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Guia de Problemas de Enzimologia y Cinetica Enzimatica
Guia de Problemas de Enzimologia y Cinetica Enzimatica
Carreras: Farmacia
Profesorado en Qumica
Licenciatura en Qumica
Licenciatura en Alimentos
0,00
0,05
0,05
0,15
0,10
0,25
0,20
0,44
0,30
0,66
0,40
0,85
VOLUMEN
(ml)
1800,0
75,0
20,0
1,5
ACTIVIDAD
(U/ml)
0,23
3,00
5,00
40,00
PROTENA
(mg/ml)
12,5
14,0
1,0
0,5
VOLUMEN
(ml)
A/min
PROTENA
(mg/ml)
Extracto crudo
Sulfato de amonio
CM-celulosa
Sephadex-G25
1000,0
20,0
100,0
100,0
124
3100
496
496
5
10
2
1
FRACCIN
Extracto crudo
VOLUMEN
(ml)
220
ACTIVIDAD
(U/ml)
42,0
PROTENA
(mg/ml)
21,0
DEAE-celulosa
Sulfato de amonio
Sephadex-G50
Crom. de afinidad
35
20
60
10
224,0
157,5
50,0
279,8
16,0
10,5
2,5
1,6
(a) Complete la tabla. (b) Se decide omitir uno de los pasos de purificacin a partir de
los datos obtenidos, cul debera ser ese paso y por qu? Cul fue el paso que produjo la mayor purificacin y cul el de mejor rendimiento? (c) Dicha enzima reduce oxoglutarato a glutamato asociado a la oxidacin de NADH a NAD+, lo que fue utilizado
para seguir espectrofotomtricamente la actividad de la enzima. En una preparacin
anterior 0,01 ml de enzima con una concentracin de 10 mg/ml de protena produjeron
una variacin de absorbancia de 0,125/min en condiciones ptimas. Qu actividad
especfica tena esa preparacin? Volumen del ensayo: 1 ml; 340NADH: 6,22 mM-1
cm-1.
19- La asparaginasa cataliza la reaccin:
asparagina + H2O aspartato + H3N
Esta enzima es usada con fines teraputicos en caso de leucemia. Las clulas tumorales en rpida divisin necesitan cantidades mayores de asparagina que las normales.
La administracin de asparaginasa reduce los niveles de asparagina disponible en los
individuos enfermos, lo que reprime la viabilidad del tumor. Un laboratorio farmacutico
que desea comercializar asparaginasa le encarga que realice la purificacin de la enzima del hongo Boticamyces pharmaceae. A tal fin, parte de 200 ml de un extracto crudo libre de clulas conteniendo 20 mg/ml de protena. Para medir actividad enzimtica
incuba una alcuota de 10 l del extracto con el sustrato a 37C en 0,2 ml de medio de
reaccin, finalizndose sta a los 5 min directamente por el agregado de 1 ml de reactivo de color para H3N. La lectura de absorbancia a 540 nm (descontando el blanco) en
una cubeta de 1 cm de camino ptico fue de 0,44 ( para la reaccin de color = 2200 M1
cm-1). Luego realiza un fraccionamiento salino, recuperando la asparaginasa en la
fraccin 40-80 % de sulfato de amonio. Al redisolver esta fraccin en 20 ml del buffer
de purificacin Ud. recupera el 95% de actividad enzimtica y 3800 mg de protena.
Luego realiza una cromatografa en columna de DEAE-celulosa y recupera 80 ml que
contenan 600 U de asparaginasa (U es la cantidad de enzima que produce 1 mol de
H3N por minuto en las condiciones de ensayo) purificada 20 veces respecto al extracto
crudo. Como ltimo paso realiza una cromatografa en columna de hidroxi-apatita de la
que recupera 20 ml conteniendo 0,12 mg/ml de protena y 17 U/ml de actividad enzimtica.
a- Construya la tabla de purificacin y analcela, indicando la purificacin y el rendimiento total alcanzados. Seale la etapa de mayor purificacin y la de mayor rendimiento.
b- Aconseja iniciar la preparacin de la asparaginasa en gran escala usando los mismos pasos de purificacin o sugiere alguna modificacin? Justifique su respuesta.
20- Se purific prcticamente a homoqeneidad la dUTPasa (deoxiuridinatrifosfatasa) de
Escherichia coli. Esta enzima hidroliza el dUTP a dUMP y PPi jugando un importante
rol en la biosntesis del dTTP para la replicacin de DNA, ya que provee el sustrato para Ia timidilato sintetasa. Las etapas del procedimiento de purificacin se indican en la
siguiente tabla. Complete la tabla de purificacin.
FRACCIN
VOLUMEN (ml)
ACTIVIDAD
PROTENA
(U/ml)
(mg/ml)
I
1690,0
0,134
2350,0
II
340,0
0,503
6060,0
III
440,0
0,208
173,0
IV
196,0
0,224
4,0
V
19,0
2,420
10,5
I = sobrenadante del lisado celular, II = fraccionamiento con sulfato de amonio, III =
cromatografa en DEAE celulosa, IV = cromatografa en fosfocelulosa y V = filtracin en
Biogel P-150.
21- Se realiz la purificacin de la enzima glucosa-6-fosfatasa que cataliza la siguiente
reaccin:
glucosa-6-fosfato + H20 glucosa + fosfato
Se parti de 200 g de hgado bovino obtenindose un extracto inicial de 1200 ml que
tena una concentracin de protena de 10 mg/ml. Para medir actividad enzimtica se
incub una alcuota de 50 microlitros con el sustrato a 30C en 1 ml de medio de reaccin, cortndose sta a los 10 min directamente por agregado de 2 ml de reactivo de
color para fosfato. La lectura de Abs a 740 nm en una cubeta de 1 cm de camino ptico
fue de 0,49 con un blanco de medida de 0,12 (el coeficiente de extincin para la reaccin de color es de 3700 M-1 cm-1). Se realiza luego un corte con sulfato de amonio al
50 % rescatndose la fosfatasa en el precipitado. Este precipitado fue redisuelto en un
volumen de 80 ml, siendo la concentracin de protena de 21 mg/ml y la actividad 6,3
U/ml. Posteriormente se realiz una cromatografa en Sephadex G-200 recogindose
10 tubos de 12 ml c/u con actividad enzimtica. La concentracin de protena en el conjunto fue de 10,8 mg/ml y la actividad de 3,36 U/ml. Como ltimo paso se realiz una
cromatografa de afinidad y se obtuvieron 20 ml de preparacin con una actividad de
7,2 U/ml y una concentracin de protena de 0,5 mg/ml. En base a estos datos construya la tabla de purificacin e indique:
a-Cul es la purificacin y el rendimiento alcanzado?
b-Cul es la etapa individual que proporcion mayor rendimiento y cul la de mayor
purificacin?
c- Seale si todas las etapas empleadas se justifican. Fundamente su respuesta.
22- La piruvato carboxilasa (PCasa) es una enzima que usa biotina como cofactor catalizando la reaccin:
piruvato + ATP + HC03 oxaloacetato + ADP + Pi
A fin de realizar la purificacin de la PCasa de Eschericia coli Ud. parte de 300 ml de un
extracto crudo libre de clulas conteniendo 1500 mg protena. La actividad enzimtica
se midi por un mtodo continuo determinando la produccin de oxaloacetato a 272 nm
( 272 = 920 M-1 cm-1) a 30C y en un volumen final de 3 ml. Utilizando 10 l del extracto
crudo para medir la actividad Ud. obtiene un A = 0,46 luego de 5 min de reaccin
(medido en cubeta de 1 cm de camino ptico). Luego realiza un fraccionamiento salino,
recuperando la PCasa en la fraccin 30-50% de sulfato de amonio. Esta fraccin se redisolvi en 5 ml del buffer de purificacin que contenan 30 mg/ml de protena y el 90 %
de la actividad enzimtica. A continuacin realiza una cromatografa en columna de
Sephadex G-200, recuperando 30 ml que contenan 150 mg de protena y 270 U/ml (U
est expresada en mol/min) de actividad enzimtica. Como ltimo paso realiza una
cromatografa en columna de CM-celulosa de la que recupera 45 ml conteniendo 6750
U de PCasa purificada 900 veces respecto del extracto crudo. En base a estos datos
a- Construya la tabla de purificacin.
Actividad
total
(U)
3,349
Purificacin
(veces)
Rendimiento
(%)
100
3,208
96
CM-Sephadex
1251
1,847
301
55
Chromatografa de afinidad
2155
1,373
518
41
ETAPA
Extracto crudo
Ppcin con sulfato de amonio
b-Cuntas unidades de enzima espera obtener luego de realizar la purificacin?Qu actividad especfica espera obtener?
c-Qu masa molecular informar?. Qu otro mtodo podra haber usado para realizar
esta determinacin?
25- Se desea purificar una deshidrogenasa de planta (Punto Isoelctrico 3,1) a partir de
5 litros de extracto crudo. Con el propsito de poner a punto el mtodo de purificacin
se ensaya un protocolo que consta de tres etapas: fraccionamiento salino (etapa 1),
cromatografa de intercambio inico (etapa 2) y cromatografa de afinidad (etapa 3). Se
midi espectrofotomtricamente la actividad de muestras provenientes de cada etapa
empleando 5 l de muestra, en un volumen de reaccin de 1ml, durante 3 minutos a
25c (340= 6000 M-1.cm-1). Los valores de variacin de absorbancia obtenidos, la concentracin de protena y los volmenes totales se muestran en la tabla.
Etapa
Extracto crudo
1
2
3
Volumen
(ml)
50
7
10
2
Protena
(mg/ml)
3
10
0,5
0,05
A
(340nm)
0,09
0,45
0,225
0,675
10
Actividad
especfica
(U/mg)
4
Actividad
total
(U)
3,349
CM-Sephadex
Cromatografa de afinidad
ETAPA
Extracto crudo
Purificacin Rendimiento
(veces)
(%)
1
100
3,208
96
1251
1,847
301
55
2155
1,373
518
41
Ud realiza todos los pasos de purificacin y obtiene 8 ml de enzima purificada. La determinacin de la actividad enzimtica de la protena purificada empleando nitrocefina como
sustrato (=16000 M-1cm-1) result en una variacin de absorbancia de 0,48 en dos minutos cuando emplea 3 l de muestra (volumen de cubeta =1ml, camino ptico = 1cm) siendo
la concentracin de protena 0,002 mg/ml .
La determinacin de masa molecular la realiza mediante una cromatografa de filtracin
molecular empleando una columna previamente calibrada segn se indica en la siguiente
tabla:
Protena marcadora
Ribonucleasa
250
13,7
Quimotripsingeno
230
25,0
Ovoalbmina
210
43,0
Albmina
195
67,0
Aldolasa
165
158,2
Catalasa
150
231,9
El volumen de elucin de la protena en estudio fue de 220 ml, el volumen total de la columna fue de 260 ml y el volumen de exclusin de 100 ml.
a-Cual es la actividad especfica de la enzima por Ud. purificada?
b- Cual es el rendimiento y la purificacin obtenidas por Ud. con respecto a los publicados?
c-Qu masa molecular informar? (determinacin por mtodo grfico) Cmo determinara si se trata de una enzima monomrica o no?
RESPUESTAS:
1- a) Las mismas. B) Keq= [A B]/ [A] [B] = 0,67/mM
2- Cubeta: 8 x 10-3 U/ml ; 3,3 x 10-3 U/mg
Muestra: 8 x 10-2 U/ml ; 3,3 x 10-3 U/mg
3-
a) 6 x 10-2 mM/min
b) 30 nanomoles/min ml
c) 0,06 U/ml 3 U/ml (ext)
d) 0,15 U/mg
11
4-
12
c) 0,2 U/mg
19- a) Pt= 592; Rt=35 %
Mayor purificacin= IV
Mayor rendimiento= II
b) se eliminara la etapa II
20- Pt= 4044; Rt=20 %
21- a) Pt= 240; Rt=20 %
b) Mayor rendimiento= paso III
Mayor purificacin= paso IV
c) No. Se eliminara la etapa III (podra dejarse para desalar la muestra)
22- b) Pt=900; Rt=75 %
Mayor rendimiento= paso II
Mayor purificacin= paso IV
23- a) Abs= 0,34
b) Pt= 50; Rt=75 %
24- a) 0,5 U/ml
b) 5125 U 2155 U/mg
c) 31000 Filtracin molecular
25- 4950 U totales; 150 U/mg
26- a) 2500 U/mg
b) rendimiento 20 % - menor; purificacin 625- mayor
c) 31000
13
CINTICA ENZIMTICA
PROBLEMAS:
1- Utilizando la ecuacin de Michaelis-Menten demuestre que v = Vmx/2 cuando
[S]= Km.
2- Estudiando el efecto del pH sobre la actividad de una enzima se trabaj de acuerdo
a dos protocolos diferentes. En uno de ellos (A) se preincub la enzima a distintos pHs
y luego se midi la actividad de la misma a pH 7. En el otro caso (B) se determin la
actividad de la enzima a distintos pHs. Los resultados obtenidos se muestran a
continuacin.
ACTIVIDAD
Protocolo A
Protocolo B
7,9
1,0
8,1
1,9
8,0
3,2
8,2
4,9
7,8
7,3
8,0
9,0
8,0
8,0
8,1
6,3
4,0
2,5
2,0
1,0
0,2
0,0
pH
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
100
d
a
d
iv
it
c
A
%
80
60
40
20
0
0
pH
14
d
a
id
vi
tc
A
%
80
60
40
20
0
3
10
11
12
pH
0
5
10
10
20
21
25
30
30
20
40
10
15
[Sustrato]
M
2,5 10-6
3,3 10-6
4,0 10-6
5,0 10-6
1,0 10-5
2,0 10-5
4,0 10-5
1,0 10-4
2,0 10-3
1,0 10-2
velocidad
nmol/l.min
24
30
34
40
60
80
96
109
119
120
12- Una enzima con un Km de 2,4 10-4 M se ensay con las siguientes concentraciones
de sustrato: (a) 2,0 10-7 M, (b) 6,3 10-5 M, (c) 1,0 10-4 M, (d) 2,0 10-3 M y (e) 5,0 10-2 M.
La velocidad observada a 5,0 10-2 M fue de 128 nmol/l/min. Calcular las velocidades
iniciales con las otras concentraciones de sustrato.
13- Si la concentracin de enzima del problema anterior se aumentara 5 veces, cul
sera la velocidad inicial a cada una de las concentraciones dadas? y si se aumentara
la concentracin de sustrato cinco veces?
14- Se hicieron diez mezclas de reaccin. Cada una contena la misma concentracin
de enzima, a varias concentraciones de sustrato, y las velocidades iniciales se
determinaron como se muestra en la tabla. Utilizando la ecuacin de Lineweaver-Burk,
determine grficamente el Km y la Vmx. Observe que uno de los factores crticos en la
exactitud de esta determinacin son las escalas seleccionadas para la ordenada y la
abcisa. Cules son los intervalos de concentraciones de sustrato son ms tiles para
estas determinaciones?
[Sustrato]
velocidad
[Sustrato]
velocidad
M
nmol/min
M
nmol/min
-3
-5
1,0 10
65,0
2,0 10
27,0
5,0 10-4
63,0
1,0 10-5
17,0
-4
-6
1,0 10
51,0
5,0 10
9,5
5,0 10-5
42,0
1,0 10-6
2,2
-5
-7
33,0
5,0 10
1,1
3,0 10
15- Se hicieron varias mezclas de reaccin que contenan concentraciones iguales de
una enzima, a las concentraciones de sustrato indicadas en la tabla y se determinaron
las velocidades de reaccin iniciales. Utilizando la ecuacin de Eadie-Hofstee, (v =
f(v/S)determine grficamente la Km y la Vmx. Cul es la ventaja de este tipo de grfica
sobre la de Lineweaver-Burk?
16
[Sustrato]
M
4,0 10-4
2,0 10-4
1,0 10-4
5,0 10-5
4,0 10-5
2,5 10-5
2,0 10-5
velocidad
nmol/min
130,0
110,0
89,0
62,0
53,0
38,0
32,0
v sin inhibidor
(mol/min)
0,42
0,50
0,60
0,66
0,80
0,88
v con inhibidor
(mol/min)
0,17
0,20
0,24
0,27
0,32
0,36
17
19- Sobre una enzima que cataliza la reaccin S P se prueba el efecto de dos inhibidores X e Y obtenindose los datos de velocidad que se muestran en la tabla. Determinar qu tipo de inhibidor es cada uno de ellos. Calcule Km y Vmx.
[S] (mM)
2,00
2,50
3,33
4,00
5,00
sin agregado
66,67
71,40
76,92
80,00
83,33
[x]=12M
40,00
45,45
52,63
57,14
62,50
[I]=60M
22,22
23,81
25,64
26,67
27,77
V (mg de producto/min)
sin salicilato
con salicilato
0,21
0,08
0,25
0,10
0,28
0,12
0,33
0,13
0,44
0,16
0,45
0,18
21- A partir de los siguientes datos obtenidos al estudiar el efecto de un inhibidor sobre
una reaccin enzimtica, determine el tipo de inhibicin y la Km para el sustrato.
[Sustrato]
(mM)
2,0
3,0
4,0
10,0
15,0
V (g de producto/min)
[inhibidor] = 0mM [inhibidor]=6mM
139
88
179
121
213
149
313
257
370
313
18
3,3
5,0
10,0
50,0
100,0
0.037
0.043
0.053
0.063
0.063
TABLA 2
Vmax (mol/min/mg)
0,033
0,065
0,064
0,033
Compuesto
A
B
C
D
Km (M)
2,5
5,0
2,4
1,3
Preincubacin
con
A
B
C
D
Vi(M/min)
10,10
12,5
9,8
5,30
0,50
Qu efecto ejerce c/u de los compuestos sobre la enzima? Cmo puede determinar
si la interaccin en cuestin es reversible o irreversible?
25- Se ha determinado que dos compuestos B y C son inhibidores irreversibles de la
enzima E. Con el objeto de caracterizar la inactivacin se realiz lo siguiente:
19
Vi (U/ml)
1,89
1,87
1,90
1,88
1,86
1,89
COMPUESTO B
[B]=20M
[B]=30M
[B]=50M
[B]=70M
[B]=100M
t (min)Vi(U/ml) t (min)Vi (U/ml) t (min)Vi (U/ml) t (min)Vi (U/ml) t (min)Vi (U/ml)
1
1,78
1
1,74
1
1,63
1
1,55
1
1,47
5
1,34
5
1,25
2
1,40
2
1,23
2
1,17
10
0,98
10
0,83
5
0,89
5
0,72
5
0,57
15
0,70
12
0,57
7
0,65
7
0,49
7
0,36
20
0,50
20
0,37
10
0,41
10
0,26
10
0,17
COMPUESTO C
Tiempo
(min)
0,5
1,0
2,0
3,0
4,0
Vi (U/ml)
[C]=5M
1,68
1,47
1,17
0,89
0,72
20
[DMSF] = 0
1,67
2,00
2,50
3,33
4,00
Velocidad (U/mg)
[DMSF] = 16 M
1,00
1,25
1,67
2,50
3,33
[DMSF]= 50 M
0,60
0,70
1,00
1,67
2,50
[I]=2M
t (min) Vi/V0
0
1,00
1
0,90
2
0,80
4
0,63
9
0,34
14
0,19
[I]=4M
t (min) Vi/V0
0
1,00
1
0,80
2
0,69
4
0,46
9
0,17
[I]=8M
t (min) Vi/V0
0
1,00
1
0,65
2
0,40
3
0,25
4
0,06
[I]=14M
t (min) Vi/V0
0
1,00
1
0,56
2
0,30
3
0,10
4
0,005
21
0.9
0.8
0.7
Variacion de absorbancia
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0
20
40
60
80
100
120
140
Tiempo (s)
22
centraciones variables de NDP (el otro sustrato se mantuvo fijo y saturante) en ausencia o presencia del inhibidor.
[NDP]
(M)
6,25
8,30
12,50
25,00
[U-OH] = 0
0,80
1,00
1,33
2,00
Velocidad (U/mg)
[U-OH] = 4 M
0,40
0,50
0,67
1,00
[U-OH]= 12 M
0,20
0,25
0,33
0,50
kobs (min-1)
0,050
0,067
0,100
0,200
0,400
32- Se estudi el efecto de un medicamento sobre la actividad de una enzima oligomrica. Para este estudio se midi actividad de la enzima frente a este reactivo, obtenindose los siguientes resultados:
Concentracin de susVelocidad control (U/ml) Velocidad frente a reactrato (mM)
tivo 1 mM (U/ml)
0,2
2,0
0,02
0,3
2,9
0,08
0,4
3,8
0,3
0,8
7,4
3,9
1,0
9,1
9,1
5,0
33
98
10,0
50
99
Explique como acta este medicamento y que efecto produce sobre la actividad de la
enzima. Se podra utilizar en terapias, suponiendo que los productos de la actividad
enzimtica son cancergenos? (Se sabe que la concentracin intracelular de sustrato
es aproximadamente 9 mM).
Por otro lado se tomaron 0,2 ml de solucin de enzima y se la incub con un inhibidor
reversible. Se dej pasar el tiempo que aparece en la tabla, se tom una alcuota de
23
Velocidad inicial
( mol l-1min-1)
1,54
5,88
20,00
50,00
80,00
94,12
98,46
99,61
Control
(U/mg)
0,0
2,85
4,90
7,60
10,50
11,40
13,70
15,20
RESPUESTAS:
1- consultar clases de teora
2- ver curvas de actividad y de estabilidad enzimticas
Frmaco X
(U/mg)
0,0
0,05
0,23
1,02
4,00
5,70
12,00
15,70
24
3- a) Un residuo de His no protonado (pKa= 6) y un grupo amino terminal protonado (pKa alrededor de 8) o un grupo sulfidrilo (pKa = 8,1), necesarios para la actividad enzimtica, seran los responsables, respectivamente, de las partes ascendentes y descendentes de la curva. b) Cristalografa de rayos X c) Un medio
no polar suprime la ionizacin de los grupos cargados. Tal efecto podria elevar el
pKa del grupo carboxilo del Asp a pH 6
4- ver aminocidos cuyos pKa de grupo R estn entre 6 y 8.
5- dem respuesta preg. 2
6- 9 % combinada, 91 % libre; 100 % combinada
7- a) 91 mol/min
b) 25 mol/min
8- [s]= 1,5 Km
9- 253.333 min-1 o 4168 s-1
10- 555 min-1 o 9 s-1
11- Km = 1,0 x 10-5 M; Vmx= 120 nmol/l/min
12- a) 0,1 mmol/l/min; b) 27 mmol/l/min; c) 38 nmol/l/min; d) 114 mmol/l/min
13- a) 0.5 mmol/l/min; b) 73 mmol/l/min; c) 86 mmol/l/min; d) 125 mmol/l/min; e) aumentara 5 veces la V0.
14- 0,33 S < Km < 2,0 S
15- Km= 7,5 x 10-5 M; Vmx= 154 nmol/min. La grfica de Eadie-Hofstee puede
desplazar los datos en un intervalo mayor de concentraciones de sustrato. De este
modo, los datos que se presentan lineales en una grfica de Lineweaver-Burk, algunas veces exhiben desviaciones significativas de la linealidad con la grfica de
Eadie-Hofstee.
16- consultar teora
17- Km= 0,67 x 10-4 moles/l; Vmx= 0,99 mol/min; Kmi= 0,68 x 10-4 moles/l;
Vmxi= 0,40 mol/min; Inhibidor no competitivo
18- Km= 0,21 mM; Vmx= 0,48 U/mg; Kmi= 0,63 mM; Vmxi =0,48 U/mg; Competitivo.
19- Km= 1 mM; Vmx= 100 U/ml; Kmx= 3 mM; Vmxx =100 U/ml; Kmy= 1 mM;
Vmxy =33 U/ml; x competitivo; y no competitivo.
20- a) Inhibidor no competitivo
b) Km= 2,4 mM
21- Inhibidor competitivo
Km= 5,2 mM
22- a) Km= 2,55 M; Vmx= 0,065 mol/min/mg
b) A: no competitivo
B: competitivo
C: no tiene efecto
D: acompetitivo
23- a) no competitivo
b) Km= 5 mM
c) Vmx= 7,5 mol/min
d) Ki= 0,385 mM
24- ver clases de teora
25- B: mec. 1; C: mec 2
B: K1= 3 10-3 M; C: Ki= 5 M, K2=0,54 min-1
26- a) competitivo
b) Km= 0,21 mM; Vmx= 5,26 U/mg; Ki= 16,5 M
c) Afecta
27- k1= 0,038 M; mecanismo 1
25
26
Grficas de Dixon
Grficas de Cornish-Bowden
27
Inhibicin irreversible