Trabajo prctico N 10: Separacin de protenas de la leche.

Identificacin de aminocidos.
Objetivo: Obtencin de la casena de la leche; identificacin de aminocidos
presentes en dicha protena.
Introduccin:
AMINOCIDOS
El trmino aminocido define a cualquier molcula que contiene un grupo amino y
un grupo cido; sin embargo, este trmino casi siempre se utiliza para designar a un aminocido.
Aminocidos esenciales
Los seres humanos pueden sintetizar aproximadamente la mitad de los aminocidos
que forman las protenas, el resto de los aminocidos, denominados aminocidos
esenciales, han de ser ingeridos en la dieta.
A las protenas que proporcionan todos los aminocidos esenciales en la proporcin
correcta para la nutricin humana se las denomina protenas completas.
Propiedades de los aminocidos
A pesar de que generalmente los aminocidos se escriben con un grupo carboxlico
(-COOH) y un grupo amino (NH2), su estructura real es inica y depende del Ph. El
grupo carboxlico pierde un protn, dando lugar a un in carboxilato, y el grupo amino
se trotona y da lugar a un ion amonio. A esta estructura se la denomina in bipolar o
zwiterin.
La naturaleza bipolar de los aminocidos que estos tengan algunas propiedades
caractersticas:
-

Los aminocidos tienen puntos de fusin altos, generalmente superiores a

200C.
Los aminocidos son ms solubles en agua que en ter, diclorometano y otros
disolventes orgnicos comunes.
Los aminocidos tienen momentos bipolares mucho ms grandes que las
aminas o los cidos por separados.
Los aminocidos son menos cidos que la mayora de los cidos carboxlicos y
menos bsicos que la mayora de las aminas. De hecho, la parte cida de una
molcula de aminocido es el grupo NH3+, no el grupo COOH; la parte
bsica es el grupo COO y no el grupo -NH2.

Como los aminocidos tienen el grupo cido (NH3+) y bsico (COO ), son
anfteros. La forma predominante del aminocido depende del pH de la solucin. En
una solucin cida, el grupo COO se trotona y se obtiene el grupo COOH, y la
molcula tiene una carga total positiva. Si el pH aumenta, el grupo COOH pierde su
protn aproximadamente a pH= 2. A este punto se lo denomina pK a1, primera constante
de disociacin cida. Si el pH sigue aumentando, el grupo NH3+ pierde su protn a un

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pH entre 9 y 10. A este punto se lo denomina pK a2, segunda constante de disociacin

cida. Por enzima de este pH, la molcula tiene una carga total negativa.
Puntos isoelectrnicos y electroforesis
Los aminocidos presentan una carga positiva en medio cido y carga negativa en
soluciones bsicas. Hay un pH intermedio donde las dos formas del aminocido se
encuentran en la misma proporcin, como el zwiterin bipolar con una carga neta de
cero. A ese pH se lo denomina punto isoelctrico o punto isoelectrnico.
La diferencia en los puntos isoelctricos se puede utilizar para separar mezclas de
aminocidos y purificarlos por electroforesis, ya que por lo general, la solubilidad
mnima se presenta en el punto isoelctrico. Tambin se pueden identificar
aminocidos, ya que el punto isoelctrico es caracterstico para cada aminocido.

Obtencin de aminocidos: Hidrlisis cida

Muchos de los aminocidos se obtienen todava preferiblemente por hidrlisis
cida o enzimtica de las protenas. Se evita la hidrlisis alcalina debido a que la
presencia de un hidrgeno sobre el tomo asimtrico de carbono adyacente al grupo
carbonlico de la amida permite una rpida racemizacin en presencia de bases. La
racemizacin no es tan rpida en soluciones cidas pero le triptfano es destruido por
los cidos debido a la presencia del ncleo pirrlico.
Reaccin con Ninhidrina
La mayor parte de los cidos -amino carboxlicos cuando se tratan con una
solucindiluda de Ninhidrina dan un producto de color azul prpura. La pirolina,
hidroxiprolina y la asparagina dan soluciones amarillas a anaranjado-pardas. La
reaccin se usa no solamente para localizar a los aminocidos sobre las cromatografas
de papel, sino tambin para la estimacin colorimtrica cuantitativa.
PROTENAS
Clasificacin de protenas:
Las protenas se agrupan en simples o conjugadas. Las protenas simples son las
que cunado se hidrolizan slo dan lugar a aminocidos. Las protenas conjugadas estn
enlazadas a un grupo posttico no proteico como un azcar, un cido nucleico, un lpido
o algn otro grupo.
Las protenas se clasifican como fibrosas o globulares dependiendo de si forman
filamentos largos o se enrollan en si mismas. Las protenas fibrosas son alargadas,
fuertes y generalmente insolubles en agua, y su funcin principal es formar las partes

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estructurales del organismo. Las protenas globulares se encuentran enrolladas, con

formas prcticamente esfricas, y principalmente forman parte de las enzimas, las
hormonas o protenas de transporte.
Desnaturalizacin de las protenas
Con excepcin de la estructura primaria que viene definida por una conectividad
covalente, todos los otros niveles estructurales (secundaria, terciaria y cuaternaria) se
mantienen por solvatacin dbil y por enlaces de hidrgeno o por interacciones de Van
der Walls. Pequeos cambios en el ambiente que rodean las protenas pueden producir
un cambio conformacional o qumico, originando desnaturalizacin, esto es, la
modificacin de la estructura normal y prdida de la actividad biolgica. Hay muchos
factores que pueden producir la desnaturalizacin, pero los ms comunes son el calor y
el pH.
Cunado se somete una protena a un pH cido, algunos de los grupos carboxilos de
las cadenas laterales se protonan y pierden su carga inica, producindose cambios
conformacionales que dan lugar a la desnaturalizacin. En solucin bsica, los grupos
amino se desprotonan y, de forma similar, pierden su carga inica, dando lugar tambin
a cambios conformacionales y a la desnaturalizacin.
Cuando el pH es cido, las protenas de la leche se desnaturalizan y precipitan. A
este proceso se lo denomina coagulacin.
En muchos casos la desnaturalizacin es irreversible. Tal es el caso de la clara de
huevo: al calentarla coagula, pero si se enfra no recobra su estructura inicial. Sin
embargo, la desnaturalizacin puede ser reversible si a la protena solo se la ha sometido
a una desnaturalizacin suave.
El enlace peptdico
Un aminocido, como tiene un grupo amina y un grupo cido, es muy apropiado
para formar uniones amida. En condiciones adecuadas, el grupo amino de una molcula
condensa con el grupo carbonilo de otra. El producto que se obtiene es una amida
denominada dipptido, ya que est formada por dos aminocidos. La unin amida entre
aminocidos se denomina enlace peptdico.
Este enlace, al igual que el enlace amida, es muy estable, esto se debe a la fuerte
interaccin por resonancia entre los electrones no enlazantes del nitrgeno y del grupo
carbonilo. El nitrgeno del grupo amida ya no es una base fuerte y el enlace C-N tiene
restringida la rotacin debido a su carcter de doble enlace parcial.
Desarrollo:
REACTIVOS
Para la separacin de la casena de la leche se utiliza cido actico; y, para su
posterior redisolucin utiliza NaOH (medio bsico) y NaCl (sustancia isotnica). La
obtencin los aminocidos presentes en la casena se realiza con HCl.
En la determinacin del contenido proteico, despus de la coagulacin y luego de
la hidrlisis, se utiliza el reactivo de Biuret (CuSO 4, tetrato de sodio y potasio, NaOH,
Ioduro de Potasio, agua destilada).
Para la cromatografa en placa delgada se utilizan como solvente de corrida nbutanol, cido actico y agua; como revelador se utiliza Ninhidrina y piridina en etanol.

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PLAN DE TRABAJO
En la extraccin de la casena de la leche primero se procede a dilucin leche
descremada en agua; luego, a la coagulacin de la protena, que se realiza con cido
Actico y calentamiento (40-42C). El coagulo se debe separar del resto de la solucin
por centrifugacin y se descarta el sobrenadante.
Para obtener nuevamente una solucin, se realiza la redisolucin de la casena con
NaCl y NaOH. Despus de esto se somete a la solucin obtenida a la primera prueba del
contenido proteico de la solucin, por medio de la reaccin de Biuret.
Luego se procede a la separacin de aminocidos de la protena mediante una
hidrlisis cida (HCl 6 N); esto ocurre en un tubo de combustin con tapn perforado
haciendo vaco, y luego se la coloca en estufa a 120C durante 24 horas. Despus de
este proceso se realiza la segunda prueba con el reactivo de Biuret para comprobar la
finalizacin de la hidrlisis.
Para determinar la composicin en aminocidos de la protena estudiada, se
realiza una cromatografa en placa delgada con n-butanol, cido actico y agua como
solvente de corrida, sembrando como patrones los aminocidos que es posible encontrar
en la casena. El revelado se realiza con Ninhidrina y piridina en etanol.
METODOLOGA
En la extraccin de la leche se utiliza leche descremada, de lo contrario hay que
separarla de la grasa por solvente, en un paso previo a la extraccin de la protena.
Debido a que la casena no precipita por accin del calor, se la separa de la leche
hacindola coagular con un cido dbil como lo es el cido Actico al 10% a
temperaturas de entre 40 y 42C, en este paso se produce la desnaturalizacin de la
protena. Es muy importante realizar la coagulacin con un cido dbil y en baja
concentracin a temperaturas no tan elevadas para no afectar el enlace peptdico. Con
un cido dbil, la protena solo pierde solubilidad, y la desnaturalizacin es reversible
con la utilizacin de una base.
Una vez realizada la coagulacin de la casena, sta queda suspendida en la
solucin, para separarla mas rpidamente de sta, se realiza la centrifugacin.
Luego, se redisuelve el coagulo de la casena en NaOH, ya que tiene la propiedad
de disolverse en bases; tambin utiliza NaCl, que es una sustancia isotnica por lo que
no afecta la composicin de la casena, tiene la misma densidad que sta y se la utiliza
para aumentar el volumen de la solucin.
Con la protena ya disuelta, se procede a la primera prueba con el reactivo de
Biuret; este ensayo se realiza para comprobar la presencia de protenas en solucin, ya
que el in cprico en solucin alcalina y en presencia de enlaces peptdicos, forma un
compuesto cpricos de quelacin de color azul oscuro. Puede utilizarse para la
estimacin colorimtrica, ya que la intensidad del color que toma la solucin es
proporcional a la cantidad de enlaces peptdicos presentes en ella.
Para obtener los aminocidos se realiza una hidrlisis cida, debido a que la
recemizacin en medio cido es mucho mas lenta que en medio bsico. Se realiza en
condiciones drsticas (cido fuerte y concentrado, vaco y altas temperaturas por un
tiempo prolongado) debido a que el enlace peptdico es muy fuerte y difcil de romper.
Para comprobar la finalizacin de la hidrlisis se realiza la ensayo con el reactivo de
Biuret, que debe dar negativo, ya que si la hidrlisis fue completa, no debe quedar
ningn enlace peptdico en la solucin.

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Por ltimo se realiza una cromatografa en placa delgada (papel), sembrando las
siguientes protenas como patrones: Triptfano, Fenilalanina, Alanina y Glicina. Para el
revelado reutiliza la Ninhidrina que otorga diferentes coloraciones dependiendo de que
aminocido se trate. Por comparacin de colores y alturas (que dependen de la polaridad
de la molcula de aminocido) de la muestra con los patrones se puede estimar que
aminocidos estaban presentes en la casena.
RESULTADOS
Ensayos con el reactivo de Biuret:
Ensayo 1: Ensayo testigo, slo el reactivo. El color es turquesa caracterstico del
reactivo.
Ensayo 2: El reactivo con diferentes aminocidos. Con todos los aminocidos el
color se mantiene turquesa indicando que el ensayo es negativo.
Ensayo 3: El reactivo con la leche. A pesar de la coloracin de la leche se puede
observar claramente que el color ya no es turquesa sino es un azul violceo mas intenso,
esto indica que el ensayo es positivo.
Ensayo 4: El reactivo con el hidrolizado. El color es turquesa por lo que es
negativo, indica la ausencia de uniones peptdicas, por lo tanto, ausencia de protenas
Cromatografa:
Comparando las corridas y color de revelado de las muestras de casena
hidrolizada con los patrones sembrados (Fenilalanina, Triptfano, Glicina y Alanina), se
observ que slo la Fenilalanina y Triptfano si coincidan en Rf y color con la muestra
de aminocidos, pero los resultados no son del todo claros. La Glicina y Alanina no
coincidieron en altura ni color con ninguna de las manchas observadas en la muestra
sembrada.
Conclusin:
Se puede concluir que en la coagulacin la desnaturalizacin fue reversible, ya que
al redisolverla y realizar el ensayo de Biuret, ste dio positivo, lo que indica que los
enlaces peptdicos no fueron afectados.
En cuanto a la hidrlisis, sta se realiz satisfactoriamente y fue completa, ya que
nuevamente, se comprob con la reaccin de Biuret negativa que no quedaban enlaces
peptdicos presentes en la solucin, lo que indica que no hay protenas en dicha
solucin.
En cuanto a la cromatografa se puede decir que es probable la existencia de
Fenilalanina y Triptfano en la casena debido a que las corridas y los colores de
revelado coincidieron con las de algunos de los aminocidos de la muestra de la casena
hidrolizada, pero no se puede afirmar ya que el resultado no es muy claro. Si se puede
afirmar que la Glicina y Alanina no se encontraban presentes en la casena ya que ni los
colores ni las corridas de las mismas coincidan con las de los aminocidos de las
muestras.

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Bibliografa:
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L.G. WADE, JR.; Qumica Orgnica Quinta Edicin; Ed. Pearson Prentice Hall;
Pg. 1114-1155; 2000.
BREWSTED, R.: VANDERWERF, C.; Mc EWEN. W.; Curso prctico de
Qumica Orgnica; Editorial Alhambra; Pg. 149-152; 1979.
NOLLER, C. R.; Qumica de los compuestos orgnicos; Editorial
Ineramericana; Madrid; Pg. 558-585; 1968.

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