Repaso del equilibrio qumico

7.51

Septiembre, 1999

Los experimentos sobre el equilibrio estudian cmo la concentracin de los productos

de la reaccin vara en funcin de la concentracin de los reactivos y/o de las
condiciones de la reaccin. Para una tpica reaccin bimolecular en equilibrio, como por
ejemplo, A + B AB, se podra valorar una cantidad establecida del reactivo [B] con
cantidades cada vez mayores del reactivo [A] y determinar, as, la concentracin de
equilibrio del producto [AB].

La forma de la curva de equilibrio depende del mecanismo de reaccin y se puede

emplear para elegir entre distintos modelos de equilibrio.

Constantes de equilibrio
Una constante de equilibrio, representada por K (mayscula), es la relacin existente
entre las concentraciones en equilibrio de reactivos y productos o viceversa.
Para la reaccin bimolecular A + B AB, podemos definir una constante de
disociacin en el equilibrio (Kd) y otra de asociacin (Ka), relacionadas entre s del
siguiente modo:

En las reacciones bimoleculares, las unidades de Kd son unidades de concentracin (M,

mM, M, etc.) y las de Ka, son las de concentracin-1 (M-1, mM-1, M-1, etc.).

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Para una reaccin unimolecular de plegamiento de protena D N, podemos definir

una constante de desplegamiento en el equilibrio (KD) o una de plegamiento (KN),
ambas relacionadas entre s:

Estas constantes de equilibrio, al igual que todas las de las reacciones unimoleculares,
carecen de unidades.
Para cualquier expresin de equilibrio, el sentido en el que tiene lugar la reaccin (es
decir, disociacin frente a asociacin o plegamiento frente a desplegamiento) va desde
las especies moleculares situadas a la derecha de la expresin en la parte inferior, hacia
las que se encuentran sobre ellas.
Las constantes de equilibrio de una reaccin del tipo: nA + mB An Bm, son:

El valor de cualquier constante de equilibrio slo ser constante para una determinada
temperatura, presin, etc. De este modo, las constantes de equilibrio de una misma
reaccin a distintas temperaturas (p. ej., a 20 C y 37 C) podran ser muy distintas.

Por qu las reacciones alcanzan un equilibrio?

Independientemente del mecanismo, todas las reacciones reversibles alcanzan una
distribucin en equilibrio de reactivos y productos cuando la velocidad de las reacciones
que tienen lugar en ambos sentidos se iguala.
Estudiar la velocidad global a la que vara [AB] en la reaccin A + B AB.

Si iniciamos la reaccin mezclando A y B libres, la velocidad de asociacin

(kasoc[A][B]) dominar la reaccin y la de disociacin (-kdis[AB]) ser menor, ya que
habr muy poca cantidad del complejo AB. Sin embargo, a medida que se forman ms
complejos, la velocidad de asociacin tender a disminuir y la de disociacin
aumentar, debido a que las concentraciones de [A] y [B] irn disminuyendo, mientras
aumenta la de [AB]. En algn momento, las velocidades de las reacciones en ambos

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sentidos se igualarn y ya no habr ms variaciones en las concentraciones de [AB], [A]

o [B].

Bajo estas condiciones:

Esta expresin muestra que entre las concentraciones en equilibrio de reactivos y

productos habr una relacin constante (Kd) que ser igual a la relacin existente entre
las constantes de velocidad directa e inversa.
Kd recibe el nombre de constante de disociacin en equilibrio. Las concentraciones en
equilibrio de reactivos y productos podran estar caracterizadas tambin por una
constante de asociacin en equilibrio (Ka), que sera simplemente la recproca de Kd.

Determinacin de Kd o Ka en reacciones bimoleculares

Para estudiar de forma experimental una reaccin bimolecular en equilibrio, A + B
AB, se podra empezar por mezclar A y B libres o bien por diluir el complejo AB y,
luego, esperar hasta que las concentraciones de [A], [B] y [AB] permanecieran
constantes. La relacin existente entre las concentraciones en equilibrio que se ha
mostrado anteriormente determina el valor de Kd o Ka. En la prctica, los experimentos
en los que se estudia el equilibrio se llevan a cabo con muchas concentraciones iniciales
distintas, para comprobar que el modelo de equilibrio es correcto y que los valores que
se obtienen para Kd y Ka son siempre los mismos, independientemente de las
concentraciones iniciales. Por lo general, se establece un valor fijo para la concentracin
inicial de uno de los reactivos (p. ej., [B0]) y, luego, en distintos experimentos, se le
aaden concentraciones iniciales cada vez mayores del otro reactivo ([A0]). Para cada
conjunto de concentraciones, se espera a que la reaccin alcance el equilibrio y,
entonces, se miden [A], [B] y [AB]. Hay tres formas habituales de representar este tipo
de datos acerca del equilibrio:
La primera es una simple curva de enlace en la que la fraccin de B enlazada se
representa frente a la concentracin de [A] libre.

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La relacin matemtica existente entre la fraccin de B enlazada y la concentracin

libre de [A], es clara.
Fraccin de B enlazada

Esta es la ecuacin de una hiprbola rectangular; con frecuencia, las curvas de enlace
bimoleculares reciben el nombre de curvas de enlace hiperblicas.
La fraccin de B enlazada se representa, a menudo, como

, de modo que:

A partir de esta expresin es fcil deducir que, si [A] = Kd,

= 0,5. As, la mitad del
nmero mximo de enlaces de B se alcanza cuando la concentracin de A libre es igual
a Kd. De este modo, resulta sencillo calcular Kd slo con estudiar la curva de enlace. A
continuacin se muestran los mismos datos de enlace, pero representados frente a
log[A].

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En cualquier reaccin bimolecular, el 10% de B estar enlazado cuando [A] = Kd/9 y el

90% de B, cuando [A] = 9Kd. Esto quiere decir que el 80% de la reaccin de enlace
tiene lugar por encima de un rango de concentracin de alrededor de 80 en [A], con el
centro en torno a Kd.
Los datos del enlace bimolecular se pueden transformar tambin en una forma lineal
para representarlos segn la ecuacin de Scatchard.

De este modo, representando grficamente

como funcin de
, deberamos
obtener una lnea recta con una pendiente de 1/Kd. En la grfica de Scatchard que se
muestra a continuacin se representan los mismos datos utilizados en anteriores las
curvas de enlace.

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Las curvas de enlace hiperblicas y las representaciones lineales de Scatchard sirven

para reconocer reacciones bimoleculares sencillas. Ms adelante, demostraremos que las
reacciones de orden ms elevado, como por ejemplo, 2A+B A2B y 3A+B A3B,
tienen como resultado representaciones de Scatchard cncavas descendentes y curvas de
enlace con formas sigmoideas.

Equilibrios unimoleculares
Las reacciones de equilibrio, como la del plegamiento de una protena, que implican un
cambio conformacional en una molcula se estudian, por lo general, determinando las
concentraciones del reactivo y el producto en funcin de algn cambio medioambiental
que perturbe el equilibrio. Podra ser, por ejemplo, el pH, la temperatura, la presin,
algn desnaturalizante qumico, etc. En el ejemplo mostrado a continuacin, se emplea
la urea como desnaturalizante para estudiar el desplegamiento de una protena
monomrica.

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En este caso, se pueden calcular las constantes de equilibrio (KD) del desplegamiento de
la protena para cada una de las concentraciones de urea, de 2 a 4,5M aproximadamente,
donde hay presentes concentraciones apreciables de la protena tanto plegada como
desplegada. Por ejemplo, a una concentracin de urea 3M, las cantidades de protena
nativa y desnaturalizada son iguales y, de ese modo, KD = 1. Sin embargo, para calcular
el valor de KD sin la presencia de urea o a una concentracin de urea 8M,
necesitaramos un modelo sobre el modo en el que KD vara en funcin de la
concentracin de sta. Por lo general, se observa que el ln KD vara linealmente con
respecto a la concentracin de urea, permitiendo el clculo de KD en ausencia de ella.

Problemas frecuentes al calcular las constantes de equilibrio

Hay varios errores frecuentes que nos pueden llevar a un clculo incorrecto de las
constantes de equilibrio:
(1) Utilizar concentraciones de especies que no sean concentraciones de equilibrio.
Cualquier experimento de equilibrio tiene un componente cintico. Una vez que
se inicia la reaccin hay que esperar una cierta cantidad de tiempo antes de
medir los productos. Si este tiempo es muy corto, puede que las concentraciones
de reactivos y productos estn cambiando todava. Una buena forma de
comprobar si la reaccin ha alcanzado o no el equilibrio es ver si la etapa final a
la que se ha llegado es la misma independientemente de que se haya iniciado la
reaccin aadiendo reactivos o productos.
(2) Emplear concentraciones totales en lugar de concentraciones libres en la
expresin de equilibrio.
(3) Utilizar un modelo de equilibrio errneo. El cociente [A][B]/[AB] slo ser
constante en equilibrio para el modelo A + B AB.

Reacciones que producen cambios en la forma oligomrica

Las protenas oligomricas son muy frecuentes en biologa. Supongamos una reaccin
en la que dos molculas de A libre se combinen con B para formar un complejo A2B sin
intermediarios detectables.

Para calcular Kd, cuyas unidades en esta reaccin son M , valoramos una cantidad fija
de [B] con cantidades en aumento de [A] y medimos la fraccin de B enlazada. La
ecuacin que relaciona la fraccin de [B] enlazado con [A] para este modelo de
equilibrio es la siguiente:
Fraccin de B enlazada

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La curva de enlace de este modelo de equilibrio presenta una forma de S o sigmoidea

como la que se puede ver a continuacin:

Obsrvese tambin que Kd = [A] cuando la mitad de B disponible est enlazada. La

representacin de estos datos en una escala logartmica destaca que la curva de enlace
tiene una pendiente mucho ms pronunciada que en el caso A + B AB simple.
Ahora, el 90% de la reaccin de enlace tiene lugar en un rango de concentracin de [A]
de orden 9 con el centro prximo a la mitad del nmero de enlaces mximos.

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La representacin de Scatchard para esta reaccin es cncava y descendente, lo que

indica que se trata de una reaccin con cooperatividad1 positiva. En este caso, la
cooperatividad surge debido a que A se dimeriza en el complejo A2B enlazado.

En el caso general, cuando se combinan n molculas de A con una molcula de B para

formar un complejo:

Si los intermediarios no estn concentrados:

La fraccin de B enlazada

As, para una reaccin totalmente cooperativa, a medida que el nmero de subunidades
(n) aumenta, la pendiente de la representacin grfica de la fraccin de B enlazada
frente a [A] se vuelve cada vez ms pronunciada. La siguiente grfica muestra la
representacin de las subunidades n=1, n=2 y n=6.

Para una reaccin del tipo 2A + B A2B, la cooperatividad positiva significa que los intermediarios
potenciales de la reaccin (p. ej. A2 AB) estn muy poco concentrados en relacin con las etapas finales
en las que se alcanza el equilibrio.

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Los enlaces en sistemas cooperativos con grandes cambios en el proceso oligomrico

pueden ser extraordinariamente sensibles a pequeos cambios en la concentracin del
ligando.

Los procesos intermedios en las reacciones de equilibrio

Es raro que los complejos que contienen tres o ms molculas se formen en una sola
etapa en la que colisionen todas las molculas simultneamente. Por lo general, es
mucho ms probable que dichas reacciones se desarrollen mediante sucesivas
reacciones bimoleculares. En la reaccin 2A + B A2B, A podra dimerizarse primero
y luego unirse a B. Otra opcin sera que una sola molcula de A pudiera unirse a B en
una etapa, y que la segunda molcula de A se les uniera en otra etapa. Estas reacciones
se escribiran del siguiente modo:

Y, en el siguiente diagrama, se muestran de forma esquemtica para una protena

enlazante de ADN:

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Cualquiera de los dos caminos de formacin consiste en dos equilibrios combinados.

En cualquier conjunto de procesos combinados, cada etapa afecta a su adyacente
nicamente cambiando la concentracin de un participante comn mediante la accin de
masas. Si examinamos el camino superior K1K2, los procesos combinados sern:

AB es la especie ms frecuente en los equilibrios K1 y K2. As, al aumentar las

concentraciones de [A] libre o de [B] en la reaccin K1, se producira un aumento en la
concentracin de [AB]. Esto, a su vez, tendra como resultado una mayor concentracin
de A2B en la reaccin K2. Cmo se muestra a continuacin, A2 es la especie molecular
ms frecuente en las reacciones K3 y K4.

Obsrvese que el producto de las constantes de equilibrio de las etapas K1 y K2 es igual

al de las constantes de equilibrio de las etapas K3 y K4; y que ambos productos nos dan
la constante de equilibrio de la reaccin global.

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Esto se cumple siempre en los equilibrios dobles, porque la concentracin de la especie

ms frecuente desaparece cuando se multiplican las constantes de equilibrio de cada
etapa.
En reacciones de equilibrios dobles, una pregunta es si las especies intermediarias
tendrn una concentracin importante en relacin con las etapas finales. La respuesta
depender de los valores relativos de las constantes de equilibrio de cada etapa. Si las
dos etapas son bimoleculares, se puede esperar que las especies intermediarias no
presenten concentraciones importantes siempre y cuando la primera constante de
disociacin en equilibrio sea considerablemente mayor que la segunda y viceversa.
Para el caso descrito anteriormente, suponer que la reaccin sigue el camino K1K2 con
-7
-11
K1 = 5 x 10 M y K2 = 5 x 10 M. De este modo, el enlace del segundo A es mucho
ms fuerte que el del primero. Por intuicin, cualquier concentracin de [A] donde
cabra esperar que se formara [AB] exceder en gran medida la concentracin necesaria
para el enlace del segundo A. Por ello, no se esperar que el intermediario [AB]
presente concentraciones importantes. Esto se puede demostrar tambin
-9
matemticamente. Cuando [A] = 5 x 10 M:

De este modo, la concentracin de [AB] ser tan slo un 1% de las concentraciones de

[A2B] o [B] y este intermediario apenas est concentrado en relacin con las etapas
finales.
Cuando los intermediarios estn presentes en cantidades muy pequeas en comparacin
con las etapas finales, se pueden ignorar al calcular la constante de equilibrio de la
reaccin global. En el caso mencionado, esto equivale a realizar las aproximaciones:

Algo perfectamente justificable cuando K1>>K2.

-9
-9
Qu pasara si K1=K2 = 5 x 10 M? Entonces, cuando [A] = 5 x 10 M:

[AB] y [A2B] presentan ahora la misma concentracin y la presencia del intermediario

no se puede ignorar en los clculos del equilibrio. En un caso de este tipo, si tuvisemos
un experimento que pudiera distinguir AB de A2B (quiz uno de filtracin por gel o de
footprinting), se podran calcular K1 y K2 directamente.

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Si, por el contrario, los intermediarios se encuentran bastante concentrados y el

experimento no puede distinguir entre AB y A2B, ambas especies tendran que incluir el
clculo de

, la fraccin de B enlazada.

Equilibrios que incluyen componentes tampn

Es frecuente ensayar el enlace de dos macromolculas o de un ligando pequeo y una
macromolcula en una disolucin tampn que contiene componentes que, en principio,
podran participar en la reaccin. Suponer, por ejemplo, que dos iones cloruro se
enlazan a la interfaz de un dmero y son necesarios para una dimerizacin estable.

Por intuicin, el aumento de la concentracin de cloruro incrementara la formacin del

complejo. La expresin de equilibrio adecuada para esta reaccin es:

Sin embargo, en estas circunstancias, la constante de equilibrio aparente de la

dimerizacin se escribira por lo general sin especificacin explcita del cloruro:

Un poco de lgebra nos lleva a:

As, si se hubiera medido Kap en disoluciones tampn con distintas concentraciones de

NaCl, cabra esperar que la grfica de log (Kap) frente a log [Cl] fuera una recta con una
pendiente de 2. Este tipo de experimentos pueden ser muy tiles para detectar la
participacin y la estequiometra de componentes tampn en una reaccin.

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Obsrvese, sin embargo, que debido a que el ion cloruro y el ion sodio aumentan a la
vez que incrementamos la concentracin de NaCl, el experimento mostrado
anteriormente no indica que sea el cloruro y no el sodio el componente tampn que
participa en la reaccin. Se podran realizar experimentos de control para estudiar la
dimerizacin en disoluciones tampn con distintas concentraciones de KCl, KF, NaF,
Na2SO4, Na2PO4, etc.; con el fin de comprobar si el importante es el anin o el catin y
si la reaccin es especfica para un anin o catin determinado.
Las protenas contienen diversos grupos ionizables y es frecuente que participen
protones e iones hidrgeno en las reacciones de plegamiento, de cambio conformacional
y de enlace. As, es habitual que la constante Kap de una reaccin vare en funcin de la
+
+
concentracin de [H ]. El pH es igual a log[H ]; de este modo, la representacin
grfica de Kap frente al pH nos debera mostrar si es necesario uno o ms protones para
la reaccin. No obstante, en algunas ocasiones, puede que un protn enlazado no sea
completamente necesario para una reaccin, pero que su presencia modifique la
constante de equilibrio. Este conjunto de reacciones se podra escribir del siguiente
modo:

Supongamos que probamos a enlazar A con B a un pH bajo en el que todas las especies
+
+
-9
estn protonadas y nos encontramos con que [AH ][B]/[AH B] = 10 M. Esto nos da
una estimacin de K4. A continuacin, repetimos el experimento a un pH elevado en el

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-7

que las especies no estn protonadas y obtenemos [A][B]/[AB] = 10 M. Como se

puede observar, la protonacin de A hace que el enlace con A sea 100 veces ms fuerte.
Puesto que K1 K2 = K3 K4, sabemos que K3 = 100 x K2 (esto indica simplemente que el
protn se enlaza con ms fuerza al complejo AB que a A libre).
A continuacin, medimos Kap a distintos pHs. Puesto que en nuestro experimento de
enlace no distinguimos las especies protonadas de las no protonadas:

Para obtener Kap como funcin de [H ], sustituimos [A][[H ]/K3 por AH y [AB][H ]/
+
K2 por AH B. Tras realizar un ajuste y algunas sustituciones ms, obtenemos:

Los datos de la grfica que se puede ver a continuacin se obtuvieron utilizando K3 =

-6
10 M (pKa = 6), valor que cabra esperar para una cadena lateral de histidina.

Si stos fueran datos experimentales, podramos ajustarlos para obtener el valor pKa del
enlace del protn a la protena libre (pKa = -log (K3) = 6) y al complejo (pKa = -log (K2)
= 8).

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