las electroforesis en papel tambin pueden hacerse en tiras de acetato de
celulosa, que son qumicamente ms homogneas y tienen la ventaja de ser
transparentes, con lo que las sustancias a separar, una vez teidas o reveladas,
pueden cuantificarse por densitometra. Es muy til en los laboratorios clnicos por
su fcil manipulacin y su rpido desarrollo.
La principal aplicacin es la separacin de protenas del suero, conocindose el
resultado como proteinograma. Las fracciones proteicas del suero que se separan
mediante este tipo de electroforesis son la albmina y las globulinas 1, 2, y .
El acetato de celulosa se utiliza tambin para separ lipoprotenas. El resultado
obtenido se denomina lipidograma. Las fracciones lipoproteicas son denominadas
, pre- y . El tampn ms usado es el veronal, a pH 8,6. La separacin se realiza
de forma anloga a la de protenas y se produce en unos 30 minutos. Las
lipoprotenas, una vez separadas, se localizan tindolas con colorantes que se
unen a la fraccin lipdica, como Negro Sudn o Ciba 7B Fat Red.
Electroforesis anlogas a las de protenas y lipoprotenas, utilizando como
soporte el acetato de celulosa, se han aplicado tambin para la separacin de
isoenzimas de la lactato deshidrogenasa y la creatn-quinasa.

Electroforesis en gel
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Un gel es un estado intermedio entre el slido y el lquido. Este tipo de

electroforesis se halla entre los mtodos ms resolutivos y convenientes
empleados en la separacin de macromolculas. Los geles de uso ms
generalizado son: poliacrilamida y agarosa. stos poseen poros de diferentes
dimensiones moleculares que delimitan la velocidad de traslado y molculas
trasladadas durante el proceso electrofortico. De esta forma, la separacin no se
produce slo por las diferentes cargas de las molculas, sino tambin por las
diferencias de tamao. Los geles estn formados por un reticulado de polmeros
(constituyendo una red enmaraada) y el lquido intersticial en el que se encuentra
inmerso esta red.
Existe una gran variedad de tipos de electroforesis en gel, que se pueden
agrupar en dos categoras:

Electroforesis en gel en una dimensin (continuo o discontinuo)

o PAGE-nativa
o SDS-PAGE
o Isoelectroenfoque
Electroforesis en gel en dos dimesiones (bidimensional)

Segn las aplicaciones u objetivos que se pretendan conseguir en una prctica

o experimento, se utilizar un tipo u otro de electroforesis en gel. Los geles
discontinuos mejoran la resolucin de la electroforesis pues se consigue agudizar
las bandas en gran medida por el uso de esta tcnica conocida como
electroforesis a pH discontinuo que precisa de dos geles y dos tampones
diferentes.
La PAGE-nativa se utiliza para separar protenas en condiciones no
desnaturalizantes, por tanto, en funcin de la carga intrnseca de las mismas. La
SDS-PAGE es muy til para calcular el peso molecular de una protena concreta
ya que separa las protenas segn su tamao. El isoelectroenfoque es un tipo de
PAGE en una dimensin que se basa en la separacin de molculas de acuerdo a
sus diferentes puntos isoelctricos.
La electroforesis en gel en dos dimensiones combina el isoelectroenfoque
(primera dimensin) con la SDS-PAGE (segunda dimensin). Es una tcnica muy
resolutiva, y el mejor mtodo analtico para separar protenas que existe hoy en
da.
1.3.3. Electroforesis capilar
Aunque la electroforesis en gel en sus diversas formas resulta un mtodo
comn y efectivo para la separacin de molculas, el proceso de separacin
puede durar varias horas, siendo difcil de cuantificar y automatizar.
La tcnica aqu presentada se lleva a cabo en el interior de tubos capilares (1
10 m de dimetro). Estos capilares disipan el calor rpidamente permitiendo la
aplicacin de campos elctricos elevados, reduciendo as los tiempos de
separacin.

2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO

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2.1. Equipamiento
Sistema de electroforesis.
Fotodensitmetro.
2.2. Material
Pipetas de 15 ml.
Micropipetas o pipetas de pistn de 251000 l.
Puntas desechables.
Vasos de precipitado.
Tiras de papel especial (Whatman 1, 3, etc.) de filtro o de acetato de
celulosa, impregnadas en la solucin amortiguadora correspondiente.
2.3. Reactivos
Agua destilada.
Soluciones amortiguadoras.
Colorantes.
Decolorantes.

3. PROTOCOLO A REALIZAR
3.1. Electroforesis en papel
3.1.1. Se adaptan convenientemente a la cmara de electroforesis las tiras
impregnadas con la solucin amortiguadora.
3.1.2. Se aplica la muestra. Se depositan de 1015 l en una fina banda en la
zona del ctodo paralela a los polos de la cubeta electrofortica, para separar
protenas del suero o de cualquier lquido biolgico (orina, lquido cefalorraqudeo,
etc).
3.1.3. Se separan las diferentes fracciones mediante el paso de la corriente. La
duracin depende de la intensidad y el voltaje suministrado. Se aplican 0,26 mA
por cm de ancho de la tira.
3.1.4. Acabada la separacin, la tira se retira y seca en la estufa entre 60110C.
3.1.5. Se colorea sumergiendo la tira en la solucin colorante durante 5 min. El
tiempo de coloracin vara segn el colorante empleado, oscilando entre 530
min.
3.1.6. Se lava 3 veces con una solucin de actico al 5%.
3.1.7. Se seca a temperatura ambiente.
3.1.8. Se decolora, retirando el exceso de colorante. Se deja slo el que ha sido
fijado por las protenas.
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3.1.9. Se valora por fotodensitometra. Consiste en hacer pasar la tira por un haz
de luz que es absorbida segn la cantidad de protena coloreada.

4. RESULTADOS ESPERADOS
Las fracciones proteicas del suero que se separan por electroforesis en acetato
de celulosa son la albmina y las globulinas 1, 2, y . En condiciones
normales, los porcentajes de cada fraccin que se obtiene con el anlisis
densitomtrico de las tiras, son los siguientes:
PROTENAS SRICAS
Albmina
Globulinas 1
Globulinas 2
Globulinas
Globulinas

%
53-67
2,5-5
7-13
9-14
10-21

5. DISCUSIN Y COMENTARIOS

6. BIBLIOGRAFA RECOMENDADA
Gonzlez de Buitrago JM (1985): Electroforesis . En Gonzlez de Buitrago JM
(eds): Tcnicas de Laboratorio Clnico, 1 ed. Editorial Alambra (Madrid,
Espaa), pp. 117 125.
Gonzlez de Buitrago JM (1998): Osmometra. Cromatografa. Electroforesis.
Tcnicas electroqumicas. En Gonzlez de Buitrago JM, Arilla E, RodrguezSegade M, Snchez A (eds): Bioqumica Clnica, 1 ed. Editorial McGraw-Hill
Interamericana(Madrid, Espaa), pp. 17 27.
Vidal C (1988): Electroforesis. En Lozano JA, Tudelo J (eds): Prcticas de
Bioqumica. Experimentacin y Simulacin, 1 ed. Editorial Sntesis (Madrid,
Espaa), pp. 37 45.

ANEXO: MEDIOS, SOLUCIONES Y MATERIAL BIOLGICO EMPLEADO

1. Soluciones para la electroforesis
1.1. Tampn veronal/veronato sdico
veronal/veronato sdico, pH 8,6
1 litro
(g)
1,84
10,40
Hasta 1 litro

Veronal (cido dietilbarbitrico)

Veronal sdico
Agua destilada

1.2. Tampn acetato/veronal

6

1 litro
(g)
15,45
2,76
Hasta 1 litro

Acetato/veronal, pH 8,6
1 litro
Veronal sdico
10 g
Acetato sdico
6,5 g
HCl 0,1 M
64,5 ml
Agua destilada
Hasta 1 litro

2. Soluciones de colorantes utilizados en las tinciones

2.1. Solucin de negro amido
Negro Amido
1 litro
450 ml
100 ml
6,0 g
450 ml

Metanol
cido actico
Negro amido
Agua destilada

2.2. Solucin de azul de bromofenol

Azul de bromofenol
100 ml
100 ml
A saturacin
100 mg

Metanol
Bicloruro de Hg
Azul de bromofenol

2.3. Solucin de azocarmin B

Azocarmin B
100 ml
Azocarmin B
Metanol (50%)
cido actico

10 g
90 ml
10 ml