Manual de Torres

MANUAL PRCTICO DE
BACTERIOLOGA MDICA
por
Miguel F. Torres
Portada interna:
Microfotografa electrnica de Salmonella typhi en divisin. Muestra los flagelos, las
fimbrias y la pared celular de la bacteria que causa la fiebre tifoidea. Inserto: dibujos de bacterias de la microbiota oral, por A. van Leeuwenhoek, siglo XVII.
1996, Miguel Francisco Torres Rubn

Qumico Bilogo graduado de la Universidad de San Carlos de Guatemala. Posee
Maestra en Microbiologa Mdica de la Universidad de Duke, Carolina del Norte,
Estados Unidos.
Fundador del Laboratorio Microbiolgico de Referencia (LAMIR) y catedrtico titular de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Microbiologa, Escuela de
Qumica Biolgica, Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia, Universidad de San
Carlos de Guatemala.
Por muchos aos fue microbilogo del Instituto Guatemalteco de Seguridad Social
(IGSS) y del Hospital Militar en la ciudad de Guatemala. Es miembro de la Academia de Ciencias Mdicas, Fsicas y Naturales de Guatemala, y fundador de la Academia Guatemalteca de Historia de la Medicina.
Los criterios expresados en esta publicacin son de la exclusiva responsabilidad
del autor e incluyen su experiencia personal.
Impreso en Editorial Serviprensa C.A.
3a. avenida 14-68, zona 1
Tels. 232-5424, 232-9025 Fax: 232-0237
Guatemala, Guatemala, 1996
NDICE
PRESENTACIN / 11
AGRADECIMIENTOS / 13
PRLOGO / 15
Foto: Antonio van Leeuwenhoek. Foto: Luis Pasteur. Foto: Roberto Koch.
CAPTULO 1:
BREVE INTRODUCCIN A LA MICROBIOLOGA / 21
El Nombre Correcto de los Microorganismos. Recomendaciones de Bioseguridad
para el Laboratorio de Microbiologa. Medidas de Bioseguridad. Mtodos de
Esterilizacin o Desinfeccin. Descontaminacin. Antisepsia. Uso efectivo de
Antispticos, Desinfectantes y Procedimientos de Esterilizacin. Resistencia de
Microorganismos a Germicidas Qumicos.
CAPTULO 2:
INTRODUCCIN A LA BACTERIOLOGA / 29
Cmo Organizar el Area de Trabajo de Bacteriologa. Fig. 1 Mesa de Trabajo para
Bacteriologa. La Coloracin de Gram. Foto: Hans Gram. Frmulas: Reactivos para
la Coloracin de Gram. Fig. 2 Clases de Asas Microbiolgicas y su Uso, 1 Asas para
Bacteriologa, 2 Asas para Micologa y Micobacterias. Fig. 3 Inoculacin de Medios
Slidos por Estras.
CAPTULO 3:
COPROCULTIVO / 41
Propsito. Muestra. Procedimiento. Fig. 4 Marcha Bacteriolgica para Coprocultivo.
Interpretacin de Resultados. Fig. 5 Observacin y Sealamiento de Colonias
Sospechosas. Fig. 6 Tcnica para tomar Inculo de Colonias Individuales. Reacciones
de varias Enterobacterias en TSI/LIA. Diferenciacin de las Especies del Gnero
Shigella. Diferenciacin de las Especies del Gnero Salmonella. Informe.
Procedimiento para Cultivo de Cuerdas Encapsuladas (Enterotest) para Coleccin
de Muestras Duodenales. La Epidemiologa y Etiologa de la Diarrea. Patgenos
Frecuentemente Identificados en Nios con Diarrea Aguda, Atendidos en Centros
de Tratamiento, en Pases en Desarrollo.
CAPTULO 4:
COPROCULTIVO PARA CLERA / 63
Propsito. Muestra. Procedimiento. Interpretacin de Resultados. Fig. 7 Marcha
Bacteriolgica Acortada para Aislamiento de Vibrio cholerae 01. Informe. Frmulas:
1 Agua Peptonada Alcalina (APA), 2 Medio de Transporte Cary-Blair.
CAPTULO 5:
COPROCULTIVO PARA Campylobacter jejuni / 71
Propsito. Muestra. Condiciones necesarias. Procedimiento. Interpretacin de
Resultados. Informe.
CAPTULO 6:
INVESTIGACIN DE Helicobacter pylori / 75
Propsito. Muestra. Observacin Directa. Prueba de Ureasa. Cultivo. Informe.
CAPTULO 7:
UROCULTIVO / 79
Propsito. Manifestaciones Clnicas y Microorganismos Asociados con Varios Tipos
de Infecciones Urinarias. Toma de la Muesta. Toma de Urocultivo en el Hombre.
Toma de Urocultivo en la Mujer. Toma de Urocultivo en Nios Pequeos. Puncin
Supra-pbica (PSP). Procedimiento. Foto: Biplaca para Urocultivo. Fig. 8 Marcha
Bacteriolgica para Urocultivo. Interpretacin de Resultados. Informe. Deteccin
de Bacteriuria por la Coloracin de Gram de Orina no Centrifugada.
CAPTULO 8:
CULTIVO DE GARGANTA / 91
Propsito. Muestra. Procedimiento. Fig. 9 Marcha Bacteriolgica para Cultivo de
Garganta/Exudado Farngeo. Interpretacin. Foto: Interpretacin de la Prueba de
Bacitracina. Identificacin Presuntiva de Streptococcus agalactiae (Grupo B), Prueba
de CAMP. Fig. 10 Siembra e Interpretacin de la Prueba de CAMP. Caractersticas
Fsicas, Hematolgicas y Qumicas de la Sangre de Carnero. Ventajas del Uso de la
Sangre de Carnero en el Laboratorio Clnico.
CAPTULO 9:
CULTIVOS DE GARGANTA ESPECIALES / 105
Propsito. Investigacin de Corynebacterium diphtheriae. Muestra y Procedimento.
Interpretacin de Resultados. Informe. Investigacin de Neisseria meningitidis en
Cultivos de Garganta de Contactos. Muestra y Procedimiento. Interpretacin.
Informe.
CAPTULO 10:
CULTIVO DE ESPUTO / 121
Propsito. Muestra. El Frote Gram de Esputo. Interpretacin del Frote Gram de
Esputo. Cultivo de Esputo. Interpretacin de Resultados e Informe. Etiologa y
Sintomatologa de Neumona y Bronquitis.
CAPTULO 11:
HEMOCULTIVO / MIELOCULTIVO / 129
Propsito. Muestra. Procedimiento. Observaciones en Hemocultivos que Orientan
el Diagnstico Bacteriolgico. Interpretacin de Resultados. Etiologa y
Sintomatologa de Septicemia. Informe.
CAPTULO 12:
SECRECIONES DIVERSAS / 137
Propsito. Muestra. 1 Piel. Etiologa y Sintomatologa de Heridas Infectadas. 2 Ojos.
Etiologa y Sintomatologa de Infeccin Ocular. 3 Odos. Etiologa y Sintomatologa
de Otitis Media. 4 Miscelneos. Procedimiento. Interpretacin de Resultados e
Informe. Principales Pruebas para la Diferenciacin de Tres Especies del Gnero
Staphylococcus de Origen Humano.
CAPTULO 13:
SECRECIONES GENITALES / 147
Propsito. Diagnstico de Gonorrea. Foto: Neisseria gonorrhoeae, Frote Gram de Pus
Uretral Masculino. Diferenciacin de Dos Especies de Neisseria de Importancia
Clnica. Diagnstico de Chancro Blando (Chancroide). Diagnstico Directo de la
Sfilis. Foto: Treponema pallidum, Campo Oscuro de Chancro. Agentes Infecciosos
del Tracto Genital Femenino. Introduccin. Vaginitis. Cervicitis. Otros Agentes
Etiolgicos.
CAPTULO 14:
LQUIDO CEFALORRAQUDEO Y FLUIDOS CORPORALES / 163
Propsito. Muestra. Etiologa y Sintomatologa de Infeccin Osea y Articulaciones.
Procedimiento. Fig. 11 Marcha Bacteriolgica para Lquido Cefalorraqudeo (LCR).
Interpretacin de Resultados. Informe.
CAPTULO 15:
TEJIDOS Y BIOPSIAS / 171
Propsito. Muestra. Procedimiento. Interpretacin de Resultados e Informe.
CAPTULO 16:
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA) / 177
Propsito. Medio de Cultivo. Procedimiento. Esquema: Jarro Gas-Pak. Fig. 12
Marcha Bacteriolgica para Antibiograma. Antibiticos Aprobados (FDA-USA) que
deben Usarse Rutinariamente para Pruebas de Susceptibilidad en Varios Grupos
Bacterianos. 1 Enterobacterias, 2 Pseudomonas aeruginosa y otros Bacilos gramnegativo no de la Familia Enterobacteriaceae, 3 Sthapylococcus spp. Interpretacin de
Resultados. Interpretacin de los Dimetros de las Zonas de Inhibicin (mm) para
Miembros de la Familia Enterobacteriaceae. Interpretacin de los Dimetros de las
Zonas de Inhibicin (mm) para Staphylococcus spp. Control de Calidad. Lmites
Aceptables de los Halos de Inhibicin (mm) que Deben Obtenerse con las Cepas
Control. Fuentes Comunes de Error.
CAPTULO 17:
ANAEROBIOS / 193
Propsito. Muestra. Toma de Muestra para Cultivo de Anaerobios. Transporte de
las Muestras al Laboratorio. Procedimiento. Interpretacin de Resultados.
Caractersticas Morfolgicas de Algunos Bacilos Anaerobios Gram-negativo de
Importancia Mdica. Interpretacin del Cultivo. Morfologa Microscpica. Fig. 12
Diversas Morfologas Bacterianas. Informe.
CAPTULO 18:
MICOBACTERIAS / 203
Propsito. Muestras. 1 Esputo, 2 Lavado Gstrico, 3 Orina, 4 Otro Tipo de Muestras.
Procedimiento. Procedimiento de la Coloracin de Ziehl-Neelsen. Frmulas:
Reactivos para Ziehl-Neelsen. Coloracin de Kinyoun. Frmulas: Reactivos para
Kinyoun. Interpretacin e Informe de Baciloscopas. Reporte de Frotes para
Micobacterias. Cultivo para Micobacterias. Digestin y Descontaminacin de
Esputos. Mtodo de Digestin y Descontaminacin con N-acetil-levo-cistena
(NALC). Frmulas. Digestin y Descontaminacin de Esputos por el Mtodo
Convencional de Hidrxido de Sodio. Frmulas. Procedimiento de Digestin/
Descontaminacin para Esputos de Pacientes cuyas muestras estn constantemente
contaminadas con Pseudomonas sp. o Proteus sp. Procedimiento para Lavados
Gstricos. Procedimiento para Orina. Procedimiento para Hisopo Farngeo.
Procedimiento para Tejido o Piel. Procedimiento para Otros Fluidos Corporales.
Interpretacin del Cultivo. Prueba de Niacina. Grupos de Runyon (Micobacterias
Atpicas).
BIBLIOGRAFA / 223
NDICE DE FIGURAS
Fig.1 / 34
MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGA
Fig.2 / 39
CLASES DE ASAS MICROBIOLGICAS Y SU USO
1 Asas para Bacteriologa
2 Asas para Micologa
Fig.3 / 40
INOCULACIN DE MEDIOS SLIDOS POR ESTRAS
Fig.4 / 45
MARCHA BACTERIOLGICA PARA COPROCULTIVO
Fig.5 / 46
OBSERVACIN Y SEALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS
Fig.6 / 48
TCNICA PARA TOMAR INCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES
Fig.7 / 67
MARCHA BACTERIOLGICA ACORTADA PARA AISLAMIENTO DE Vibrio
cholerae 01
Fig.8 / 84
MARCHA BACTERIOLGICA PARA UROCULTIVO
Fig.9 / 94
MARCHA BACTERIOLGICA PARA CULTIVO DE GARGANTA
FIG.10 / 100
SIEMBRA E INTERPRETACIN DE LA PRUEBA DE CAMP
Fig. 11 / 166
MARCHA BACTERIOLGICA PARA LQUIDO CEFALORRAQUDEO (LCR)
Fig.12 / 181
MARCHA BACTERIOLGICA PARA ANTIBIOGRAMA
Fig.13 / 201
DIVERSAS MORFOLOGAS BACTERIANAS
Nota:
Al centro del libro, a partir de la pgina 111 aparecen 32 fotografas a color y
sus explicaciones correspondientes.
Guatemala, agosto de 1996
PRESENTACIN
Las enfermedades infecciosas continan siendo la principal causa de morbimortalidad en Mesoamrica. Entre las variadas infecciones que afectan la salud
pblica de nuestros pueblos, las infecciones de origen bacteriano son unas de las
ms frecuentes. Por este motivo, cualquier esfuerzo orientado a capacitar personal
de salud en diagnstico bacteriolgico, incide directamente en su mejor tratamiento
y control.
La Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos
de Guatemala, se complace en presentar el siguiente MANUAL PRCTICO DE
BACTERIOLOGA MDICA a la comunidad cientfica de Guatemala y Centroamrica.
Como su ttulo lo indica, se trata de un libro fcil de leer, comprender y aplicar,
dirigido a profesionales, estudiantes y tcnicos que estudian o trabajan directamente
la bacteriologa en los laboratorios clnicos privados o estatales.
El autor es catedrtico titular desde hace 22 aos en el Departamento de
Microbiologa, Escuela de Qumica Biolgica de esta Casa de Estudios. Durante estos
aos, ha tenido a su cargo la enseanza de la bacteriologa mdica a los estudiantes
de Qumica Biolgica. Cuenta con una gran trayectoria profesional dentro y fuera
de la Universidad de San Carlos de Guatemala. Se ha destacado no slo como
catedrtico e investigador a travs de sus mltiples publicaciones en revistas
cientficas nacionales e internacionales, sino tambin a lo largo de los aos ha
demostrado su empeo por mejorar la microbiologa en nuestro medio. Uno de sus
principales logros fue la creacin del Laboratorio Microbiolgico de Referencia
-LAMIR- en 1991.
La experiencia de Miguel F. Torres en la docencia e investigacin en
bacteriologa, parasitologa y micologa, aunados a sus conocimientos y experiencia
adquiridos durante varios aos de servicio como microbilogo clnico del Instituto
Guatemalteco de Seguridad Social y del Hospital Militar, garantizan el contenido
del manual.
Esta obra fue completada por el autor durante su ao sabtico de la Universidad
de San Carlos. Constituye un valioso libro de texto para los estudiantes de diversas
carreras. Por este motivo, no dudamos en recomendarlo y desearle muchos xitos.
Atentamente,
Lic. Jorge Rodolfo Prez Folgar
Decano
Lic. Gerardo Arroyo Cataln
Director de la Escuela
de Qumica Biolgica
Licda. Heidi Logemann Lima

Jefe del Departamento
de Microbiologa
AGRADECIMIENTOS
El autor desea patentizar sus agradecimientos a los siguientes destacados
bacterilogos de Centroamrica y el Caribe, por su valiosa colaboracin al haber
revisado el manuscrito de este libro. Los distinguidos colegas efectuaron valiosos
comentarios y sugerencias, los cuales dada su gran experiencia y prestigio,
enriquecen la obra.
Licda. Floridalma Cano Granados
Supervisora del Laboratorio de Bacteriologa y Parasitologa Intestinal
Laboratorios de Microbiologa Dr. Leonardo J. Mata
Instituto de Nutricin de Centroamrica y Panam
Guatemala
Dr. Edmundo E. Poujol
Ex-Director del Departamento de Microbiologa
Universidad Nacional Autnoma
Honduras
Dr. Jaime Guevara R.
Jefe de la Seccin de Laboratorios
Direccin Tcnica de Servicios de Salud
Caja Costarricense de Seguro Social
Costa Rica
Dra. Marion C. de Martin
Vice-decana de la Facultad de Medicina
Universidad Nacional
Panam
Dr. Gerardo F. Martnez
Jefe del Departamento de Bacteriologa / Micologa
Sub-Direccin de Microbiologa
Instituto de Medicina Tropical Dr. Pedro Kour
Cuba
A los personeros del Ministerio de Salud Pblica y Asistencia Social de
Guatemala que brindaron su apoyo para lograr el financiamiento de 250 copias de
la Segunda Edicin del presente Manual. Ellos permitieron hacer llegar nuestro
mensaje acadmico y gua de trabajo a profesionales, tcnicos de laboratorio y
estudiantes. Actualizar y estandarizar la bacteriologa mdica en nuestros pases,
debe ser la meta. Estas labores deben ser dinmicas y constantes.
PRLOGO A LA SEGUNDA EDICIN

Las tres diferentes formas que presentan las bacterias fueron observadas por
primera vez por Antonio van Leeuwenhoek en Delft, Holanda, en el siglo XVII. Sin
embargo, la bacteriologa mdica surgi como tal hacia fines del siglo XIX, con los
geniales descubrimientos de Pasteur en Francia y Koch en Alemania. Por primera
vez en la historia, en 1876, Roberto Koch propag una bacteria patgena en cultivo
puro fuera del cuerpo. Al aislar Bacillus anthracis no slo estableci sta bacteria
como causa del ntrax en el ganado vacuno, sino inaugur un mtodo de
investigacin de las infecciones, actualmente vigente.
Hoy en da, la bacteriologa clnica ha avanzado enormemente y en la ltima
dcada del siglo XX es muy extensa y diversa. Por este motivo, se hace necesario
extraer de la literatura actualizada los conocimientos, tcnicas y criterios
interpretativos necesarios para efectuar adecuadamente los anlisis bacteriolgicos
ms frecuentes, y ordenarlos de manera simple y comprensible. Estos son los
propsitos fundamentales de la presente publicacin.
Este MANUAL PRCTICO DE BACTERIOLOGA MDICA no es un texto
exhaustivo de la materia, ni mucho menos un tratado de taxonoma bacteriana. Es
una gua simplificada de trabajo, orientada hacia la obtencin de resultados lo ms
rpido posible y con el mayor significado clnico. Al final del libro, se seleccionan
las referencias bibliogrficas ms relevantes.
Anteriormente se aceptaba que el buen bacterilogo clnico era aquel capaz
de identificar hasta especie todas las bacterias presentes en determinado cultivo.
Hoy en da este concepto ha cambiado y el buen bacterilogo clnico es quien
discrimina efectivamente los microorganismos potencialmente patgenos de la
microbiota normal, los identifica total o presuntivamente lo ms pronto posible y
emite un informe claro y correcto. Por este motivo, en el presente manual prctico
se hace nfasis en los criterios actualizados de interpretacin.
El estudio de la Historia de la Humanidad, permite comprender la realidad
presente y proyectarse mejor hacia el futuro. En el caso de la bacteriologa mdica,
los inspiradores escritos, sus retratos y el ejemplo de tres pioneros de esta ciencia,
que aparecen al principio del libro, van dedicados al amable lector.
15
Es imperativo hacer mencin del gran aporte que el invento del microscopio
represent para las ciencias biolgicas. Antonio van Leeuwenhoek durante el siglo
XVII fue el primer humano que observ las bacterias. Este personaje longevo, no
slo efectu grandes descubrimientos con sus microscopios de lente de gota,
sino tambin nos leg su ejemplo del valor de la palabra cientfica escrita. El
microscopio compuesto que usamos hoy en da fue inventado posteriormente por
los hermanos Hans y Zacaras Janssen, en Middleburg, Holanda. Luego fue
perfeccionado por Galileo Galilei y Johannes Kepler.
Durante el siglo XVIII, estos refinados instrumentos fueron curiosa
entretencin para cientficos y aficionados, incluyendo a las ilustradas damas de
las cortes europeas. No fue sino hasta el siglo XIX, que los grandes titanes de la
bacteriologa, Luis Pasteur en Francia y Roberto Koch en Alemania, efectuaron los
descubrimientos bsicos que han permitido el desarrollo de la bacteriologa mdica
moderna. Los logros de estos dos pioneros fueron mltiples, por lo que es muy
difcil sumarizarlos. Conviene recordar que el increble avance de la bacteriologa
en las postrimeras del siglo XX, y el que vivirn nuestros descendientes en el
prximo milenio, se fundamentan en sus descubrimientos y los de sus discpulos.
La Primera Edicin de este MANUAL PRCTICO DE BACTERIOLOGA
MDICA, fue patrocinada por la compaa farmacutica Pfizer, en septiembre de
1996. Esta edicin se agot rpidamente entre profesionales y estudiantes de
laboratorio clnico en Centroamrica. Hasta la fecha, este libro ha sido adoptado
como referencia del trabajo rutinario en bacteriologa clnica en mltiples
laboratorios y es libro de texto en varias universidades.
En 1999, el Ministerio de Salud Pblica y Asistencia Social de Guatemala, ha
reconocido la necesidad de patrocinar una Segunda Edicin, la cual llegar a todos
los profesionales y tcnicos de la Red Nacional de Laboratorios Clnicos, ahora
como norma obligatoria a observar en bacteriologa mdica. El autor ha plasmado
en el presente libro, treinta aos de experiencia en la materia, de manera simplista
y expresando lo mnimo que es necesario efectuar en los laboratorios clnicos de
Mesoamrica.
Miguel F. Torres, Q.B., M.A.
Ciudad de Guatemala, 25 de octubre de 1999
16
El ojo humano es incapaz de visualizar objetos menores de 30 micras. Por este motivo,
antes de la invencin del microscopio, el hombre desconoci la vida microscpica y la estructura
celular de los tejidos.
Antonio van Leeuwenhoek fue un comerciante de telas, nacido en 1632 en Delft, Holanda.
Fabric ingeniosos microscopios con pequeos lentes fundidos en placas de diversos metales.
Con los cientos de microscopios que hizo personalmente a lo largo de su vida, fue el primer ser
humano que observ las bacterias, los protozoos, los glbulos rojos y los espermatozoides.
Durante 50 aos, inform peridicamente sus maravillosos hallazgos en detalladas cartas
dirigidas a la Real Sociedad de Londres. A partir de preparaciones de material interdental,
dibuj y report por primera vez los tres tipos de formas bacterianas.
17
Carta a sus hermanas:

La voluntad es algo grande, pues la accin y el trabajo
generalmente siguen a la voluntad y casi siempre el trabajo se
acompaa del xito.
Estas tres cosas, trabajo, voluntad y xito, llenan la existencia
humana.
La voluntad abre la puerta al xito, ambos brillantes y felices, el
trabajo pasa estas puertas y al final del viaje el xito corona nuestros
esfuerzos.
LOUIS PASTEUR, 1841 (Besanon, Francia)
18
Roberto Koch fue un mdico rural alemn, nacido en 1843. Sus aportes a la
bacteriologa mdica fueron enormes. Primero cultiv la bacteria causante del ntrax en
humor vtreo de buey. Luego desarroll gradualmente tcnicas bacteriolgicas fundamentales,
como el uso del agar extrado de algas marinas para solidificar los medios de cultivo y
as poder observar colonias.
Con su discpulo Paul Ehrlich, aplic los colorantes derivados de la anilina a la
coloracin de microorganismos. Descubri las bacterias causantes de el clera, la tuberculosis (bacilo de Koch) y el protozoo causante de la enfermedad del sueo.
19
CAPTULO 1
BREVE INTRODUCCIN A LA MICROBIOLOGA
La microbiologa es la ciencia que estudia a los seres vivos microscpicos, es
decir que slo pueden observarse con ayuda del microscopio. Los pequeos organismos microscpicos son llamados vulgarmente microbios, pero la palabra correcta para designarlos es microorganismos. La microbiologa se aplica no slo a la
ciencia mdica, sino tambin a la veterinaria, a la agronoma y a la industria, por lo
que forma parte del plan de estudios de varias carreras universitarias.
Existen muchas clases de microorganismos, los cuales se clasifican segn su
estructura, manera de reproducirse y muchas otras caractersticas. Los grupos ms
importantes de microorganismos son: los virus, las bacterias, los protozoos y los
hongos. Los virus son los microorganismos ms pequeos, se reproducen nicamente dentro de las clulas y tienen forma similar a cristales. La palabra
microorganismo abarca grupos de seres vivos muy diferentes entre s.
La microbiologa se sub-divide en varias disciplinas que estudian cada grupo
taxonmico de microorganismos. Algunos no son propiamente microorganismos,
pero su estudio se basa en estructuras microscpicas.
Microbiologa
Bacteriologa (bacterias)
Micologa (hongos)
Virologa (virus)
Parasitologa
Protozoologa (protozoos)
Helmintologa (helmintos)
Entomologa (insectos, caros, otros)
La mayora de los microorganismos no son capaces de causar enfermedades

en el hombre y se les llama por esta razn saprfitos o saprobios. Sin embargo,
algunos causan enfermedades en el hombre, llamadas infecciones. Cuando un
microorganismo es capaz de producir infeccin, se dice que es patgeno; la
virulencia es la cuantificacin de la patogenicidad.
La inmunologa naci ligada a la microbiologa como el estudio de los mecanismos de defensa contra los microorganismos. Ahora su campo de accin se ha
extendido mucho y es una ciencia biolgica independiente.
21
En todos los ambientes que rodean al hombre existen microorganismos. Las

bacterias y los hongos son los ms abundantes; prcticamente todos los objetos que
vemos y tocamos estn cubiertos de ellos. El cuerpo humano, especialmente donde hay membranas mucosas (intestino, vagina, boca, etc.), est cubierto de
bacterias. De los microorganismos que viven constantemente en el hombre, se dice
que forman parte de alguna microbiota. Por microbiota se entiende aquel conjunto de diversos microorganismos que normalmente convive con el hombre sin
causarle ningn dao. La palabra flora no es correcta, y por lo tanto no debe
utilizarse. Se dice que los microorganismos de las microbiotas colonizan, no
infectan, aunque eventualmente pueden hacerlo y en este caso se les llama
oportunistas.
EL NOMBRE CORRECTO DE LOS MICROORGANISMOS:
Todos los nombres cientficos de los seres vivos, de acuerdo con el sistema
binario de Linneo, se componen de dos palabras: la primera que indica un gran
grupo, es el gnero y siempre se escribe la primera letra con mayscula. El segundo
nombre es la especie y siempre se escribe con letras minsculas. Casi todos los
nombres cientficos de los microorganismos se derivan del griego o del latn, por
esta razn:
a)
b)
Siempre se subrayan discontinuamente o se escriben con letra cursiva

Nunca se tildan
Ejemplos:
Staphylococcus aureus (bacteria)
Escherichia coli (bacteria)
Streptococcus pyogenes (bacteria)
Pseudomonas aeruginosa (bacteria)
Entamoeba histolytica (parsito, protozoo)
Giardia lamblia (parsito, protozoo)
Ascaris lumbricoides (parsito, helminto)
Trichophyton rubrum (hongo)
Microsporum canis (hongo)
Adems del nombre cientfico, en algunos casos existe un nombre de uso comn o vulgar. El uso de este tipo de nombres debe evitarse.
Los nombres vulgares ms conocidos son los siguientes:
22
Nombre correcto:
Nombre vulgar:
Escherichia coli
Streptococcus pneumoniae
Neisseria gonorrhoeae
Enterobius vermicularis
Trichuris trichiura
Entamoeba histolytica
Entamoeba coli
Hymenolepis nana
Candida albicans
colibacilo (bacteria)
neumococo (bacteria)
gonococo (bacteria)
oxiuro (parsito, helminto)
tricocfalo (parsito, helminto)
ameba histoltica (parsito, protozoo)
ameba coli (parsito, protozoo)
tenia nana (parsito, helminto)
monilia (hongo)
Si se desea hacer referencia a todas las especies de un gnero se usa la abreviatura para especies: spp. y no se subraya. Si slo se refiere a una especie no
determinada de un gnero dado, se usa: sp. abreviatura de especie.
Ejemplos:
Streptococcus spp. = todos los estreptococos que existen.
Shigella sp. = una especie no determinada del gnero Shigella.
Tomado de:
RECOMENDACIONES DE BIOSEGURIDAD PARA EL

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
Dr. Miguel F. Torres y Dra. Margarita Paz de Ramrez
Laboratorio Microbiolgico de Referencia (LAMIR) y Depto. de Citohistologa.
Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia, Universidad de San Carlos.
23
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Lavarse las manos frecuentemente

Usar gabacha
Usar guantes de caucho en buen estado cuando es necesario
Usar mascarilla cuando es necesario
Rotular adecuadamente todo el material y los reactivos
No comer en el rea de trabajo
No almacenar comida en el rea de trabajo
No fumar
Usar adecuadamente los desinfectantes
Usar detergentes y desinfectantes adecuados para cada tipo de material
Clasificar los desechos
Descontaminar el material biolgico antes de descartarlo
Esterilizar o incinerar el material contaminado
Destruir el material descartable o no reusable
No utilizar materiales inflamables cerca del mechero
Conocer el uso y manejo de los extinguidores
Neutralizar los desechos qumicos
Descontaminar el material radioactivo antes de su descarte
Equipo necesario:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Campana bacteriolgica
Campana de flujo laminar cuando es necesario
Lmpara de pie
Mechero o incinerador
Incubadora bacteriolgica
Autoclave
Horno esterilizador
Agitador de tubos
Centrfuga
24
Equipo de seguridad necesario en un laboratorio de investigacin:

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Extinguidores en lugares accesibles

Basureros cerrados
Lava-ojos
Extractor de vapores
Incinerador
Recipientes con desinfectantes y descontaminantes
Campana de flujo laminar y/o de bioseguridad
Equipo adecuado para descarte de material contaminado y de solventes
Recipientes plomados
MTODOS DE ESTERILIZACIN O DESINFECCIN
Mtodo
ESTERILIZACIN:
Calor
Hmedo (autoclave)
Seco (horno)
Concentracin o nivel
Gas
Oxido de etileno
Lquido Glutaraldehido
Perxido de hidrgeno
Formaldehido
Dixido de cloro
121 C a diferentes intervalos de tiempo

171 C por 1 hora; 160 C por 2 horas;
121 C por 16 horas
450-500 mg/litro a 55-60 C
variable
6-30%
6-8%
variable
DESINFECCIN
Calor
Hmedo
(incluye pasteurizacin)
Lquido glutaraldehido
perxido de hidrgeno
formaldehido
compuestos clorinados
alcoholes (etanol, isoproplico)
compuestos fenlicos
compuestos yodados
75-100 C
variable
3-6%
1-8%
500-5,000 mg de cloro libre/litro
70%
0.5-3%
0.1-0.2%
ANTISEPSIA
alcoholes
yodforos
hexaclorofeno
70%
1-2 mg de yodo libre/litro
1-3%
25
Actividad
alta
alta-media
alta-media
alta-media
intermedia
intermedia
media-baja
media-baja
DESINFECCIN:
Proceso generalmente menos letal que la esterilizacin.
Elimina virtualmente todos los microorganismos patgenos pero no necesariamente todas las formas microbianas (esporas).
El procedimiento de desinfeccin carece del margen de seguridad que
se logra por los procedimientos de esterilizacin.
Factores:
1.
2.
3.
4.
Naturaleza y nmero de microorganismos contaminantes.

El tipo y configuracin del material a desinfectar.
Tipo y concentracin del germicida qumico usado.
Tiempo y temperatura de exposicin.
DESCONTAMINACIN:
Es un trmino usado para describir un proceso o tratamiento aplicado a
una superficie ambiental o a un instrumento de trabajo. Este trmino abarca
desde lavado con agua y jabn hasta la desinfeccin o esterilizacin.
ANTISEPSIA:
Un antisptico es definido como un germicida usado sobre piel o tejido
vivo con el propsito de inhibir o destruir microorganismos.
USO EFECTIVO DE ANTISPTICOS, DESINFECTANTES Y
PROCEDIMIENTOS DE ESTERILIZACIN
Factores para la eleccin de desinfectantes y procedimientos de
esterilizacin.
1.
2.
3.
Grado de muerte microbiana requerida.

Naturaleza del material o la superficie a ser tratada.
Costo y disponibilidad de los agentes germicidas.
26
ESTERILIZACIN:
Uso de procedimiento fsico o qumico para destruir toda la vida
microbiana, incluyendo grandes cantidades de endosporas bacterianas
altamente resistentes.
Tipos de esterilizacin:
Calor hmedo: autoclave de vapor
Calor seco: horno esterilizador
Gas de xido de etileno
Esterilizantes qumicos: germicidas basados en glutaraldehido.
RESISTENCIA
RESISTENCIADE
DEMICROORGANISMOS
MICROORGANISMOSAAGERMICIDAS
GERMICIDASQUMICOS
QUIMICOS(*)
(*)
ESPORAS BACTERIANAS
Bacillus subtilis
Clostridium sporogenes
MICOBACTERIAS
Mycobacterium tuberculosis var. bovis
VIRUS PEQUEOS O NO LIPDICOS
Poliovirus - Coxsackievirus - Rhinovirus
HONGOS
Trichophyton sp.-Cryptococcus sp.-Candida sp.
BACTERIAS VEGETATIVAS
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Salmonella choleraesuis
VIRUS DE MEDIANO TAMAO O LIPDICOS
Herpes simplex - Cytomegalovirus
Virus sincitial respiratorio
Virus de Hepatitis B
Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)
(*) En orden descendente de resistencia
27
CAPTULO 2
INTRODUCCIN A LA BACTERIOLOGA
Las bacterias son microorganismos formados por una sola clula muy simple, que en condiciones ideales realiza funciones de alimentacin y reproduccin.
Son uno de los grupos microbianos ms frecuentes y abundantes en casi todos los
ambientes.
La reproduccin de las bacterias ocurre por simple particin de una clula en
dos clulas hijas, y ocurre en un tiempo muy corto en comparacin con la reproduccin de otros seres vivientes. Algunas tienen la capacidad de producir esporas
que son estructuras de resistencia. Las bacterias pueden ser mviles o inmviles.
Cuando tienen movimiento, lo hacen por medio de flagelos o filamentos largos
que agitan en forma de ltigo.
Para que las bacterias puedan reproducirse in vitro, es decir en las condiciones de laboratorio, debe proporcionrseles todas las sustancias nutritivas que requieren (protenas, azcares, vitaminas, etc.). Estos nutrientes se encuentran en los
medios de cultivo. El pH es muy importante y debe mantenerse estable y regulado
segn cada medio de cultivo.
Las bacterias se clasifican en base a diversas caractersticas. Segn sus requerimientos de oxgeno, las bacterias pueden ser:
a.
Aerobias: Crecen bien en la atmsfera que respiramos, es decir en presencia de oxgeno, el cual requieren para su sobrevivencia.
b.
Microaeroflicas: Crecen mejor en presencia de pocas cantidades de oxgeno. Para disminuir la concentracin de oxgeno en el microambiente
en el cual se incuban cultivos de bacterias, se recomienda introducirlos
en jarros de vidrio con una candela encendida, lo que enriquece con un
5 al 10 % de anhdrido carbnico (CO2).
c.
Anaerobias: Son incapaces de crecer en presencia de oxgeno, el cual les

es sumamente txico e impide su crecimiento.
29
d.
Facultativas: Son capaces de crecern en ausencia de oxgeno y tienen la

facultad de tambin crecer en aerobiosis.
Segn la temperatura ptima de crecimiento, las bacterias pueden ser:

a.
Mesfilas: Crecen a temperaturas intermedias, semejantes a la temperatura del cuerpo humano o a la temperatura del ambiente. En este
grupo se incluyen todas las bacterias patgenas, por esta razn la temperatura a la cual deben mantenerse constantemente las incubadoras
bacteriolgicas es de 36 grados centgrados.
b.
Termfilas: Crecen a altas temperaturas (calor).
c.
Crifilas: Crecen a bajas temperaturas (fro).
d.
Psicrotrficas: Crecen a temperaturas de refrigeracin.
Segn su forma, las bacterias se clasifican en tres grupos:

a.
Cocos: Son bacterias de forma esfrica o redondeada. Ejemplo, Foto A

pgina siguiente: Microfotografa de Staphylococcus aureus en divisin.
b.
Bacilos: Son bacterias alargadas, de forma similar a una salchicha o

bastoncillo. Ejemplo, Foto B pgina siguiente: bacilos en divisin.
c.
Espiroquetas: Son bacterias alargadas y retorcidas en forma de resorte o

espiral. Ejemplo, Foto C pgina siguiente: Microfotografa de bacterias
de la microbiota oral; Treponema sp. (espiroquetas), bacilos y cocos.
Dependiendo de su forma de agrupacin los cocos pueden clasificarse as:

a.
Diplococos: Agrupacin de bacterias esfricas en grupos de dos, o

parejas (ejemplos: Streptococcus pneumoniae y Neisseria gonorrhoeae).
b.
En cadenas. Ejemplo: estreptococos (Streptococcus spp.)
c.
En racimos. Ejemplo: estafilococos (Staphylococcus spp.)
Este tipo de clasificacin no se aplica a los bacilos ni a las espiroquetas.
30
C
31
CMO ORGANIZAR EL REA DE TRABAJO DE BACTERIOLOGA

Para poder trabajar bacteriologa mdica, se requiere del siguiente material y
equipo bsico, segn se ilustra en la figura 1 (pg. 34).
1. Una superficie lisa del alto de un escritorio de oficina (76 a 78 cm de alto),
material liso, blanco o negro mate, lavable, tipo frmica. El lugar de trabajo debe
estar lejos de ventanas que permitan corrientes de aire, lavatrastos o basureros.
Contar con una silla cmoda, giratoria, con respaldo, y ajustable al alto adecuado.
2. Un mechero quemador de gas propano tipo Meker, Bunsen o Touch-OMatic. Ajustar la entrada de aire a manera de obtener una llama azul y translcida
(no amarilla). Debe tenerse presente que solamente es estril el aire que est un pie
(30 cm) alrededor del mechero encendido, por lo que se debe trabajar lo ms cerca
posible. Situarlo al frente ligeramente hacia la derecha. Tambin puede usarse
incinerador.
3. Una campana bacteriolgica de madera o fibra de vidrio para aislar el rea
de trabajo, la cual debe desinfectarse diariamente antes de iniciar el trabajo. Frotarla por dentro con formol al 10 por ciento, fenol al 1 por ciento, o por lo menos con
alcohol al 70 por ciento. La campana no es indispensable; puede trabajarse sin ella,
si se hace con cuidado, es decir sobre una superficie desinfectada y cerca del mechero.
4. Un autoclave para esterilizar con calor hmedo a presin, material y medios de cultivo, matar material contaminado y cultivos (esterilizar previo descarte o limpieza). Puede ser pequeo, tipo olla de presin. Calibrarlo a manera de
autoclavear siempre por 15-20 minutos a 121o C y 15 libras de presin por pulgada cuadrada.
5. Un soporte de asas, que puede ser de madera forrada con frmica, con las
siguientes asas de nichrome (aleacin de nquel y cromo), segn se ilustra en la
figura 2 (pg. 39): dos en anillo (no calibrada), dos en aguja, y una asa calibrada de
platino puro en anillo pequeo para tomar 0.001 ml (para inocular urocultivos).
Para trabajar Micologa (hongos) debe contarse tambin con asa espatulada, asa en
L y dos agujas de diseccin. Las asas bacteriolgicas deben ponerse rectas y limpiarse diariamente. Esto se hace fcilmente hacindolas rodar en el suelo deslizando el zapato a manera que rueden y luego hacer el anillo con el cabo de otra asa.
Debe trabajarse siempre con dos asas en anillo, cuando una se forma, se usa la que
ya est fra.
32
6. Una lmpara de mesa de pie corto (tipo escritorio) o de cuello de ganso;

colocarla al frente, ligeramente hacia la izquierda, de manera que ilumine fuertemente el rea sobre la mesa, pero que la luz no d directamente a los ojos.
7. Microscopio ptico binocular de buena calidad, con condensador de campo oscuro.
8. Lupa o de preferencia microscopio estereoscpico para observar bien
las colonias.
9. Incubadora bacteriolgica que debe mantenerse constantemente a 36o C
exactos (no a 37o C a 35o C). Debe mantenerse siempre cerrada y pegarle una hoja
de control diario de temperatura.
10. Balanza para pesar medios de cultivo.
11. Hornilla elctrica de dos discos y temperatura graduable.
12. Refrigerador con congelador.
13. Frascos grandes de boca ancha, de los que se usan para dulces en las tiendas, con tapadera metlica de rosca que cierre bien. Tener suficientes veladoras
(velas gruesas) de parafina. Alternativamente usar jarra Gas-Pak con sobres
microaeroflicos.
14. Jarro Gas-Pak (BBL) o similar, sobres generadores de anaerobiosis,
catalizadores e indicadores para incubar cultivos anaerobios.
15. Agitador de tubos tipo vortex.
16. Colorantes, soluciones y medios de cultivo segn se describe en cada
captulo.
17. Gradillas para colocar tubos con medios de cultivo o muestras.
33
Fig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGA
34
LA COLORACIN DE GRAM
Las bacterias son microorganismos incoloros, por
este motivo deben teirse para poder observarlos con ayuda del microscopio. Por esta razn, a continuacin se describe la tcnica ms importante que debe usarse para diferenciar bacterias: la coloracin de Gram. Se recomienda
usar la modificacin de Hucker segn Bartholomew, de
acuerdo con la bibliografa que aparece al final de este
manual.
a)
Preparacin de frotes:
Hans Gram
La coloracin de Gram puede aplicarse a frotes extendidos sobre portaobjetos

de vidrio (tambin llamados frotis) de todo tipo de muestras clnicas, o a frotes de
suspensiones de cultivos. Frotar la muestra suavemente y sin revolver mucho sobre la superficie de un portaobjetos limpio y seco. Esperar que seque sobre una
superficie lisa o flamear muy levemente. Rotular adecuadamente con crayn graso
por detrs de la lmina. Una vez que el frote ya est seco, fijar pasando levemente
por la llama del mechero dos veces, sin que se caliente excesivamente (que no queme al ponerlo sobre la piel del dorso de la mano). Dejar que el frote se enfre antes
de colorearlo, pues si se colorea caliente precipitan los colorantes.
Si la muestra que se va a colorear contiene mucha sangre, el frote debe
hemolizarse con agua. Proceder as: dejarlo secar y fijar con calor, cubrir completamente con agua del chorro un minuto, y luego proceder a colorearlo con Gram.
Este tratamiento permite destruir los eritrocitos y poder observar las bacterias.
b)
Tcnica de la coloracin de Gram:
1. Cubrir el frote ya fijado y fro con cristal violeta, dejar el colorante por un
minuto (ver preparacin de colorantes adelante). Enjuagar en un chorro suave de
agua corriente. Escurrir muy bien.
2. Cubrir con lugol de Gram y dejar por un minuto. Enjuagar de nuevo suavemente con agua corriente, escurrir bien.
3. Aplicar gota a gota el decolorante alcohol-acetona por 4 5 segundos,
hasta que ya no salga ms cristal violeta. Este paso es crucial y debe ser muy breve
en frotes delgados y ms prolongado en frotes gruesos.
35
4. Cubrir el frote con safranina slo por 30 segundos. Enjuagar suavemente

con agua, escurrir y dejar secar. El frote puede secarse dentro de la incubadora a
36 C, o flamear muy levemente, si es urgente. Otra alternativa es secarlo con aire
obtenido de una pera de hule o un secador para manos.
5. Examinar en el microscopio con el lente de inmersin, con aceite especial
de viscosidad adecuada.
c)
Resultados:
Bacterias gram-positivo: morado-azul obscuro.

Bacterias gram-negativo: rojo.
La diferencia de coloraciones se debe al grosor de la pared celular, que es ms
delgada en las bacterias gram-negativo. Esta coloracin slo es vlida para cocos
y casi todos los bacilos (excepto micobacterias), no es vlida para espiroquetas. Si
el frote es de material clnico, es decir de muestras de pacientes, debe quedar rojo a
simple vista despus de colorearlo. Si hay leucocitos presentes en la muestra stos
deben ser rojos (gram-negativo) y si hay levaduras deben verse azul-morado (gramnegativo), lo que sirve para evaluar si el frote se decolor adecuadamente.
d)
Informe:
El reporte correcto de una bacterioscopa (observacin de bacterias) con Gram

debe contener los siguientes elementos y en este orden:
1. Identificacin del paciente (apellidos, nombres, nmero de registro o
afiliacin, servicio y fecha).
2. Ttulo que indique el tipo de muestra examinada y el sitio anatmico de
donde proviene. Por ejemplo: Secrecin de lcera en miembro inferior derecho.
Coloracin de Gram:
3. Mencionar primero las bacterias observadas. Empezar por la clase ms
freuente en la muestra, indicar agrupacin y cantidad (muy escaso, escaso, regular
cantidad, abundante o muy abundante +, ++, +++, ++++). Por ejemplo: cocos
gram-positivo en cadenas cortas: abundantes; bacilos gram-negativo: regular cantidad, diplococos gram-negativo: muy escasos. Usar siempre positivo y negativo
36
en singular con respecto al Gram, nunca gram-positivos o gram-negativos en

plural.
4. Luego es muy importante para el mdico saber si hay glbulos blancos en
la muestra, su clase y cantidad. Por ejemplo: Leucocitos polimorfonucleares: abundantes. Este dato indica que hay verdadera infeccin y que la muestra era purulenta.
Si se observan bacterias dentro del citoplasma de los leucocitos, mencionar
intracelular en el reporte, lo que es de especial inters clnico en los frotes de
secreciones uretrales masculinas. La presencia de linfocitos indica infeccin crnica o viral (no purulenta).
5. Indicar siempre la presencia y cantidad de levaduras o micelio de hongos
(gram-positivo); de clulas epiteliales, de especial inters en frotes de esputo (se
miran gram-negativo aplanadas con citoplasma grande, transparente y ncleo
pequeo redondo u ovalado). Aunque no es crucial, indicar la presencia de fibrina,
que se mira en forma de hebras gram-negativo alargadas e irregulares.
6. Cuando es necesario, con experiencia y cautela podrn incluirse al final
comentarios sobre la calidad de la muestra, indicar que la morfologa observada es
compatible con una especie de bacterias o recomendaciones de tratamiento (con
mucha prudencia).
Reactivos para la coloracin de Gram:
(Modificacin de Hucker segn Bartholomew)
1.
CRISTAL VIOLETA:
Solucin A:
Cristal violeta (certificado) ............................................... 2 gramos
Alcohol etlico al 95 % ....................................................... 20 ml
Solucin B:
Oxalato de amonio ............................................................ 0.8 gramos
Agua destilada ................................................................... 80 ml
Mezclar ambas soluciones, para preparar 100 ml. Guardar (en oscuridad) 24
horas antes de usarse y filtrar con papel filtro directamente al frasco de coloracin.
2.
LUGOL DE GRAM:
Cristales de yodo ............................................................... 1 gramo
Yoduro de potasio .............................................................. 2 gramos
37

Moler en un mortero el yodo y el yoduro. Agregar el agua destilada (en
probeta) poco a poco. Continuar moliendo para disolver completamente; agregar
el agua a manera de ir lavando el mortero, hacia una botella de vidrio oscuro
(mbar). Slo dura una semana.
3.
ALCOHOL-ACETONA (Decolorante):
Mezclar volmenes iguales de acetona pura (para anlisis) y alcohol etlico
al 95 %.
4.
SAFRANINA:
Solucin stock (concentrada):
Safranina-0 (certificada) .................................................... 2.5 gramos
Alcohol etlico al 95 %. ...................................................... 100 ml
Solucin de trabajo:
Diluir 1:10 la solucin stock (concentrada), as:
Solucin stock .................................................................... 10 ml
Solucin anticorrosiva para desinfectar bistures:

Formaldehido (Formol) .................................................... 8 %
Alcohol etlico .................................................................... 60-70 %
Nitrito de sodio .................................................................. 0.2 %
Para preparar un litro:
En un baln aforado de 1,000 ml (1 litro), colocar 2 gramos de nitrito de sodio,
luego agregar 700 ml de etanol absoluto y 200 ml de formaldehido al 40 %. Luego
aforar con 100 ml de agua destilada.
Los bistures con sus mangos deben mantenerse constantemente sumergidos
en esta solucin, dentro de un recipiente de acero inoxidable con tapadera.
38
Fig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLGICAS Y SU USO

ASAS PARA BACTERIOLOGA:
1.
Asa en argolla o anillo, no calibrada. Generalmente de almbre de

nichrome. Sirve para siembra por estras e inoculaciones en general.
2.
Asa recta o en hilo. Sirve para trasladar una sola colonia a medios de
identificacin, o subcultivo.
3.
Asa de platino en anillo. Calibrada para tomar 0.001 ml, para

urocultivo.
ASAS PARA MICOLOGA Y MICOBACTERIAS:
4.
Asa espatulada, para manipular colonias duras y tomar muestras.
5.
Asa de almbre grueso en "L", para purificar colonias de hongos y

procedimientos especiales.
6.
Aguja de diseccin con punta aguda, para purificar colonias pequeas

y distribuir las preparaciones de hongos en fresco.
39
Fig . 3 INOCULACIN DE MEDIOS

SLIDOS POR ESTRAS
1. Con asa o hisopo estril,
estriar inculo original de
aproximadamente 0.5 cm,
en el borde de la caja de Petri.
2. Flamear primera vez al

terminar el inculo original.
3. Segunda estra cruzada,

debe tocar ligeramente
el inculo original.
4. Flamear segunda vez, al

terminar la segunda estra.
5. Tercera estra. Debe tocar

ligeramente la segunda estra,
y cubrir toda la superficie libre
del medio sin tocar al final el
inculo original.
40
CAPTULO 3
COPROCULTIVO
PROPSITO:
Demostrar por medio de cultivo, la presencia de bacterias enteropatgenas,
es decir que infectan el intestino penetrando o no su mucosa. Esto causa diarrea,
dolor abdominal, fiebre y a veces la muerte.
Las principales especies enteropatgenas que se buscan en el coprocultivo,
en orden de importancia en Guatemala son:
-
Shigella flexneri
Salmonella typhi
Shigella sonnei
Salmonella enteritidis
Shigella dysenteriae tipo 1
Shigella boydii
Arizona hinshawii
Edwardsiella tarda
Yersinia enterocolitica
(Shigella grupo B)
(agente de fiebre tifoidea)
(Shigella grupo D)
(Shigella A-1 o Bacilo de Shiga,
causa severa disentera epidmica)
(Shigella grupo C, rara en Guatemala)
(rara)
(muy rara)
(muy rara)
Las bacterias de la familia Enterobacteriaceae, normalmente habitan en el intestino humano, por lo que se conocen comnmente como enterobacterias. Forman aproximadamente el uno por ciento de la microbiota fecal, el resto son bacterias anaerobias. Por esta razn es muy importante que el laboratorio est en capacidad de aislar, diferenciar e identificar correctamente los enteropatgenos de la lista
anterior.
MUESTRA:
Para efectuar un coprocultivo pueden inocularse las siguientes muestras:
-
heces frescas (la mejor muestra)

hisopo rectal (cuando no se obtienen heces)
41
material obtenido por proctoscopa

biopsia de mucosa intestinal
Las muestras deben tomarse antes de iniciar tratamiento con antibiticos. Las
heces debern procesarse lo ms pronto posible, de preferencia antes de 2-3 horas
de ser emitidas; no es necesario que el paciente est en ayunas. El hisopo rectal es
una buena toma de muestra (en caso de no ser posible obtener muestra de heces
reciente) porque arranca las bacterias que se encuentran dentro de la mucosa.
En los adultos, introducir con cuidado en el ano un hisopo estril 4 centmetros,
dar 3 vueltas a la derecha y 3 vueltas a la izquierda. En los nios, introducir el
hisopo 2.5 centmetros y dar la misma cantidad de vueltas. En el adulto es ms fcil
tomar el hisopo rectal, con el paciente acostado de lado y l mismo separndose los
glteos. Los nios deben acostarse boca arriba y con la mano izquierda tomar
ambos pies, presionar a manera de flexionar las rodillas hacia abajo y luego
introducir el hisopo.
Cuando las heces, que se encuentran a 37 C dentro del intestino, son colectadas y permanecen a temperatura ambiente (aproximadamente a 20 C), el pH baja
considerablemente (acidez) y hace que las bacterias especialmente Shigella spp. pierdan su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por esta razn si la muestra de heces no se procesa con la velocidad ya indicada, debe colocarse en un medio de transporte bufferado que evite los cambios bruscos de pH. Para este propsito colocar con hisopo estril una porcin anormal de las heces (con moco, sangre
o pus) aproximadamente del tamao del hisopo bien cargado en tubos o viales con
3 ml del siguiente medio de transporte: glicerol-salino bufferado, (especialmente
para Shigella), o caldo Hajna GN (Gram-negativo). Probablemente el mejor medio
de transporte para enterobacterias sea Carry-Blair. El caldo GN es de
enriquecimiento, por lo que debe incubarse a 36C por aproximadamente 18 horas
antes de sembrarse, pero puede usarse como transporte alternativo en ausencia de
glicerol-salino bufferado.
Glicerol salino bufferado
Para transporte de coprocultivos
Cloruro de sodio ...................................................................... 4.2 gramos
Fosfato dipotsico (anhidro) ..................................................3.1 gramos
Fosfato monopotsico (anhidro) ...........................................1.0 gramos
Rojo fenol .................................................................................. 0.003 gramos
Agua destilada .........................................................................700 ml
Glicerina ...................................................................................300 ml
42
El pH final debe ser 7.2. Medir 3 ml en viales o tubos con tapn de rosca y
luego autoclavear a 121C por 10 a 15 minutos. Descartar si el medio se acidifica
y vira a color amarillo.
Otros caldos de enriquecimiento como Selenito-F o Tetrationato con yodo no
deben usarse excepto en encuestas especiales para buscar Salmonella spp., ya que
su uso retrasa 24 horas el resultado del coprocultivo, lo que disminuye considerablemente su utilidad clnica.
La coloracin de Gram de heces nunca debe practicarse por carecer de significado clnico, excepto en los siguientes casos: colitis pseudomembranosa causada
por Staphylococcus aureus donde predominan en el frote cocos gram-positivo, o en
caso de candidosis intestinal, donde predominan en el Gram las levaduras
(gram-positivo).
PROCEDIMIENTO:
Debe conocerse la edad del paciente, anotar si es nio menor de 6 meses.
Para efectuar el coprocultivo deben usarse medios que sean selectivos (contienen inhibidores, por lo que slo permiten el crecimiento de bacilos gram-negativo)
y diferenciales (contienen lactosa e indicadores de pH que viran cuando se produce cido, lo que hace cambiar el color de las colonias y as las diferencia).
Algunos de estos medios contienen sales de hierro que precipitan en forma
de sulfuro ferroso de color negro intenso si las bacterias producen cido sulfhdrico.
El coprocultivo debe efectuarse en dos medios selectivos/diferenciales diferentes,
de preferencia uno ms inhibidor que otro. Se recomienda usar rutinariamente agar
MacConkey y agar XLD o agar SS (Salmonella y Shigella).
En caso de heces con moco y sangre (disentera) debe incluirse adicionalmente
el medio de Hektoen, lo mismo que para material obtenido por biopsia intestinal y
proctoscopa.
El color original y los virajes producidos por el crecimiento bacteriano, en
estos tres medios que contienen el azcar lactosa (como agente diferencial) es el
siguiente:
43
MEDIO
COLOR
ANTES DE
INOCULAR
COLONIAS
LACTOSAPOSITIVO
COLONIAS
LACTOSANEGATIVO
COLONIAS
CON CIDO
SULFHDRICO
MacConkey
rosado
rojo (rosado)
incoloras
no cambian
SS
rosado
ligeramente
amarillento
rojo
incoloras
negro
Hektoen
verde claro
anaranjadosalmn
verde
azuladas
negro
XLD
rojo
amarillas
rojas
negro
Efecte el coprocultivo as:

1-
Inocular una porcin anormal de heces (con moco, sangre o pus) o de muestra similar, directamente en una caja de MacConkey y una caja de SS. El inculo
se coloca con asa en anillo (flameada y fra) o con hisopo en las cajas de ambos
medios. Inocular slo 1/2 cm en un extremo en el MacConkey y 1 cm en el SS.
El Hektoen se inocula igual que el MacConkey.
2-
Diseminar el inculo utilizando dos asas en anillo. Flamear una de las asas
mientras la otra se enfra (ver figura 3, pg. 40).
3-
Ya diseminadas de esta manera las muestras en la superficie de las cajas,

incubar a 36C por 18 a 24 horas, en la incubadora, con esa temperatura controlada diariamente (ver figura 4, pg. 45).
44
Fig. 4 MARCHA BACTERIOLGICA PARA COPROCULTIVO
Muestras:
Heces frescas Hisopo rectal Sedimento de

enema salino
INOCULAR
Rutina
MacConkey
Material de
proctoscopa,
biospia intestinal
XLD SS
Medios:
Diseminar por estras, incubar a 36o C
Seleccionar colonias segn el caso,

trasladar a TSI/LIA/urea
45
Opcional
Hektoen
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
1-
Despus de incubadas, observar cuidadosamente las dos o tres cajas de cada

paciente simultneamente. Debe contarse con una luz de lmpara que ilumine las cajas por detrs y observarlas utilizando una lupa corriente. Marcar
por detrs con un crculo de crayn graso cada tipo diferente de colonias sospechosas as: Primero escoger en el MacConkey una colonia por cada tipo de
colonias lactosa-negativo (incoloras), empezando por las colonias ms pequeas (ms o menos 1 mm de dimetro). Si el paciente es un nio menor de un
ao, se marcar adicionalmente en el MacConkey una colonia tpica de
Escherichia coli (roja, brillante y de bordes lisos pero no mucosa), de la parte
de la caja donde las colonias estn ms separadas y ponerle con crayn graso
por detrs C al lado. Examinar el SS de la misma forma. En este medio el
crecimiento ser ms escaso pues es ms inhibidor. Marcar por detrs una
colonia por cada tipo de colonias lactosa-negativo (incoloras) empezando por
las ms pequeas, e incluyendo una colonia con centro negro (cido
sulfhdrico) si las hay. Si se inocul Hektoen, marcar una colonia pequea
verde azulado (lactosa-negativo).
CR
AY
GR
AS
Fig. 5 OBSERVACIN Y SEALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS
Marcar colonias
sospechosas por
detrs de la caja de Petri
46
2-
El laboratorio debe contar con un microscopio estereoscpico para hacer los

sub-cultivos con asa en aguja o recta as:
Colocar las cajas con las colonias previamente marcadas bajo el microscopio
estereoscpico y enfocar. Usar un par de asas en hilo bien rectas, flameadas y
fras, acostmbrese a usarlas segn se indica a continuacin: apoyndose en
el borde del microscopio con los dedos meique y anular de la mano derecha
(izquierda si es zurdo), tome el asa recta a manera de lpiz y bjela lentamente hasta que aparezca en el campo del microscopio y slo toque la superficie
de la colonia seleccionada, con cuidado de no pincharla o pasar tocando otras
colonias cercanas. Con cuidado de no contaminar la punta del asa que ya
toc la colonia sospechosa, destape un tubo (13X100) de TSI (medio rojo)
con el dedo meique de la mano derecha, flamee bien la boca del tubo y
luego pinche el medio en el centro y hasta el fondo a manera de tocar exactamente el centro del fondo del tubo, retire el asa sin salir del tubo de TSI y
luego haga un estriado rpido y parejo en la superficie inclinada. Sin flamear
y con la misma asa, inocule el medio LIA (morado) pinchando esta vez tres
veces y luego estriar la superficie y con la misma asa sin flamear, haga una
estra en un tubo de agar urea de Christensen (mejor tomar una nueva colonia de igual morfologa). Si no cuenta con microscopio estereoscpico proceda as:
Tome la caja ya marcada de MacConkey, XLD o SS Hektoen entre los dedos
pulgar, ndice y medio de la mano izquierda (retraiga los dedos anular y meique). Colquela verticalmente a manera que la luz pase por detrs a travs
de la caja, tome su asa recta agarrada como un lpiz con la mano derecha,
apoye firmemente los dedos anular y meique en la palma de su mano izquierda que sostiene la caja. Acerque cuidadosamente el asa y toque con mucho
cuidado la colonia seleccionada sin pincharla ni tocar otras colonias cercanas.
(ver figura 6, pg. 48). Inocule simultneamente una pareja de TSI/LIA y urea
agar segn ya se describi. Estos tres medios en tubo deben tener 2.5 cm de
fondo y 3.8 cm de superficie inclinada para que funcionen correctamente,
Rotular ambos tubos y colocarlos por pareja en gradillas. Si el MacConkey
slo presenta colonias lactosa-positivo (rojas) descrtelo. Lo mismo se har
con el Hektoen que slo presenta colonias lactosa-positivo (anaranjado salmn), o el XLD que slo presenta colonias amarillas. Reincube la caja de SS
otras 24 horas a temperatura ambiente para investigar la presencia de Yersinia
enterocolitica.
47
Fig. 6 TCNICA PARA TOMAR INCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES
3-
Incube a 36C la gradilla con las parejas TSI/ LIA y urea, de manera que no
quede duda de qu tubo de TSI corresponde a su LIA. Deben permanecer en
incubacin de 18 a 24 horas. Los tapones de rosca deben quedar ligeramente
flojos para permitir la entrada de oxgeno. Las colonias marcadas g (E. coli,
nios menores de un ao) pueden pasar slo a TSI, para ahorrar LIA y urea.
4-
Examine las reacciones coloreadas en el TSI/LIA simultneamente; tome

ambos tubos juntos hacia abajo con la mano derecha y obsrvelos contra la
luz. Interprete resultados de acuerdo a la siguiente tabla.
48
Reaccin ya
ya
Reaccin
incubada
incubada
A=cido K=alcalino
R=rojo
N=neutro
Gas (g)
(-a+++)
Medio sin
Medio sin
inocular
inocular
cido
sulfhdrico
(h) (-a+++)
TSI
(rojo)
Amarillo
rojo
no
aplicable
no
aplicable
burbujas
o
rupturas
negro
LIA
(morado)
Amarillo
violeta
Superficie
roja
antre
amarillo
y morado
burbujas
o
rupturas
negro
Urea de Christensen: (amarillo ligeramente anaranjado), positivo = rosado fuerte;

negativo = no hay cambio
Para expresar en clave y abreviadamente las reacciones en TSI o LIA use las
abreviaturas A, K, R, N, -, +, g, h, segn la tabla anterior en este orden: superficie/
fondo, gas, cido sulfhdrico.
Por ejemplo las reacciones de Escherichia coli en TSI; LIA se expresan as:
TSI;LIA = A/A, g+; h-/ K/K, g+, h- o
TSI;LIA = K/A, g-; h-/K/N, g-, hLas reacciones coloreadas en TSI/LIA, son muy tiles para la identificacin
de los enterobacterias, por lo que en el laboratorio debe contarse con una tabla
actualizada de reacciones en TSI/LIA y pruebas bioqumicas en general.
Reacciones a las cuales debe ponerse especial atencin:
Bacteria
TSI
LIA
UREA
Shigella spp.
K/A,g-,h-
K/A (N),g-,h-
Salmonella sp.
K/A,g+,h++
K/K,g+,h+
A/A,g-,h-
A (K)/A,g-,h-
49
5-
Los tubos de TSI, marcados g y que corresponden a coprocultivos de

nios menores de un ao deben aglutinarse para investigar Escherichia
coli enteropatgena (pools A, B y C) (Segn Dr. Myron Levine, U. de
Maryland VI Congreso C.A. de Microbiologa, comunicacion personal). El
informe final deber reportarse as: Se aisl Escherichia coli enteropatgena
del grupo ___ . Debe hacerse notar que aunque el valor cInico de esta prueba ha sido puesto en duda, ya que tambin existen E. coli invasivas y productoras de toxinas que no se investigan, actualmente debe realizarse la
aglutinacin para demostrar la presencia de serotipos clsicos enteropatgenos
en los nios pequeos. Inocule una asada pequea en caldo tripticasa soya o
caldo BHI (infusin de cerebro y corazn de buey), proceda efectuar la prueba de susceptibilidad antimicrobiana segn el mtodo de Bauer-Kirby, descrito ms adelante. Si no se observa ninguna aglutinacin, ni se aisla Shigella o
Salmonella apunte en el libro de trabajo la clave N-SSE, y el informe final debe
redactarse as: Negativo para Shigella, Salmonella y Escherichia coli
enteropatgena. (Slo para nios menores de un ao). Las claves sugeridas
para registro en los libros de trabajo evitan escritura innecesaria, facilitan y
aceleran el trabajo.
50
REACCIONES DE VARIAS ENTEROBACTERIAS EN TSI Y LIA
Enterobacteria
LIA
TSI
UREA
Escherichia coli
A(K)/A, g+ (-), h-
K/KN, g-+, h-
Shigella spp.*
K/A, g-, h-
K/A, g-, h-
Salmonella typhi*
K/A, g-, h++- (poco)
K/K, g-, h-(+)
Salmonella spp.*
K/A, g-, h+++(-)
K/KN, g-, h+ (-)
Arizona hinshawii*
K(A)/A, g+, h+++
K/KN, g-, h+ (-)
Yersinia enterocolitica*
A/A, g-, h-
A(K)/A, g-, h-
Citrobacter sp.
K(A)/A, g+, h+++(-)
K/A, g-+, h+-
Edwarsiella tarda
K/A, g+, h+++

(indol +)
K/K, g-+, h+
Klebsiella sp.
A/A, g++, h(mucosidad ++)
KN/KN, g+, h-
Enterobacter sp.
A/A, g++, h-
KN/KN, g+(-), h-
-(+)
Serratia sp.
KA/A, g-, h-
KN/KN, g-, h-
-+
Proteus vulgaris
A(K)/A, g+, h+++
R/A, g-, h-(+)
Proteus mirabilis
K(A)/A, g+, h+++
R/A, g-, h-(+)
Morganella morganii
(antes Proteus morganii)
K/A, g-(+), h-
KR/A, g-, h-
Providencia sp.
K/A, g+ -, h
R/A, g-, h-
+-
Nota Importante:
Solamente reportar como coprocultivo positivo las enterobacterias marcadas con * el resto
es microbiota normal y no debe reportarse nunca. Reacciones menos probables entre
parntesis. Todas las reacciones con reaccin roja (R) en la superficie de LIA, presuntivamente
son Proteus sp., Morganella sp. o Providencia sp., no tienen importancia clnica en coprocultivos
y no deben tomarse en cuenta. Esta tabla es slo una gua, que debe actualizarse
constantemente.
51
DIFERENCIACIN DE LAS ESPECIES DEL GNERO SHIGELLA:

TSI y LIA = K/A,g-,hOler el medio de TSI sin tocarlo con nariz o boca, el olor a semen es caracterstico de Shigella spp., especialmente de Shigella grupo B (Shigella flexneri), la ms
frecuente en Guatemala. El fondo de los tubos de TSI y LIA no presentan gas, ni
cido sulfhdrico y tienen un color amarillo canario. La reaccin K (alcalino) de
la superficie del TSI es roja de un tono fresa no muy intenso. Aglutinar el crecimiento del TSI sospechoso, o del LIA as:
Utilice la tapadera limpia y seca de una caja de Petri, ryela con crayn graso
por detrs a manera de hacer rayas paralelas y perpendiculares que formen cuadritos
de aproximadamente un centmetro cuadrado. Coloque todas sus parejas TSI/LIA
con reaccin sospechosa de Shigella, en orden numrico en una gradilla. En la misma gradilla pero en otro extremo ordene en pares los TSI/LIA con reaccin sospechosa de Salmonella y los TSI marcados C (Escherichia coli) para proceder a aglutinar.
Por cada pareja sospechosa de Shigella (K/A,g-,h-; K/A,g-,h-) coloque en el centro
de un cuadrito una gotita de antisuero Shigella grupo B (Shigella flexneri). Aglutine
tomando una porcin pequea del crecimiento en TSI (puede ser tambin del LIA)
con asa en anillo estril; coloque el crecimiento sobre la caja (mueva el asa en valo
pequeo sin tocar la gota), luego suspenda bien el crecimiento en la gota a manera
de obtener una suspensin ligeramente lechosa. Observe inmediatamente despus
de inclinar la tapadera de la caja hacia adelante y hacia atrs la aparicin de
aglutinacin franca y obvia.
Slo tomar en cuenta aglutinaciones que ocurren antes de 1 minuto despus
de mezclar. Si aglutina reportar Shigella B en el libro de trabajo. Si no aglutina siga
aglutinando pero siempre en este orden para ahorrarse trabajo y anti-sueros, que
son muy caros:
1234-
Shigella flexneri, grupo B

Shigella sonnei, grupo D
- La ms frecuente en Guatemala
- La segunda ms frecuente en
Guatemala
Shigella dysenteriae, grupo A - Rara pero grave y epidmica, debe
darse alerta al mdico.
Shigella boydii, grupo C
- Muy rara vez se aisla en el pas.
52
DIFERENCIACIN DE LAS ESPECIES DEL GNERO SALMONELLA:

La taxonoma moderna del gnero Salmonella ha cambiado, sin embargo para fines
prcticos de diagnstico y de investigacin, se recomienda usar la clasificacin antigua simplificada as:
-
Salmonella typhi:
causa fiebre tifoidea con diseminacin generalizada de la bacteria (puede aislarse de heces,
mdula sea, sangre, orina, etc).
Salmonella enteritidis:
causa infeccin intestinal y puede diseminarse

a la sangre.
Salmonella choleraesuis:
rara, causa infeccin en animales y rara vez

en el hombre.
Salmonella typhi presenta en TSI dos caractersticas muy importantes para

su identificacin, las que se complementan con LIA, citrato de Simmons y
aglutinacin:
12-
345-
No produce gas.
Produce poco cido sulfhdrico (una pequea mancha negra,
a veces difcil de apreciarse en el rea del tubo donde empieza el
inclinado).
Generalmente, el LIA es todo morado (K/K,g-,h-(+)
Es citrato-negativo.
Aglutina con el antisuero anti-antgeno Vi.
El agar inclinado de citrato de Simmons es un medio verde que se prepara

inclinado con las mismas medidas del TSI/LIA. Debe inocularse con una asada del
crecimiento de los tubos TSI o LIA sospechosos de Salmonella, luego se incuba a
36C de 18 a 24 horas y los cambios de color se interpretan as:
verde = negativo
azul = positivo
53
Diferencie presuntivamente las especies del gnero Salmonella con estas tres
pruebas sencillas:
Prueba
Especie
Gas
(TSI)
cido sulhdrico
(TSI)
Citrato
Salmonella typhi
+ dbil
Salmonella enteritidis
+++
+ (slo 60%)
(+)
(+) = positivo lento, ms de 3 das de incubacin.

En resumen, para diferenciar e identificar Salmonella siga estos pasos:
1-
Identifique las reacciones sospechosas en TSI/LIA de Salmonella typhi y

Salmonella spp. segn la tabla. Es muy importante notar la reaccin toda
morado-violeta en el LIA (K/K), es decir el medio no cambia de color lo
cual es tpico del gnero Salmonella. Anote la cantidad de cido sulfhdrico
en el TSI.
2-
Ordene sus TSI/LIA/urea en la gradilla de tubos para aglutinacin y, segn

ya se explic, aglutine todos los TSI con una gota de antisuero comercial
polivalente de Salmonella.
3-
Si la reaccin es positiva, inocule un tubo de citrato de Simmons e incube,

simultneamente inocule la prueba de susceptibilidad antimicrobiana.
4-
Si el laboratorio cuenta con el set de antisueros de grupo de Salmonella, aglutine

slo los tubos con aglutinacin franca en el antisuero polivalente a Salmonella
en los antisueros de grupo. Algunos grupos frecuentes en Guatemala son B,
G, y C1. Salmonella typhi pertenece al grupo D, por lo que aglutinacin positiva a este grupo, adems de las otras pruebas sencillas confirma esta especie.
Si se investiga el grupo, ste debe informarse, por ejemplo:
Se aisl Salmonella enteritidis del grupo B.
Idealmente el laboratorio podr confirmar con ms seguridad y mayor
54
trabajo las especies de enterobacterias con sistemas de mltiples pruebas

bioqumicas miniaturizadas, por ejemplo API, segn las condiciones de trabajo.
INFORME:
El informe del coprocultivo debe constar de 3 partes:
1-
Ttulo: coprocultivo, cultivo de biopsia colnica, etc. De preferencia debe escribirse con maysculas y centrado.
2-
Resultado: Para ahorrar tiempo y trabajo, debe apuntarse el resultado en clave, en el libro de trabajo y luego la secretaria del laboratorio lo deber
transcribir con el texto correcto, segn la prxima tabla. Incluir el grupo de
Salmonella si se efectu. En el caso de Shigella no es necesario poner el grupo,
slo la especie, par ejemplo: Se aisl Shigella flexneri.
3-
Prueba de susceptibilidad antimicrobiana (S/A): con los antibiticos de utilidad clnica para tratar infecciones por enterobacterias.
Utilice la siguiente tabla para registrar e informar el resultado del coprocultivo:
RESULTADO
CLAVE
en libro de trabajo
(tcnico)
TEXTO (Secretaria)
Coprocultivo negativo
de adulto
NP
No se aislan enteropatgenos, desarrollan

bacterias de la microbiota normal
Coprocultivo negativo de
nio menor de un ao
N-SSE
Negativo para Shigella, Salmonella y

Escherichia coli enteropatgena
Coprocultivo positivo
Shigella A
Se aisl Shigella dysenteriae. S/A
Shigella B
Se aisl Shigella flexneri. S/A
Shigella C
Se aisl Shigella boydii. S/A
Shigella D
Se aisl Shigella sonnei. S/A
Salmonella typhi
Se aisl Salmonella typhi. S/A
Salmonella grupo ____
Se aisl Salmonella enteritidis del grupo ____. S/A
Se aisl Salmonella choleraesuis. S/A
Arizona
Se aisl Arizona hinshawii. S/A
Yersinia
Se aisl Yersinia enterocolitica. S/A
S/A = susceptibilidad antimicrobiana.
55
PROCEDIMIENTO PARA CULTIVO DE CUERDAS ENCAPSULADAS

(ENTEROTEST)
PARA COLECCIN DE MUESTRAS DUODENALES
El objetivo de este procedimiento es obtener una muestra de la bilis del paciente para cultivar especficamente Salmonella typhi; tambin puede usarse para
examinar en fresco su contenido para trofozoitos de Giardia lamblia, huevos de
Clonorchis sinensis, o larvas de Strongyloides stercoralis. El pH de la parte distal de la
cuerda debe ser alcalino, si lleg al duodeno. El procedimiento consiste en dar al
paciente (en ayunas) una cuerda de nylon absorbente (de 90 a 140 cm para adulto y
67 cm para nios) dentro de una cpsula, la cual debe tragarse con agua. Un extremo de la cuerda se pega por fuera a la cara del paciente con cinta adhesiva y el otro
distal debe llegar hasta el duodeno, donde permanece cuatro horas para empaparse de bilis. El paciente slo debe beber agua, mnimo un vaso por hora.
Procedimiento:
1-
El mdico debe extraer (usar guantes) la cuerda de la boca mediante una traccin rpida pero suave. Luego cortar con tijeras estriles la punta de la cuerda
(amarilla por la bilis), a manera de que caiga aspticamente en un tubo o
botellita con caldo tetrationato.
2-
El caldo tetrationato sirve para enriquecer la muestra para el aislamiento de

Salmonella. Agitar e incubar 24 horas a 36 C.
3-
Despus de la incubacin, inocular por estras una asada del caldo tetrationato (agitado) en MacConkey y SS. Incubar 18 a 24 horas aerbicamente a
36 C.
4-
Trasladar las colonias lactosa-negativo (incoloras) a TSI, LIA, urea y citrato,

incubar 18 a 24 horas a 36 C.
5-
Identificar Salmonella typhi por medio de sus reacciones en TSI, LIA, urea y
citrato. Aglutinar con anti-suero polivalente de Salmonella, antgeno Vi y grupo D, segn ya se explic.
Medio de cultivo:
Preparar el caldo de tetrationato adicionado con yodo y verde brillante segn
las instrucciones en el frasco de la base en polvo, as:
56
Suspender 17.5 gramos de la base en polvo en 500 ml de agua destilada, calentar hasta que hierva. Dejar enfriar a menos de 45 C y luego agregar: 10 ml de
solucin de yodo (yodo: 6 g, yoduro de potasio: 5 g, agua destilada: 20 ml.) y 5 ml
de solucin acuosa de verde brillante al 0.1 %.
Medir 10 ml en frasquitos estriles (de los que vienen con el medio Thayer
Martin) o tubos estriles con tapn de rosca. El medio debe quedar verde con precipitado blanco.
LA EPIDEMIOLOGA Y ETIOLOGA DE LA DIARREA

Adaptado de:
World Health Organization. 1992. Control of Diarrheal Diseases Program.

Readings on Diarrhea, Student Manual, Unit I The Epidemiology and Etiology
of Diarrhea. Geneva.
Usualmente se define a la diarrea como la eliminacin de tres o ms
evacuaciones intestinales lquidas o blandas en un perodo de 24 horas.
Existen tres tipos de diarrea:
Diarrea aguda, lquida
Disentera
Diarrea persistente
El problema que representan las enfermedades diarricas
La diarrea es una de las causas principales de enfermedad y muerte en
los nios menores de 5 aos de los pases en desarrollo, en donde ocurren
aproximadamente 1.3 mil millones de episodios y 3.2 millones de muertes al
ao por diarrea. En promedio, estos nios padecen 3.3 episodios de diarrea
por ao, pero en algunas reas, el promedio pasa de nueve episodios por ao.
Es comn que donde los episodios son frecuentes, los nios pasen el 15% de
sus vidas con diarrea. Dentro de este grupo de edad, los nios menores de
dos aos, son los que sufren la mayor morbilidad y mortalidad. Se estima que
aproximadamente 80-90% de las muertes por diarrea ocurre en nios menores de dos aos. La causa principal de muertes por diarrea aguda es la
deshidratacin, la cual resulta por la prdida de lquidos y electrolitos. Otras
causas importantes de muerte son disentera, desnutricin y otras infecciones
serias, como neumona.
57
Disentera
Esta forma de diarrea se caracteriza por la presencia de sangre visible en
las heces fecales y frecuentemente presencia de moco. Sus efectos importantes incluyen anorexia, prdida de peso rpida y daos a la mucosa intestinal
causados por la bacteria invasora.
La mayora de los casos de disentera aguda en nios, son causados por
Shigella spp. Otras causas son Campylobacter jejuni y menos frecuentemente
Escherichia coli entero invasora (EIEC) y Salmonella. El protozoo Entamoeba
histolytica, puede causar disentera seria en adultos jvenes, pero es una causa
muy rara en nios. En alrededor de 90% de los casos de infeccin intestinal
por Entamoeba histolytica, las cepas no son virulentas.
Los pacientes con disentera causada por Shigella dysenteriae tipo 1 (Bacilo de Shiga), estn a menudo clnicamente muy enfermos. Este sndrome
clnico casi siempre incluye fiebre alta, sntomas txicos y clicos abdominales intensos y tenesmo. Ocasionalmente se registran convulsiones. A veces se
acompaa de complicaciones graves, como el sndrome hemoltico urmico.
Pueden presentarse epidemias de gran magnitud causadas por este
enteropatgeno. Esto ocurri en Centroamrica en los aos 1969 y 1970. La
terapia antimicrobiana apropiada aminora significativamente la gravedad y
duracin de la disentera y de la fiebre, as como la excrecin del patgeno.
EPIDEMIOLOGA
Transmisin de los agentes que causan diarrea
Los agentes infecciosos que causan diarrea generalmente se diseminan
por la ruta fecal-oral, lo cual incluye la ingestin de agua o alimentos contaminados fecalmente, y el contacto directo con heces fecales.
Varios comportamientos especficos de las personas contribuyen a la
propagacin de los enteropatgenos y por consiguiente incrementan el riesgo de sufrir diarrea. Estos incluyen:
-
Falta de lactancia materna exclusiva durante los primeros 4-6

meses de vida.
58
Usar biberones para alimentar a los nios.

Guardar alimentos a temperatura ambiente.
Beber agua contaminada con bacterias fecales.
No lavarse las manos despus de defecar, despus de desechar las
heces de los nios o de limpiar los paales y antes de preparar o
servir alimentos.
No desechar higinicamente las heces (incluyendo las de los
lactantes).
Epidemias
En las reas tropicales, la diarrea por rotavirus ocurre todo el ao, aumenta su frecuencia durante los meses secos y ms fros, mientras que las
diarreas bacterianas aumentan durante la estacin lluviosa y ms clida. La
incidencia de diarrea persistente sigue el mismo patrn estacional de la diarrea aguda lquida.
Hay dos enteropatgenos Vibrio cholerae y Shigella dysenteriae tipo 1 que
provocan grandes epidemias en las que la morbilidad y mortalidad en todos
los grupos de edad son altas. Desde 1961, el clera causado por el biotipo
Eltor de V. cholerae 01 se ha diseminado a pases de Asia, el Mediterrneo
Oriental, Africa, y a algunos pases de Europa. Desde 1991, ha causado epidemias en prcticamente todos los pases de Amrica Latina y casos sin
diseminacin secundaria en los Estados Unidos. Durante el mismo perodo
de tiempo Shigella dysenteriae tipo 1 ha ocasionado grandes epidemias de
disentera grave en Centro Amrica (69-70) y, ms recientemente, en Africa
Central y Sur de Asia.
ETIOLOGA
Enteropatgenos importantes:
Virus:
Rotavirus
Bacterias: Escherichia coli enterotoxignica
Shigella spp.
Campylobacter jejuni
Vibrio cholerae 01
Salmonella spp.
Protozoos: Cryptosporidium parvum
59
Patgenos frecuentemente identificados en nios con diarrea

aguda, atendidos en centros de tratamiento, en pases en desarrollo
Patgeno
Porcentaje de
casos
Antimicrobianos
recomendados en
base clnica*
Virus
Rotavirus
15-25
Ninguno***
Bacterias
Escherichia coli
enterotoxignica
10-20
Ninguno
Shigella
5-15
Trimetoprimsulfametoxazol,
cido nalidxico
Campylobacter jejuni
10-15
Ninguno
Vibrio cholerae 01
5-10**
Tetraciclina,
Doxiciclina,
otros
Salmonella (no tifoidea)
1-5
Ninguno***
Escherichia coli
enteropatgena
1-5
Ninguno
Cryptosporidium parvum
5-15
Ninguno***
20-30
Ninguno***
Protozoos
Ningn patgeno
aislado
*
**
***
Para cepas sensibles

En reas endmicas; puede ser ms alto durante epidemias
Ningn antimicrobiano efectivo
60
Otros patgenos, cuya importancia como causa de diarrea aguda en

nios en los pases en desarrollo es mnima, o no est bien definida. Estos
incluyen:
Virus:
agente Norwalk
adenovirus entricos
Bacterias: Aeromonas hydrophila
Escherichia coli enteroagregativa
Escherichia coli enteroinvasora
Escherichia coli enterohemorrgica
Plesiomonas shigelloides
Vibrio cholerae que no es 01
Vibrio parahaemolyticus
Protozoos: Giardia lamblia
Entamoeba histolytica
Isospora belli
Cyclospora cayetanensis
Mecanismos Patognicos de los Agentes Etiolgicos de Diarrea
Los enteropatgenos causan diarrea por varios mecanismos, algunos de
los cuales se revisan a continuacin.
Virus
Los rotavirus se replican dentro de las clulas epiteliales maduras que
cubren la porcin superior de las vellosidades intestinales, causando destruccin celular y acortamiento de las vellosidades.
Bacterias
Adherencia a la mucosa
Produccin de toxinas que causan secrecin intestinal
Invasin de la mucosa
Protozoos
Adherencia a la mucosa
Invasin de la mucosa
61
Shigella
Shigella es la causa ms importante de disentera, encontrndose en alrededor de 60% de todos los episodios y en prcticamente en todos los episodios graves de esta forma de diarrea; tambin pueden causar diarrea lquida.
S. flexneri es la especie ms prevalente en pases en desarrollo, sin embargo, S. dysenteriae tipo 1 que causa epidemias regionales es responsable de
la disentera ms grave. La destruccin tisular y posiblemente la diarrea lquida son producidas en parte por la extremadamente potente toxina de
Shiga, que es producida en cantidades relativamente grandes por S. dysenteriae
tipo 1. Shigella se disemina principalmente por la transmisin de persona a
persona. El tratamiento efectivo contra Shigella spp. se hace con
antimicrobianos a los cuales son susceptibles, pero es comn la resistencia
antimicrobiana. Puede haber resistencia a mltiples antimicrobianos especialmente en las cepas de S. dysenteriae tipo 1. Los antimicrobianos ms tiles son
trimetoprim-sulfametoxazol y cido nalidxico; en algunas reas tambin es
efectiva la ampicilina.
62
CAPTULO 4
COPROCULTIVO PARA CLERA
PROPSITO:
Demostrar por medio de cultivo la presencia de Vibrio cholerae 01, la bacteria
causante del clera. Esta bacteria se adquiere por ingestin de bebidas o alimentos
contaminados. Llega al intestino delgado, donde se adhiere a la mucosa y, debido a
la produccin de una potente toxina, causa la salida masiva de agua y electrolitos.
En un bajo porcentaje de los pacientes infectados, se produce el colera gravis, la
forma clnica del clera agudo, con muy abundante diarrea acuosa (semejante a
agua de arroz) y vmitos. Esto provoca en el paciente deshidratacin severa que
puede causar la muerte, si no se instituye tratamiento de rehidratacin y antibiticos.
El clera ha sido endmico en la India y en otros pases desde la ms remota
antigedad. En 1961 se inici la sptima pandemia en Indonesia. En enero de 1991
apareci en Per y a partir de all se ha diseminado a varios pases de Latinoamrica,
donde ahora es una infeccin endmica, ms frecuente durante la poca lluviosa.
Vibrio cholerae 01 (01 indica que pertenece al serogrupo 1 segn su antgeno
somtico), se subdivide en tres serotipos: Inaba, Ogawa, y el serotipo Hikojima que
an no se ha detectado en Latinoamrica. Generalmente si la epidemia se inicia
con el serotipo Inaba, despus de algn tiempo se transforma en Ogawa, debido a
cambio de antgenos. Esta clasificacin slo tiene inters epidemiolgico. Existen
dos biotipos de V. cholerae 01: eltor y clsico. En Latinoamrica, durante la presente
pandemia, el biotipo presente es eltor, el cual se caracteriza por causar epidemias
con pocos casos graves (aproximadamente 2%) y muchos casos leves o
asintomticos; tambin sobrevive ms tiempo en el medio ambiente, y es ms resistente a los agentes qumicos.
El tratamiento principal del clera es evitar la muerte por deshidratacin, por
medio del pronto reemplazo de agua y electrolitos. Debe hacerse por va oral y si
es necesario por va intravenosa. El tratamiento con antibiticos ayuda a la recuperacin, pues elimina los vibrios y acorta la diarrea, adems evita portadores de la
bacteria. En adultos se recomienda la tetraciclina, y en nios el trimetoprimsulfametoxazol (cotrimoxazol). En el caso de mujeres embarazadas se indica la
furazolidona.
63
El diagnstico definitivo de clera se establece slo por la demostracin de V.

cholerae 01 por medio de cultivo. El frote Gram directo de las heces puede ser indicativo de clera, pero no se considera un procedimiento diagnstico exacto.
MUESTRA:
Las muestras adecuadas para efectuar el diagnstico bacteriolgico de el clera son: heces diarricas (principalmente con apariencia de agua de arroz), hisopo
rectal o vmitos. Deben recolectarse de preferencia dentro de las primeras 24 horas
de la enfermedad y previo a la administracin de antibiticos. Si las muestras de
heces frescas van a ser procesadas en un tiempo adecuado (antes de dos horas),
deben recolectarse en un recipiente de vidrio o plstico bien limpio, de preferencia
estril, y enviarse inmediatamente al laboratorio. En caso contrario deben inocularse dos hisopos con material fecal en el medio de transporte Cary-Blair, que
debe enviarse al laboratorio de referencia sin necesidad de refrigeracin. En
el medio hospitalario no es necesario usar intilmente el medio de transporte
Cary-Blair, ya que la muestra de heces frescas debe remitirse al laboratorio para su
cultivo directo inmediato.
PROCEDIMIENTO:
Existen muchas variantes en la marcha bacteriolgica a seguir para el aislamiento e identificacin de Vibrio cholerae 01. La marcha simplificada propuesta es,
en la experiencia del autor, efectiva y sencilla (ver figura 7, pg. 67). V. cholerae 01
puede aislarse directamente de las heces, pero se logran resultados mucho mejores
si previamente se hace un enriquecimiento en el caldo selectivo alcalino llamado
agua pepto nada alcalina o APA. En este caldo el agente etiolgico del clera prolifera en la superficie, pues resiste la alcalinidad extrema del medio (pH 9.0 a 9.2), y
otras bacterias de la microbiota fecal se destruyen, por lo que se obtienen cultivos
casi puros.
1.
Inocular masivamente un tubo con 5 ml de agua peptonada alcalina,

con un hisopo estril bien cargado de heces o vmito. Sacar el hisopo y
agitar muy bien el tubo, luego incubar verticalmente y con el tapn ligeramente suelto, solamente por 5 a 8 horas a 36 C.
2.
Si se trata de heces, inocular directamente cajas de agar MacConkey,

XLD o SS e idealmente Hektoen para el aislamiento de Shigella y
Salmonella, ya que las infecciones intestinales causadas por estos dos
gneros, clnicamente pueden semejar clera.
64
3.
Despus del tiempo crtico de incubacin del APA, retirar el tubo cuidadosamente de la incubadora y colocarlo verticalmente en una gradilla o
soporte. Destaparlo despacio, sin que se agite, y con el asa en anillo,
tomar verticalmente una asada de la superficie del caldo (no ms de 5
mm de profundidad). Inocular una caja de agar TCBS y una de agar
sangre de carnero al 5%. Incubar aerbicamente 18 a 24 horas a 36 C.
El agar TCBS (tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa) contiene elevadas
concentraciones de tiosulfato de sodio y citrato de sodio. La fuerte alcalinidad del
medio de cultivo TCBS, inhibe considerablemente las enterobacterias; la bilis de
buey y el colato inhiben sobre todo a los enterococos. Los coliformes que eventualmente puedan crecer, no fermentan la sacarosa (sinnimo: sucrosa). Contiene dos
indicadores de pH: azul de timol y azul de bromotimol, que viran al color amarillo
en presencia de acidez. Vibrio cholerae es sacarosa positivo, por lo que produce colonias amarillas. Vibrio fluvialis, V. furnissii y V. alginolyticus, tambin producen
colonias amarillas en TCBS; estos vibrios son de muy poca importancia
epidemiolgica. Algunas cepas de enterococos, Proteus y Klebsiella sacarosa-positivo, tambin pueden producir colonias amarillas, pero de morfologa distinta a las
que produce V. cholerae 01.
1.
Vibrio cholerae 01 produce en TCBS el crecimiento masivo y puro de colonias grandes (de 2 a 3 mm de dimetro), de color amarillo canario
(sacarosa-positivo), aplanadas o de bordes delgados. Este tipo de colonias en TCBS, en grandes cantidades debido al enriquecimiento selectivo en APA, son muy indicativas de la presencia de la bacteria.
2.
Si hay crecimiento tpico en TCBS, en el agar sangre de carnero se desarrollar un crecimiento masivo y casi puro de colonias grandes incoloras, brillantes, de bordes aplanados y no hemolticas. En el rea de la
caja donde el crecimiento es confluente, generalmente aparece una zona
de decoloracin del medio que semeja hemlisis; probablemente se debe
al metabolismo de la bacteria, reminiscencia de la hemlisis especfica a
los eritrocitos de carnero, que presentaba originalmente V. cholerae 01
del biotipo eltor; en todo caso, es una caracterstica adicional que ayuda
a sospechar la presencia de la bacteria en este medio.
3.
Aglutinar las colonias tpicas y aisladas del agar sangre de carnero, con
antisuero polivalente anti-V. cholerae 01. Al hacerlo, evitar tomar de las
65
colonias pequeas o blancas que pueden aparecer, ya que el medio no es

inhibitorio. Nunca debe aglutinarse del TCBS, pues en este medio las
colonias son chiclosas, muy adherentes al medio, y no se pueden suspender bien en el antisuero, por lo que la aglutinacin slo es confiable
a partir del crecimiento en agar sangre de carnero.
4.
Si se obtiene una reaccin de aglutinacin positiva, franca e inmediata,

generalmente con presencia de grumos grandes, se ha demostrado la
presencia de V. cholerae 01. Proceder a aglutinar el crecimiento tpico del
agar sangre de carnero en antisueros anti-serotipo Inaba y anti-serotipo
Ogawa; generalmente la aglutinacin es ms fina, pero evidente. Esto
ltimo no es crucial, pero si deseable. La prueba de oxidasa es positiva;
debe hacerse en caso de duda o confirmacin.
5.
Si el laboratorio no cuenta con antisuero polivalente anti-V. cholerae 01,

se deber seleccionar una colonia tpica del TCBS, y subcultivar en TSI y
LIA. En estos medios la reaccin despus de 18 a 24 horas de incubacin,
generalmente es TSI: K/A (A/A); LIA: K/K-N, sin gas ni cido
sulfhdrico en ambos tubos. El tubo de TSI debe remitirse al laboratorio
de referencia donde se efecta la confirmacin.
6.
Efectuar prueba de susceptibilidad a los antibiticos, segn el mtodo

de Bauer-Kirby. Slo deben colocarse los siguientes discos: tetraciclina y
trimetoprim-sulfametoxazol, son indispensables; ampicilina o algn otro
antibitico, son optativos. Interpretar los dimetros de los halos de inhibicin igual que para enterobacterias. Es deseable, pero no indispensable, colocar en el centro de la caja de agar Mueller-Hinton, un disco con
50 UI de polimixina-B. La resistencia con ausencia de zona de inhibicin
a este antibitico, indica que la cepa aislada de V. cholerae 01, pertenece
al biotipo eltor. Esto es de esperarse en Latinoamrica, ya que el biotipo
clsico no est actualmente presente. Si se detecta una cepa susceptible
a polimixina-B, debe remitirse al laboratorio nacional de referencia pertinente, para que confirme este hallazgo de inters nacional. El biotipo
eltor presenta una prueba de Voges-Proskauer positiva.
66
Fig. 7 MARCHA BACTERIOLGICA ACORTADA PARA

AISLAMIENTO DE Vibrio cholerae 01
Muestras:
Heces lquidas
Hisopo rectal
Vmitos
1. Inocular con hisopo estril bien cargado un tubo con APA,

descartar el hisopo y agitar
o
2. Incubar 5-6 horas a 36 C
Vibro cholerae
en la superficie
del APA
APA
3. Tomar inculo de la
superficie del APA
4. Sembrar TCBS y agar
sangre de carnero (ASC)
5. Incubar 18-24 horas
o
a 36 C
No agitar
6. Interpretar simultneamente
TCBS
Colonias:
- Amarillas
- Grandes
- Planas
Sembrar antibiograma
ASC
Colonias:
- Grandes
- No hemolticas
Hacer frote
Gram: bacilos
gram-negativo, algunos curvos.
Aglutinar, si positivo dar informe
STAT
STAT: Vibrio cholerae 01
Nota: El diagnstico definitivo se puede obtener en 24 horas

67
INFORME:
En el caso de clera el reporte debe ser inmediato, ya que en los casos graves
la vida del paciente puede depender de este resultado. Por este motivo se justifica
plenamente usar una tcnica simplificada y evitar pruebas innecesarias, para ahorrar tiempo. Nunca debe esperarse el resultado del antibiograma para hacer el reporte de un cultivo positivo. Se recomienda informar as, lo ms pronto posible, y
al lugar ms indicado:
1.
Inmediatamente despus de una prueba de aglutinacin franca a partir

del agar sangre de carnero:
Se aisl Vibrio cholerae O1.
2.
Despus de aglutinacin positiva con antisuero polivalente anti-V.

cholerae 01 y luego aglutinacin positiva con antisuero de serotipo Ogawa
o Inaba:
Se aisl Vibrio cholerae 01, serotipo Inaba (u Ogawa).
3.
Despus de interpretar la prueba de susceptibilidad, pero posteriormente

a haber enviado un reporte preliminar:
Se aisl Vibrio cholerae 01, serotipo Ogawa (o Inaba), biotipo eltor.
Susceptible a: ... ; Resitente a: ...
FRMULAS:
1. AGUA PEPTONADA ALCALINA (APA):
Peptona ...................................................................... 10 gramos
Cloruro de sodio. ...................................................... 10 gramos
Agua destilada .......................................................... 1,000 ml
Ajustar pH final a 9.0-9.2 con hidrxido de sodio 1N.
Distribuir 5 ml en tubos 13x100 o de mayor volumen con tapn de rosca.
Autoclavear 15 minutos a 121 C (15 libras de presin por pulgada cuadrada).
68
2. MEDIO DE TRANSPORTE CARY-BLAIR:

Tioglicolato de sodio ................................................ 1.5 gramos
Fosfato dibsico de sodio ........................................ 1.1 gramos
(Na2HPO4)
Cloruro de sodio ....................................................... 5.0 gramos
Agar. ........................................................................... 5.0 gramos
Agua destilada .......................................................... 991.0 ml
Disolver los ingredientes en el agua por calentamiento, y con agitacin constante.
Enfriar a 50 grados centgrados, y adicionar 9 ml de cloruro de calcio al 1%, recientemente preparado (0.1 gramos de cloruro de calcio + 10 ml de agua). Ajustar pH a
8.4 con hidrxido de sodio 1N, y distribuir 6 ml en tubos de 13x100 con tapn de
rosca, a manera de dejar un pequeo espacio de aire entre el tapn y el medio.
Autoclavear a 100 grados centgrados en Bao de Mara hirviendo, por 15 minutos.
Enroscar bien el tapn y almacenar en refrigeracin y oscuridad.
69
CAPTULO 5
COPROCULTIVO PARA Campylobacter jejuni
PROPSITO:
Demostrar por medio de cultivo, la presencia de Campylobacter jejuni. A partir
de 1977, se considera a esta bacteria como un importante agente causal de diarrea
humana. C. jejuni es ms frecuente que Shigella y Salmonella en coprocultivos. Estudios efectuados por el autor en Guatemala, revelan que en heces de nios menores
de cinco aos de edad con diarrea, esta bacteria se aisla aproximadamente en el 10
por ciento. Estos resultados son comparables con otros estudios similares en Latino-amrica; la frecuencia mundial de aislamiento a partir de coprocultivos vara
del 4 al 30 por ciento. Sin embargo, debido a que su aislamiento requiere de un
medio de cultivo y condiciones de incubacin especiales, su bsqueda no se efecta rutinariamente, lo cual debera hacerse debido a su importancia epidemiolgica.
Campylobacter jejuni es un bacilo gram-negativo, curvo, en espiral o en
forma de S. Presenta dos flagelos, uno en cada extremo de la clula, lo que le
proporciona un movimiento rpido y helicoidal, que lanza a la bacteria a manera
de dardo. Es una bacteria estrictamente microaeroflica, oxidasa-positivo, que no
fermenta ni oxida los carbohidratos. Crece a 36 grados centgrados, pero se utiliza
su capacidad diferencial (termfila) de crecer mejor a 42 grados centgrados, para
su aislamiento.
La infeccin intestinal por este bacilo causa diarrea con dolor abdominal,
fiebre y ocasionalmente vmitos. Puede haber sangre macroscpica en las heces,
especialmente en las muestras peditricas. La infeccin se adquiere por va oral,
al consumir agua o alimentos contaminados, especialmente carne mal cocinada y
leche no pasteurizada. La infeccin puede adquirirse de otro humano, o ser una
zoonosis, pues tambin puede adquirirse de los animales. C. jejuni es muy frecuente en animales domsticos y mascotas. Especialmente coloniza pollos y otras
aves; causa enteritis en ganado bovino, y aborto en ovejas. En el humano, adems
de enteritis, ocasionalmente causa septicemia, artritis sptica, meningitis y otras
infecciones.
El diagnstico de campilobacteriosis puede efectuarse presuntivamente por
la observacin directa de bacterias con movimiento de dardo en las heces con
71
campo oscuro o contraste de fases. Un frote coloreado con Gram, muestra abundantes bacilos gram-negativo curvos. El diagnstico definitivo se establece por
medio del aislamiento e identificacin de C. jejuni.
MUESTRA:
En vista que para el aislamiento de C. jejuni se deben aplicar procedimientos
especializados, las muestras deben ser heces frescas, que deben procesarse antes de
dos horas de haber sido emitidas. Las heces no deben estar contaminadas con
orina. Tambin puede utilizarse hisopo rectal, si la inoculacin se efecta inmediatamente.
CONDICIONES NECESARIAS:
El procedimiento para el aislamiento eficaz de esta bacteria, debe incluir los
siguientes aspectos:
1.
Un agar sangre de carnero selectivo, recientemente preparado. Se

recomienda el Agar Skirrow modificado, que contiene como inhibidores: vancomicina (10 mg/lt), polimixina-B (2,500 UI/lt) y trimetoprim (5 mg/lt). Idealmente debe prepararse con la siguiente base:
Blood Agar Base No. 2 (Oxoid), adicionada de 10% de sangre de
carnero desfibrinada/estril. La sangre de carnero remueve formas
txicas de oxgeno en el medio de cultivo. La mezcla de antibiticos que hacen al medio selectivo para C. jejuni puede obtenerse comercialmente.
2.
Incubacin en microaerofilia estricta. Idealmente: 5% de oxgeno, 10%

de anhdrido carbnico y 85% de nitrgeno. La forma ms fcil y efectiva de lograr esta atmsfera, es usar el jarro Gas-Pak (BBL), sin cataltico
ni indicador. Segn las instrucciones del productor, usar el sobre rojo
generador de anaerobiosis (BBL). La incubacin en jarro con candela no
es adecuada, pues proporciona una atmsfera con demasiado oxgeno
(12%-17%) para permitir el crecimiento de C. jejuni.
3.
Incubacin a 42 C por 48 horas. Inhibe la microbiota intestinal,

y permite el crecimiento termfilo de Campylobacter jejuni, C. coli y
C. laridis.
72
PROCEDIMIENTO:
1.
Analizar microscpicamente la muestra fecal, para buscar la presencia

de leucocitos polimorfonucleares. Si no los hay, no vale la pena efectuar
el cultivo para C. jejuni, pues las posibilidades de aislarlo son muy bajas.
2.
Analizar macroscpicamente la muestra fecal, y tomar con asa o hisopo

estril, las porciones con moco, sangre o pus. Inocular por estras dos
cajas de Agar Skirrow, y una de agar chocolate.
3.
Inmediatamente colocar las tres cajas en atmsfera microaeroflica, por

medio del jarro Gas-Pak sin cataltico ni indicador, con sobre generador
de anaerobiosis (BBL). Es necesario quitar la canastilla con paladio
iridiado (cataltico) del jarro.
4.
Incubar a 42 grados centgrados exactos, por no menos de 48 horas.
1.
Retirar las cajas de la incubadora y del jarro Gas-Pak. Con microscopio

estereoscpico, o al menos con lupa, examinar detenidamente las colonias aisladas. Buscar colonias con la siguiente morfologa tpica: hmedas o ligeramente mucosas, muy aplanadas, blanco-grisceas o incoloras, no hemolticas, rodeadas de un velo de crecimiento que se esparce sobre el agar circundante a la colonia, bordes irregulares y poco perceptibles. Menos frecuentemente las colonias son ms secas, convexas y
amarillentas; con incubacin prolongada se transforman en rugosas. Si
no se encuentran colonias tpicas, incubar por otras 24 a 48 horas antes
de descartar el cultivo como negativo.
2.
De una colonia aislada con morfologa tpica, hacer inmediata y cuidadosamente un frote (de preferencia del velo circundante), en una pequea gota de agua. Colorear con Gram (dejar la safranina por tres minutos, pues la bacteria se tie plidamente), o con fuchsina bsica al 1%
por 10 a 20 segundos, despus de fijar al calor.
3.
Si el frote presenta bacilos gram-negativo curvos, algunos en forma de

gaviota, en forma de S, o en espiral (ondulante), presuntivamente
se ha aislado Campylobacter jejuni. Reportar este hallazgo de inmediato.
En los cultivos expuestos al aire predominan las formas cocoides.
73
4.
De otra colonia tpica, subcultivar con el asa en hilo a otra caja de Agar
Skirrow, y a una caja de agar sangre de carnero, e inocular un tubo de
agar TSI. Estriar e incubar los tres medios en atmsfera microaeroflica a
42 C, segn ya fue descrito.
5.
El cultivo puro que resulta del subcultivo en Skirrow o agar sangre de

carnero generalmente es una capa blanquecina de crecimiento; sirve
para confirmar de nuevo la morfolofa bacteriana tpica, y efectuar las
siguientes pruebas confirmativas:
-
Oxidasa y catalasa: ambas deben ser positivas, y se consideran como

suficientes. Campylobacter jejuni, C. coli y C. laridis dan ambas
pruebas positivas.
El tubo de TSI debe ser K/K, sin gas, y sin cido sulfdrico.
No es indispensable, pero si existen facilidades, hacer la prueba de

hidrlisis del hipurato. Es positiva para C. jejuni, y negativa para
C. coli.
C. jejuni es susceptible a un disco de 30 microgramos de cido

nalidxico, mientras que C. laridis es resistente; esta diferenciacin
tampoco se considera indispensable.
Eventualmente algunas cepas de Pseudomonas aeruginosa pueden

crecer en el medio Skirrow microaeroflico/termfilo, sin
embargo, stas se diferencian por su pigmento verdoso y su olor
caracterstico.
INFORME:
Al detectar la morfologa bacteriana tpica en las colonias que desarrollan a
las 48 horas de incubacin, informar:
Se aisl Campylobacter jejuni, confirmacin pendiente.
Al efectuar las pruebas confirmatorias, reportar:
Se aisl Campylobacter jejuni, se recomienda considerar el tratamiento
con eritromicina.
74
CAPTULO 6
INVESTIGACIN DE Helicobacter pylori
PROPSITO:
Demostrar por medio de observacin, cultivo, o la tcnica indirecta de ureasa,
la presencia de Helicobacter pylori. Esta bacteria se ha reconocido recientemente como
agente causal de gastritis crnica activa tipo B, y predispone a la produccin de
lceras ppticas. Anteriormente se clasificaba en el gnero Campylobacter, pero debido a varias diferencias en su estructura, composicin y susceptibilidad
antimicrobiana, a partir de 1989, se clasifica en el gnero Helicobacter.
Es un bacilo gram-negativo helicoidal o espiral, que presenta movilidad en
forma de dardo debida a sus flagelos. Es una bacteria microaeroflica, cuyo crecimiento ptimo es a 36 C. Se observa o aisla a partir de biopsias de la mucosa
gstrica.
Su deteccin tiene actualmente mucha importancia clnica. El mecanismo
ms probable para explicar la patologa gstrica que causa, es su gran actividad
sobre las clulas parietales del estmago, lo que induce la produccin de gran cantidad de cido clorhdrico. Adems, la potente enzima ureasa que produce H. pylori,
degrada la mucina del moco gstrico y libera gran cantidad de amonio. En
Latinoamrica en general, la gastritis es una enfermedad muy frecuente. Se sabe
que el 70 por ciento la poblacin guatemalteca sufre de infeccin gstrica asociada
a H. pylori, lo que indica la importancia de su bsqueda en nuestro medio. Esta
bacteria es susceptible a eritromicina, tetraciclina, penicilina, gentamicina, cefalotina,
clindamicina, ciprofloxacina y otros antibiticos; tambin es susceptible a las sales
de bismuto que contienen varios medicamentos contra la gastritis. Es resistente a
las sulfonamidas, cido nalidxico y trimetoprim-sulfametoxazol.
MUESTRA:
La muestra siempre debe ser obtenida por el gastroenterlogo por medio de
gastroscopa. Las biopsias, cepillados o aspirados, se toman por el gastroscopio, de
antro pilrico, de cuerpo y de fondo del estmago. Las biopsias producen los resultados ms confiables. Tambin puede usarse la tcnica de la cuerda encapsulada o
Enterotest para extraer moco gstrico.
75
OBSERVACIN DIRECTA:
Puede efectuarse por medio de la observacin de la bacteria en fresco (en
preparaciones con solucin salina), con microscopa de contraste de fases (o campo
oscuro), o en frotes coloreados. En el caso de la observacin en fresco y contraste de
fases, se buscan bacilos curvos muy mviles con el tpico movimiento en forma de
dardo. La coloracin de Gram no se considera adecuada para teir H. pylori. Lo
ms usado es la deteccin de la bacteria en el laboratorio de Patologa, donde se
preparan cortes y frotes por aposicin de la biopsia, y se tien con Giemsa modificado, hematoxilina-eosina o la compleja impregnacin con sales de plata segn
Warthin-Starry. Se buscan abundantes bacilos curvos o helicoidales directamente
sobre la mucosa.
PRUEBA DE UREASA:
H. pylori produce abundante ureasa, enzima que acta sobre el sustrato urea,
con produccin de abundante amonaco, lo cual alcaliniza el medio. Es una prueba
indirecta de la presencia de H. pylori en la muestra, por lo tanto se considera
presuntiva. Proceder as:
1.
Macerar aspticamente la biopsia, idealmente en macerador pequeo

de vidrio, con 0.3 ml de solucin estril de glucosa al 20%.
2.
Inocular masivamente un tubo de caldo urea, o agar urea de Christensen.
3.
Incubar a 36 grados centgrados por pocas horas.
4.
Se considera como una prueba positiva cuando el medio vira rpidamente a color rosado fuerte, al alcalinizarse.
CULTIVO:
El aislamiento de H. pylori por medio de cultivo, constituye la confirmacin
definitiva de este diagnstico bacteriolgico. Para efectuarlo, se recomienda proceder as:
1.
Macerar la biopsia con 0.3 ml de solucin estril de glucosa al 20%.
2.
Inmediatamente inocular 0.03 ml del macerado en dos cajas de agar

chocolate y dos cajas de Agar Skirrow. Diseminar por estras.
76
3.
Introducir las cajas en un jarro Gas-Pak (BBL), sin cataltico en la tapadera,

ni indicador de anaerobiosis. Introducir segn las instrucciones del productor, un sobre rojo generador de anaerobiosis. Sin el cataltico presente, proporciona una atmsfera microaeroflica adecuada para el cultivo
de H. pylori.
4.
Incubar a 36 grados centgrados por cinco das.
5.
Despus de la incubacin prolongada, buscar con ayuda del microscopio estereoscpico o lupa, colonias con las siguientes caractersticas: muy
pequeas (0.5 mm de dimetro, no mayores de 2 mm), circulares,
translcidas y no pigmentadas. Efectuar observacin en fresco con contraste de fases o campo oscuro y/o frote Gram modificado (fucsina bsica al 1% como contraste). Si se observan bacterias con el tpico movimiento en forma de dardo y bacilos gram-negativo curvos o espirales, el
cultivo es compatible con H. pylori.
6.
Las pruebas confirmatorias a partir del cultivo puro son las siguientes:
-
Ureasa: positivo fuerte.

Catalasa: positivo
Oxidasa: positivo
Acido sulfhdrico en TSI: negativo (optativo)
Otra prueba muy especfica pero no indispensable es la hidrlisis
del indoxil acetato.
INFORME:
1.
Si la observacin directa arroja los resultados esperados, informar:

Se observan abundantes bacilos de morfologa compatible con
Helicobacter pylori.
2.
Si la prueba de ureasa es positivo fuerte en pocas horas, informar:

Prueba de ureasa rpida: positivo fuerte, muy indicativa de la
presencia de Helicobacter pylori.
3.
Si el cultivo presenta los resultados de observacin directa y pruebas

confirmatorias con los resultados esperados, informar:
Se aisl Helicobacter pylori.
77
CAPTULO 7
UROCULTIVO
PROPSITO:
El cultivo de orina que ha sido colectada adecuadamente o urocultivo se
efecta para demostrar la presencia de un nmero significativo de bacterias. En
condiciones normales, la orina dentro del cuerpo es estril, pero siempre se contamina con bacterias al obtener la muestra. Por esta razn, el criterio para interpretar
el crecimiento es cuantitativo. De acuerdo con el llamado criterio de Kass, un
nmero de bacterias mayor o igual a 100,000 UFC/ml (unidades formadoras de
colonia por mililitro de orina) se considera infeccin urinaria verdadera, es decir,
es un recuento significativo.
A diferencia de otros cultivos bacteriolgicos, las bacterias que causan la
infeccin urinaria, se limitan a unos pocos microorganismos de crecimiento rpido. Las principales bacterias que infectan el sistema urinario son las enterobacterias
(bacilos gram-negativo). Escherichia coli es sin duda la bacteria que con ms
frecuencia se aisla de urocultivos positivos, luego:
Klebsiella spp.
Enterobacter spp.
Proteus spp.
Pseudomonas aeruginosa (no es enterobacteria)
De menor importancia son los cocos gram positivo:
Enterococcus spp.
Streptococcus pyogenes y Streptococcus sp. (raros)
Staphylococcus epidermidis (puede ser contaminacin)
Staphylococcus saprophyticus (puede ser contaminacin)
Las infecciones mixtas causadas por dos o ms especies bacterianas son raras,
por lo que el crecimiento con varios tipos de colonias indica contaminacin.
La demostracin de la piuria (presencia de leucocitos polimorfonucleares en
el sedimento urinario) y la bacteriuria (bacterias en la orina), son ambos de gran
importancia para establecer el diagnstico de infeccin urinaria.
79
80
*Escherichia coli
Chlamydia trachomatis
Staphylococcus saprophyticus
Trichomonas vaginalis (protozoo)
Virus Herpes simplex tipo 2
Candida albicans (hongo)
*Bacilos gram-negativo
Ureaplasma urealyticum
Chlamydia trachomatis
Sintomtico: disuria,
frecuencia
Asintomtico
Disuria, frecuencia
Agudo: fiebre, calofros,

dolor de espalda
Tracto urinario
inferior:
cistitis
Uretritis
Prostatitis
Mayor o igual a
100
Mayor o igual a
100
Mayor o igual a
100,000
(criterio de Kass)
Mayor o igual a
100,000
(criterio de Kass)
CONTEO
SIGNIFICATIVO
(UFC/ml)
Tomado de: Pezzlo, M. 1992. Urine Culture Procedure. In: Isenberg, H.D. (Editor in Chief). Clinical Microbiology
Procedures Handbook. Two volumes. American Society for Microbiology. Washington, D.C., USA.
*Escherichia coli
*Otros bacilos gram-negativo
Enterococcus spp.
Staphylococcus coagulasa-negativo
Agudo: fiebre, calofros, dolor

de cintura posterior, nusea,
vmitos, cilindros leucocitarios, invasin tisular
Crnico: asintomtico,
moderado o agudo, lesiones,
cilindros leucocitarios
Tracto urinario
superior:
pielonefritis
* Aislamiento comn.
*Bacilos gram-negativo
Staphylococcus coagulasa-negativo
Candida spp. (hongo)
Mycobacterium spp.
Mycoplasma hominis
MANIFESTACIONES
CLNICAS
TIPO DE
INFECCIN
MICROORGANISMOS
ASOCIADOS CON
LA INFECCIN
MANIFESTACIONES CLNICAS Y MICROORGANISMOS ASOCIADOS

CON VARIOS TIPOS DE INFECCIONES URINARIAS
TOMA DE LA MUESTRA:
Si en algn examen bacteriolgico la toma de la muestra es crucial, para obtener un resultado de cultivo con correlacin clnica, es en el urocultivo. El meato
urinario, o sea el agujero de salida de la uretra (tubo que desagua la vejiga), est
siempre colonizado por bacterias saprfitas, tanto en el hombre como en la mujer.
Por esta razn, los genitales deben desinfectarse antes de tomar la muestra, segn
se explica a continuacin. Tomar la muestra de orina para urocultivo despus de
dos horas sin que el paciente haya orinado. Si la muestra se toma antes, la orina no
ha pasado suficiente tiempo en la vejiga, para alcanzar cantidades significativas.
TOMA DE UROCULTIVO EN EL HOMBRE:
1.
Desinfectar bien la punta del pene del paciente con una gasa estril empapada en jabn antisptico no irritante. Remover el jabn con otra
gasa estril, empapada en agua estril.
2.
Pedir al paciente que orine directamente en la taza del sanitario.
3.
Despus de transcurridos unos 3 a 5 segundos, destapar rpidamente

pero con cuidado un frasco estril de boca ancha y tomar al vuelo una
muestra de orina de la parte central de la miccin. Se deja correr la
primera porcin de orina para que remueva las bacterias de la parte
anterior del meato urinario, que contaminara el urocultivo. Tapar rpidamente el frasco.
4.
Si no es posible inocular el urocultivo antes de una hora de obtenida la

muestra, refrigerarla (no congelar). La muestra conservada en refrigeracin se mantiene en buenas condiciones para ser inoculada, por un
mximo de 48 horas.
TOMA DE UROCULTIVO EN LA MUJER:

En el caso de la mujer, debe observarse especial cuidado en la toma de la
muestra, ya que sus genitales no estn expuestos y estn abundantemente colonizados por bacterias. Proceder as:
1.
Solicitar a la paciente que se coloque sobre la taza del inodoro con las
piernas abiertas. Con los dedos ndice y medio de la mano izquierda
debe separarse los labios genitales mayores.
81
2.
Con una gasa empapada en jabn antisptico no irritante limpiar bien

toda el rea y luego remover el jabn con otra gasa empapada en agua
estril.
3.
Obtener la muestra de orina al vuelo dejando al igual que en el caso

del hombre, que corra el chorro de orina unos segundos y luego tomar
de la porcin central de la miccin. Tapar rpidamente.
4.
Sembrar antes de una hora o refrigerar la muestra.
TOMA DE UROCULTIVO EN NIOS PEQUEOS:

Con los nios que an no saben hablar para comprender instrucciones y
orinar a voluntad, debe procederse as:
1.
En los nios varones desinfectar bien, con jabn antisptico no irritante,

todo el pene y el rea genital. En las nias desinfectar bien los labios
mayores y el rea genital que los rodea. Quitar bien el jabn con gasa y
agua estril, luego secar finalmente con una gasa estril seca.
2.
Pegar una bolsita de plstico estril y descartable, especial para tomar

urocultivos infantiles. En los nios tener la precaucin de introducir todo
el pene en el orificio del llenado y en las nias que el agujero de la
bolsita quede pegado al centro por donde saldr la orina. Colocar
los paales en su lugar y fijar la bolsita en su lugar con tiras de
masking-tape.
3.
Generalmente se le pide a la madre o a quien lleve al nio al laboratorio,

que espere hasta que orine. Algunos procedimientos que aceleran la
miccin son: dar bebidas (agua, leche, etc.), aplicar presin sobre la vejiga. Tambin se puede estimular al nio segn el reflejo de Castaeda:
cargar al nio boca abajo con la mano derecha y con el ngulo que forma
el dedo pulgar doblando de la mano izquierda hacer presin en forma
de rayas en la parte baja de la espalda del nio.
PUNCIN SUPRA-PBICA (PSP):

Es la obtencin de la muestra de orina por medio de puncin directa a la
vejiga, con una aguja larga. Por ser un procedimiento delicado que conlleva algunos riesgos debe hacerse slo por el pediatra. Se debe efectuar slo en estos casos:
82
Malformacin anatmica que evite la miccin normal del nio, causando contaminaciones.
Urocultivo aerobio negativo varias veces, continan los sntomas, el
sedimento urinario presenta leucocitos y se sospecha de una infeccin
urinaria causada por bacterias anaerobios.
Nota importante: Jams introduzca sonda para tomar el urocultivo. Hace varios
aos que esta tcnica cay en desuso, pues introduce a la vejiga bacterias que estn
colonizando el meato urinario. Recuerde que de ser posible debe tomarse la primera orina de la maana, generalmente esto no es posible, por lo que debe esperarse
un mnimo de dos horas sin que el paciente orine antes de obtener el urocultivo
para que las bacterias tengan suficiente tiempo para reproducirse hasta nmeros
significativos dentro del sistema urinario.
PROCEDIMIENTO:
1.
Ya que la muestra ha sido colectada siguiendo estrictamente las instrucciones anteriores, sembrar la orina en dos medios de cultivo segn la
tcnica del asa calibrada usada en la Clnica Mayo (Rochester, Minnesota,
EUA). Los dos medios de cultivo a utilizar son:
Agar sangre de carnero al 5%: crecen la mayora de bacterias.
MacConkey: crecen slo bacilos gram-negativo aerobios (enterobacterias) pues es selectivo y diferencial.
Alternativamente usar solamente el medio CLED si el microbilogo
a cargo conoce su interpretacin, la cual puede ser confusa, por lo
que no se recomienda.
2.
Para sembrar, usar una asa calibrada de platino (95% platino, 5% rodio)
que tome 0.001 ml. Agitar el frasco de orina (de preferencia con agitador
vortex, abrir delante del mechero y flamear la boca del mismo. Introducir verticalmente el asa flameada y fra
en la orina, justamente por debajo de la
superficie.
3.
Inocular primero el agar sangre deslizando el asa una sola vez a lo largo de la caja
y pasando por el centro. Flamear e inocular en igual forma el MacConkey. Alternativamente, sembrar una biplaca de
agar sangre de carnero y MacConkey, con
83
Agar sangre carnero

MacConkey
Biplaca para urocultivo
Fig. 8 MARCHA BACTERIOLGICA PARA UROCULTIVO

Muestra Orina colectada
al vuelo
1. Agitar
2. Tomar 0.001 ml
con asa calibrada
de platino,
verticalmente y
justamente por
debajo de la
superficie
INOCULAR DE RUTINA
BIPLACA
ASC
MacConkey
Medios: 1o: Agar sangre
de carnero (ASC)
2o. MacConkey
3. En ambos medios, primero una

estra longitudinal con asa de
platino calibrada (0.001 ml)
4. Con asa corriente flameada y

fra, estriar perpendicularmente
toda la caja
Idealmente, incubar el agar sangre

en jarro con candela a 36o C
Incubar aerbicamente a 36o C

84
0.001 ml en cada mitad segn la foto. Esto permite el ahorro de cajas

de Petri.
4.
Inmediatamente estriar con asa corriente en anillo el inculo de orina,

por ambas cajas, haciendo estras tupidas y perpendiculares a la estra
dejada por el asa calibrada.
5.
Con el objeto de ahorrar cajas de Petri, alternativamente puede usarse

una caja dividida por la mitad o biplaca, con agar sangre de carnero en
un lado y MacConkey en el otro; estriar de la misma manera.
5.
Idealmente, incubar el agar sangre a 36 C en jarro de boca ancha con un

trozo de papel absorbente hmedo y una veladora o candela encendida,
cerrar bien.
6.
Incubar el MacConkey sin jarro en la incubadora a 36 C.
1.
Despus de incubar ambas cajas durante 18 a 24 horas, interpretar

resultados de ambas cajas simultneamente y con buena luz.
2.
Tericamente cada bacteria origina una colonia en la superficie del medio, pero esto no es estrictamente cierto, pues cadenas o grupos de bacterias tambin pueden originar una sola colonia. Por esta razn se deben contar y reportar unidades formadoras de colonias o UFC. La
cantidad de colonias, en el agar sangre debe ser igual o muy similar en
el MacConkey. Si en el MacConkey crece una enterobacteria, en el agar
sangre tambin deber aparecer, es decir, debe haber correlacin entre
ambas cajas. De all se deriva la importancia de interpretar el crecimiento de ambas cajas simultneamente y de usar un medio selectivo/diferencial y otro rico no inhibidor, cuando se trata de una bacteria grampositivo, slo crece en agar sangre.
3.
Contar el nmero de colonias presentes y multiplicar por 1000, si se us

el asa calibrada de 0.001 ml. Multiplicar por 100 si se utiliz una asa
calibrada de 0.01 ml. Ejemplos con asa de 0.001 ml:
85
No. colonias contadas

25
78
100 en adelante
4.
UFC/ml de orina
25,000
78,000
ms de 100,000
En la mayora de urocultivos positivos, se observa el crecimiento de 100

ms o colonias rojas (lactosa-positivo), brillantes pero no mucosas en la
superficie del MacConkey, con correlacin en el agar sangre.
En este caso informar presuntivamente:

CLAVE :
(en libro de registros)
TEXTO
DEL INFORME:
E. coli ms de 100,000
UFC /ml. S/A (susceptibilidad antimicrobiana)
Se aisl Escherichia coli, ms de 100,000 UFC /ml. Infeccin urinaria verdadera, segn el criterio de Kass. S/A.
De una colonia tpica, inocular un TSI, LIA, MIO y Citrato de Simmons para
confirmar la identificacin presuntiva de E. coli y al mismo tiempo inocular de la
misma colonia y otras idnticas, la prueba de susceptibilidad antimimicrobiana o
antibiograma, segn la tcnica de Bauer-Kirby descrita. Pueden aislarse cepas de
E. coli fermentadoras lentas de lactosa y debern identificarse con TSI y LIA, no
presentan diseminacin en cepas en el agar sangre.
Si las colonias en el MacConkey son rojas (lactosa positivo) pero mucosas,
informar:
CLAVE:
TEXTO:
Klebsiella-Enterobacter ms
de 100,000 UFC /ml. S/A.
Se aisl Klebsiella-Enterobacter ms de 100,000 UFC ml. Infeccin urinaria verdadera, segn el criterio de Kass. S/A.
Inocular TSI y susceptibilidad. La diferenciacin de estos dos gneros y de las

enterobacterias en general debe hacerse por medio de pruebas bioqumicas, de preferencia con el sistema API-ATB/VITEK (Bio Meriux) o SENSIDENT (Merck).
6.
Si las colonias en MacConkey son lactosa-negativo (incoloras), hay correlacin en el agar sangre (donde las colonias son grandes, beta
86
hemolticas y de color verdoso), y los cultivos huelen a perraje o gipil

nuevo (telas tpicas de Guatemala, olor semejante a uvas), inocular para
confirmar TSI y LIA y susceptibilidad, informar:
CLAVE:
TEXTO:
ms de 100,000 UFC /ml.
S/A.
Se aisl Pseudomonas aeruginosa, ms de 100,000 UFC/ml. Infeccin urinaria verdadera, segn el criterio de Kass. S/A.
Si las colonias son lactosa-negativo (incoloras) en MacConkey, no huelen a

perraje o gipil nuevo, y en el agar sangre de carnero presentan diseminacin en
capas, inocular TSI, LIA y urea y susceptibilidad, informar:
CLAVE:
TEXTO:
Proteus sp. ms de 100,000

UFC ml. S/A.
Se aisl Proteus sp. ms de 100,000 UFC ml. Infeccin urinaria verdadera, segn el criterio de Kass. S/A.
Despus de 18 a 24 horas de incubacin a 36 C de las pruebas de identificacin interpretar para confirmar su reporte inicial con las reacciones en TSI, LIA y
urea segn el Captulo del coprocultivo. Notar reaccin roja (R) en la superficie de
LIA y urea positivo para el gnero Proteus.
8.
Los cocos gram-positivo no crecen en MacConkey, por lo que aparecen

formando colonias slo en el agar sangre. Para tomarlos en cuenta y
reportarlos como agentes causantes de infeccin urinaria deben aparecer en cultivos puros en el agar sangre. Identifique as:
Primero notar la presencia de hemlisis alrededor de cada colonia. Hemlisis

es la accin causada por algunas sustancias producidas por las bacterias que destruyen total o parcialmente los eritrocitos del medio. Hay dos tipos de hemlisis,
los cuales se discuten en detalle en el Captulo 8:
TIPO DE HEMLISIS
SE OBSERVA
Alfa
Un halo verde
Beta
Un halo claro, del color del medio
87
Staphylococcus aureus: colonias grandes (1 a 2 mm de dimetro), pueden o no

ser hemolticas (no importante), a veces presentan pigmento amarillo. Coloracin
de Gram: cocos gram-positivo, bien redondos, agrupados en racimos. Identificar
con dos pruebas especficas descritas en el Captulo 8: coagulasa y manitol-sal.
Inocular prueba de susceptibilidad con discos de antibiticos para gram-positivo
segn la tabla del captulo correspondiente. Staphylocccus epidermidis (coagualasa y
manitol-negativos). Generalmente es contaminante. Tomarlo en cuenta y reportar
slo si est presente en cantidad significativa y en cultivo puro.
Streptococcus pyogenes: colonias pequeas (1 mm o menos), la hemlisis es
beta, sta caracterstica es muy importante. Coloracin de Gram: cocos gram-positivo ligeramente alargados y agrupados en cadenas cortas o parejas. Identificacin
especfica: ver prueba de inhibicin por disco de bacitracina en prximo captulo.
Streptococcus sp. alfa hemoltico, slo debe tomarse en cuenta si se presenta en
conteos altos y en cultivo puro.
9.
Si no se observa ningn crecimiento a las 24 horas de incubacin, descarte las cajas y reporte as los urocultivos negativos:
CLAVE:
TEXTO:
N-24
Urocultivo negativo a las 24 horas de incubacin a 36 C.
No se debe perder tiempo y esfuerzo en reincubar los urocultivos rutinarios

hasta las 48 horas, porque las bacterias cuasantes de infeccin urinaria son aerobios
de crecimiento rpido. En casos especiales pueden efectuase urocultivos para
anaerobios, hongos o micobacterias.
INFORME:
Deben establecerse los siguientes criterios para reportar o no los crecimientos
de los urocultivos as:
88
UFC/ml
CRITERIO PARA REPORTAR
10,000 - 10,000 *
Negativo a las 24 horas de incubacin a 36 C
10,000 - 50,000
Sugerir repetir cultivo. Revisar condiciones de toma de muestra y

correlacin de leucocitos en el sedimento urinario.
50,000 - 100,000
Se aisl _________ , _____ ,000 UFC/ml. S/A (reportar el nmero

de UFC contado y la especie bacteriana con su S/A).
100,000 o ms
Se aisl_________ , ms de 100,000 UFC/ml. Infeccin urinaria verdadera de acuerdo con el criterio de Kass. S/A.
*30 a 50 por ciento de mujeres con infeccin vesical y/o uretral con disuria,
urgencia y frecuencia (sndrome uretral agudo) no llenan el criterio de Kass.
En estos casos, 100 UFC/ml de orina debe ser el lmite para hacer diagnstico
correcto, en asociacin ntima con el mdico tratante. (Segn Jacobo Sabbaj K.,
VI Congreso Centroamericano de Microbiologa, Guatemala, 5-9 de diciembre de
1983).
DETECCIN DE BACTERIURIA POR LA COLORACIN
DE GRAM DE ORINA NO CENTRIFUGADA:
En aquellos laboratorios en donde no es posible efectuar urocultivo, este mtodo fcil y barato lo sustituye. La coloracin de Gram de orina puede detectar
tanto la presencia de bacterias como de leucocitos. Proceder as:
1.
En un porta-objetos de vidrio (limpio) colocar 10 l (una gota) de orina

no centrifugada bien mezclada.
2.
Dejar secar al aire, fijar con calor, marcar por detrs con un crculo de
crayn graso y colorear cuidadosamente con Gran.
3.
Observar con aceite de inmersin.
4.
Informar la cantidad de bacterias por campo en inmersin.
5.
La presencia de una o ms bacterias por campo de inmersin correlaciona

bien con un urocultivo mayor o igual a 100,000 UFC/ml (criterio de
Kass).
89
6.
La presencia de muchas clulas epiteliales (citoplasma grande y claro,

ncleo pequeo) y diferentes tipos de bacterias indican contaminacin
y el examen debe repetirse.
90
CAPTULO 8
CULTIVO DE GARGANTA
PROPSITO
El cultivo de garganta, se efecta para demostrar la presencia de Streptococcus
pyogenes (Streptococcus que pertenece al grupo A de Lancefield y es beta hemoltico).
No debe llamarse orocultivo, pues este trmino significa literalmente cultivo de
boca. Algunas otras bacterias mucho menos importantes en infecciones de la faringe,
son:
Haemophilus influenzae
Klebsiella pneumoniae
Otras enterobacterias
Estos microorganismos slo deben reportarse si predominan sobre la
microbiota normal de la garganta, que es abundante y muy variada.
Streptococcus agalactiae del grupo B y los estreptococos de los grupos C, F y G
de Lancefield tambin son beta hemolticos (generalmente presenta poca hemlisis
beta). Pueden ser agentes etiolgicos de faringitis, por lo que debe identificarse
adecuadamente.
Los sntomas frecuentemente asociados a infecciones de la faringe por
Streptococcus pyogenes son: dolor de garganta, ganglios linfticos del cuello agrandados, dolor de cabeza, nusea, vmitos y dolor abdominal. La infeccin de la
faringe causada por virus provoca tos, secrecin nasal y nariz tapada. Sin embargo,
con mucha frecuencia no es posible establecer diagnstico slo en base a observaciones clnicas.
MUESTRA:
No es necesario que el paciente est en ayunas; sin embargo, conviene dejar
pasar 1 a 2 horas para que se vuelva a formar la secrecin que fue deglutida. Debe
tomarse siempre antes de iniciar el tratamiento con antibiticos. El cultivo de
garganta debe tomarse con sumo cuidado. Es indispensable examinar bien las le-
91
siones en la garganta del paciente en el laboratorio para tomar la muestra del lugar
preciso. Siga al pie de la letra las siguientes instrucciones:
1.
Colocar al paciente sentado y pedirle que trague saliva fuertemente dos

veces.
2.
Pedir al paciente, viendo hacia arriba que abra la boca, saque la lengua y
diga aahh.
3.
Con un bajalenguas, presionar fuertemente la lengua hacia abajo y

simultneamente iluminar bien el fondo de la garganta (detrs de la
vula o campanilla), con una lmpara porttil de bateras o flash light.
4.
Localizar en el fondo de la garganta y en las amgdalas (que se encuentran a los lados), las siguientes lesiones:
Inflamacin (enrojecimiento)
Pus (secrecin blanquecina o amarillenta)
lceras blanquecinas
5.
Con un hisopo estril frotar firmemente las lesiones con sumo cuidado
de no tocar la lengua, la campanilla, la pared interna de los carrillos
(cachetes) o los labios, al retirar el hisopo.
PROCEDIMIENTO:
1.
Inocular inmediatamente una caja (o placa) de agar sangre de carnero

al 5%; hacer dos cortadas en el agar durante la siembra. Las cortadas
deben ser aproximadamente de 1 cm de largo y el asa debe llegar al
fondo de la caja; orientar las cortadas de la orilla de la caja al centro. En
este caso no flamear el asa entre cada estra (ver figura 9, pg. 90). El
propsito de las cortadas es introducir las bacterias dentro del agar para
alejarlos del oxgeno atmosfrico y as incrementar la hemlisis tipo beta.
Anteriormente se acostumbraba enriquecer previamente por 2 horas en
caldo Todd-Hewitt, pero los resultados indican que no vale la pena.
2.
Con el objeto de obtener cultivos evidentes de Streptococcous pyogenes,

sin necesidad de hacer sub-cultivos, proceder as:
Con pinza flameada y fra, colocar en la zona de ms fuerte
inoculacin en el agar sangre de carnero (primera estra), un disco
de 30 mcg de neomicina. A unos 8-10 mm de distancia, colocar un
92
disco de 0.04 unidades de bacitracina. Streptococcus pyogenes y

Streptococcus pneumoniae son resistentes al antibitico neomicina,
por lo que crecen en cultivo casi puro alrededor de este disco. Como
el disco de bacitracina (tambin llamado taxo A) se encuentra muy
cerca frecuentemente puede acelerarse la identificacin presutiva.
Las colonias que crecen alrededor del disco de neomicina (N-30)
pueden usarse para hacer sub-cultivos y antibiogramas (segn:
Maxted, W. R.: J. Clin. Path. 6: 224, 1953).
Este mtodo sencillo que clarifica la interpretacin, puede aplicarse para facilitar el aislamiento, y efectuar la identificacin
presuntiva rpida de Streptococcus pneumoniae.
3.
Introducir la caja en un frasco de vidrio de boca ancha, poner en el fondo una toalla de papel hmeda, colocar la caja con el medio arriba y
luego introducir sobre una tapa de caja de Petri una veladora o candela
corta encendida. Cerrar el frasco bien, sellarlo con masking-tape. La
vela se apagar sola. Es conveniente aplicar (una vez a la semana) un
poco de cera a la boca del frasco y a la rosca interna de la tapadera, para
que sellen bien.
4.
Incubar por 18 a 24 horas a 36 C. Es indispensable el uso del jarro con

candela y humedad, para obtener reacciones hemolticas correctas. Si
no se usa, la recuperacin de Streptococcus pyogenes ser mucho menor.
El propsito de usar sangre de carnero en el medio, es aumentar la beta

hemlisis caracterstica e inhibir a Haemophilus haemolyticus que puede confundirse
con Streptococcus pyogenes. Con sangre de carnero se obtiene una excelente diferenciacin entre alfa y beta hemlisis, entre otras ventajas (ver pg. 103).
Evitar el uso de sangre humana vencida de banco de sangre en todos los cultivos bacteriolgicos ya que puede ser inhibitoria al crecimiento bacteriano por
contener anticoagulantes, anticuerpos o antibiticos, adems del peligro potencial
de la transmisin del virus del SIDA, hepatitis B, etc.
No hacer frotes Gram directos de faringe, pues su interpretacin es muy difcil debido a lo abundante de la microbiota y no tiene significado clnico.
93
Fig. 9 MARCHA BACTERIOLGICA PARA CULTIVO

DE GARGANTA/EXUDADO FARNGEO
1.
Muestra: Tomar un
hisopo farngeo con
buena luz y bajalenguas
vula
Amgdala
Farnge
posterior
2. Inocular una caja de agar sangre de carnero por estras, con dos cortadas
de 1 cm, sin flamear entre cada estra
3. Colocar sobre la primera estra, un disco de bacitracina de 0.04 unidades
y un disco de 30 mcg de neomicina, separados 8-10 mm entre s
4. Incubar en jarro con candela y humedad a 36o C
Cortada 1
Disco de bacitracina
Disco de neomicina
A
N
30
Cortada 2
5. Despus de 18-24 horas de incubacin, interpretar con buena luz. Buscar

e identificar colonias beta hemolticas
94
INTERPRETACIN:
La microbiota de la faringe es sumamente variada; predominan Streptococcus
sp. alfa hemolticos (hemlisis verde) llamados por esta razn grupo viridans y
neisserias no patgenas. Estos grupos bacterianos nunca deben reportarse.
Con el objeto de no perderse en la interpretacin de este cultivo, que siempre
presenta muchos tipos de colonias, utilice los siguientes criterios:
1.
Tener presente que el patgeno ms importante es Streptococcus pyogenes

que es beta hemoltico. Tomar la caja de agar sangre de carnero con la
mano izquierda entre los dedos pulgar y medio sosteniendo por detrs
de la caja con el dedo ndice.
2.
Con una lupa en la mano derecha examinar cuidadosamente la caja con

buena luz transmitida (por detrs), segn la foto. En primer lugar notar
si hay o no hemlisis beta (clara) en las cortadas (ver fotografa en la
portada de este manual). Si la hay, buscar con cuidado colonias separadas beta hemolticas pequeas y brillantes, sospechosas de Streptococcus
pyogenes. Aunque slo se observe una de estas colonias, debe tomarse
en cuenta.
3.
Con una asa recta estril y siguiendo la tcnica ilustrada en la figura 6,

pg. 46, trasladar una sola colonia tpica al centro de otra caja de agar
sangre de carnero. Slo tocar la superficie del medio rotando el asa (no
pinchar el medio). Luego con una asa en argolla estriar en tres direcciones opuestas y luego colocar con pinzas estriles en el centro del
inculo un disco de bacitracina de 0.04 unidades (taxo A, o disco B
segn la marca). La bacitracina es un antibitico originalmente aislado
de Bacillus licheniformis. La prueba presuntiva de la inhibicin selectiva por este antibitico tiende a ser sustituida por otras pruebas. Sin
embargo, se sigue usando debido a su facilidad y alto porcentaje de
exactitud.
4.
Si las colonias beta hemolticas no estn aisladas, hacer una purificacin as: con una asa recta o aguja de diseccin flameada, tomar las colonias beta hemolticas con cuidado, aunque se tome de otras colonias
que estn muy cercanas o adyacentes. De preferencia hacer esto bajo el
microscopio estereoscpico. Trasladar el inculo dos o tres veces a un
extremo de una caja de agar sangre de carnero y luego con dos asas en
95
anillo, estriar en toda la caja con dos cortadas, al igual que el cultivo
inicial. Colocar con pinzas estriles un disco bacitracina en el inicio de la
segunda estra.
5.
Tipo de hemlisis
Apariencia de halo
Alfa
Verde (incompleta)
Beta
Claro, del color del medio (completa)
6.
Para interpreter correctamente los crecimientos de cultivos de exudados

farngeos memorizar esta tabla:
Interpretar resultados slo para Streptococcus beta hemolticos as:
Inhibicin por disco de bacitracina
Reportar
+ (si produce halo),

ver foto abajo
* Se aisl Streptococcus pyogenes beta

hemoltico del grupo A de Lancefield.
- (no inhibicin)
Streptococcus sp. beta hemoltico no del

grupo A de Lancefield (hacer prueba de CAMP).
La inhibicin por el disco de bacitracina identifica a S. pyogenes con 95% de certeza. Cualquier
dimetro de halo de inhibicin se considera significativo. Efectuar simultneamente susceptibilidad a un disco de trimetoprim-sulfametoxazol; S. pyogenes es resistente a este antibitico, lo que
aumenta la certeza de la identificacin, junto con la prueba de CAMP negativa (tcnica adelante).
Interpretacin, con buena

luz transmitida por detrs
del sub-cultivo en agar
sangre de carnero.
Se observa el halo de inhibicin del crecimiento
alrededor del disco de
bacitracina (halo oscuro
sin hemlisis).
96
7.
8.
Aparte de las causadas por Streptococcus pyogenes, son raras las infecciones de la garganta ocasionadas por otras bacterias. Reportar las bacterias que se citan a continuacin solamente cuando predominan por encima de la microbiota normal. Examinar la ltima estra que presenta
colonias separadas. Con mucho cuidado y con lupa, observar si hay ms
colonias que Streptococcus sp. alfa hemoltico y Neisseria sp., de:
Streptococcus pneumoniae (neumococo): coco gram-positivo ovalado o lanceolado, agrupado en parejas. Colonias alfa hemolticas
aplanadas o ligeramente mucosas (debido a la presencia de cpsula). Al pasarlo a otro agar sangre de carnero es inhibido por el
disco de optoquina Taxo P o Disco N). Ver tabla adelante en
nmero 8. Esta bacteria es parte de la microbiota normal de la garganta, en bajas concentraciones.
Staphylococcus aureus: coco gram-positivo esfrico, en racimos,

coagulasa positivo; crecimiento amarillo en agar manitol-sal. No
causa frecuentemente faringitis como errneamente se cree.
Enterobacterias: principalmente Klebsiella sp., Enterobacter sp. y

Escherichia coli.
Pseudomonas aeruginosa: bacilo gram-negativo aerobio, colonias

grandes, generalmente beta hemolticas con pigmento verdoso y olor
caracterstico. TSI/LIA no viran (no fermentador), y el pigmento
que se nota en la superficie del crecimiento fluorece bajo la luz
ultravioleta.
Haemophilus influenzae: bacilo gram-negativo muy corto y fino,

pleomrfico (es decir formas cocobacilares y formas largas juntas).
Crece en agar chocolate con jarro con candela y en agar sangre de
carnero colonias muy pequeas slo alrededor de colonias de
Staphylococcus aureus, a lo que se llama satelitismo.
Para diferenciar en cultivo de garganta o en cualquier otro cultivo

bacteriolgico (L.C.R., hemocultivo, esputo, secreciones oculares, etc.)
las colonias alfa hemolticas planas que crecen en el agar sangre de
carnero, memorizar esta tabla:
97
Inhibicin por disco de optoquina
Informar
+ (presencia de halo)*
Se aisl Streptococcus pneumoniae
- (no inhibe)
Streptococcus sp. alfa hemoltico **
Si se usa un disco impregnado de optoquina de 6 mm de dimetro, se considera significativa una

zona de inhibicin slo si es mayor de 14 mm de dimetro.
**
En cultivo de garganta es microbiota normal, no informarlo.
9.
El cultivo de garganta negativo es aquel que:

no presenta colonias beta hemolticas
no presenta beta hemlisis en las cortadas
no predomina ninguna de las bacterias citadas
el crecimiento consiste principalmente de colonias alfa hemolticas no
aplanadas y pequeas colonias amarillentas que se desprenden fcilmente del agar con el asa (Neisseria, Branhamella.)
Informar cultivos de garganta negativos as:

Clave
Informar
NP
(en libro de registro)
No se aislan patgenos, desarrollan bacterias de

la microbiota normal.
10.
En la garganta pueden existir Streptococcus sp. beta hemolticos no del

grupo A de Lancefield. A los Streptococcus pyogenes del grupo A de
Lancefield no se les debe hacer prueba de susceptibilidad, ya que por lo
general son muy susceptibles a la penicilina que es el antibitico de eleccin. Por el contrario, a los Streptococcus sp. beta hemolticos no del grupo A de Lancefield s debe efectuarse prueba presuntiva de susceptibilidad a la penicilina, con un disco del antibitico en agar sangre de
carnero. Adems, debe hacerse la prueba de CAMP para Streptococcus
sp. beta hemolticos no del grupo A de Lancefield. Existen procedimientos de agrupamiento serolgico, los cuales pueden usarse dependiendo de los recursos del laboratorio.
98
ETIOLOGA Y SINTOMATOLOGA DE INFECCIONES

RESPIRATORIAS SUPERIORES
SIGNOS Y SNTOMAS
Sinusitis/Rinitis:
BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA

Cefalea
Streptococcus pyogenes (grupo A)
Dolor/eritema en regin malar
Rayos-X: Consolidacin, nivel

de lquido, engrosamiento de la
pared de los senos
Klebsiella spp. y otras enterobacterias
Bacteroides spp. y otros anaerobios (sinusitis)
Garganta y faringe:
Streptococcus pyogenes (grupo A)
Eritema y edema de mucosas
Corynebacterium diphtheriae
Pus en amgdalas
Pseudomembranas
Bordetella pertussis
Edema de la vula
Lengua con cubierta griscea
Linfadenitis cervical
IDENTIFICACIN PRESUNTIVA DE Streptococcus agalactiae

(GRUPO B). PRUEBA DE CAMP:
1.
Esta bacteria es resistente al disco de 0.04 unidades de bacitracina. Es

indispensable contar con agar sangre de carnero al 5% para hacer la
prueba de CAMP. En una caja de este medio hacer con el asa en argolla
una estra recta a lo largo de toda la caja con una cepa de Staphylococcus
aureus productor de doble zona de beta hemlisis.
2.
Luego con sumo cuidado, hacer una estra con el Streptococccus beta
hemoltico a identificar, perpendicular a la estra de S. aureus pero que
no la toque (A). Generalmente S. agalactiae presenta un halo pequeo de
hemlisis beta, el cual puede disminuir al sub-cultivar.
3.
Incubar en jarro con candela y humedad de 18 a 24 horas a 36 C. Interpretar como Streptococcus agalactiae del grupo B de Lancefield si se
produce una flecha de intensa beta hemlisis que apunta hacia la estra de Staphylococcus aureus (B).
99
Fig. 10 SIEMBRA E INTERPRETACIN DE LA PRUEBA DE CAMP
Strepto.
Strepto.
Flecha
Staph.
Staph.
A. Siembra prueba de CAMP
B. Flecha de beta hemlisis indica

B: prueba de CAMP positiva
4.
Hacer la prueba con un control positivo (cepa conocida de S. agalactiae)

y un control negativo (cepa conocida de S. pyogenes). Estas cepas control
y la cepa de S. aureus de doble zona de beta hemlisis, deben conservarse suspendiendo masivamente cultivos puros en aproximadamente 3
ml de sangre de carnero pura, en tubos estriles y congelar.
5.
Streptococcus agalactiae es un agente etiolgico de vaginitis y meningitis

neonatal, por lo que tambin debe buscarse cultivando en agar sangre
de carnero al 5% las secreciones vaginales y lquidos cefalorraqudeos.
100
Tomado de:
CARACTERSTICAS FSICAS, HEMATOLGICAS

Y QUMICAS DE LA SANGRE DE CARNERO
Miguel F. Torres, Q.B., M.A.
La sangre desfibrinada y estril de diversos animales, se ha utilizado

desde el siglo XIX como enriquecimiento para el cultivo de diversas bacterias
patgenas. El agar sangre como se utiliza hoy en da, fue introducido por
primera vez en Francia en 1903, por Bezanon y Griffon. Posteriormente en
1919, Brown demostr la exactitud de la sangre ovina para clasificar al gnero Streptococcus segn el tipo de hemlisis.
En vista de la comprobada utilidad de la sangre de carnero en la bacteriologa del Laboratorio Clnico actualizado, es conveniente conocer las caractersticas de la sangre en la especie Ovis aries (oveja/carnero). Para este
propsito, debe compararse con la sangre humana.
La revisin de literatura especializada, indica que el peso especfico,
viscosidad relativa, presin osmtica y punto de congelacin son idnticos a
la sangre humana.
Las principales caractersticas hematolgicas de la sangre de carnero
completa, son: hemoglobina 9-15 g/dl (promedio: 11.5); hematocrito 27-45%
(promedio: 35); glbulos rojos 9-l5 millones/mm3 (promedio: 12); leucocitos
101
4,000-12,000/mm 3 (promedio: 8,000); linfocitos 62%; velocidad de

sedimentacin 0.5 mm/hr. Los valores de hemoglobina y hematocrito disminuyen con la edad y se elevan cuando el animal est excitado.
Los glbulos rojos ovinos son ms pequeos que los humanos. La membrana celular de los pequeos eritocitos de carnero es muy susceptible a la
accin de las hemolisinas bacterianas. Esto es especialmente cierto en el caso
de las estreptolisinas O y S de Streptococcus pyogenes. Esta caracterstica aunada a su fragilidad ligeramente mayor en comparacin a los eritrocitos humanos, hace que los eritrocitos ovinos sean excelentes indicadores de hemlisis
in vitro.
La sangre de carnero presenta velocidad de sedimentacin mucho menor en comparacin con la sangre humana. Esta caracterstica es deseable, ya
que los eritrocitos de la sangre desfibrinada, suspendidos en su propio suero
y almacenados en refrigeracin durante menos de 21 das, no se compactan
tanto como en el caso de la sangre humana. Esto permite que se preserven
mejor.
Se sabe que el aumento de glucosa en el suero de la sangre desfibrinada
utilizada para enriquecer medios de cultivo slidos, es inversamente proporcional al dimetro de los halos de hemlisis. Por este motivo su bajo contenido de glucosa es la caracterstica bioqumica que hace a la sangre ovina ideal
para demostrar los amplios y tpicos halos de hemlisis alrededor de las colonias productoras de hemolisinas. Los valores normales se encuentran en el
rango de 30 a 57 mg/dl.
El resto de los valores qumicos es muy similar a la sangre humana,
excepto en el caso del cido rico, que es muy bajo en los carneros. El rango
normal de esta sustancia oscila entre 0.05 y 1.9 mg/dl.
Tomado de:
POR QU SANGRE DE CARNERO

EN EL LABORATORIO CLNICO?
Por Miguel F. Torres, QB, MA. Guatemala, 1992.
102
VENTAJAS DEL USO DE LA SANGRE DE CARNERO

EN EL LABORATORIO CLNICO
La palabra hemlisis deriva del griego (haima=sangre) y
(lysis=disolver). Se refiere a la accin de ciertas bacterias sobre los glbulos
rojos. La ruptura eritroctica la provocan toxinas proticas llamadas por su
efecto hemolisinas. Muchas bacterias producen hemolisinas, pero probablemente la nica que provoca hemlisis in vivo sea la toxina alfa de Clostridium
perfringens, la cual es una alfa lecitinasa que causa lisis de la lipoprotena de la
membrana celular del eritrocito humano (aparte de la hemlisis causada por
anticuerpos o drogas en presencia de complemento).
En Streptococcus pyogenes, una citolisina thiol-activada, llamada
estreptolisina -O (oxgeno lbil), altera la permeabilidad de la membrana
eritroctica al unirse con el colesterol. Esto provoca destruccin completa de
los eritrocitos, y su efecto macroscpico es llamado hemlisis beta. La
estreptolisina -S (oxgeno estable) tambin causa hemlisis beta en presencia
de oxgeno en la superficie del agar sangre. Las reacciones hemolticas, as
como los crecimientos bacterianos tpicos y exuberantes, son fundamentales
en el diagnstico bacteriolgico. Debe usarse sangre de carnero para preparar
el agar al 5% y obtener las siguientes ventajas tcnicas:
1
2
3
Debido a que los eritrocitos de la especie Ovis aries (carnero: macho, oveja: hembra y cra: cordero) son sumamente susceptibles a
la accin de las hemolisinas bacterianas, se incrementan considerablemente las hemlisis de tipo beta.
Se evitan reacciones hemolticas dudosas, que dificultan la interpretacin de los cultivos, pues en agar sangre de carnero se diferencian perfectamente las hemlisis verdosas de tipo alfa, de las
reacciones de hemlisis completa tipo beta.
En los cultivos de garganta es muy importante su uso, pues la sangre de carnero por su bajo contenido de nucletidos de piridina
(factor V) es inhibitoria para Haemophilus haemolyticus, que produce colonias idnticas a Streptococcus pyogenes, por lo que evita
falsos positivos.
103
4
5
La sangre de carnero desfibrinada aspticamente, no contiene

anticoagulantes (como la sangre vencida de Banco), ni anticuerpos
contra las bacterias patgenas del hombre o antibiticos, por lo
que en general permite mejores crecimientos.
Se evita manipular volmenes considerables de sangre humana,
por lo que se anula el riesgo de contraer SIDA, hepatitis B y otras
infecciones humanas, durante la preparacin del agar sangre.
Referencia:
Torres, M.F. 1986. Estandarizacin de la Bacteriologa Mdica en Guatemala
(Conferencia magistral). En: Memorias, III Congreso Nacional de
Microbiologa, pgina 20. Guatemala 2-6 diciembre.
104
CAPTULO 9
CULTIVOS DE GARGANTA ESPECIALES
PROPSITO:
Demostrar por medio de cultivo la presencia de dos bacterias que solamente
deben investigarse en casos especiales y justificados:
1.
Corynebacterium diphtheriae: es la bacteria causante de la difteria. Debe

investigarse solamente en pacientes cuya sintomatologa clnica es compatible con esta infeccin. Los sntomas de la difteria larngea son: formacin de pseudo-membranas (pellejos) de color gris en la garganta,
que sangran mucho al desprenderse, fiebre y el paciente se encuentra
severamente intoxicado (debido a la potente toxina que produce la bacteria). Actualmente en Latinoamrica la difteria es muy rara, debido
a la efectividad de la vacuna llamada triple o DPT (difteria, pertusis,
ttanos).
2.
Neisseria meningitidis: es la bacteria causante de severa y muy contagiosa meningitis (infeccin de las membranas que cubren el cerebro), y por
lo tanto se investiga principalmente en lquido cefalorraqudeo. Su presencia debe investigarse por cultivo de garganta en parientes, mdicos,
enfermeras, o tcnicos de laboratorio que han estado en contacto directo
con pacientes (generalmente nios) con meningitis meningocccica. A
estas personas se les llama contactos. El propsito fundamental es
erradicar la bacteria de la garganta de los contactos con tratamiento
antibitico adecuado, para evitar la diseminacin de la infeccin que
puede llegar a ser epidmica.
INVESTIGACIN DE Corynebacterium diphtheriae:
MUESTRA Y PROCEDIMIENTO:
El diagnstico de la difteria es primordialmente clnico. De ninguna manera
es aceptable que el mdico delegue esta responsabilidad en el laboratorio de
microbiologa, por medio de un frote de exudado farngeo coloreado con Gram.
C. diphtheriae es un bacilo gram-positivo en forma de maza (un extremo ms
105
ancho que otro). En el frote Gram de material tomado directamente de las

pseudo-membranas de la garganta. No puede diferenciarse de otros difteroides
de igual morfologa.
Proceder a tomar la muestra as:
1.
Debe contarse con buena iluminacin (lmpara porttil de mano), para

poder examinar bien la garganta. Deprimir la lengua con bajalenguas
de madera estril, y buscar reas necrticas o grisceas (pseudo-membranas). Con un hisopo estril, frotar firmemente las lesiones descritas.
Retirar el hisopo de tal manera que no toque las paredes internas de los
carrillos, ni la lengua.
2.
Inocular con el hisopo, un tubo de medio inclinado de Loeffler (suero

animal ms caldo glucosado, coagulado). Este medio debe ser color crema plido. Incubar aerbicamente a 36 C durante 18 a 24 horas.
3.
Tomar de nuevo muestra con otro hisopo, e inocular una caja de agar
chocolate-telurito de potasio. Incubar aerbicamente a 36 C por 18 a 24
horas.
4.
Tomar un tercer hisopo de las pseudo-membranas, e inocular directamente una caja de agar sangre de carnero al 5%, con cortadas, para investigar la presencia de Streptococcus pyogenes. Incubar en jarro hmedo
con candela a 36 C.
El objeto del medio de Loeffler es permitir que C. diphtheriae crezca ms
abundantemente que la microbiota de la garganta, slo durante las primeras
ocho horas de incubacin, y sobre todo con su morfologa tpica.
Proceder as:
1.
Despus de incubar el tubo de Loeffler solamente de dos a ocho horas a

36 C, preparar dos frotes del leve crecimiento. Al efectuar los frotes,
tratar de remover lo menos posible el escaso crecimiento al suspenderlo
en una pequea gota de agua, pues es necesario preservar la forma de
agrupacin tpica de C. diphtheriae.
106
2.
Colorear un frote con Gram. Fijar el otro frote con calor leve a la llama, y
teirlo un minuto con azul de metileno de Ziehl-Neelsen.
3.
Buscar en el frote Gram: bacilos gram-positivo pleomrficos y en forma

de maza. Se agrupan en forma de letras chinas o en ngulos en forma
de V o Y. No se agrupan en empalizadas (paralelos) como otros
difteroides.
4.
En el frote coloreado con azul de metileno, se observa el mismo tipo de

agrupacin y adems coloracin discontinua en forma de bandas azules causada por los corpsculos metacromticos de polimetafosfato, que
son reservas alimenticias de la bacteria.
5.
Despus de 18 a 24 horas de incubacin, C. diphtheriae forma en el medio

agar chocolate-telurito colonias de color negro intenso. Un frote Gram
de estas colonias revela bacilos gram-positivo pleomrficos. No descartar como negativo antes de 48 horas de incubacin. Si la morfologa de
las colonias negras no es muy tpica en el agar chocolate-telurito, pero si
las hay en el Loeffler, hacer un pasaje de una asada del crecimiento en
Loeffler a otra caja de chocolate-telurito para confirmar.
6.
C. diphtheriae es catalasa y nitratos positivo. Para efectuar estas pruebas,

subcultivar las colonias negras del chocolate-telurito, a agar sangre de
carnero. Al obtener cultivo puro con morfologa compatible en Gram,
suspender sobre un porta objetos una asada del crecimiento en una gota
de agua oxigenada, y observar la aparicin de burbujas de oxgeno. Debe
tenerse la precaucin de tomar solamente del crecimiento y no del medio de cultivo, pues sangre o suero dan reacciones positivas falsas de
catalasa. La prueba de reduccin de nitratos a nitritos, puede hacerse en
caldo nitratado, si se cuenta con l y los reactivos necesarios, pero no es
indispensable.
INFORME:
1.
Si la morfologa del crecimiento en Loeffler (incubado slo de 2 a 8 horas) es muy tpica, y no se cultiv en chocolate-telurito, informar:
Se aisl un bacilo gram-positivo, de morfologa compatible con
Corynebacterium diphtheriae.
107
2.
Si la morfologa microscpica del crecimiento en Loeffler es tpica y hay

colonias negras en chocolate-telurito, reportar:
Se aisl Corynebacterium diphtheriae. Identificacin preliminar,
pendiente de demostrar la produccin de toxina in vitro o in vivo.
INVESTIGACIN DE Neisseria meningitidis

EN CULTIVOS DE GARGANTA DE CONTACTOS:
MUESTRA Y PROCEDIMIENTO:
Neisseria meningitidis sobrevive pobremente en el medio ambiente y su nico
hospedero es el hombre, por lo tanto los portadores humanos son el principal
reservorio. La transmisin ocurre por contacto directo con secreciones respiratorias, o por pequeas gotas suspendidas en el aire, que acarrean la bacteria. El porcentaje promedio de portadores de N. meningitidis en la orofaringe y nasofaringe es
de 5 a 15 por ciento, y usualmente slo durante algunas semanas en cada individuo. En un pequeo porcentaje de personas, la bacteria se disemina de la nasofaringe
hasta el torrente circulatorio, y produce meningococcemia, meningitis, o ambas.
Adems de los sntomas de meningitis, en el 75 por ciento de los casos, hay profundos efectos vasculares, que provocan petequias o exantema purprico, lo que ayuda al diagnstico clnico, que debe ser confirmado siempre por Bacteriologa.
El cultivo de garganta/nasofaringe para el aislamiento de N. meningitidis, debe
obtenerse exclusivamente de contactos (personas que han tenido contacto directo con algn paciente en el cual se ha demostrado la presencia de la bacteria en su
lquido cefalorraqudeo). Se logra mayor porcentaje de aislamientos si la muestra
se obtiene de la nasofaringe en lugar de la garganta. De ninguna manera es un
procedimiento de rutina.
Proceder as:
1.
Con hisopo estril y buena iluminacin, frotar firmemente el fondo de

la garganta. Si es posible, usar un hisopo largo y curvo, que llegue lo
ms profundo posible. Con otro hisopo delgado y curvo, tomar muestra
de la nasofaringe (por la nariz).
2.
Con cada hisopo por separado, inocular un tubo del medio ThayerMartin; estriar bien la superficie del medio con el mismo hisopo.
108
3.
Introducir los tubos, con el tapn de rosca ligeramente flojo, dentro

de un jarro con candela encendida y humedad. Incubar por 18 a 24
horas a 36 C.
INTERPRETACIN:
1.
Despus del perodo de incubacin, observar el crecimiento de colonias

pequeas, grises, brillantes y ligeramente mucosas.
2.
Con el asa en hilo, y con mucho cuidado, hacer un pequeo frote Gram
de las colonias sospechosas; deben observarse diplococos gram-negativo en forma de granos de caf, agrupados en parejas.
3.
Para obtener un cultivo puro, subcultivar las colonias que presentan esta
morfologa microscpica a una caja de agar chocolate (sin inhibidores),
e incubar en jarro con candela por 18 a 24 horas.
4.
Efectuar la prueba de oxidasa, ya sea agregando el reactivo directamente sobre la caja, o frotar las colonias con palillo de madera sobre discos
hmedos con el reactivo de oxidasa. La aparicin de coloracin morado
oscuro-negro, indica una prueba positiva. Si este es el caso, proceder a
efectuar la prueba de oxidacin de maltosa y sacarosa, segn se indica
en el captulo de secreciones genitales. N. meningitidis oxida la maltosa,
pero no la sacarosa (sucrosa). Neisseria lactomica que tambin crece en el
medio Thayer-Martin y tiene inters clnico, debe identificarse con la
oxidacin positiva de la lactosa.
5.
Desde el punto de vista epidemiolgico, es muy conveniente saber a

cual grupo pertenece el aislamiento (A,B,C,D,X,Y,Z, y otros). Por este
motivo, si el laboratorio no cuenta con los antisueros de tipificacin,
debe remitir el cultivo en agar chocolate (bien sellado) al laboratorio
nacional de referencia correspondiente.
INFORME:
Si todas las pruebas anteriores son positivas, y se est seguro que no se trata
de una Neisseria sp. o Branhamella catarrhalis, tan frecuentes en la microbiota normal de la garganta, informar: Se aisl Neisseria meningitidis.
Si se cuenta con los antisueros de tipificacin, realcela e informe:
Se aisl Neisseria meningitidis del grupo __. (segn el que haya aglutinado)
109
Fotografas
a
Color
111
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
116
31
32
FOTOGRAFAS
Foto 1. Listeria monocytogenes, en contraste de fases. Los bacilos aparecen incoloros y
brillantes . No es una coloracin, sta tcnica de observacin en fresco proporciona
excelente contraste. Foto: CDC, Atlanta, Georgia, EUA.
Foto 2. Listeria monocytogenes, coloracin de Gram. Aislamiento de lquido
cefalorraqudeo. Bacilos regulares de coloracin slida. Presentan el tpico color morado
negruzco las bacterias gram-positivo. Foto: Walter Reed Institute, Washington, D.C.,
E.U.A.
Foto 3. Staphylococcus aureus, coloracin de Gram de cultivo puro obtenido de secrecin
de herida infectada. Son cocos esfricos de una micra de dimetro, agrupados en forma
de racimos. Foto: Walter Reed Institute, Washington, D.C., E.U.A.
Foto 4. Streptococcus pyogenes, frote Gram de secrecin de oreja necrtica. Presenta
abundantes cocos gram-positivo pequeos y ligeramente ovalados, sueltos, en parejas
y cadenas cortas. Infeccin infantil mortal, Laboratorio de Microbiologa, Hospital
General del IGSS zona 9, agosto de 1982. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 5. Streptococcus pneumoniae, frote Gram de esputo purulento de paciente con
neumona lobar. Imagen tpica de esta bacteria: cocos gram-positivo agrupada en
parejas. Foto: Institut Pasteur, Pars, Francia.
Foto 6. Streptococcus pneumoniae, frote de sedimento de lquido cefalorraqudeo (LCR)
de paciente con meningitis grave. Presenta abundantes cocos gram-positivo ovalados;
se insina la cpsula como un halo claro difuso alrededor de las clulas. Aparecen dos
leucocitos polimorfonucleares (gram-negativo). Foto: Rubn Mayorga Peralta,
Guatemala.
Foto 7. Escherichia coli, frote Gram de cultivo puro obtenido de urocultivo positivo.
Bacilos gram-negativo, regulares, de coloracin slida y bordes redondeados. Esta
morfologa es tpica en las enterobacterias. Foto: Walter Reed Institute, Washington,
D.C., E.U.A.
Foto 8. Bacteroides fragilis, coloracin de Gram de cultivo puro. Presenta coloracin rojo
plido (tpica de los anaerobios gram-negativo) y pleomorfismo. Foto: Anaerobe
Laboratory, Virginia Politechnic Institute, Blacksbourg, E.U.A.
Foto 9. Shigella flexneri, Salmonella enteritidis y Escherichia coli en Agar Hektoen Enterics.
Este medio selectivo para bacilos gram-negativo, brinda buena diferenciacin. Las
colonias de bacterias lactosa-positivo como E. coli presentan color salmn; las lactosa-
117
negativo como Shigella spp. dan colonias puntiformes color verde plido. Las colonias
productoras de cido sulfhdrico como Salmonella spp. manifiestan color negro en la
colonia. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 10. Arizona hinshawii y Escherichia coli en MacConkey (izquierda) y Hektoen
(derecha). Cultivo mixto de miositis necrotizante severa en un paciente peditrico,
Hospital General del IGSS zona 9, 1982. Este cultivo semeja un coprocultivo positivo a
Salmonella enteritidis. En MacConkey las colonias lactosa-positivo son rojas y las lactosanegativo incoloras. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 11. Reacciones tpicas de Salmonella enteritidis en TSI/LIA. TSI (abajo): superficie
alcalina (rojo), fondo cido (amarillo, oculto por el precipitado negro), presenta
abundante gas (burbuja y fondo separado) y cido sulfhdrico (negro). El LIA (arriba)
es alcalino/alcalino (violeta), lo que indica descarboxilacin del aminocido lisina,
tambin presenta precipitado negro debido al cido sulfhdrico. Foto: CDC, Atlanta,
E.U.A.
Foto 12. Reacciones tpicas de Shigella flexneri en TSI/LIA. TSI (abajo): superficie alcalina
(rojo), fondo cido (amarillo), no presenta gas ni cido sulfhdrico. El LIA (arriba) es
alcalino/cido (K/A), sin gas ni cido sulfhdrico. En Shigella spp. frecuentemente el
color del fondo de ambos tubos es amarillo canario y el TSI huele a semen. Foto: Miguel
F. Torres, Guatemala.
Foto 13. Reacciones de tres enterobacterias en TSI. De izquierda a derecha: medio no
inoculado (K/K), Escherichia coli (A/A,++,-), Salmonella enteritidis (K/A, +,+++) y
Salmonella typhi (K/A,-,+poco). Foto: CDC, Atlanta, E.U.A.
Foto 14. Vibrio cholerae 01 en agar TCBS. Cultivo de heces de paciente guatemalteco con
clera enriquecido en agua peptonada alcalina (APA), luego sembrada en TCBS.
Colonias tpicas: grandes, aplanadas y amarillas (sacarosa-positivo). Foto: Miguel F.
Torres, Guatemala.
Foto 15. Efecto del enriquecimento de coprocultivo en APA para el aislamiento de
Vibrio cholerae 01. Izquierda: cultivo en TCBS de enriquecimiento en APA, muestra
crecimiento puro y masivo. Derecha: cultivo de heces sembradas directamente en TCBS,
sin enriquecimiento, presenta crecimiento ms escaso de cultivo mixto. Foto: Miguel F.
Torres, Guatemala.
Foto 16. Prueba de susceptibilidad segn el mtodo de Bauer-Kirby. El biotipo eltor de
Vibrio cholerae 01 es resistente al disco de 50 UI de Polimixina-B, que se observa en el
centro. Fotografa: Miguel F. Torres, previamente publicada en Torres, M. et al. 1991.
Etiologa y Diagnstico de Laboratorio de el Clera. OPS/OMS, Guatemala.
118
Foto 17. Urocultivo positivo a Klebsiella pneumoniae, ms de 100,000 UFC/ml, en agar

MacConkey sembrado con de 0.001 ml de orina con asa calibrada de platino. Muestra
colonias grandes y muy mucosas debido a la presencia de cpsula. Foto: Miguel F.
Torres, Guatemala.
Foto 18. Urocultivo positivo a Escherichia coli, ms de 100,000 UFC/ ml, en agar
MacConkey. Esta imagen es la ms frecuente en urocultivos positivos. Las incontables
colonias son rojas, brillantes y de bordes enteros. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 19. Streptococcus pyogenes, sub-cultivo sobre agar sangre de carnero al 5%, con un
disco de bacitracina. Este cultivo fu incubado en jarro hmedo con candela a 37 grados
centgrados por 24 horas. Se observa claramente la inhibicin del crecimiento provocada
selectivamente por este antibitico, como un halo rojo (sin destruccin de los eritrocitos
ovinos) alrededor del disco. En el crecimento de esta bacteria se observa intensa
hemlisis de tipo beta. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 20. Streptococcus pyogenes, prueba de CAMP negativa; siembra sobre agar sangre
de carnero. Las estras verticales de Staphylococcus aureus de doble zona de beta hemlisis
presentan crecimiento blanco. Las estras perpendiculares de varias cepas de S. pyogenes
son beta hemolticas, pero la hemlisis no se incrementa en forma de flecha donde el
crecimiento de ambas bacterias se acerca sin tocarse. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 21. Crecimiento de Streptococcus pneumoniae, cultivo de LCR en agar sangre de
carnero. Las colonias tpicas son pequeas, redondas, planas, de bordes enteros y
francamente alfa hemolticas. Las colonias jvenes son elevadas; a medida que el cultivo
envejece, las colonias se aplastan y su centro se deprime debido a la accin de enzimas
autolticas; esto no ocurre con otros estreptococos viridans.La tpica hemlis alfa se
incrementa al incubar en microaerofilia con jarro hmedo con candela. Foto: Miguel F.
Torres, Guatemala.
Foto 22. Sub-cultivo del crecimiento original de la foto anterior con disco de optoquina.
El halo de inhibin mayor de 14 mm de dimetro, identifica presuntivamente a
Streptococcus pneumoniae. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 23. Cultivo de esputo en agar sangre de carnero, de paciente guatemalteco con
neumona lobar causada por Streptococcus pyogenes. Las cepas muy virulentas que
poseen cpsula gruesa, presentan colonias mucosas como las de ste caso. Las colonias
confluentes presentan la tpica hemlisis tipo alfa. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 24. Sub-cultivo del crecimiento mucoso de la foto anterior, con un disco de
optoquina. Se observa un amplio halo de inhibicin del cultivo por el hidrocloruro de
119
etil cuprena (optoquina, derivado de la quinina). Las cepas mucosas dan tambin las
reacciones tpicas de inhibicin y alfa hemlisis. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 25. Haemophilus influenzae, prueba de satelitismo de sub-cultivo de aislamiento de
LCR. Paciente guatemalteco de un ao con meningitis mortal. H. influenzae crece slo
muy cerca de la estra de Staphylococcus aureus. En el agar sangre de carnero el factor V
(nucletidos de piridina o nicotinamida adenina dinucletido) se encuentra dentro de
los eritrocitos, el factor X (hemina) s se encuentra libre en el medio. S. aureus libera
factor V, por lo que causa satelitismo de ciertos Haemophilus spp. Foto: Miguel F. Torres,
Guatemala.
Foto 26. Shigella dysenteriae tipo 1 (Bacilo de Shiga). Prueba de susceptibilidad segn el
mtodo de Bauer-Kirby, de una cepa aislada en INCAP (Instituto de Nutricin de
Centroamrica y Panam, Guatemala) durante la epidemia de shigellosis 1969-70. Foto:
Leonardo J. Mata, Costa Rica.
Foto 27. Demostracin del mtodo para preparacin de frotes de esputo entre dos portaobjetos. M. Torres y sus estudiantes en el curso Bacteriologa II, Laboratorio de
Microbiologa, Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia, USAC, 1979. Foto: annima.
Foto 28. Mycobacterium tuberculosis en frote de esputo coloreado con la tcnica de ZiehlNeelsen. Los bacilos alcohol-cido resistentes aparecen teidos de color rojo. La
coloracin de Kinyoun da los mismos resultados. Foto: Gillies R.R. y T.C. Dodds,
Inglaterra.
Foto 29. Colonias de Mycobacterium tuberculosis, acercamiento con microscopio
estereoscpico. Este tipo de colonias rugosas y de bordes irregulares, son llamadas
eugnicas. No presentan pigmento. Foto: CDC, Atlanta, E.U.A.
Foto 30. Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, con factor cordn. Las cepas ms virulentas
de M. tuberculsis manifiestan esta caracterstica. Se observa el crecimiento en forma de
cordones sinuosos. Foto: Rubn Mayorga Peralta.
Foto 31. Mycobacterium kansasii, crecimiento eugnico en el medio de Lowenstein-Jensen.
Fu cultivado en la oscuridad por varias semanas, con el tubo cubierto por papel negro
de manera que no tuviera contacto con la luz. No presenta pigmento. Foto: CDC, Atlanta,
E.U.A.
Foto 32. Mycobacterium kansasii, cultivo en Lowenstein-Jensen despus de exposicin a
la luz. Es fotocromgeno, es decir que presenta pigmento anaranjado fuerte slo en
presencia de luz. Foto: CDC, Atlanta, E.U.A.
120
CAPTULO 10
CULTIVO DE ESPUTO
PROPSITO:
Demostrar por medio de frote coloreado con Gram y cultivo, la presencia de
bacterias causantes de infeccin respiratoria inferior. La neumona bacteriana, o
infeccin del pulmn causada por bacterias puede ser de dos tipos:
a.
b.
Neumocccica: causada por Streptococcus pneumoniae.

No neumocccica: causada por Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus
aureus, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, y ocasionalmente
por otras bacterias.
MUESTRA:
La infeccin bacteriana de trquea y bronquios produce abundante esputo.
Debe obtenerse el primer esputo de la maana, pues es ms espeso y no est contaminado por comida. Indicar al paciente que al despertar, se enjuague la boca con
agua corriente (sin usar antispticos ni pasta dental) y luego acostado en su cama
(boca abajo) debe desgarrar esputo con fuerza, y depositarlo directamente en un
recipiente estril de boca ancha proporcionado por el laboratorio. Para este propsito, el laboratorio debe contar con recipientes estriles de plstico, descartables. Si
no se cuenta con este material, deben esterilizarse suficientes frascos de vidrio,
pequeos y de boca ancha.
En el caso del cultivo de esputo, para obtener resultados confiables, es crucial
la obtencin de una buena muestra. Si el cultivo se efecta de material inadecuado
como saliva, el resultado confundir al mdico tratante porque no se detect el
verdadero patgeno, o se recuper de la microbiota de la saliva un patgeno potencial que no es el agente etiolgico primario de la neumona. Por este motivo, el
laboratorio deber rechazar sin vacilar las muestras que se consideren insatisfactorias, segn los criterios que aparecen ms adelante.
Aproximadamente 1 a 3 ml de esputo mucopurulento son suficientes para
efectuar el frote Gram y cultivo de rutina, pero son insuficientes para el cultivo de
121
micobacterias (BK). Si la muestra no se va a procesar de inmediato, debe refrigerarse

por no ms de tres horas.
Debe ponerse atencin en el color, olor y consistencia del esputo. Las muestras hialinas y completamente lquidas deben rechazarse de inmediato pues no son
esputo, son saliva. Una muestra de esputo muy tenaz y adherente puede indicar la
presencia de Klebsiella pneumoniae. Mal olor indica la presencia de anaerobios, pero
el esputo nunca debe cultivarse para anaerobios, pues siempre van a estar presentes por el paso de la muestra a travs de la boca, donde son muy abundantes. En
caso de sospecharse infeccin pulmonar por anaerobios, debe obtenerse muestra
por puncin trans-traqueal.
Al laboratorio pueden remitirse otras muestras que provienen del aparato
respiratorio inferior, las cuales se procesan de manera similar al esputo, en busca
de las mismas bacterias y adems anaerobios (en caldo tioglicolato). Estas muestras obtenidas por tcnicas invasivas, siempre son obtenidas por el mdico
neumlogo: aspirado traqueal, lavado bronquial, cepillado bronquial, biopsia bronquial, lavado bronco-alveolar, aspirado trans-traqueal, aspirado pulmonar, y biopsia
pulmonar. Al procesar estas muestras, que frecuentemente son pequeas, debe tomarse en cuenta su importancia y la dificultad de su obtencin, por lo que con
frecuencia son imposibles de repetir.
EL FROTE GRAM DE ESPUTO:
En primer lugar debe procederse a evaluar la calidad de la muestra, es decir
determinar si es adecuada y confiable para ser cultivada o no. Proceder as:
1.
Vertir aspticamente el esputo en una caja de Petri estril y colocarla

sobre un fondo obscuro.
2.
Quebrar los extremos de dos aplicadores de madera estriles. Con ayuda de las puntas irregulares, seleccionar las partculas anormales: con
pus (blanquecino), o sangre (rojizo).
3.
Con cuidado, colocar la partcula anormal en el extremo de un

porta-objetos. Con otro porta-objetos, presionar la muestra varias veces
a manera de cortar el esputo, y luego deslizar ambos porta-objetos
uno sobre otro, para obtener dos frotes delgados.
4.
Seleccionar el mejor de los dos frotes. Dejar secar, y luego fijar con calor
122
sobre el mechero. Colorear el frote seleccionado con Gram y el otro con

Ziehl-Neelsen, si as fue solicitado por el mdico.
5.
Observar varios campos en el microscopio con un aumento de 100X (seco

dbil).
Descartar el esputo si presenta:
a.
b.
Ms de 10 clulas epiteliales/campo, y
Menos de 25 leucocitos/campo (criterio de la Clnica Mayo, de
Murray y Washington, y de Van Scoy).
En el verdadero esputo, se observan en fresco abundantes leucocitos y

macrfagos alveolares.
6.
Si el esputo es aceptable para ser cultivado, ponerle una gota de aceite y

observarlo con lente de inmersin, segn los siguientes criterios.
INTERPRETACIN DEL FROTE GRAM DE ESPUTO:

1.
Al interpretar un frote de esputo coloreado con Gram, debe tenerse en

cuenta que esta muestra siempre va a presentar bacterias de la microbiota
de la boca. Sin embargo, deben reportarse cuantitativamente todas las
bacterias observadas, segn los criterios que aparecen en este manual,
en la tcnica e informe de la coloracin de Gram.
2.
No debe sobre interpretarse la presencia de bacterias. Es muy importante detectar y reportar principalmente el tipo de bacterias que predomina. Los cocos gram-positivo usualmente se localizan alrededor de las
clulas epiteliales.
3.
El predominio de un tipo de bacterias, permite distinguir simple colonizacin de infeccin verdadera. El mdico debe relacionar estos datos
con las observaciones clnicas.
4.
La morfologa bacteriana observada en el esputo nunca identifica la

especie (Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, etc.), el hacerlo causa errores en el tratamiento del paciente. Sin embargo, la presencia de
abundantes cocos gram-positivo lanceolados, solos, en pares o cadenas
cortas, cuya cpsula se insina pero no se tie con Gram, y abundantes leucocitos polimorfonucleares, permite sospechar la presencia
123
de Streptococcus pneumoniae (neumococo) como agente causante de la

neumona.
5.
Observar cuidadosamente la presencia de pequeos cocobacilos gramnegativo (Haemophilus influenzae), hongos filamentosos que son grampositivo, y filamentos gram-positivo delgados y ramificados (Nocardia
asteroides o Actinomyces israelii). Los hongos intracelulares deben detectarse con la coloracin de Giemsa.
6.
Los cristales de Charcot-Leyden, que provienen de los grnulos de los

eosinfilos, son alargados y terminados en punta. Deben reportarse si
se observan.
CULTIVO DE ESPUTO:
El esputo vertido en una caja de Petri estril (para poder seleccionar mejor la
fraccin de la muestra a analizar), debe procesarse as:
1.
Seleccionar con las puntas irregulares de dos aplicadores estriles de

madera, las partculas anormales (con pus y/o sangre). Pasar estas partculas y unirlas en un espacio seco de la caja de Petri.
2.
Tomar la muestra seleccionada con el asa en argolla (flameada y fra) y

estriar con cortadas en la superficie de una caja de agar sangre de carnero al 5%.
3.
Si an queda muestra de la partcula seleccionada, inocular una caja de

MacConkey. Si esto no es posible, seleccionar otra partcula anormal.
4.
Si el frote coloreado con Gram indica la posible presencia de Haemophilus

influenzae, debe inocularse tambin agar chocolate.
5.
Incubar el agar sangre de carnero y el agar chocolate en jarro hmedo

con candela, y el MacConkey aerbicamente, por 18 a 24 horas a 36 C.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS E INFORME:

1.
Examinar las cajas simultneamente, con lupa y buena luz o microscopio estereoscpico. En primer lugar, buscar en el agar sangre de carnero
colonias de Streptococcus pneumoniae, con las siguientes caractersticas:
124
alfa hemolticas (hemlisis verdosa), planas (deprimidas en el centro y

con los bordes ligeramente ms elevados), brillantes, transparentes, y
pequeas (menos de un milmetro de dimetro). Algunas veces las colonias de S. pneumoniae no son tpicas, y pueden ser grandes (hasta 4 mm),
convexas y muy mucosas (debido a la cpsula). Siempre presentan la
hemlisis verdosa (alfa) caracterstica.
2.
Con la tcnica ya indicada para sub-cultivar Streptococcus beta hemoltico

en cultivos de garganta, trasladar con el asa en hilo, una o dos colonias a
una caja de agar sangre de carnero. Estriar en varias direcciones, y con
pinzas flameadas colocar en el centro un disco de optoquina (Taxo P o
disco O). Incubar en jarro con candela a 36 C por 18 a 24 horas, e
interpretar as:
a.
b.
Inhibicin positiva (si hay halo); slo se considera significativa una

zona de inhibicin mayor de 14 mm de dimetro. Reportar: Se aisl Streptococcus pneumoniae.
Inhibicin negativa (no hay halo); se trata de un Streptococcus alfa
hemoltico (grupo viridans), no debe reportarse pues es microbiota
normal.
Se ha demostrado que aproximadamente en el 45 por ciento de pacientes con

neumona neumocccica, no se asla la bacteria responsable. Por este motivo, un
cultivo de esputo negativo, no descarta definitivamente la presencia de esta infeccin.
3.
Buscar colonias beta hemolticas en el agar sangre de carnero. Si las hay,

proceder de acuerdo con las recomendaciones para la identificacin de
Streptococcus pyogenes en el captulo de cultivo de garganta. No efectuar
antibiograma a esta bacteria, por su susceptibilidad prcticamente uniforme a la penicilina, que es el tratamiento de eleccin.
4.
Haemophilus influenzae crece bien en agar chocolate, presenta colonias

pequeas (frecuentemente menos de un milmetro de dimetro), brillantes y circulares. En agar sangre de carnero crece solamente alrededor de las colonias de otras bacterias (Staphylococcus aureus, etc.), a lo
que se conoce como satelitismo natural, el cual de preferencia, pero no
necesariamente, debe observarse con microscopio estereoscpico. Si hay
duda, sub-cultivar en otra caja de agar sangre de carnero, con una estra
de Staphylococcus aureus , para observar el satelitismo artificial (creci125
miento slo muy cerca de la estra de S. aureus). El frote Gram del crecimiento de las pequeas colonias satlites presenta predominio de
cocobacilos gram-negativo, con algunas formas filamentosas. Es oxidasapositivo.
5.
Buscar en el MacConkey colonias lactosa-positivo (rojo-rosado) mucosas

(bacterias capsuladas), indicativas de la presencia de Klebsiella
pneumoniae. Si el crecimiento predominante son este tipo de colonias
grandes, francamente mucosas, trasladar con el asa en hilo a TSI, LIA,
MIO, urea y citrato e interpretar segn las indicaciones en el captulo de
coprocultivo. Si las pruebas son compatibles, reportar:
Se aisl Klebsiella pneumoniae.
6.
En el caso de Streptococcus pneumoniae: debe efectuarse prueba de susceptibilidad antimicrobiana a la penicilina. Cada vez aparecen ms reportes en la literatura de cepas de S. pneumoniae resistentes a penicilina
por la produccin de beta lactamasa. Hacer la prueba para determinar
la susceptibilidad a la penicilina en agar Mueller-Hinton + 5% de sangre
de carnero en jarro con candela, con un disco de 1 g de oxacilina; se
interpreta como susceptible la presencia de un halo de inhibicin mayor
o igual a 20 mm (NCCLS, M100-56, 1995). Si es posible, detectar la produccin de beta lactamasa por un mtodo confiable. En el caso de
Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, otras
enterobacterias o Haemophilus influenzae (en este caso en agar chocolate), s efectuar prueba de susceptibilidad.
7.
Debe tomarse en cuenta que en los cultivos de esputo, rara vez se obtienen cultivos puros. Identificar otras bacterias que pueden causar neumona humana, solamente si su crecimiento predomina.
8.
El cultivo de esputo para aislar Legionella pneumophila, debe efectuarse

por procedimientos especiales, y slo en casos plenamente justificados.
Para este propsito, deber consultarse literatura especializada.
9.
Si en la interpretacin del cultivo de esputo no se toman en cuenta los

criterios anteriores, es un examen intil que puede conducir a graves
errores en el tratamiento del paciente. Si no se aisla S. pneumoniae o S.
pyogenes (aunque sea escaso), u otras bacterias predominantes sobre la
microbiota, reportar:
No se aislan patgenos, desarrollan bacterias de la microbiota normal.
126
ETIOLOGA Y SINTOMATOLOGA DE NEUMONA Y BRONQUITIS

SIGNOS Y SNTOMAS
Tos
Dolor torxico
Disnea
Consolidacin pulmonar
Klebsiella pneumoniae y otras enterobacterias
Sonidos anormales
Legionella spp.
Disminucin de sonido respiratorio
Mycobacterium spp.
Infiltrado (Rayos-X)
Fusobacterium nucleatum
Matidez a la percusin
Bacteroides melaninogenicus
Cavitacin
y otros anaerobios
Empiema
127
CAPTULO 11
HEMOCULTIVO / MIELOCULTIVO
PROPSITO:
El hemocultivo o cultivo de sangre, sirve para detectar las bacterias que se
estn reproduciendo en la sangre, lo que provoca septicemia. El mielocultivo es el
cultivo de mdula sea y sirve para detectar bacterias en esta muestra, especialmente Salmonella typhi. La septicemia es una de las enfermedades infecciosas
ms graves, por esta razn la deteccin efectiva y rpida de la bacteria causante,
constituye una de las funciones ms importantes del diagnstico bacteriolgico. La
deteccin de bacterias en sangre o mdula sea tiene importancia diagnstica y
pronstica. En el caso de fiebre tifoidea, causada por S. typhi, su hallazgo en la
sangre, o ms efectivamente en mdula sea, constituye el diagnstico de sta severa infeccin, y permite instituir tratamiento con el delicado antibitico de eleccin (cloranfenicol).
En condiciones normales no se detectan bacterias en la sangre. Las bacterias
penetran hacia el torrente circulatorio desde sitios extravasculares, por los vasos
linfticos. Cuando las bacterias se multiplican a una velocidad que excede la capacidad del sistema reticulo-endotelial para removerlas de la sangre, ocurre la
septicemia. Se diferencia de la bacteremia, que es la presencia transitoria de bacterias en el torrente circulatorio, la cual ocurre cotidianamente durante el cepillado
dental, contacto sexual, etc. Actualmente existe la tendencia por usar estos dos
trminos (septicemia y bacteremia) indistintamente
Usualmente causa septicemia una sola especie bacteriana. Sin embargo, la
septicemia polimicrobiana se presenta con una frecuencia no despreciable.
MUESTRA:
Los sntomas del paciente que indican la necesidad de obtener un hemocultivo
son: aumento sbito del pulso y la temperatura, cambios sensoriales, calofros,
postracin y presin baja. La recuperacin de las bacterias de la sangre depende de
estos factores:
129
1.
La cantidad de sangre que se cultiva. En nios debe ser al menos 2.5 ml

y en adultos usualmente 5 ml, aunque sera preferible cultivar 10 ml.
2.
La relacin entre sangre y caldo de cultivo debe ser siempre 1:10, es

decir sangre al diez por ciento en caldo, con el objeto de evitar la coagulacin de la sangre.
3.
La presencia de inhibidores bacterianos en el suero, tales como

anticuerpos, complemento o antibiticos.
4.
Los mtodos de cultivo en el laboratorio de microbiologa.
5.
La caracterstica de la bacteria de ser fastidiosa, es decir que requiere

un medio de cultivo enriquecido y complejo.
El hemocultivo debe obtenerse siempre antes de iniciar el tratamiento con

antibiticos. No es crucial obtener la muestra de sangre cuando sube la temperatura del paciente; si es posible, deber tomarse antes del alza esperada de temperatura o inmediatamente despus del calofro. En algunos casos, se justifica obtener
varias muestras del paciente, en tiempos y de sitios diferentes, es decir seriado.
Los hemocultivos seriados, obtenidos antes de la antibioticoterapia, son especialmente tiles en el caso de sepsis aguda, meningitis, osteomielitis, neumona
bacteriana, pielonefritis y endocarditis.
Debido a que la piel humana normal est constantemente cubierta de abundante microbiota, es muy importante tomar la muestra con precauciones especiales. Para obtener la muestra no es necesario utilizar campo estril, pero s observar todas las indicaciones necesarias para la toma asptica de la muestra. Al obtener la sangre para hemocultivo, deben seguirse cuidadosamente las siguientes instrucciones:
1.
Destapar el frasco con caldo de hemocultivo, para descubrir el tapn de

hule perforable. Dejar la tapadera a un lado, y con un algodn empapado en solucin de yodo al 3 por ciento en alcohol (tintura), limpiar bien
el tapn perforable. Dejar secar mientras se atiende al paciente.
2.
Colocar la ligadura en el brazo del paciente, luego palpar la vena y localizar con precisin el sitio donde se va a puncionar.
3.
Es una buena prctica rutinaria lavar con agua y jabn el brazo del
130
paciente, antes de aplicar desinfectantes. Limpiar el sitio exacto con un

algodn empapado en tintura de yodo al 3 por ciento. Dejar secar y
luego limpiar el sitio de puncin con un algodn empapado en alcohol,
con movimientos circulares en forma de espiral que se inicia en el sitio
de puncin. Despus de esta prepacin no se debe volver a tocar la vena.
4.
Con aguja y jeringa estriles, puncionar la vena y obtener aspticamente

5 ml o ms de sangre.
5.
Nunca debe cambiarse aguja despus de obtener la sangre, excepto cuando se falla en el intento de hacerlo, y se punciona en otro sitio. Inyectar
exactamente 5 ml de sangre en el frasco que contiene 45 ml de caldo, o
10 ml en un frasco con 90 ml de caldo. En los hemocultivos peditricos,
inyectar 2.5 ml de sangre en 25 ml de caldo.
6.
El caldo preparado comercialmente que debe usarse, es el caldo thiol,

especialmente diseado para efectuar hemocultivos de pacientes que
pudieran haber recibido penicilina, estreptomicina o sulfonamidas. El
caldo debe contener de 0.025 por ciento a 0.05 por ciento de polianetol
sulfonato de sodio (SPS). Esta sustancia acta como anticoagulante, y
adems inhibe la actividad bactericida del suero y la fagocitosis de los
leucocitos, inactiva el complemento y neutraliza lisozimas y antibiticos
aminoglucsidos. Tambin debe tener vaco parcial y atmsfera enriquecida con anhdrido carbnico. Los frascos comerciales deben mantenerse en la oscuridad y a temperatura ambiente.
7.
En caso de no contarse con frascos o botellitas comerciales para

hemocultivo, stas pueden prepararse en el laboratorio, en recipientes
de vidrio esterilizables y con doble tapn, el interno perforable. Los caldos BHI (infusin de cerebro y corazn de buey) o Tripticasa-soya dan
buenos resultados. Usualmente el hemocultivo para anaerobios no se
efecta, a menos que se cuente con botellitas anaerobias comerciales;
sin embargo, algunos anaerobios aerotolerantes eventualmente pueden
crecer.
8.
Agitar suavemente las botellas ya inoculadas, e incubar a 36 C.
9.
Las muestras de mdula sea para efectuar el mielocultivo siempre deben ser obtenidas por el mdico, quien puncionar el esternn o la cresta
131
ilaca. Esta muestra debe procesarse exactamente igual que el

hemocultivo.
PROCEDIMIENTO:
1.
Incubar los hemocultivos y mielocultivos a 36 C por siete das, excepto

en casos especiales en los cuales debe prolongarse la incubacin, por
ejemplo para el aislamiento de Brucella spp.
2.
Con mucho cuidado para que el caldo no se agite, examinar diariamente los frascos contra la luz, para buscar alguno de los siguientes signos
visibles que indican crecimiento bacteriano, los cuales orientan hacia el
tipo de bacteria que est creciendo:
OBSERVACIONES EN HEMOCULTIVOS QUE ORIENTAN
EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO
Signo visible
Posible bacteria
Turbidez
Bacilos gram-negativo aerobios

Staphylococcus spp.
Bacteroides spp.
Hemlisis
Streptococcus spp.
Staphylococcus spp.
Listeria spp.
Clostridium spp.
Bacillus spp.
Formacin de gas
Bacilos gram-negativo aerobios

Anaerobios
Colonias visibles como motas de algodn
Staphylococcus spp.
Streptococcus spp.
Formacin de pelcula
Pseudomonas spp.
Bacillus spp.
Levaduras
Formacin de cogulo gelatinoso
Coloracin verdosa (raro)
132
3.
En caso de observar cualquiera de estas caractersticas, agitar suavemente, limpiar el tapn perforable con algodn y alcohol, puncionar
con jeringa y aguja estriles (puede ser de tuberculina) y aspirar una
pequea cantidad del caldo. Inocular una gota, y luego estriar con asa
sobre una caja de agar sangre de carnero y una caja de agar chocolate;
incubar ambas cajas en jarro con candela. Es aconsejable sembrar tres
gotas del hemocultivo, pero slo estriar una. Si no se observa crecimiento en las gotas no rayadas y lo hay en las estras, posiblemente se trata
de contaminacin. Simultneamente, dejar secar dos gotas del caldo sobre un porta-objetos; colorear con Gram.
4.
Observar cuidadosamente el frote Gram con lente de inmersin, pues la

observacin de las bacterias es la base de su caracterizacin. Adems,
algunas bacterias como Haemophilus influenzae no producen signos visibles en el caldo. Si se observan bacilos o cocobacilos gram-negativo,
inocular adicionalmente una caja de agar MacConkey; incubar
aerbicamente. Esto es especialmente importante para el aislamiento e
identificacin de Salmonella typhi.
5.
Si se observan cocos gram-positivo esfricos y con tendencia a agruparse en racimos, inocular una caja de agar manitol-sal, para facilitar el
aislamiento e identificacin de Staphylococcus aureus. Si se observan
diplococos o cadenas cortas de cocos gram-positivo ovalados, aplicar
los discos de optoquina y bacitracina sobre la segunda estra del agar
sangre de carnero, para acelerar la identificacin presuntiva de
Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes.
6.
Rutinariamente, revisar los hemocultivos y mielocultivos aparentemente

negativos. Proceder as: hacer aspticamente un frote Gram del caldo a
las 48 horas, y tambin al sptimo da de incubacin. La incubacin
prolongada puede producir una leve turbidez de fibrina.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS;
1.
Con siete das de incubacin a 36 C se recupera el 95 por ciento de las

bacterias clnicamente significativas. Identificar los crecimientos
bacterianos segn el caso, con las tcnicas descritas. Si se observa en
MacConkey el crecimiento de colonias lactosa-negativo sospechosas de
Salmonella typhi, aglutinar inmediatamente el crecimiento en agar sangre de carnero, con antisuero polivalente anti-Salmonella, anti-Salmonella
133
grupo D, y anti-antgeno Vi. Si hay aglutinacin franca, reportar inmediatamente la presencia de Salmonella typhi.
2.
Algunas bacterias frecuentes en hemocultivos positivos, son las

siguientes:
-
3.
Salmonella typhi
Escherichia coli
Streptococcus pyogenes
Algunas bacterias que frecuentemente crecen en hemocultivos, como

contaminantes provenientes de la microbiota de la piel, son los siguientes bacilos gram-positivo:
-
Bacillus sp. (esporulado)

Corynebacterium sp. (no esporulado, difteroide)
ETIOLOGA Y SINTOMATOLOGA DE SEPTICEMIA
SIGNOS Y SNTOMAS
Fiebre en picos
Streptococcus pyogenes (grupo A) en todas las edades
Calofros
Streptococcus alfa hemoltico (endocarditis)
Murmullo cardaco (endocarditis) Streptococcus grupos A, B y D neonatos

Petequias en piel y mucosas
Hemorragia puntiforme en uas
Malestar
Salmonella typhi (fiebre tifoidea)

Escherichia coli
Bacteroides fragilis y otros anaerobios
Listeria monocytogenes
134
INFORME:
1.
Los hemocultivos deben reportarse como negativos si no se observan

bacterias en el segundo control por coloracin de Gram, a los siete das
de incubacin, nunca antes. Reportar as:
Negativo a los siete das de incubacin a 36 C.
2.
Si el hemocultivo presenta crecimiento a cualquier tiempo de incubacin,

reportar cuanto antes la bacteria aislada, identificada si es posible hasta
especie, aunque la identificacin sea presuntiva. Reportar as:
Se aisl ___________ , susceptibilidad pendiente.
3.
En el caso del aislamiento e identificacin de Streptococcus pneumoniae o

Streptococcus pyogenes de hemocultivo, reportar as:
Se aisl Streptococcus ___________ , se recomienda tratamiento con penicilina.
Si se trata de S. pneumoniae si hacer la prueba de susceptibilidad a la
penicilina.
4.
Despus de interpretar los resultados de la prueba de susceptibilidad

antimicrobiana, enviar otro reporte, as:
Se aisl: ___________________
Susceptible a: ______________
Intermedio a: ______________
Resistente a: _______________
Si el laboratorio tiene capacidad econmica suficiente, es conveniente utilizar

el sistema para deteccin de bacterias por lisis-centrifugacin (ISOLATOR, Laboratorios Wampole), o algn sistema automatizado para efectuar hemocultivos (por
ejemplo BACTEC, Becton Dickinson).
135
CAPTULO 12
SECRECIONES DIVERSAS
PROPSITO:
Detectar por medio de frote Gram y cultivo aerobio, la presencia de bacterias
que causan infecciones con presencia de pus en la piel, ojos, odos, tejido subcutneo, heridas infectadas y otros sitios anatmicos diversos. A las bacterias que
provocan la formacin de pus se les llama pigenas. En este tipo de infecciones,
son de especial inters los llamados cocos pigenos gram-positivo, que son los
siguientes:
-
Menos frecuentemente pueden aislarse de este tipo de lesiones, otras bacterias tales como:
-
Pseudomonas aeruginosa (de importancia en quemaduras infectadas)

Escherichia coli
Haemophilus aegyptius (en infecciones oculares)
Salmonella typhi (raro)
Mycobacterium tuberculosis (raro)
MUESTRA:
La muestra deber obtenerse segn el sitio anatmico, siempre con material
estril y antes de tratamiento con antibiticos. En la mayora de los casos puede
usarse hisopo estril (envuelto en papel individual, no dentro de frasco). Cuando
la cantidad de pus es muy escasa, tomar la muestra con el extremo puntiagudo y
delgado de un aplicador de madera estril que ha sido quebrado por los extremos.
Tambin puede usarse la punta de una asa espatulada flameada y fra, bistur pequeo (nmero 15), o una lanceta estril.
137
Debe considerarse como regla general indispensable, hacer siempre un frote

para Gram, sobre un porta-objetos limpio. Es de vital importancia observar las
bacterias en el frote, especialmente cuando deben interpretarse cultivos con alguna
microbiota normal adems de algn patgeno.
1. PIEL:
Si no hay apertura por donde salga el pus, escoger una lesin intacta y madura, de preferencia con punta blanquecina. Limpiar el rea de donde se tomar
la muestra para frote Gram y cultivo, con algodn empapado en alcohol y exprimido. Limpiar bien pero con cuidado de no sacar el pus, luego con lanceta estril o
bistur pequeo, puncionar a manera de evitar que salga sangre. Si es necesario
(usar guantes de hule estriles) presionar a los lados de la lesin, hacia el centro,
para exprimir el pus hacia afuera. Tomar una pequea gota de pus con el asa
espatulada estril, punta de aplicador de madera estril (quebrado) o hisopo estril, e inocular siempre los siguientes medios de cultivo, en este orden:
Primero: Agar sangre de carnero al 5%
Segundo: Agar chocolate
Tercero: Agar manitol-sal (en caja de Petri)
Cuarto: Agar MacConkey
Luego hacer un frote Gram delgado, sin frotar mucho sobre el porta-objetos.
Los medios de cultivo deben inocularse con una asada de pus, en un extremo de la
caja. El objeto de hacerlo en el orden indicado, es evitar el acarreo de inhibidores
del MacConkey y manitol-sal, hacia el agar sangre de carnero y el agar chocolate,
que no son inhibitorios.
ETIOLOGA Y SINTOMATOLOGA DE HERIDAS INFECTADAS
SIGNOS Y SNTOMAS
Secrecin serosa o purulenta
Absceso: subcutneo o submucoso
Eritema y edema
Clostridium spp., Bacteroides spp. y otros anaerobios
Crepitacin (gas en tejidos)
Enterobacterias
Dolor
Ulceracin y formacin de fstulas
Enterococos
138
2. OJOS:
Tomar la muestra con hisopo estril, as: bajar el prpado inferior, haciendo
presin hacia abajo, a manera de exponer la conjuntiva enrojecida y purulenta (usar
guantes de hule estriles). Frotar la conjuntiva al mismo tiempo que se rota el hisopo
hacia afuera, con mucho cuidado de no raspar el globo del ojo. Inocular agar sangre de carnero, agar chocolate, agar manitol-sal y agar MacConkey, en ese orden.
Descartar el hisopo, y con un segundo hisopo estril, tomar ms muestra. Hacer un
frote pequeo sobre un porta-objetos limpio, con cuidado de no frotar excesivamente.
En los cultivos oculares es muy importante incluir siempre agar chocolate,
para lograr el crecimiento de las bacterias fastidiosas (difciles de cultivar) que causan conjuntivitis. Si en el frote Gram se observan diplococos gram-negativo, inocular un tubo de medio Thayer-Martin, selectivo para N. gonorrhoeae.
ETIOLOGA Y SINTOMATOLOGA DE INFECCIN OCULAR
SIGNOS Y SNTOMAS
Secrecin conjuntival serosa
o purulenta
Hiperemia ocular
Dolor ocular

Haemophilus spp., especialmente H. aegyptius
Moraxella lacunata
Pseudomonas aeruginosa (reportar stat)
3. ODOS:
En los casos de otitis media, generalmente no es necesario que el mdico
otorrinolaringlogo puncione el tmpano (timpanocentesis). Este procedimiento
jams debe practicarse por el personal del laboratorio. Proceder as: con un hisopo
empapado en alcohol, y luego exprimido con papel absorbente, limpiar bien el
odo externo. Introducir en el canal auditivo otro hisopo estril, despacio y sin tocar el pabelln de la oreja, con cuidado de no llegar al tmpano. No debe haber
sangrado. Con el hisopo empapado en pus, inocular los siguientes medios: agar
sangre de carnero, agar chocolate, agar manito-sal y agar MacConkey, en ese or139
den. Con un segundo hisopo estril, tomar ms muestra y sin frotar mucho, hacer
un pequeo frote sobre porta-objetos limpio.
ETIOLOGA Y SINTOMATOLOGA DE OTITIS MEDIA
SIGNOS Y SNTOMAS
Secrecin tica purulenta

Agudo:
Dolor agudo en odo y mandbula
Cefalea pulstil
Tmpano rojo y abultado
Crnico:
Proteus spp.
Anaerobios
4. MISCELNEOS:
Antes de obtener la muestra, debe ponerse especial cuidado en desinfectar
bien las reas que se espera estn colonizadas por abundante microbiota. El objeto
de esta operacin, es evitar contaminaciones innecesarias que dificultan la interpretacin del frote Gram y el cultivo.
El material para tomar las muestras debe ser estril. La toma de muestra debe
ser agresiva pero cuidadosa; un hisopo frotado descuidadamente sobre una lesin
seca y no de un sitio representativo, es completamente intil. El sangrado debe
evitarse en la medida de lo posible. Para la toma de muestras difciles o invasivas,
que representen peligro para el paciente, debe solicitarse la intervencin del
microbilogo o del mdico.
Los lquidos acuosos y de volumen grande, deben centrifugarse y luego hacer frote Gram y cultivo del sedimento. Inocular el medio de Thayer-Martin si se
sospecha la presencia de Neisseria gonorrhoeae, y el medio de Lowenstein-Jensen si
se sospecha la presencia de Mycobacterium tuberculosis. En el captulo 17 sobre
Anaerobios, se explica que tipo de muestras deben sembrarse en anaerobiosis y
como deben procesarse.
140
PROCEDIMIENTO:
Teir el frote con la coloracin de Gram, segn el captulo correspondiente.
Las muestras obtenidas siguiendo las instrucciones anteriores, y que fueron inoculadas directamente en un extremo de cada caja, deben diseminarse aspticamente
en la superficie de los medios de cultivo. Para este propsito, usar dos asas en
argolla (bien rectas y con la argolla circular y cerrada). Mientras una asa se flamea,
la otra se enfra en el soporte que la mantiene vertical. Segn se indic, trabajar
cerca del mechero encendido y con buena luz.
Si en el frote Gram de una secrecin purulenta (especialmente de piel), se
observan abundantes cocos gram-positivo, ligeramente ovalados, con tendencia a
agruparse en pares o cadenas cortas y acompaados de abundantes leucocitos
polimorfonucleares, inocular el agar sangre de carnero con cortadas (igual que el
cultivo de garganta). Luego colocar con pinzas flameadas un disco de bacitracina
de 0.04 unidades en la segunda estra, para acelerar y facilitar el aislamiento e identificacin de Streptococcus pyogenes.
Incubar el agar sangre de carnero y el agar chocolate a 36 C en jarro con
candela encendida y humedad (papel absorbente hmedo en el fondo del jarro). La
boca del jarro, donde enrosca la tapadera, debe frotarse espordicamente con la
misma candela, para que la cera o parafina forme un sello. Cerrar bien el jarro, y
luego sellar con masking tape. Incubar el agar manitol-sal y MacConkey
aerbicamente.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS E INFORME:
Es importante observar el frote lo ms pronto posible, ya que en base a este
resultado se puede iniciar tratamiento preliminar. Observar los frotes Gram con
aceite y el lente objetivo de inmersin. Es de gran importancia observar cual es la
bacteria que predomina en el frote. Informar la cantidad de bactrias observadas, la
cantidad de leucocitos y de qu tipo son. En el frote, los leucocitos deben observarse gram-negativo (rojos); si aparecen gram-positivo (morados), falta decoloracin
y debe aplicarse ms alcohol-acetona.
Examinar los cultivos despus de 18 a 24 horas de incubacin, con microscopio estereoscpico o lupa y buena luz. En el agar sangre buscar colonias pequeas
beta hemolticas; si las hay, identificar un subcultivo en agar sangre de carnero con
discos de bacitracina y trimetoprim-sulfametoxazol y prueba de CAMP. Si hay co-
141
lonias planas alfa hemolticas (hemlisis verdosa), identificar un sub-cultivo en agar

sangre de carnero con disco de optoquina para Streptococcus pneumoniae.
De diversas secreciones, pueden aislarse Enterococcus spp. alfa hemolticos o
no hemolticos, que pertenecen al grupo D de Lancefield. Son llamados
enterococos por su probable origen fecal, y los ms importantes son: E. faecalis, E.
faecium, E. durans y E. avium. Sub-cultivar a agar bilis-esculina; un color negro a las
24 horas de incubacin a 36 C indica hidrlisis de la esculina positiva. Debe tomarse en cuenta que esta reaccin tambin la dan positiva E. bovis y E. equinus, que
no son enterococos. Para identificar correctamente a los enterococos, debe sembrarse en un caldo con 6.5% de cloruro de sodio y observar el crecimiento halfilo
(soporta la sal), antes de 48 horas de incubacin, con viraje del prpura al amarillo
y turbidez. El caldo con cloruro de sodio al 6.5%, se prepara fcilmente as:
Caldo tripticasa soya ......................................15 gramos
Cloruro de sodio .............................................. 32.5 gramos
Agua destilada .................................................50 ml
Servir 6 ml en tubos con tapn de rosca, esterilizar en autoclave a 121 C por
15 minutos.
Enterococcus spp. son cocos gram positivo, catalasa-negativo, se agrupan en
pares y cadenas (no en racimos o ttrodos), y son halfilos (turbidez en el caldo con
6.5% de cloruro de sodio).
Si se observa crecimiento de colonias grandes (ms de 1 mm de dimetro),
blancas o amarillentas (tanto en el agar sangre de carnero como en el manitol-sal),
identificar a Staphylococcus aureus por medio de la prueba de coagulasa. Colocar en
porta-objetos o caja de Petri, una gota de plasma humano citratado (del que se usa
para tiempo de protrombina). Suspender all una asada pequea del cultivo en
agar sangre de carnero. Si se observa franca aglutinacin, la prueba de coagulasa es
positiva; reportar: Se aisl Staphylococcus aureus, y efectuar la prueba de susceptibilidad. Si la prueba de coagulasa en lmina es dudosa, pero hay coloracin amarilla
alrededor de las colonias en el agar manitol-sal (acidificado por la fermentacin del
manitol), debe efectuarse la prueba en tubo. Proceder as: en un pequeo tubo de
hemlisis, medir 0.5 ml de plasma citratado, suspender all una asada del cultivo
en agar sangre, incubar de 4 a 24 horas a 36 C. Un cogulo bien formado indica
prueba positiva de coagulasa en tubo. Observar la presencia de cogulo a las 4
horas de incubacin a 36 C; si no lo hay, reincubar a temperatura ambiente, para
evitar la lisis del cogulo por la enzima estreptokinasa. La prueba de coagulasa en
142
tubo es ms sensible y confiable, pero si la reaccin da positiva en lmina es suficiente para identificar a Stapylococcus aureus, pues hay aproximadamente 96 por
ciento de correlacin.
Si la prueba de coagulasa es negativa, y la fermentecin del manitol tambin
es negativa (colonias rosadas en manitol-sal), puede reportarse presuntivamente
Staphylococcus epidermidis o Staphylococcus coagulasa-negativo. Hacer el reporte de
esta bacteria con prudencia, ya que en la gran mayora de los casos no causa infeccin, pero se aisla con frecuencia pues es miembro importante de la microbiota de
la piel. Si la coagulasa es negativa y la fermentacin del manitol positiva, puede
tratarse de Staphylococcus saprophyticus, hacer susceptibilidad a un disco con
novobiocina, que debe presentar inhibicin. Si es necesario, hacer pruebas adicionales segn la tabla a continuacin. En caso de cocos gram-positivo con agrupacin en pares, paquetes o grupos de cuatro bacterias, descartar Micrococcus sp. por
la prueba de OF-glucosa, es oxidativo.
PRINCIPALES PRUEBAS PARA LA DIFERENCIACIN DE TRES
ESPECIES DEL GNERO Staphylococcus DE ORIGEN HUMANO*
PRUEBA
S. aureus
S. epidermidis
S. saprophyticus
Coagulasa
Fermentacin del manitol

(produccin de cido)
+/-
DNAsa
Resistencia a novobiocina
Crecimiento en anaerobiosis
Hemlisis
Tomado de: Isada, C.M. et al.: Infectious Diseases Handbook, 1995-96.
Si hay duda entre los gneros Staphylococcus y Streptococcus, hacer la prueba

de catalasa, que es positiva en el caso de los estafilococos y negativa en los
estreptococos.
El gnero Haemophilus est formado por cocobacilos gram-negativo
pleomrficos, que requieren el enriquecimiento de los medios de cultivo con sangre, para poder desarrollarse. Esto se debe a que como su nombre lo indica, requieren de varios factores sanguneos para su nutricin y reproduccin. La mayor parte
de los aislamientos clnicos de este gnero de bacterias, puede identificarse hasta
143
gnero por medio de la prueba de satelitismo; la diferenciacin hasta especie requiere de pruebas ms complejas. El crecimiento de Haemophilus spp. se logra en
agar chocolate incubado en jarro con candela, pues son microorganismos
microaeroflicos. Crece solamente en agar chocolate, y no en agar sangre, pues en el
primero los factores de crecimiento se encuentran libres en el medio, y no dentro de
los eritrocitos.
Hacer la identificacin de Haemophilus sp. por medio de la prueba de
satelitismo, as:
1.
En agar chocolate se observan colonias muy pequeas, puntiformes, de

menos de un milmetro de dimetro, translcidas y ligeramente mucosas.
Hacer un frote Gram a estas pequeas colonias, con cuidado de tomar
slo de ellas; predominan cocobacilos gram-negativo pequeos, casi
esfricos y escasos bacilos largos y filamentosos (pleomorfismo).
2.
Tomar una asada del crecimiento en agar chocolate y estriarla en el centro de una caja de agar sangre de carnero al 5%, slo en una direccin.
3.
En sentido perpendicular a la estra efectuada, hacer una estra de

Staphylococcus aureus, recta y a lo largo de toda la caja. Esta cepa pura
puede provenir de otro cultivo, o de preferencia tener una cepa tpica
de S. aureus, en cualquier agar inclinado en tubo, conservada en
refrigeracin.
4.
Incubar el agar sangre de 24 a 48 horas a 36 C en jarro hmedo con

candela. Una prueba positiva de satelitismo consiste en el crecimiento
de las pequeas colonias del Haemophilus slo muy cerca de la estra de
S. aureus. Hacer frote Gram a este crecimiento satlite para confirmar la
morfologa.
Si en el cultivo original tambin hay colonias de Staphylococcus sp.,

enterobacterias o algunas otras bacterias, puede observarse el satelitismo natural.
Este consiste en el crecimiento de las pequeas colonias puntiformes de Haemophilus
alrededor de colonias grandes. Este fenmeno se aprecia bien con el microscopio
estereoscpico o lupa al efectuar la interpretacin.
144
Con fines prcticos, es aceptable el reporte de los aislamientos con satelitismo

positivo as:
Cultivo de ojos, reportar: Se aisl Haemophilus aegyptius.
Cultivo de cualquier otra secrecin: Se aisl Haemophilus influenzae.
Hacer susceptibilidad en agar chocolate. Diseminar sobre toda la superficie
de la caja varias asadas del crecimiento en el agar chocolate original, o de colonias
satlites, con mucho cuidado de no tocar la estra de S. aureus.
Las enterobacterias aisladas de cualquier secrecin en cantidad considerable,
deben identificarse con medios diferenciales (TSI, LIA, MIO, urea y citrato), o de
preferencia con el mtodo API (Bio Meriux). Bacilos gram-negativo no fermentadores pueden eventualmente aislarse de secreciones; efectuarles antibiograma y
si es posible identificarlos.
145
CAPTULO 13
SECRECIONES GENITALES
PROPSITO:
Demostrar la presencia de microorganismos de varios tipos que infectan los
rganos genitales femeninos y masculinos, en especial los siguientes:
Bacteria, causante de la gonorrea.
Treponema pallidum
Bacteria, causante de la sfilis.
Gardnerella vaginalis
Bacteria, bacilo gram-negativo causante de
vaginosis.
Candida albicans
Hongo levaduriforme, causante de vulvovaginitis.
Trichomonas vaginalis
Protozoo, causante de tricomoniasis vaginal.
DIAGNSTICO DE GONORREA
Muestra:
La gonorrea es una enfermedad de transmisin sexual que en
el hombre generalmente causa el
aparecimiento de pus cremoso,
amarillento o verdoso que sale de
la punta del pene. En la mujer,
este sntoma puede no ser
evidente, lo que hace ms difcil
el diagnstico.
El agente causal de la
gonorrea es la bacteria Neisseria
gonorrhoeae un diplococo gram-negativo (rojo). Las neiserias presentan forma arrionada y se agrupan
en pares que semejan granos de
caf. El diagnstico de laboratorio
de la gonorrea consiste en la obser-
Neisseria gonorrhoeae, frote

Gram de pus uretral masculino.
147
vacin de la morfologa tpica de la bacteria en frotes Gram de pus uretral (slo en

el hombre, no as en la mujer), y en el cultivo de la bacteria Neisseria gonorrhoeae.
Puede aislarse de descargas uretrales, vaginales e hisopos rectales; rara vez se aislan de heces, sangre, lquido cefalorraqudeo, lquido sinovial, etc. Los nios que
nacen de madres con gonorrea, se infectan con la bacteria al pasar por el canal
vaginal durante el parto y generalmente presentan conjuntivitis purulenta. En el
pus de los ojos de estos nios puede observarse y cultivarse la bacteria.
La toma de la muestra es diferente en el hombre y en la mujer. Obtener la
muestra antes de tratamiento, as:
Hombres:
1-
Tener listo el siguiente material: hisopos estriles, porta-objetos limpios,

una caja de agar sangre y una caja o botellita de medio Thayer-Martin.
2-
Pedir al paciente que se ponga de pie y con ambas manos exprimir el

pene hacia adelante, a manera de forzar a salir el pus de la uretra.
3-
Con hisopo estril de madera (quebrado) o palillo de dientes, tomar

una gota del pus, tratando de no tocar la piel.
4-
Preparar cuidadosamente un frote delgado sobre porta-objetos de

vidrio limpio, haciendo rodar el palillo o hisopo sobre la lmina,
no frotar. El propsito de preparar el frote con estas precauciones
es no romper los leucocitos presentes ni alterar la posicin de las
bacterias.
5-
Tomar una gota de pus con la punta de algodn de un hisopo estril.

Inmediatamente inocular la caja o botellita de Thayer-Martin; en botellitas frotar el hisopo en la superficie del medio desde el fondo. Simultneamente sembrar una caja de agar sangre de carnero, para aislar otros
patgenos. Transportar las muestras rpidamente al laboratorio.
Mujeres:
1-
Idealmente la muestra debe obtenerse por el gineclogo, con la paciente

acostada en posicin y en cama ginecolgicas, usando espculo para
separar las paredes vaginales y observar el cuello uterino. Tener listo el
mismo material que para la toma de muestra masculina.
148
2-
Con la punta de algodn de un hisopo estril tomar pus de donde se

localice (usar buena luz), es decir del cuello uterino, vagina o uretra.
Preparar un frote para Gram haciendo rodar el hisopo sobre un portaobjetos de vidrio.
3-
Tomar ms pus con otro hisopo estril, e inocular una caja o botellita de
Thayer-Martin, y una caja de agar sangre de carnero.
Procedimiento:
1-
Colorear los frotes con Gram segn la tcnica ya explicada.
2-
Con asas flameadas y fras, diseminar por estras el inculo sobre toda
la superficie de cajas o botellitas.
3-
Incubar tanto el agar sangre como el Thayer-Martin de 24 a 48 horas a

36 C en jarro hmedo con candela encendida. Si el Thayer-Martin est
en botellitas, tomar la precaucin de dejarlas semi-abiertas, nunca bien
cerradas.
Interpretacin de resultados:
Gram: buscar diplococos adosados en forma de granos de caf y gram-negativo (rojos). Anotar si se encuentran adentro de los leucocitos polimorfonucleares
(intracelulares), o libres fuera de estas clulas (extracelulares). En el pus uretral
masculino, la presencia de estas bacterias tpicas indica gonorrea. Reportar la cantidad y clase de leucocitos observados. En los frotes masculinos, los diplococos
gram-negativo intracelulares se asocian a gonorrea aguda; extacelulares se asocian
a gonorrea crnica. El frote Gram endocervical es de diagnstico limitado y
correlaciona con el cultivo en Thayer-Martin en 65 por ciento de los casos.
En el caso de las mujeres por lo general la imagen microscpica no es tpica y
se observan muchas clases de bacterias, tanto gram-positivo como gram-negativo, de la abundante microbiota normal de la vagina. Algunas bacterias de esta
microbiota pueden ser idnticas a Neisseria gonorrhoeae . Por estas razones el diagnstico de gonorrea femenina se basa en el cultivo y no en el frote Gram.
Cultivo:
Despus de 24 a 48 horas de incubacin a 36 C en jarro con candela, exami149
nar el Thayer-Martin con buena luz. Debido a que el Thayer-Martin contiene sustancias enriquecedoras que favorecen el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae, y sustancias inhibidoras de otras bacterias, por lo general slo crece este microorganismo
en cultivo puro. N. gonorrhoeae presenta colonias pequeas (menos de 1 mm de
dimetro), translcidas, brillantes y de bordes lisos.
Hacer una coloracin de Gram de las pequeas colonias en Thayer-Martin,
suspenderlas en una pequea gota de agua destilada o solucin salina fijar con
calor y luego colorear. Si se observan diplococos gram-negativo, el cultivo es muy
sospechoso de N. gonorrhoeae y debe efectuarse la prueba de oxidasa. Esta prueba
demuestra la presencia de la enzima indofenol-oxidasa, que da al reactivo
(dihidrocloruro de tetrametil-p-fenilendiamina al 1% en agua, 0.1 g en 10 ml de
agua) un color morado o negro.
La prueba de oxidasa puede efectuarse aplicando directamente el reactivo
lquido al cultivo o sobre discos de papel filtro ya impregnados con el reactivo.
Para efectuar la prueba en discos de papel, proceder as: con pinzas flameadas,
colocar un disco de oxidasa en una caja de Petri vaca. Humedecerlo con una gota
de solucin salina. Con el asa calibrada de platino o palillo de dientes de madera
tomar una o dos colonias tpicas frotar este crecimiento sobre el disco hmedo. Si
aparece una coloracin morado-negruzco antes de 10 segundos en la parte del disco donde se frotaron las colonias, la prueba es positiva. Esta prueba debe
interpretarse antes de 10 segundos, pues el oxgeno del aire puede ocasionar falsos
positivos. Nunca usar el asa corriente en esta prueba, pues el alambre con hierro o
nichrome causa por s solo una reaccin positiva.
Efectuar la prueba con el reactivo lquido as: aplicar unas gotas del reactivo
recin preparado directamente sobre la caja de Thayer-Martin, si las colonias toman rpidamente un color rosado, luego morado y luego negro, la prueba es positiva. Si se observa este viraje en el color de las colonias, o la prueba en disco es
positiva, sub-cultivar inmediatamente una colonia tpica sin reactivo, o una colonia al empezar a cambiar de color a una caja de agar chocolate. Incubar 24 horas
a 36C en jarro hmedo con candela. Despus de incubar, hacer frote Gram al
crecimiento en agar chocolate, que debe presentar diplococos arrionados gramnegativo.
Identificar la especie N. gonorrhoeae por medio de la prueba de oxidacin de
los tres azcares: maltosa, glucosa y sacarosa (sucrosa) en el medio base de CTA
(cistina-tripticasa agar). El medio CTA es un medio semi-slido; al medio base estril se le adiciona el carbohidrato en solucin acuosa (esterilizado por filtracin)
150
hasta una concentracin de 1%. Debe prepararse en tubos 13 X 100 con tapn de
rosca, inocular los tres tubos de maltosa, glucosa y sacarosa con dos asadas bien
cargadas por tubo. Depositar el crecimiento masivo slo unos pocos milmetros
por debajo de la superficie del medio. Cerrar bien apretado el tapn de rosca e
incubar de 48 a 72 horas a 37 C. Una coloracin amarilla en la superficie del medio
indica reaccin positiva. Interpretar resultados segn esta tabla:
Diferenciacin de dos especies de Neisseria
de importancia clnica
Especie
Glucosa
Maltosa
Sacarosa
Neisseria meningitidis*
Ver captulo 14
Las pruebas de CTA frecuentemente dan resultados dudosos, tienen la desventaja que para preparar los medios en tubo se requiere esterilizar por filtracin la
solucin del carbohidrato que debe ser muy puro. Es adecuado usar por lo menos
slo el tubo con maltosa, que diferencia bien las dos especies.
En trminos generales y segn las caractersticas del trabajo bacteriolgico en
nuestro medio, se considera adecuado reportar (aunque sea presuntivamente) como
Neisseria gonorrhoeae a aquellos aislamientos de secreciones genitales con morfologa
tpica de Neisseria, oxidasa positivo y un frote Gram de la secrecin que indique la
presencia de esta bacteria. Efectuar la prueba de susceptibilidad inoculando masivamente la bacteria en cultivo puro, en la superficie de una caja de agar chocolate
(base Mueller-Hinton caliente + 5% sangre de carnero).
Informe:
Tomando en cuenta los procedimientos y comentarios anteriores, si se est seguro aunque sea presuntivamente, reportar la presencia de N. gonorrhoeae. Debe tomarse en cuenta que un reporte de este tipo implica que el o la paciente contrajeron
una infeccin por contacto sexual. Un error del laboratorio puede por lo tanto causar serios problemas conyugales o dejar a un paciente infectado sin tratamiento.
151
DIAGNSTICO DE CHANCRO BLANDO (CHANCROIDE)

Muestra y Procedimiento:
El chancro blando o chancroide es una infeccin de transmisin sexual causada por una bacteria fastidiosa (difcil de cultivar) llamada Haemophilus ducreyi. Es
un bacilo pequeo gram-negativo, que en frotes de lesiones genitales o cultivos se
presenta formando cadenas de 5 a 20 bacilos, paralelas entre s o entrelazadas,
por lo que se ha descrito esta agrupacin caracterstica como cardmenes de
peces o huella digital.
Las lesiones en los genitales son generalmente lceras bien circunscritas dolorosas con base necrtica y bordes socavados y blandos. De estas caractersticas se
deriva el nombre de chancro blando o chancroide (similar al chancro sifiltico tpico). Las lesiones rara vez son ms grandes de 2 cm de dimetro, pueden haber
lesiones mltiples por autoinoculacin y en ms de la mitad de los casos, los ganglios
de la ingle estn endurecidos.
El diagnstico del chancro blando se basa en las caractersticas clnicas y en el
frote Gram directo de la lesin .
Para efectuar el diagnstico de laboratorio del chancro blando, proceder as:
Frotar un hisopo estril en los bordes y el fondo de la lesin y luego
rodarlo cuidadosamente sobre un porta-objetos bien limpio, slo en una
direccin para no destruir la agrupacin caracterstica de la bacteria.
Dejar secar, fijar con calor y colorear con Gram.
Interpretacin de Resultados e Informe:
Observar cuidadosamente el frote Gram del material de la lesin con el
lente de inmersin y aceite. Buscar bacilos gram-negativo agrupados en
cadenas largas, paralelas o entrelazadas (cardmen de peces), los cuales deben predominar sobre otras formas de bacterias. Si se observa esta
morfologa tpica reportar inmediatamente as: Se observan (escasos, regular cantidad o abundantes) bacilos gram-negativo, agrupados en cadenas largas (o cortas segn el caso) de morfologa compatible con
Haemophilus ducreyi. Esta morfologa se considera presuntivamente
diagnstica de chancro blando.
152
DIAGNSTICO DIRECTO DE LA SIFILIS

La sfilis es una enfermedad que
se transmite por contacto sexual. Es
causada por Treponema pallidum, una
bacteria del grupo de las espiroquetas, con forma alargada, enrollada a manera de tirabuzn y muy
mvil. T. pallidum no se puede colorear con Gram ni cultivar in vitro, por
estas razones es indispensable utilizar tcnicas especiales para demostrar su presencia. Generalmente la
deteccin de anticuerpos inespecficos o reaginas, por la prueba
de V.D.R.L. (Venereal Diseases
Research Laboratory) y la deteccin
de anticuerpos especficos contra esta
bacteria por FTA-ABS (Fluorescent
Treponemal Antibodies-Absorbed),
establecen el diagnstico de sfilis. Sin
embargo, debe transcurrir algn
tiempo despus del contagio para que
las pruebas serolgicas se positivicen.
Treponema pallidum,
campo oscuro de chancro.
En la mayora de los casos de sfilis primaria aparece una lesin tpica en los
rganos genitales, llamada chancro. El chancro se caracteriza por ser una lcera
no purulenta, generalmente de forma redondeada y de bordes duros. Es una lesin muy infectiva que contiene muchas espiroquetas, por lo que debe manipularse
con guantes.
Debido a que T. pallidum es una bacteria muy delgada y que no toma los colorantes de Gram, su presencia debe demostrarse por observacin microscpica en
fresco con condensador de campo oscuro. Es muy importante que el paciente no
haya recibido tratamiento con antibiticos especialmente penicilina, que hace desaparecer rpidamente los treponemas de las lesiones. Para el examen se procede
as:
1-
Tener listo el siguiente material: guantes de hule estriles, gotero con

solucin salina, tubos capilares no heparinizados, bulbo de hule peque153
o para tubos capilares (de los que vienen en kits de serologa), portaobjetos, cubre-objetos, solucin salina estril en frasco, gasa estril y algodn con alcohol.
2-
Es imprescindible examinar bien al paciente en un cubculo privado con

buena luz para localizar bien el chancro ms tpico. Usar los guantes
puestos para este procedimiento, limpiar suavemente la superficie del
chancro con gasa estril seca para causar ligera abrasin. Si hay costra
levantarla con cuidado.
3-
Llenar un tubo capilar, aproximadamente un centmetro con solucin

salina estril, dejarle puesto el bulbito de hule y tomarlo con la mano
derecha.
4-
Con la mano izquierda, tomar la lesin entre los dedos pulgar e ndice y
presionar fuertemente hasta que brote del fondo de la lesin un lquido
translcido. Este procedimiento es doloroso para el paciente, pero debe
soportar el dolor sin anestesia.
5-
Causar leve abrasin con el tubo capilar sin causar sangramiento, rpidamente dejar caer en el centro de la lesin una gota de solucin salina
del tubo capilar, succionarla. Gotearla de nuevo en la lesin, dos o tres
veces ms. Debe usarse lo menos posible de solucin salina para no diluir la muestra, que debe ser un lquido lechoso ligeramente hemorrgico
que queda dentro del tubo capilar. Puede usarse pipeta Pasteur o asa
estril si se considera ms fcil de manejar.
6-
Colocar con cuidado una gota de la muestra as obtenida en un portaobjetos limpio, cubrir con cubre-objetos a manera de no dejar burbujas
en la preparacin en fresco.
7-
Descartar el tubo capilar en un lugar adecuado, tomando en cuenta que

es material muy infectivo. Limpiar el bulbito de hule con algodn y alcohol, lo mismo que los guantes antes de quitrselos.
8-
Transportar la muestra con su respectiva solicitud de laboratorio lo ms

pronto posible, y examinarla inmediatamente con campo oscuro. No
debe retrasarse la observacin porque las espiroquetas pierden su movilidad tpica.
154
9-
Cambiar el condensador de campo claro corriente que se usa en el microscopio, por un condensador especial para campo oscuro. Bajar el
condensador de campo oscuro y colocarle dos gotas de aceite de
inmersin de buena calidad, de manera que no queden burbujas de aire.
Colocar la muestra en la platina con el cubre-objetos hacia arriba. Subir
lentamente el condensador hasta que el lente pegue con el aceite por debajo de la lmina (que no queden burbujas). Aumentar la intensidad de
la luz del microscopio al mximo, luego enfocar la muestra con seco
dbil; subir y bajar lentamente el condensador hasta que se obtenga el
mximo de contraste, es decir los objetos ms brillantes y el campo ms
oscuro.
10-
Cambiar al lente seco fuerte (de preferencia con diafragma) y enfocar de

nuevo con el tornillo micromtrico y la altura del condensador. Una vez
claramente enfocado, buscar detenidamente bacterias (ver foto y figura
12) con las siguientes caractersticas:
a)
b)
c)
d)
e)
f)
Tamao ligeramente mayor al dimetro promedio de un eritrocito

(8 micras).
Muy finas alargadas y en forma de espiroquetas (como saca-corchos).
Espiras regulares que no desaparecen al moverse.
De 8 a 14 espiras en cada bacteria.
Movimiento rpido de flexin en el centro y rotacin sobre su eje
mayor (en la mayora de las muestras).
Movimiento activo hacia adelante y hacia atrs (especialmente en
muestras de chancros bien desarrollados con abundante material
mucoide y viscoso).
11-
Dependiendo del estado de la lesin, puede observarse de un slo

microorganismo en 20 campos hasta 50 por campo.
12-
El procedimiento de campo oscuro tambin sirve para observar T.

pallidum de lesiones en piel de pacientes con sfilis secundaria. Para tomar la muestra forrar ambas ramas de una pinza con tubo de hule. Morder la lesin firmemente a manera de forzar la salida de lquido transparente el cual se observa en campo obscuro segn el procedimiento
descrito.
155
Interpretacin de resultados e informe:

Debe tomarse en cuenta que espiroquetas de idntica morfologa forman parte de la microbiota de los genitales y la boca, por lo que son indiferenciables y
pueden causar falsos positivos. Este factor debe ser tomado en cuenta por el mdico e interpretarse segn la sintomatologa del paciente, no es responsabilidad del
laboratorio que debe reportar lo observado.
Si la observacin en campo obscuro coincide con la mayora de las caractersticas descritas en el punto 10 anterior, reportar as:
Campo oscuro: POSITIVO, se observan (escasas, regulares, abundantes)
espiroquetas de morfologa compatible con Treponema pallidum.
En caso que slo se observen leucocitos y eritrocitos escasos, pero no
espiroquetas, reportar as:
Campo oscuro: NEGATIVO, no se observan espiroquetas.
Los treponemas son bacterias muy delgadas y por lo tanto difciles de colorear. Antiguamente se utilizaban coloraciones por impregnacin con sales de plata
para observarlos, con malos resultados. Ninguno de los tratados modernos revisados para la preparacin del presente manual menciona este tipo de coloraciones,
que han cado en desuso. Puede utilizarse el condensador de contraste de fases,
pero los treponemas se observan menos obvios que con campo oscuro. Si no se
cuenta con microscopio con campo oscuro, remitir al paciente a una unidad que s
cuente con esta facilidad.
156
AGENTES INFECCIOSOS DEL TRACTO GENITAL FEMENINO

Gerardo Arroyo, QB, CMIAC, MSc.
Director de la Escuela de Qumica Biolgica
Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia
Universidad de San Carlos de Guatemala
INTRODUCCION
Los procesos infecciosos del tracto genital femenino (TGF) son el motivo de consulta ms frecuente en las clnicas de Ginecologa. Se manifiestan
clnicamente por la presencia de flujo vaginal, prurito, eritema, dispareunia o
sangrado anormal (menorragia o metrorragia). Las infecciones del TGF son
importantes adems de las molestias que causan a la paciente, por las potenciales complicaciones al diseminarse a otros rganos como el tero o las trompas de Falopio y porque representan tambin un riesgo para el feto en la
mujer embarazada.
Segn el rea anatmica afectada por los procesos infecciosos, stos pueden clasificarse como vaginitis, vulvovaginitis, cervicitis, endometritis,
salpingitis, enfermedad plvica inflamatoria (EPI) o abcesos tubo-ovricos.
Esta clasificacin brinda las bases para el manejo clnico y tambin orienta
sobre la etiologa, epidemiologa y tratamiento de los mismos. Es tambin
importante mencionar, que durante las diferentes etapas fisiolgicas de la
vida de la mujer (niez, edad reproductiva, postparto o postmenopausia), se
presentan con mayor o menor frecuencia algn tipo de microorganismos en
particular.
VAGINITIS
La etiologa de la vaginitis depende de la edad y de la etapa fisiolgica
de la paciente, por lo que debe dividirse en vaginitis en nias premenrquicas,
vaginitis en la mujer en edad reproductiva y vaginitis en la mujer
postmenopusica. Los sntomas y signos clnicos de la vaginitis incluyen
flujo vaginal, prurito, eritema de la mucosa vaginal y exocervical y sangrado
anormal. Estas manifestaciones son interpretadas de diversas maneras por
las pacientes que pueden aceptar condiciones patolgicas como normales, o
157
viceversa. Por este motivo, es importante establecer criterios objetivos que

permiten determinar cuando se encuentra presente un proceso infeccioso y
cuando son situaciones fisiolgicas. La vaginitis es definida objetivamente
cuando se encuentran trastornos cualitativos o cuantitativos en el flujo vaginal
y/o sntomas asociados a la presencia de microorganismos patgenos. Los
cambios cualitativos incluyen aumento del pH por arriba de 4.5, prueba de
amina positiva y presencia de clulas clave.
1.
Vaginitis en nias premenrquicas
La vagina de las nias despus de 30 das de nacidas, es susceptible de

infectarse con Neisseria gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis, as como por otros
microorganismos como Streptococcus spp. y enterobacterias. Las infecciones
por Candida spp. son sumamente raras en nias antes de la pubertad. El
origen de las infecciones gonoccicas y clamidiales en nias, es el abuso sexual;
y por el contrario, las infecciones por estreptococos y enterobacterias son por
contaminacin ano-vaginal.
Existen procesos inflamatorios no infecciosos que se diagnostican con
mayor frecuencia en nias e incluyen vaginitis a cuerpo extrao, vaginitis
atrfica, (asociada muchas veces a mala higiene perianal), as como cierto
nmero de casos de vaginitis por Enterobius vermicularis.
2.
Vaginitis en la mujer de edad reproductiva
Durante los aos de la vida reproductiva de la mujer, la vaginitis se

presenta con una frecuencia de hasta 40% en embarazadas, 25% en mujeres
de clnicas de planificacin familiar y 18% en adolescentes. Ms del 80% de
los casos de vaginitis infecciosa son causadas por Trichomonas vaginalis
(protozoo), Candida spp. (hongo) y la llamada vaginosis bacteriana (VB). Adems de estos microorganismos, tambin pueden aislarse estreptococos,
estafilococos y enterobacterias. Otras etiologas incluyen la vaginitis ulcerativa
que acompaa al Sndrome de Choque Txico, vaginitis asociada al uso de
tampones, vaginitis por cuerpos extraos, vaginitis alergica al Nonoxinol-9
(espermicida) y otros tipos de vaginitis idioptica.
158
3.
Vaginitis en mujeres postmenopusicas
Durante la etapa postmenopusica, el epitelio atrfico es susceptible de

inflamaciones que tienen su origen principalmente en la falta de maduracin
epitelial por ausencia de estmulo estrognico. La ms comn e importante
en este grupo de pacientes es la vaginitis atrfica, la cual es en la mayora de
los casos no infecciosa y responde satisfactoriamente al tratamiento local o
sistmico con estrgenos.
A.
Tricomoniasis
La tricomoniasis es una enfermedad de transmisin sexual, que se presenta clnicamente con flujo vaginal profuso, de color amarillo-verdoso, a veces
espumoso, de mal olor, acompaado de prurito, y eritema de la vagina y
exocrvix. El eritema del exocrvix ha sido descrito como cuello en fresa.
El pH del flujo vaginal es arriba de 5.0, la prueba de amina es generalmente
positiva y al examen en fresco es posible observar Tropozoitos mviles de
Trichomonas vaginalis, con un alto grado de sensibilidad y especificidad.
La tricomoniasis ha sido identificada en 10.3% de mujeres embarazadas, 7.3% de mujeres en clnicas de planificacin familiar y en 8.5% de mujeres adolescentes (12 a 18 aos).
B.
Candidosis vulvovaginal
La candidiasis vulvovaginal, generalmente causada por Candida albicans,

puede transmitirse sexualmente, la mayora de los casos se deben a contaminacin ano-vaginal. Clnicamente se presenta con prurito, irritacin vulvar y
un flujo espeso de color blanco espeso que semeja leche cortada y que se adhiere a las paredes vaginales. El pH es muy parecido al normal o menor y la
reaccin de amina es negativa. El examen en fresco revela la presencia de
levaduras, micelio y pseudomicelio asociado a variable cantidad de leucocitos
polimorfonucleares.
En diferentes grupos de mujeres guatemaltecas se ha reportado una frecuencia de 12.6% en embarazadas, 5.3% en pacientes de planificacin familiar
y 6.8% en adolescentes.
159
C.
Vaginosis bacteriana
La VB es el tipo ms frecuente de vaginitis infecciosa. Se ha reportado

en 20.1% de mujeres embarazadas, 13.5% de pacientes en planificacin familiar y en 1.7% de adolescentes. Esta enfermedad ha recibido diversos nombres, entre ellos vaginitis inespecfica, vaginitis por Gardnerella y vaginosis
inespecfica entre otros, de los cuales el trmino VB es quizs el ms apropiado en vista de que el epitelio escamoso no muestra generalmente infiltracin
leucocitaria. La VB se define como el sobrecrecimiento de otras bacterias sobre la microbiota normal de bacilos de Dderlein. Entre las bacterias que han
sido aisladas de casos de VB se encuentran Gardnerella vaginalis, Bacteroides
spp., Eubacterium lentum, Peptococcus spp., Peptostreptococcus spp., Mycoplasma
hominis, Mobiluncus curtisii y Mobiluncus mulieri.
La presentacin clnica incluye secrecin vaginal acuosa homognea, de
color blanco grisceo que se adhiere a las paredes vaginales, con mal olor. El
pH del flujo vaginal es generalmente mayor de 5.0, la reaccin de amina es
positiva y es caracterstica la presencia de clulas clave. El frote Gram revela
la ausencia de bacilos de Dderlein (gram-positivo) y abundantes bacilos
pleomrficos gram-negativo. Los frotes Gram son de utilidad cuando se interpretan como presencia de microbiota normal, microbiota mixta o compatibles con VB. El diagnstico de esta condicin se establece cuando se encuentran presentes tres criterios de los antes mencionados, incluyendo entre
ellos la presentacin clnica caracterstica. Los cultivos in vitro no son tiles
para el diagnstico, en vista de que es posible aislar la mayora de los
microorganismos mencionados en pacientes sanas.
CERVICITIS
La cervicitis es la inflamacin del canal endocervical y las glndulas
endocervicales y en la mayora de los casos, los sntomas son vagos e
inespecficos. Los agentes infecciosos ms importantes son Neisseria gonorrhoeae
y Chlamydia trachomatis. Adems de estos microorganismos son importantes
el virus Herpes simplex y por extensin de los procesos infecciosos vaginales,
Trichomonas vaginalis y Candida albicans.
En nuestro medio se ha reportado cervicitis en un 10.6% de mujeres embarazadas (gonorrea=0.7% y clamidia=5.3%), 9.2% de pacientes en clnicas
160
de planificacin familiar (gonorrea=0.3% y clamidia=7.0%) y en 9.0% de las

adolescentes (gonorrea=1.7% y clamidia=6.8%).
El diagnstico clnico de cervicitis no es posible en muchos casos pues
adems de que los sntomas no son siempre caractersticos, los signos pueden confundirse con otras condiciones. Por esta razn es importante hacer
nfasis en los aspectos objetivos que correlacionan mejor con el diagnstico
de cervicitis. Entre ellos se encuentra la observacin de muco-pus procedente del canal endocervical. Esto se efecta por medio de la prueba del hisopo
endocervical, la cual se basa en que al retirarlo del canal muestra coloracin
amarilla, verde o roja que indica muco-pus o friabilidad de la mucosa, y la
presencia de ms de 10 leucocitos polimorfonucleares por campo de 40X.
El diagnstico etiolgico debe buscar la presencia de N. gonorrhoeae y C.
trachomatis. El diagnstico microbiolgico de clamidia se basa en la deteccin
de antgenos del microorganismo mediante tcnicas de ELISA o pruebas rpidas. Las tcnicas citolgicas que utilizan Papanicolaou o Giemsa para identificar clulas con inclusiones, han demostrado muy baja sensibilidad aunque
una especificidad aceptable, por lo que no deben utilizarse para diagnstico.
OTROS AGENTES ETIOLGICOS

Mycobacterium tuberculosis
endometritis, salpingitis
Actinomyces spp. y Arachnia sp.
colonizacin uterina en pacientes
Entamoeba gingivalis (protozoo)
con dispositivos intrauterinos
Entamoeba histolytica (protozoo)
vaginitis, cervicitis
Enterebius vermicularis (helminto)
vaginitis en nias
161
CAPTULO 14
LQUIDO CEFALORRAQUDEO Y
FLUIDOS CORPORALES
PROPSITO:
Demostrar por medio de bacterioscopa con Gram y cultivo, la presencia de
bacterias en estas muestras, que normalmente deben ser estriles. Las bacterias que
tienen mayor importancia en el lquido cefalorraqudeo son:
Gram negativo:
Neisseria meningitidis (causa meningitis meningoccica severa)
Haemophilus influenzae (especialmente en nios de 6 meses a 4 aos de
edad)
Escherichia coli y otras enterobacterias (en pacientes debilitados, neonatos
y post-craneotoma)
Gram-positivo:
Streptococcus pneumoniae (muy importante)
Streptococcus sp. (grupos B y D en neonatos)
Listeria monocytogenes (raro)
Otros microorganismos importantes:
Mycobacterium tuberculosis, Leptospira interrogans y Treponema pallidum
(bacterias).
Cryptococcus neoformans y Candida albicans (hongos levaduriformes)
V arios virus (enterovirus, paperas y otros).
MUESTRA:
Las muestras incluidas en los fluidos corporales son:
Lquido cefalorraqudeo (conocido tambin como fluido espinal o LCR)
163
Lquido ventricular (lquido cisternal, lquido craneal)

Fluido abdominal (lquido peritoneal o asebico, lquido de parasentesis, lquido de dilisis, bilis)
Lquido pleural, torasentesis y empiema (obtenido del trax)
Lquido pericrdico
Lquido sinovial
Mdula sea, sangre (ver captulo de hemocultivo y mielocultivo)
Por lo general estas muestras son obtenidas por el mdico que solicita su anlisis. Deben obtenerse antes de iniciar tratamiento con antibiticos y las debe colectar en recipientes estriles proporcionados por el laboratorio.
Las muestras deben transportarse inmediatamente al laboratorio y ser procesadas inmediatamente no despus de 30 minutos de recolectadas. Rotular con el
nombre del paciente, nmero de registro, fecha y naturaleza de la muestra. Si el
mdico sospecha que la muestra puede contener bacilos alcohol-cido resistentes
debe hacerlo saber en su solicitud al laboratorio.
Los sntomas de irritacin de las meninges (membranas que cubren el cerebro
y la mdula espinal), que puede ser causada por microorganismos son: fiebre, dolor de cabeza, vmitos, rigidez y dolor de nuca, reflejos aumentados, estupor a
coma y petequias en la piel. En los nios estos sntomas son vagos e inespecficos,
por esta razn slo los resultados del laboratorio pueden establecer el diagnstico.
En caso de meningitis bacteriana, el lquido cefalorraqudeo (LCR) generalmente
es purulento (turbio), con abundantes leucocitos (generalmente ms de 1,000 por
milmetro cbico), con predominio de neutrfilos polimorfonucleares y glucosa
disminuida (consumida por las bacterias). En la meningitis tuberculosa, generalmente el LCR es lmpido y su glucosa normal.
ETIOLOGA Y SINTOMATOLOGA DE INFECCIN SEA Y ARTICULACIONES
SIGNOS Y SNTOMAS
Edema articular
Eritema y calor
Dolor al movimiento
Dolor a la palpacin
Rayos X: sinovitis u osteomielitis
Enterobacterias
Micobacterias
164
PROCEDIMIENTO:
1.
El mdico debe obtener la muestra (LCR o cualquier otro fluido corporal del cual desee examen completo) en dos tubos estriles 13 x 100 con
tapn de rosca o frasquitos estriles que cierren bien. Enviarlos inmediatamente al laboratorio. Mantener la muestra dentro de la incubadora a 36C mientras se procesa. En caso de recibirse un solo frasquito
separar aspticamente en dos porciones.
2.
Uno de los tubos no se centrifuga, enviarlo a donde corresponda

para citologa (recuento total de clulas), recuento diferencial
(frmula) y anlisis qumico. El otro tubo sirve para el anlisis
microbiolgico.
3.
Centrifugar la muestra 15 minutos a alta velocidad (2500-3000 rpm). Decantar aspticamente, tapar agitar y procesar slo el sedimento.
4.
Sembrar una asada del sedimiento en cada uno de estos medios:

Agar sangre de carnero al 5%
Agar chocolate
MacConkey
Sabouraud (hongos), no Micosel
Tioglicolato
Lowenstein-Jensen (slo si se solicita)
5.
Diseminar por estras en toda la superficie de los medios slidos. Introducir el agar sangre de carnero y el agar chocolate en jarro hmedo con
candela encendida. Incubar todos los medios a 36C, excepto el
Sabouraud que se incuba a 27C (o a temperatura ambiente para aislamiento de hongos patgenos especialmente Cryptococcus neoformans).
6.
En porta-objetos nuevos o bien limpios con alcohol, hacer dos frotes

pequeos (de aproximadamente un centmetro de dimetro) en el
centro de la lmina. Si el material es muy escaso poner una gota
del sedimiento, dejar secar, luego colocar otra gota encima y dejar secar
de nuevo.
7.
Colorear un frote con Gram y otro con Ziehl-Neelsen.
165
Fig. 11 MARCHA BACTERIOLGICA PARA

LQUIDO CEFALORRAQUDEO (LCR)
Muestra: LCR obtenido siempre por el mdico, en

dos recipientes estriles, ya sea tubos o
frasquitos preparados por el laboratorio.
1. Enviar un recipiente sin centrifugar a Citologa y
Qumica
2. Centrifugar 15 minutos, decantar aspticamente y procesar sedimento
GRAM
ZIEHL-NEELSEN
sedimento
3. RUTINARIAMENTE SEMBRAR EN
agar sangre
agar
MacConkey
de carnero chocolate
Sabouraud
4. Incubar en jarro
con candela
OPCIONAL
Tioglicolato Lowenstein-Jensen
NO INCLINAR
5. Incubar aerbicamente a 36o C,

Sabouraud a 27o C
6. Aislamiento e identificacin de bacterias, micobacterias u hongos

166
Lo ms pronto posible, observar los frotes de sedimento de LCR con lente de
inmersin. En vista que del resultado de los frotes depende el tratamiento inmediato de pacientes con infeccin grave de las meninges, su observacin debe hacerse con todo cuidado. Poner especial cuidado en observar las siguientes morfologas:
1.
Diplococos gram-negativo (rojos), arrionados, dispuestos en parejas

como granos de caf, idnticos a N. gonorrhoeae de pus uretral: morfologa
compatible con N. meningitidis. Dar alerta al mdico inmediatamente.
2.
Cocobacilos gram-negativo (rojo plido) pleomrficos, con escasas formas bacilares: morfologa compatible con H. influenzae, agente de
meningitis en nios de 6 meses a 4 aos; raro en adultos.
3.
Cocos gram-positivo (morados), lanceolados, ovalados, dispuestos en

parejas o cadenas cortas, la cpsula se insina como un halo claro
alrededor de las bacterias: En LCR morfologa compatible con
S. pneumoniae. En otros fluidos puede ser S. pyogenes con mayor
frecuencia.
4.
Bacilos gram-negativo (rojos) de coloracin slida, no pleomrficos,

bacilos alargados: morfologa compatible con enterobacterias o
pseudomonas (E. coli, Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa, etc.)
5.
Levaduras redondeadas, algunas con gemaciones laterales, gram-positivo, se insina cpsula, hacer tinta china para demostrar la presencia
de la levadura capsulada C. neoformans.
6.
En el Ziehl-Neelsen: bacilos alcohol-cido resistente (rojos), cortos, algunos con coloracin dispareja en forma de grnulos: morfologa compatible con M. tuberculosis.
Si hay bacterias en los frotes, el laboratorio est en la obligacin de alertar al

mdico de inmediato. Reportar el Gram segn se indic. Es muy importante sealar la cantidad y clase de leucocitos presentes. Si la morfologa es tpica, informar
con que bacteria es compatible segn las explicaciones anteriores. Si no hay seguridad, reportar slo el tipo y cantidad de bacterias observadas.
167
Los cultivos deben observarse a las 24 horas de incubacin a 36C. Si no se

observa crecimiento, reincubar todas las cajas. Si a las 48 horas de incubacin tampoco hay crecimiento, apuntar en el libro de control: N-48, y reportar Negativo a
las 48 horas de incubacin a 36C en aero-anaerobiosis. Si se observa algn crecimiento a las 24 48 horas, comparar con la siguiente tabla:
Crecimiento en
BACTERIA
Agar Sangre
Agar Chocolate
MacConkey
Tioglicolato
Sabouraud
-/+
H. influenzae
S. pneumoniae
+/-
Enterobacterias
y pseudomonas
Cryptococcus
neoformans
Anaerobios
N. meningitidis
Hacer frote Gram de las colonias para confirmar morfologa e identificar

segn los captulos anteriores, as:
BACTERIA
*
**
COLONIAS
PRUEBAS DE CONFIRMACIN
N. meningitidis
Pequeas (1 mm de dimetro o menos)

brillantes, bordes enteros, no hemolticas)
Oxidasa*, azcares en CTA (ver

tabla en captulo 13)
H. influenzae
Muy pequeas (puntiformes) brillantes,

bordes enteros, no hemolticas)
Prueba de satelitismo con Staphylococcus aureus**
S. pneumoniae
Pequeas (1 mm de dimetro o ms)

aplanadas, alfa hemolticas
Inhibicin por disco de optoquina

(ver captulo 8)
Enterobacterias
Grandes, brillantes, bordes lisos crecen

en todos los medios. Notar en
MacConkey si son lactosa positivo
(rojas) o negativo (incoloras)
TSI/LIA/MIO/urea/citrato; o API.
Aglutina-cin con antisueros
Aglutinar con antisueros especficos, los grupos ms frecuentes son A, B y C. Hacer antibiograma
en agar Mueller-Hinton con 5% de sangre, achocolatdo.
Prueba de satelitismo para H. influenzae (de LCR, secreciones) y H. aegyptis (de ojos).
168
Efectuar la prueba de satelitismo as:

1.
2.
3.
4.
5.
Obtener un cultivo puro en agar chocolate en jarro hmedo con candela, a 36 C.

Tomar una asada y estriar en la superficie de una caja de agar sangre,
slo en una direccin.
Tomar una asada de un cultivo de Staphylococcus aureus (de otro cultivo
cualquiera o de preferencia una cepa pura mantenida en refrigeracin).
Hacer con el asa en argolla una sola estra recta, perpendicular a las
estras del Haemophilus.
Incubar en jarro con candela 24 horas a 36 C y luego examinar con lupa
y buena luz.
Una reaccin positiva se manifiesta por el crecimiento de pequeas colonias puntiformes y translcidas que crecen slo muy cerca de la estra
de S. aureus.
INFORME:
El informe del frote Gram de LCR debe haberse enviado previamente, el da
en que se recibi la muestra. Despus informar lo ms pronto posible el resultado
del cultivo con el nombre correcto de la bacteria, y la cantidad de colonias observadas (escaso, regular, abundante cantidad) en las cajas originales, por ejemplo:
Primer informe, entregar el mismo da de obtencin de la muestra:
Frote Gram: Se observan escasos diplococos gram-positivo, lanceolados
y capsulados, de morfologa compatible con S. pneumoniae. Leucocitos
polimorfonucleares: regular cantidad. Cultivo: Pendiente
Segundo informe, entregar el da que termina la identificacin:
Cultivo: Se aisl S. pneumoniae. Antibiograma.
169
CAPTULO 15
TEJIDOS Y BIOPSIAS
PROPSITO:
Demostrar por frote y cultivo la presencia de bacterias en piezas de tejidos de
sala de operaciones, o piezas an ms pequeas obtenidas por biopsia. Las bacterias que pueden estar presentes son muy variadas. Anteriormente slo se efectuaba histopatologa de estas muestras, en la actualidad el examen microbiolgico es
tambin de gran ayuda diagnstica. Adems, la microbiologa post-mortem contribuye a elucidar las infecciones mortales.
MUESTRA:
Este tipo de muestras son exclusivamente obtenidas por el mdico en condiciones aspticas, y depositadas en recipientes estriles de boca ancha con un poco
de solucin salina estril, proporcionados por el laboratorio.
Debe obtenerse suficiente cantidad y no debe adicionarse ninguna sustancia
fijadora como formol. Despus de procesarse, la muestra debe almacenarse en refrigeracin o congelacin, en solucin salina estril para que no se deseque, con el
propsito de preservarla para nuevos estudios, ya que generalmente hay riesgo
para el paciente al tomar nueva muestra.
De lcera o tractos fistulosos debe efectuarse curetaje profundo tomando parte del tejido de la pared del tracto fistuloso. Debe desinfectarse la piel circundante
e introducir un catter venoso de plstico estril, y luego aspirar con jeringa estril.
De las lceras obtener material de la base. Si se justifica, el material de estas muestras debe obtenerse en algn medio de transporte anaerbico adecuado (ver captulo 17). En el caso de material de fstulas, debe hacerse una preparacin en fresco
para buscar grnulos de Actinomyces, Nocardia u hongos.
Para obtener cultivos de material de autopsia, la piel debe ser desinfectada
aplicando una esptula caliente para quemar la piel. Si se trata de un rgano, debe
sumergirse en agua hirviendo por 5 a 10 segundos, y luego debe disecarse con
instrumentos estriles y tomar para cultivo material del centro. La mitad de la
171
muestra debe fijarse en formol, y la otra enviarse en recipiente estril con un poco
de solucin salina estril al laboratorio de microbiologa.
PROCEDIMIENTO:
No es adecuado inocular los medios slo tocando o frotando la pieza con una
asa. Debe hacerse de la siguiente manera:
1-
Colocar la pieza con pinzas estriles en una caja de Petri estril. Con
tijeras estriles, picarla finamente y luego pasarla a un macerador de
tejido estril o, si no lo hay, a un pequeo mortero estril.
2-
Usar arena esteril para triturar bien la muestra. Si se hace en un mortero, adicionar una pequea cantidad de solucin salina estril. Dejar sedimentar para cultivar el sobrenadante. Si se sospecha la presencia de
hongos, no triturar, slo picar finamente con tijeras estriles.
3-
Con aguja y jeringa estriles, aspirar aspticamente una porcin del

sobrenadante. Inyectar aproximadamente un mililitro en un frasco de
caldo para hemocultivo.
4-
Seleccionar los otros medios de cultivo a inocularse con base en el o los

microorganismos sospechados, u observados en una coloracin de Gram.
Si se desconoce la historia del paciente inocular con una gota del resto
de la muestra en la jeringa los siguientes medios: agar sangre de carnero
al 5%, agar chocolate, MacConkey, manitol-sal, tioglicolato, Sabouraud,
mycosel y Lowenstein-Jensen.
5-
Incubar a 36C el agar sangre y el agar chocolate en jarro hmedo con

candela; MacConkey, manitol-sal, tioglicolato y Lowenstein-Jensen,
aerbicamente a 36C, y los tubos de Sabouraud y mycosel a 27C o a
temperatura ambiente.
6-
Preparar dos frotes, colorear uno con Gram y el otro con Ziehl-Neelsen.
7-
Las muestras de sangre de autopsia deben procesarse como hemocultivo,

sin importar la presencia de cogulos.
172
INTERPRETACIN DE RESULTADOS E INFORME

Si se observa crecimiento en los medios despus de 24 a 48 horas de incubacin,
hacer las coloraciones y sub-cultivos adecuados para efectuar la identificacin segn el caso. Pueden encontrarse los siguientes microorganismos con inters clnico: anaerobios como Actinomyces sp., bacterias aerobias comunes, Nocardia sp.,
hongos sistmicos y Mycobacterium sp. Descartar cultivos para bacterias a las 48
horas de incubacin, cultivos para hongos despus de dos semanas y el LowensteinJensen despus de 6 semanas de incubacin. Reportar segn las normas de los
captulos anteriores.
173
ANUNCIO
ZITHROMAX
175
DOCUMENTO
ZITHROMAX
176
CAPTULO 16
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
(ANTIBIOGRAMA)
PROPSITO
La prueba de susceptibilidad sirve para determinar in vitro a qu antibiticos
es susceptible o resistente una determinada cepa bacteriana aislada del paciente.
Este mtodo permite al mdico escoger el antibitico ms adecuado con base cientfica proporcionada por el laboratorio, y evita dar tratamientos tiles.
Susceptible: Cuando los microorganismos responsables de una infeccin son
inhibidos por concentraciones de antibitico obtenidas con un rgimen usual de
dosificacin.
Moderadamente susceptible: Cuando los microorganismos son inhibidos por
concentraciones altas de antibitico.
Resistente: Si los microorganismos que causan la infeccin, toleran concentraciones de antibitico superiores a las que pueden obtenerse en la sangre por
medio de un rgimen usual de dosificacin.
Intermedio (Indeterminado): Hoy en da se considera como prueba errtica
que por lo tanto debe repetirse, ya que realmente se trata de una poblacin bacteriana
resistente.
El nombre Antibiograma es adecuado para designar esta prueba, pero no
lo es Prueba de sensibilidad, pues las bacterias no sienten la accin de los
antibiticos, son susceptibles a estos medicamentos. La tcnica que debe usarse es
la de Bauer-Kirby, ligeramente modificada por el Comit Nacional de Estndares
para Laboratorios Clnicos de Estados Unidos (NCCLS).
MEDIO DE CULTIVO
Por medio de la tcnica de Bauer-Kirby modificada se obtienen resultados
confiables, reproducibles y de gran utilidad clnica siempre y cuando se sigan al
pie de la letra las instrucciones de este captulo. Es una tcnica relativamente sen177
cilla que siempre debe efectuarse con el agar de Mueller-Hinton; el grosor de la

caja, concentracin del inculo, humedad, temperatura y otros factores deben estar
perfectamente estandarizados para que los resultados puedan ser comparables entre
los diversos laboratorios. Es muy importante tomar en cuenta que esta tcnica slo
sirve para efectuar el antibiograma de las siguientes bacterias aerbicas o facultativas de crecimiento rpido:
-
Enterobacterias
Pseudomonas
El antibiograma para Haemophilus spp. y Neisseria spp. debe hacerse en MuellerHinton con 5% de sangre, achocolatado.
Preparar el agar Mueller-Hinton segn las indicaciones del productor y con
las siguientes caractersticas:
1-
Las cajas de Petri de tamao estndar (100 mm de dimetro), deben

llenarse con aproximadamente 25 ml del agar lquido ya autoclaveado,
a manera de dar un medio de 4 mm de grueso.
Idealmente deben usarse cajas de Petri descartables de plstico, de 150
mm de dimetro con la misma profundidad, para poder colocar los discos ms separados
2-
Deben guardarse en la refrigeradora dentro de bolsas plsticas selladas,

(de 2 a 8 C), por no ms de 7 das.
3-
El pH del medio debe ser de 7.2 a 7.4. Medir el pH del medio con
potencimetro. Dejar solidificar un poco del medio dentro de un pequeo beaker alrededor del electrodo del aparato. Ajustar si es necesario,
antes de autoclavear, con NaOH 1N, o HCl 1N.
4-
De cada lote de medio, incubar dos cajas por 24 horas a 36 C para comprobar su esterilidad. Descartar estas cajas ya que no son adecuadas
para efectuar antibiograma despus de ser incubadas.
5-
Inmediatamente antes de usar el medio Mueller-Hinton, secarlo a 36 C.

Colocar las cajas en la incubadora por 20 minutos con el medio arriba y
la tapadera ligeramente abierta.
178
Almacenaje de discos con antibiticos

Para que el procedimiento proporcione datos con verdadera correlacin clnica, en primer lugar debe tomarse la siguiente precaucin para el almacenaje de los
discos de papel impregnados con los diferentes antibiticos, que se obtienen comercialmente. Almacenar los discos de acuerdo con las siguientes instrucciones,
para que no pierdan su potencia:
1-
Congelar (idealmente a -20 C) los discos de penicilina, ampicilina,

carbenicilina y cefalosporinas. Descongelar peridicamente slo los discos que sern usados durante la semana. Descongelarlos por lo menos
dos horas antes de usarse.
2-
Los discos del resto de antibiticos pueden almacenarse refrigerados

sin congelacin. De preferencia con una pastilla desecante.
3-
Si se usan los cartuchos de discos montados en dispensador, introducir

dos pastillas desecantes de las que vienen con los discos y cerrar bien
despus de usar.
PROCEDIMIENTO:
Efectuar el antibiograma as:
1-
Con el asa flameada y fra tomar 4 a 5 colonias bien aisladas y de igual

morfologa del cultivo original en cualquier medio slido. Debe trasladarse siempre un cultivo puro.
2-
Inocular un tubo con 4 ml de caldo tripticasa soya o caldo infusin de

cerebro y corazn (BHI).
3-
Incubar el caldo de 2 a 5 horas a 36 C, hasta que aparezca una ligera

tubidez.
4-
Ajustar la turbidez del caldo a la turbidez del estndar de MacFarland

0.5. Si el caldo es ms turbio que el estndar agregarle ms caldo o solucin salina estril. Comparar ambos tubos (muestra y estndar) con buena
luz y frente a un fondo blanco con una lnea negra para evaluar
visualmente la turbidez.
179
Preparar el estndar 0.5 de MacFarland as: mezclar 0.5 ml de cloruro de

bario 0.048 M (1.175 g BaCl2. 2H2O en baln de 100 ml, aforar con agua
destilada), ms 99.5 ml de cido sulfrico 0.36 N (1 ml de H2SO4 en
baln de 100 ml, aforar con agua destilada). Llenar tubos que cierren
bien, sellarlos, guardarlos en la oscuridad con fecha. Hacer nuevo
estndar cada 6 meses.
5-
Antes de quince minutos de diludos los caldos, inocular la caja presecada de agar Mueller-Hinton as: introducir un hisopo estril en el
caldo de turbidez igual al estndar; exprimir bien el hisopo presionndolo firmemente contra las paredes del tubo, arriba del nivel del caldo.
6-
Con el hisopo exprimido sembrar la caja en tres direcciones opuestas

sobre toda la superficie, cerca del mechero encendido. En caso de urgencia puede sembrarse la prueba con la muestra directa, slo si el frote
Gram revela una sola clase de bacteria (LCR o secreciones varias), pero
esto debe evitarse y considerarse preliminar.
7-
Dejar secar la caja de 3 a 5 minutos, pero no ms de 15 minutos, con la

tapadera cerrada.
8-
Con pinzas estriles o dispersador especial, colocar los discos impregnados de antibiticos a manera de que queden lo ms separados entre s
que sea posible. Con las pinzas flameadas y fras presionar los discos ya
colocados para adherirlos bien al medio de cultivo.
Escoger los antibiticos a colocar dependiendo de la bacteria estudiada,
segn el listado bsico actualizado de cada laboratorio y de acuerdo
con los listados oficiales del NCCLS (1995), que aparecen en las pginas
182 y 183 de este manual.
Es preferible usar discos comerciales y no los obsequiados por el productor del antibitico. Al recibir discos obsequiados por el productor
del antibitico, debe verificarse que stos sean elaborados por una compaa especializada (por ejemplo: DIFCO o BBL), y no por la misma
compaa productora del antibitico.
9-
Invertir las cajas e incubarlas por 16 a 18 horas a 36 C, nunca usar jarro

con candela (excepto para Haemophilus spp. y Neisseria spp.)
180
Fig. 12 MARCHA BACTERIOLGICA PARA ANTIBIOGRAMA
1. Tomar 4 5 colonias
de igual morfologa
del cultivo original
2. Inocular un tubo con
4 ml de caldo
Cualquier
medio slido
3. Incubar por 2 a 5 hrs a 36 C hasta alcanzar la

turbidez del estndar 0.5 de MacFarland
Agar Mueller-Hinton
5. Sembrar caja
pre-secada en tres
direcciones opuestas
4. Empapar hisopo estril, exprimir

bien contra las paredes del tubo
6. Dejar secar de 3 a 5
minutos (no ms de 15)
y colocar discos de
antibiticos para
gram-positivo o
gram-negativo
7. Incubar por 16 a 18 hrs a

o
36 C y medir dimetros
de halos de inhibicin;
interpretar segn tablas
181
ANTIBITICOS APROBADOS (FDA-USA) QUE DEBEN

USARSE RUTINARIAMENTE PARA PRUEBAS DE
SUSCEPTIBILIDAD EN VARIOS GRUPOS BACTERIANOS
Segn: NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards), M7-A3
(M100-56), 1995.
Enterobacterias:
Grupo A, prueba inicial, reportar siempre:
11. Ampicilina*
12. Cefazolina*
13. Cefalotina*
14. Gentamicina*
Grupo B, prueba inicial, reportar selectivamente:
15. Mezlocilina o piperacilina
16. Ticarcilina
17. Ampicilina-sulbactam* o amoxicilina-cido clavulnico
18. Piperacilina-tazobactam
19. Ticarcilina-cido clavulnico
10. Cefmetazol
11. Cefoperazona
12. Cefotetan
13. Cefoxitina*
14. Cefamandol/cefonicida/cefuroxima
15. Cefotaxima*/ceftizoxima/ceftriaxona
16. Imipenem
17. Amikacina
18. Ciprofloxacina*
19. Trimetoprim-sulfametoxazol*
*
De utilidad en infeccin urinaria, adems de carbenicilina, cinoxacina,

lamefloxacina/norfloxacina/ofloxacina, loracarbef y nitrofurantona.
182
Pseudomonas aeruginosa y otros bacilos gram-negativo facultativos no de la

familia Enterobacteriaceae:
11. Mezlocilina o ticarcilina
12. Piperacilina
13. Gentamicina
14. Ceftazidima
15. Ticarcilina-cido clavulnico
16. Cefoperazona
17. Aztreonam
18. Imipenem
19. Amikacina
10. Tobramicina
11. Ciprofloxacina
12. Trimetoprim-sulfametoxazol
Staphylococcus spp.:
11. Penicilina
12. Oxacilina o meticilina
13. Azitromicina
14. Vancomicina
15. Clindamicina
16. Claritromicina
17. Eritromicina
18. Trimetoprim-sulfametoxazol
1-
Despus de 16 a 18 horas de incubacin, examinar con buena luz las

cajas ya crecidas.
2-
Medir en milmetros el dimetro de los halos de inhibicin completa

183
con una regla por detrs de la caja de Petri, o con patrones especiales.
No tomar en cuenta escasas colonias separadas dentro del halo de inhibicin o crecimiento muy dbil (80% de inhibicin). Sin embargo, si se
observan mltiples colonias dentro del halo de inhibicin, stas deben
sub-cultivarse para descartar contaminacin. En caso de tratarse de la
misma bacteria que se analiza, repetir el antibiograma de las colonias
que crecen dentro del halo. El velo de crecimiento de Proteus sp. dentro del halo, tampoco debe tomarse en cuenta. Medir siempre hasta el
mrgen donde se inicia el crecimiento grueso.
3-
En el caso de sulfonamidas, puede ocurrir crecimiento dentro del halo,

el cual no debe tomarse en cuenta.
4-
En caso de urgencia puede efectuarse una lectura preliminar despus

de 5 6 horas de incubacin, siempre y cuando la caja se reincube y
posteriormente se enve el informe definitivo.
5-
Transformar las medidas de los dimetros de los halos de inhibicin en

milmetros, a: resistente, intermedio, moderadamente susceptible o susceptible por medio del uso de tablas actualizadas.
Se deben utilizar las tablas de interpretacin que son oficiales en Estados Unidos: National Comittee for Clinical Laboratory Standards
(NCCLS). Para este propsito, utilice las tablas de las pginas 185, 186 y
187 de este manual.
184
INTERPRETACIN DE LOS DIMETROS DE LAS ZONAS DE INHIBICIN (mm)

PARA MIEMBROS DE LA FAMILIA Enterobacteriaceae
Agente
antimicrobiano
Amikacina
Amoxicilinacido clavulnico
Moderadamente
Contenido
Resistente Intermedio
Susceptible
susceptible
del disco (mcg)
17
130
14
20/10
13
14-17
18
15-16
110
13
14-16
17
10/10
11
12-14
15
130
15
16-21
22
Cefamandol
130
14
15-17
18
Cefazolina
130
14
15-17
18
Cefmetazol
130
12
13-15
16
Cefonicida
130
14
15-17
18
Cefoperazona
175
15
16-20
21
Cefotaxima
130
14
15-22
23
Cefotetan
130
12
13-15
16
Cefoxitina
130
14
15-17
18
Ceftazidima
130
14
15-17
18
Ceftizoxima
130
14
15-19
20
Ceftriaxona
130
13
14-20
21
Cefuroxima (oral)
130
14
15-22
23
Cefuroxima (parenteral)
130
14
15-17
18
Cefalotina
130
14
15-17
18
Cloranfenicol
130
12
Ciprofloxacina
135
15
Gentamicina
110
12
Imipenem
110
13
Kanamicina
130
13
Mezlocilina
175
17
Netilmicina
130
12
Piperacilina
100
17
Tetraciclina
130
14
Ticarcilina
175
14
Ampicilina
Ampicilina-sulbactam
Aztreonam
185
18
13-17
16-20
21
15
13-14
14-15
16
18
14-17
18-20
21
15
13-14
18-20
21
19
15-18
15-19
20
(Continuacin)
Agente
Antimicrobiano
Ticarcilina-cido
clavulnico
Moderadamente
Contenido
Susceptible
del disco (mcg)
susceptible
20
75/10
14
310
12
1.25/23.75
10
11-15
16
Carbenicilina
100
19
20-22
23
Cinoxacina
100
14
15-18
19
Nitrofurantona
300
14
15-16
17
Norfloxacina
310
12
13-16
17
Ofloxacina
315
12
13-15
16
Sulfisoxazol
250 300
12
13-16
17
315
10
11-15
>16
Tobramicina
Trimetoprimsulfametoxazol
15-19
15
13-14
Reportar slo en
urocultivos:
Trimetoprim
INTERPRETACIN DE LOS DIMETROS DE LAS ZONAS

DE INHIBICIN (mm) PARA Staphylococcus spp.
Agente
antimicrobiano
Contenido
del disco
Moderadamente
Susceptible
susceptible
Amoxicilina- cido
clavulnico
120/10 mcg
19
20
Ampicilina
10 mcg/ml
28
29
15
10/10 mcg
11
15-17
Cefazolina
30 mcg
14
15-17
Cefotaxima
30 mcg
14
15-22
23
Ceftriaxona
30 mcg
13
14-20
21
Cefalotina
30 mcg
14
15-17
18
Cloranfenicol
30 mcg
12
Ciprofloxacina
35 mcg
15
Clindamicina
32 mcg
14
15-20
21
Eritromicina
15 mcg
13
14-22
23
Gentamicina
10 mcg
12
13-14
15
Imipenem
10 mcg
13
186
12-14
18
18
13-17
16-20
14-15
21
16
(Continuacin)
Agente
antimicrobiano
Contenido
del disco
Moderadamente
Susceptible
susceptible
Meticilina
135 mcg
10-13
14
Ofloxacina
315 mcg
12
12
13-15
16
Oxacilina
311 mcg
10
11-12
10
13
Penicilina G
10 U
28
28
28
29
Rifampicina
315 mcg
16
17-19
16
20
Tetraciclina
330 mcg
14
15-18
314
19
1.25/23.75 mcg
10
10
11-15
16
330 mcg
39
10-11
39
312
Trimetoprimsulfametoxazol
Vancomicina
Reportar
slo slo
en uro:
Reportar
en urocultivos:
Nitrofurantona
300 mcg
14
15-16
14
17
Norfloxacina
310 mcg
12
13-16
17
Sulfisoxazol
250 300 mcg
12
12
13-16
Trimetoprim
315 mcg
10
11-15
16
17
Tomado de: Munro, S. 1992. Disk Diffusion Susceptibility Testing. In: Isenberg, H.D. (Editor
in Chief). CLINICAL MICROBIOLOGY PROCEDURES HANDBOOK. Two
volumes. American Society for Microbiology. Washington, D.C., U.S.A. Basado
en: NCCLS. 1991. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility
Testing. Third informational supplement. M100-S3. NCCLS, Villanova,
Pennsylvania, U.S.A.
CONTROL DE CALIDAD
Para controlar la efectividad y reproducibilidad de la prueba, cada laboratorio
debe mantener refrigeradas en agar inclinado y sub-cultivar semanalmente las
siguientes dos cepas bacterianas estndar, que producen patrones de suscepti-bilidad
conocidos:
a)
b)
Escherichia coli ATCC 25922 (gram-negativo)

Staphylococcus aureus ATCC 25923 (gram-positivo)
La susceptibilidad de las dos cepas patrn debe probarse con cada lote nuevo
187
de medio Mueller-Hinton, o una vez a la semana. Nunca hacerlo de los cultivos

refrigerados, hacerlo de colonias previamente sub-cultivadas en agar sangre.
Las zonas de inhibicin de los patrones conocidos sirven para evaluar la precisin de la prueba. Los halos de inhibicin de las dos cepas control deben estar
entre los rangos de la siguiente tabla:
LMITES ACEPTABLES DE LOS HALOS DE INHIBICIN (mm)
QUE DEBEN OBTENERSE CON LAS CEPAS CONTROL Y ALGUNOS
ANTIBITICOS
Antibitico
S. aureus ATCC 25923
E. coli ATCC 25922
Amikacina
--------
19 - 26
Ampicilina
27 - 35
16 - 22
29 - 37
20 - 24
Aztreonam
--------
28 - 36
Ceftazidima
--------
25 - 32
Clindamicina
24 - 30
--------
Cloranfenicol
19 - 26
21 - 27
Eritromicina
22 - 30
--------
Gentamicina
19 - 27
19 - 26
Penicilina-G
26 - 37
--------
Tetraciclina
19 - 28
18 - 25
Tobramicina
--------
18 - 26
Trimetoprim-sulfametoxazol
24 - 32
24 - 32
FUENTES COMUNES DE ERROR:

12345-
Usar otro medio que no sea Mueller-Hinton.

Mala estandarizacin de la turbidez del inculo.
Mala preparacin del medio, no ajustar el pH entre 7.2 y 7.4.
Usar medio vencido o cajas mal almacenadas.
Mal almacenaje de los discos con antibiticos.
188
161718191011121314151617-
Mala preparacin o almacenaje del estndar 0.5 de MacFarland.

No exprimir el hisopo en las paredes del tubo.
Retraso entre la preparacin del inculo y la siembra (aumenta la
concentracin bacteriana).
Retraso en la aplicacin de los discos en las cajas ya inoculadas.
Exceso de incubacin de las cajas.
Uso de jarro con candela o incubacin a otra temperatura que no sea
36 C.
Lectura prematura antes de 16 a 18 horas de incubacin.
Mala medicin de los halos de inhibicin.
Cultivos mixto, no puros.
Aplicacin de la tcnica a anaerobios o bacterias de crecimiento lento.
No usar las cepas control.
Errores de transcripcin de resultados.
La prueba de susceptibilidad antimicrobiana de difusin sobre agar, propuesta

desde 1966 por Bauer, Kirby, Sherris y Truck, contina siendo aceptable y prctica.
Es indispensable hacer notar el enorme avance que se ha logrado recientemente en
la miniaturizacin y automatizacin del antibiograma. Si el laboratorio tiene posibilidades econmicas y tcnicas, debe utilizar alguno de los procedimientos modernos de antibiograma por dilucin, miniaturizado e idealmente automatizado.
El autor tiene conocimiento de dos mtodos de este tipo, disponibles en nuestro
medio que dan buenos resultados: ATB/VITEK de Bio Meriux y SENSIDENT de
Merck.
ESPECIFICACIONES PARA PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD*
DE DOS ANTIBITICOS DE PFIZER
(Para bacilos gram-negativo facultativos y Staphylococcus spp.)
Nombre
genrico
Nombre
comercial
Azitromicina
(macrlido,
azlido)
Zithromax
Ampicilinasulbactam
Unasyn
(Sultamicilina)
Contenido
del disco
Interpretacin del dimetro

del halo (mm)
Intermedio Susceptible
Resistente
15 mcg
13
14-17
18
10 mcg de
ampicilina +
10 mcg
sulbactam
11
12-14**
15
** Mtodo de difusin en disco sobre agar segn Bauer-Kirby.

** Moderadamente susceptible.
189
ANUNCIO
UNASYN
(blanco y negro,
cara de nio)
191
DOCUMENTO
UNASYN
(blanco y negro
columna vertical,
debe decir
UNASYN al
principio)
192
CAPTULO 17
ANAEROBIOS
PROPSITO:
Demostrar por medio de cultivo con procedimientos especiales, la presencia
de bacterias anaerobias, es decir aquellas que no crecen en presencia de oxgeno
del aire. Estas bacterias son normales y predominan en las microbiotas de las
mucosas (boca, intestino, heces, vagina, etc.) En determinadas circunstancias llegan a sitios anatmicos diferentes y causan infeccin, generalmente en asociacin
con bacterias aerobias tales como enterobacterias, pseudomonas o cocos gram-positivo. Por esta razn, siempre debe hacerse frote Gram del material clnico y cultivo aerobio, adems del cultivo en anaerobiosis (ausencia de oxgeno).
MUESTRA:
Si en algn tipo de anlisis bacteriolgico es de vital importancia la toma de
la muestra y su transporte al laboratorio, es en el caso de los anaerobios. Esto se
debe principalmente a dos factores:
-
La muestra debe tomarse con mucho cuidado a manera de no contaminarla con bacterias de los sitios colonizados normalmente por anaerobios.
Por esta razn, el mdico a veces debe tomar muestras de secreciones
del pulmn por puncin trans-traqueal (para evitar los anaerobios de la
orofaringe), o puncin suprapbica de la vejiga (para evitar los
anaerobios de la uretra).
Las bacterias anaerobias son muy susceptibles al oxgeno del aire. Si los
anaerobios en la muestra entran brevemente en contacto con aire, pierden muy rpidamente su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por esta razn deben seguirse al pie de la letra instrucciones, tanto
para toma de la muestra como para su transporte al laboratorio.
Hallazgos clnicos que sugieren infeccin causada por anaerobios:

12-
Pus con mal olor.

Infeccin cerca de membranas mucosas.
193
131415161718191011121314-
Tejido necrtico, gangrena o formacin de pseudo-membranas.

Gas en tejido o secrecin.
Endocarditis con hemocultivos rutinarios negativos.
Infeccin asociada con cncer u otros procesos que causan destruccin
de tejidos.
Infeccin relacionada con uso de antibiticos aminoglucsidos.
Tromboflebitis sptica.
Bacteremia con ictericia.
Infeccin causada por mordidas humanas o de animales (investigar
Pasteurella multocida, cocobacilo gram-negativo aerobio).
Pus sanguinolento y negruzco que puede fluorecer de color rojo bajo
luz ultravioleta (Bacteroides melaninogenicus).
Presencia de grnulos de azufre en pus de lesiones en mandbula u
otro sitio (actinomicosis, buscar Actinomyces israelii).
Signos y sntomas de gangrena gaseosa.
Entidades clnicas que generalmente implican anaerobios como aborto
sptico, o ciruga gastrointestinal infectada.
TOMA DE MUESTRA PARA CULTIVO DE ANAEROBIOS:

Si se sospechan anaerobios en la muestra, sta debe manejarse de manera
especial. Los sitios anatmicos de donde se requiere tomar muestra son muy variados, generalmente las muestras aceptables para cultivo de anaerobios son:
1234567-
Pus aspirado.
Tejidos varios (biopsia, ciruga, autopsia).
Fluidos corporales (LCR, lquido pleural, paracentsis, pericrdico,
sinovial).
Aspirado por puncin trans-traqueal.
Aspirado por puncin pulmonar directa.
Orina aspirada por puncin supra-pbica.
Grnulos de azufre de pacientes con sospecha de actinomicosis.
Las muestras no aceptables para cultivo de anaerobios, pues contienen normalmente estas bacterias y siempre deben ser rechazadas si se solicita este tipo de
cultivo, son:
123-
Hisopos de garganta o boca.

Esputo espectorado.
Material de broncoscopa no colectado con catter de doble lumen.
194
45678-
Heces, contenido intestinal, hisopo rectal.

Hisopo de lesiones superficiales (lceras de decbito, etc.)
Material contiguo a mucosas.
Orina colectada al vuelo.
Hisopos vaginales o cervicales.
En todo caso, evitar contaminaciones con microbiota anaerobia normal. No

deben pasar ms de 10 minutos para transportar este tipo de muestras al laboratorio. Si no es posible transportarla con esta rapidez la muestra debe inocularse en un
frasco o dispositivo especial que la mantenga en anaerobiosis.
El laboratorio de microbiologa debe ser alertado que se tomar una muestra
para anaerobios, para que tenga listo el material necesario y la muestra se siembre
cuanto antes. El personal del laboratorio debe conocer bien los procedimientos especiales para toma de muestra y aislamiento de anaerobios. Tomar las muestras
con hisopo es menos satisfactorio que aspirar. Esto se debe a que el hisopo puede
exponer a los anaerobios al oxgeno del ambiente, tiende a secarse rpidamente y
permite colectar una muestra muy pequea.
En resumen para lograr el cultivo de las bacterias anaerobias deben tomarse
las siguientes precauciones.
1234-
Cultivar el material clnico inmediatamente despus de obtenido.

Emplear medios frescos.
Obtener condiciones anaerobias adecuadas.
Efectuar el sub-cultivo de colonias inmediatamente despus de sacarlas
del medio anaerobio.
TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS AL LABORATORIO:

Si la muestra no va a ser inoculada antes de 10 minutos de obtenida, debe
colocarse en ambiente anaerobio para su transporte. Para este propsito, usar recipientes especiales obtenidos comercialmente (de preferencia culturettes, para
transporte de anaerobios). En caso de no contarse con este material, por lo menos
colocar la muestra lo ms pronto posible en caldo tioglicolato. Este medio lquido
contiene tioglicolato de sodio que reduce el medio y lo hace anaerobio en el fondo.
Siempre debe usarse medio fresco, calentar el tubo por 10 minutos (tapn de rosca
flojo) en bao de agua hirviendo, y luego enfriar en agua fra. El caldo debe quedar amarillo con una capa rosada delgada en la superficie.
195
Si la muestra se aspir con una jeringa, debe sacarse todo el aire (que no queden burbujas), y sellar la punta de la aguja insertando un tapn de hule.
PROCEDIMIENTO:
La muestra recin tomada, o adecuadamente transportada al laboratorio, debe procesarse as:
En primer lugar, siempre hacer un frote y colorearlo con Gram.
2-
Sembrar la muestra por estras en una

caja de agar sangre de carnero al 5%
fresca y en el fondo de un tubo de caldo tioglicolato (hervido y enfriado).
3-
Introducir rpidamente la caja con el

medio hacia arriba y el tioglicolato en
un jarro Gas-Pak limpio y seco. Abrir
un sobrecito indicador de anaerobiosis
Jarro Gas-Pak
y colocarlo dentro del jarro a manera
de que la almohadilla con azul de metileno se vea claramente. Inmediatamente cortar con tijera la esquina indicada del sobre generador de hidrgeno y CO2 (sin apacharlo), y con pipeta de vidrio (no insertarla),
agregarle 10 ml de agua destilada. Colocar el sobre con la abertura hacia
arriba y cerrar fuertemente el jarro con la tapadera especial y la pinza de
tornillo. La tapadera tiene por dentro una canastilla metlica que puede
desenroscarse. Adentro debe colocarse un sobrecito de trocitos de paladio
iridiado que acta como cataltico para combinar el oxgeno dentro del
jarro con el hidrgeno producido por el sobre generador y formar agua.
Con el uso, el cataltico se inactiva, por lo que una vez a la semana deben calentarse los trocitos a 100 C por treinta minutos (en cpsula de
porcelana, dentro del horno de secar material), para reactivarlo y secarlo peridicamente.
4-
Adicionalmente, toda la muestra que llega al laboratorio para cultivo de

anaerobios debe sembrarse por estras en otro agar sangre de carnero,
MacConkey y manitol-sal, los cuales se incuban aerbicamente.
196
H2+CO2
1-
Hallazgos bacteriolgicos que sugieren la presencia de anaerobios:
1-
Morfologa sugestiva en el Gram directo de la muestra.
2-
Ausencia de crecimiento aerobio de las bacterias observadas en el Gram

directo.
3-
Crecimiento en el fondo del tioglicolato hace sospechar anaerobios. Ausencia de crecimiento en tioglicolato no descarta definitivamente la presencia de anaerobios.
4-
Gas o mal olor en la muestra o el cultivo.
5-
Colonias caractersticas en el agar sangre incubado en Gas-Pak.
6-
Colonias negras despus de incubacin prolongada indican Bacteriodes

melaninogenicus; las colonias jvenes pueden dar fluorescencia roja bajo
luz ultravioleta.
La identificacin hasta especie de todas las bacterias anaerobias de inters

clnico es una tarea compleja y altamente especializada. Se recomienda seguir las
siguientes claves para efectuar la identificacin presuntiva. En primer lugar, una
interpretacin correcta y acuciosa del frote de la muestra original coloreado con
Gram, permite sospechar qu bacterias anaerobias se deben aislar, y en algunos
casos permite la deteccin de anaerobios cuyo aislamiento no se logra por alguna
causa. Observar y reportar el frote Gram segn lo indicado y luego correlacionar
con las bacterias anaerobias y aerobias aisladas.
Observar y registrar en el frote Gram del material clnico, lo siguiente:
1-
La reaccin al Gram, el tamao, la forma y la cantidad relativa de las

bacterias presentes.
2-
La presencia de esporas, su forma y posicin en la clula.
3-
Cualquier caracterstica morfolgica especial como ramificacin pseudoramificacin, formacin de cadenas, filamentos, cuerpos esfricos o diminutas formas granulares.
197
4-
Comparar con la siguiente tabla como gua, y correlacionar con el cultivo anaerobio.
CARACTERSTICAS MORFOLGICAS DE ALGUNOS BACILOS ANAEROBIOS

GRAM-NEGATIVO DE IMPORTANCIA MDICA
ESPECIE
MORFOLOGA MICROSCPICA
COLONIA
Bacteroides
fragilis
Bacilos regulares con extremos redondeados*, pueden ser pleomrficos (agar

sangre); comnmente vacuolados (tioglicolato); pueden presentar cuerpos
esfricos en su interior.
En motas, circular, entera y brillante.
Bacteroides
melaninogenicus
Cocobacilos* (agar sangre); pleomrficos,

vacuolados,
bacilos
degenerados
(tioglicolato).
Colonias negras en
agar sangre despus de
4-5 das de incubacin.
Bacteroides
variabilis
Bacilos pequeos con extremos redondeados*; vacuolados.
Colonias circulares,
enteras, brillantes u
opacas con bordes
translcidos.
Fusobacterium
necrophorum
(Sphaerophorus
necrophorus)
Bacilos pleomrficos con extremos redondeados*; esfrulas y cuerpos redondeados.
Umbonada (con centro

ms alto que el resto
de la colonia), opaca,
con borde translcido
circular.
Fusobacterium
fusiforme
Bacilos delgados con extremos adelgazados

terminados en punta; algunos o la mayora
filamentosos (agar sangre y tioglicolato).
Circular, entera.
Ver figura 12: Diversas Morfologas Bacterianas
INTERPRETACIN DEL CULTIVO

1-
Despus de no menos de 48 horas de incubacin, destapar el jarro: Antes de abrirlo notar que el indicador debe estar blanco y la superficie
interior del jarro con gotas de agua. Si el indicador est celeste y no hay
agua de condensacin, significa que no se produjo anaerobiosis y deben
revisarse los procedimientos. Notar un fuerte olor ptrido caractersti198
co de los anaerobios. Descartar el indicador y el sobre generador de hidrgeno y CO2.

2-
Examinar simultneamente la caja de agar sangre y el tubo de tioglicolato.

Debe tenerse a mano el resultado de los crecimientos aerobios, ya que
muchas bacterias facultativas crecen tanto en aerobiosis como en
anaerobiosis. Es de esperarse que enterobacterias, pseudomonas,
estafilococos y estreptococos tambin crezcan en el agar sangre anaerobio,
pues son facultativos. Examinar las cajas con buena luz, con lupa y microscopio estereoscpico.
3-
Hacer inmediatamente frote Gram y sub-cultivo en agar sangre de carnero al 5% y en tioglicolato (hervido y enfriado) de cada tipo de colonias
que no corresponda a aerobios ya previamente identificados. Tambin
sembrar un sub-cultivo en agar sangre aerobio donde los anaerobios
verdaderos no crecen. Es muy frecuente que se encuentran en la misma
muestra dos o ms anaerobios adems de varios aerobios.
4-
Incubar aerbicamente el agar sangre de carnero donde se efectu el

sub-cultivo y el tioglicolato original. Si no se observa crecimiento en el
agar sangre aerobio a las 24 a 48 horas, se trata verdaderamente de un
anaerobio. Hacer frote Gram del crecimiento en tioglicolato y referirse a
la tabla para confirmar la identificacin presuntiva de los anaerobios.
5-
La presencia de colonias con doble zona de beta hemlisis. Y que

microscpicamente son bacilos gram-positivo gruesos, generalmente
poco o no esporulados, indican la presencia de Clostridium perfringens.
Esta bacteria se aisla de lesiones gangrenosas y heridas contaminadas
con tierra (gangrena gaseosa). Debe reportarse inmediatamente.
6-
La mayora de anaerobios que causan infeccin verdadera en humanos

son gram-negativo, en especial Bacteroides fragilis. Identificar
presuntivamente a los anaerobios gram-negativo segn la tabla que aparece en la pgina siguiente.
199
IDENTIFICACIN PRESUNTIVA DE VARIOS

ANAEROBIOS DE IMPORTANCIA MDiCA
MORFOLOGA MICROSCPICA
Bacilos gram-negativo, pleomficos; se colorean plidamente
algunos presentan cuerpos esfricos o predo minio de cocobacilos*.
Bacteroides sp.
Bacilos plidamente gram-negativo, finos con los extremos en

punta*.
Fusobacterium sp.
Pequeos diplococos* gram-negativo, semejantes a Neisseria pero

mucho ms pequeos.
Veillonella sp.
Bacilos gram-positivo gruesos o finos que presentan esporas las

cuales no se tien con Gram.
Clostridium sp.
Cocos gram-positivo ovalados o lanceolados* con tendencia a

agruparse en cadenas; semejantes a Streptococcus sp., pero
anaerobios.
REPORTAR
Peptostreptococcus sp.
Cocos gram-positivo redondos con tendencia a agruparse en racimos*; semejantes a Staphylococcus sp., pero anaerobios
Peptococcus sp.
Bacilos gram-positivo no esporulados.
Se aisl un bacilo
anaerobio gram-negativo no esporulado.
Bacilos gram-positivo no esporulados, ligeramente ramificados;

colonias en forma de muelas.
Actinomyces sp.
Ver figura 13: Diversas Morfologas Bacterianas
200
Fig. 13 DIVERSAS MORFOLOGAS BACTERIANAS
Cocos sueltos
Cocos en parejas
(diplococos)
Cocos en cadenas
(estreptococos)
Cocos en racimos
(estafilococos)
Cocos en
ttradas
Cocobacilos
Bacilos en forma
de maza
(difteroides)
Bacilos con bordes

redondeados
Bacilos con
bordes
cuadrados
Fusobacterium sp.
Vibrio sp.
Spirillum sp.
Borrelia sp.
Treponema sp.
201
Leptospira sp.
7-
En el caso de bacilos anaerobios gram-negativo, hacer un sub-cultivo en

agar sangre de carnero y colocar en las primeras estras los siguientes
discos:
-
Kanamicina
Vancomicina
Colistina
(1,000 mcg)
(5 mcg)
(10 mcg)
La presencia de halo de inhibicin indica susceptible (S), no hay halo es resistente (R), V = variable. Interpretar los resultados junto con otras pruebas
confirmatorias, as:
Bacteria
Kanamicina
Vancomicina
Colistin
Bacteroides fragilis
Otros Bacteroides sp.
B. melaninogenicus
B. ureolyticus
Fusobacterium nucleolatum
F. necrophorum
F. mortiferum
F. varium
Fusobacterium sp.
Se sugiere que en los laboratorios clnicos, sea el profesional microbilogo

quien efecte la identificacin definitiva o presuntiva de los anaerobios.
INFORME:
Segn los criterios anteriores y otros que pueden obtenerse en literatura especializada, informar las bacterias anaerobias aisladas. No se efecta prueba de susceptibilidad para anaerobios mientras no se cuente con una tcnica sencilla que
pueda implementarse en los diversos laboratorios de nuestro medio.
202
CAPTULO 18
MICOBACTERIAS
PROPSITO:
Demostrar por medio de coloraciones y cultivos especiales la presencia de
bacterias pertenecientes al gnero Mycobacterium especialmente Mycobacterium tuberculosis, llamado comnmente BK (Bacilo de Koch).
Este grupo de bacterias en forma de bacilo, se tien con dificultad por el alto
contenido de grasas en su pared celular. Para lograr teirlas deben usarse colorantes con fenol y/o calor. Una vez teidas con fuchsina carblica (fenolada) no se
decoloran con alcohol acidificado. Por esta caracterstica muy particular se les llama bacilos alcohol-cido resistentes (abreviado BAAR). No usar el trmino cido-alcohol resistentes.
Las micobacterias son aerobios estrictos, no mviles, no poseen cpsula ni
producen esporas. Su crecimiento es sumamente lento; la mayora de las especies
patgenas crecen despus de 2 a 6 semanas de incubacin a 36 C en el medio de
Lowenstein-Jensen. Aproximadamente 12 especies de Mycobacterium se asocian a
infeccin humana. En nuestro medio, sin lugar a duda, M. tuberculosis es la especie
ms importante. Las micobacterias en general producen granulomas destructivos
de crecimiento lento, que pueden sufrir necrosis o cavitacin. La deteccin de
micobacterias es una gran responsabilidad para el laboratorio de microbiologa, ya
que un resultado positivo de frote o cultivo implica serias consecuencias para el
paciente y afecta su vida con un tratamiento especfico por varios meses, o incluso
aos.
MUESTRAS
1.
Esputo: La tuberculosis es en nuestro medio la infeccin humana ms importante causada por micobacterias. Esta infeccin crnica generalmente ocurre
en los pulmones por la inhalacin del agente causal, el cual por lo general es
M. tuberculosis (muy rara vez M. bovis o M. kansasii). Por esta razn, el esputo
es la muestra que con mayor frecuencia se remite al laboratorio para la investigacin de tuberculosis.
203
El esputo debe colectarse temprano en la maana, inmediatamente al

despertar. De preferencia tres a cuatro muestras (seriadas) en das
alternos.
El primer esputo de la maana es la muestra ms adecuada para el anlisis,
pues es concentrada y menos contaminada, ya que el paciente no ha comido
o bebido durante la noche. Un slo esputo es ms adecuado que un pool o
mezcla de varias muestras.
Colectar la muestra de esputo as: el esputo, al igual que cualquier otra muestra para micobacterias, debe colectarse antes de iniciar tratamiento, que puede inhibir el crecimiento.
Indicar al paciente que al despertar se enjuague la boca dos veces con agua
corriente; no usar pasta dental o cualquier otro antisptico.
Acostado boca abajo en su cama, el paciente debe desgarrar esputo lo ms
profundamente posible; as como estar consciente de que descargas
nasofarngeas o saliva no son esputo. El esputo se produce despus de un
acceso de tos que expulsa material exudativo de los pulmones; 5 a 10 ml de
esputo es la cantidad adecuada para anlisis, pero cualquier volumen debe
procesarse.
El paciente debe depositar la muestra en un recipiente estril de boca ancha
proporcionado por el laboratorio. De preferencia debern usarse recipientes
especiales de plstico descartables, del tipo que incluye adentro un tubo grueso
para efectuar el proceso.
El buen esputo para anlisis de micobacterias es caseoso (apariencia de queso), puede ser verdoso o amarillento. Si no se remite o procesa rpidamente,
adicionar aproximadamente 0.5 g de carbonato de sodio (Na2CO3), para disminuir el crecimiento de contaminantes y luego debe refrigerarse o congelarse. Se debe identificar bien la muestra con una etiqueta que tenga el nombre y
nmero de registro del paciente, la fecha y tipo de muestra.
Debido a que el exterior del recipiente puede contaminarse durante la
obtencin de la muestra, debe colocarse en una bolsa plstica y luego llevarse
al laboratorio. Si el paciente produce muy poca cantidad de esputo, puede
examinarse un pool de 24 a 48 horas de coleccin continua, aunque no es lo
deseable.
204
En pacientes que tienen dificultad para producir esputo puede usarse varios
mtodos:
2.
a)
Nebulizacin de solucin salina hipertnica (cloruro de sodio al 10%,

sin propilenglicol), es excelente para inducir la produccin de esputo,
generalmente diludo.
b)
Los hisopos farngeos pueden ser usados en estos pacientes para extraer el esputo. Especialmente este procedimiento es aconsejable para
nios pequeos a los cuales no se les puede pedir una muestra adecuada.
c)
Broncoscopa: puede ser usada para obtener las muestras directamente

del sitio infectado. Se obtienen muy buenas muestras.
Lavado gstrico: Frecuentemente se solicita lavado gstrico para anlisis de

micobacterias. No se usa para detectar tuberculosis del estmago, sirve para
demostrar micobacterias del esputo que el paciente involuntariamente se ha
tragado.
Este procedimiento est indicado en los siguientes pacientes:
a)
Con evidencia radiolgica de tuberculosis pulmonar y en quienes los

exmenes de esputo son negativos.
b)
En pacientes que no cooperan, diciendo que no producen esputo o se lo

tragan.
c)
Los que no pueden expectorar porque padecen de otros trastornos: estados de coma, enfermedad neurolgica, etc.
d)
En los nios en los que normalmente se hace difcil obtener la muestra

de esputo.
La investigacin microscpica de BAAR en lavado gstrico no es recomendable como un procedimiento diagnstico nico y definitivo, pues BAAR como
M. gastri forman parte de la microbiota gstrica y no se pueden diferenciar de
M. tuberculosis. Sin embargo, mltiples BAAR en contenido gstrico generalmente se correlacionan con cultivos positivos de M. tuberculosis y constituye
informacin valiosa inmediata con utilidad clnica.
205
El lavado gstrico debe ser efectuado en la maana, cuando el estmago est

vaco (por lo menos 8 horas despus que el paciente ha comido o tomado
medicamentos orales), es mejor que el paciente se levante de su cama y que la
muestra se obtenga 30 minutos despus de inducir esputo por nebulizacin.
Deben usarse sondas de Levin, jeringas estriles de 50 ml y 20 a 30 ml de agua
destilada estril. Introducir la sonda al estmago por la nariz, inyectar el agua,
succionar e inyectar de nuevo varias veces.
La muestra obtenida debe colocarse en recipiente estril de boca ancha. Debido a que las micobacterias pueden destruirse rpidamente en los lavados
gstricos por la accin del cido clorhdrico del estmago, la muestra debe ser
procesada en un perodo de tiempo que no exceda de 20 minutos.
Si por cualquier circunstancia no es posible procesarla rpidamente, es necesario neutralizarla, agregando carbonato de sodio al 10%, solucin de fosfato
trisdico anhidro al 10%, solucin de fosfato trisdico con 12 molculas de
agua al 23% o bien cristales de fosfato disdico. En todos los casos es aconsejable usar rojo fenol como indicador para saber si el pH est entre 7 y 8. No
neutralizar las muestras que son procesadas antes de 4 horas despus de obtenidas y mantenidas en refrigeracin.
3.
Orina: Se debe examinar un mnimo de tres muestras de la primera orina de

la maana colectada al vuelo en recipiente estril de boca ancha (ver captulo 7), o muestras obtenidas por catter. Se debe colectar toda la orina posible cada vez, algunas veces se utiliza orina colectada durante 12 a 24 horas, la
cual es menos adecuada porque generalmente est muy contaminada y contiene menos micobacterias viables que la primera orina de la maana. Las
muestras deben mantenerse refrigeradas mientras se procesan lo antes posible; no utilizar recipientes con preservativos.
4.
Otro tipo de muestras: La tuberculosis es una infeccin que puede localizarse

en casi cualquier parte del cuerpo, por esta razn pueden analizarse las siguientes muestras de lquidos, exudados o tejidos:
Lavado bronquial
Fragmentos de pulmn
Hisopo farngeo
Lquido cefalorraqudeo
Lquido pleural
Lquido articular
Pus
206
Raspado endometrial/sangre menstrual

Mdula sea
Lquido pericrdico
Trozos de varios tejidos obtenidos en autopsia
Heces (en ocasiones muy especiales)
Por lo general este tipo de muestras son obtenidas por el mdico en recipientes estriles proporcionados por el laboratorio. Si es necesario se puede adicionar heparina o citrato de sodio como anticoagulantes; no usar preservativos o fijadores.
Es conveniente obtener un volumen grande de muestra; si la cantidad es pequea adicionar solucin salina para evitar desecacin. Si la muestra no se
examina inmediatamente debe refrigerarse.
PROCEDIMIENTO:
Baciloscopa: El diagnstico de micobacteriosis se basa en la observacin de
los bacilos alcohol-cido resistente en la muestra y su cultivo in vitro. Los bacilos
alcohol-cido resistentes deben teirse con las coloraciones de Ziehl-Neelsen o
Kinyoun; ambas tinciones dan buenos resultados. La diferencia fundamental consiste en lo siguiente: Ziehl-Neelsen s utiliza calentamiento de la lmina y Kinyoun
no, adems la fuchsina de Kinyoun es ms concentrada.
Coloracin de Ziehl-Neelsen: Preparar frotes delgados de la muestra a examinar. Si se trata de esputo trasladar la muestra a una caja de Petri estril y examinarla con buena luz sobre fondo oscuro. Con aplicadores de madera quebrados,
seleccionar los fragmentos anormales (con pus verdoso, blanquesino o amarillento; sangre rojiza o herrumbrosa). Colocar un pequeo fragmento entre dos
portaobjetos de vidrio, aplastar varias veces el esputo y luego deslizar una lmina
sobre otra para obtener dos frotes parejos y delgados. Escoger el mejor, dejar secar
y luego fijar moderadamente con calor sobre la llama del mechero (igual que para
la coloracin de Gram). Puede colorearse sedimento del esputo digerido/
descontaminado, u otras muestras clnicas.
Procedimiento de la coloracin de Ziehl-Neelsen:
1-
Poner el frote ya fijado y fro en el soporte de coloracin cerca del lavatrastos,

colocarle encima un trozo de papel filtro para que mantenga el colorante sobre el frote.
207
12-
Cubrir el papel filtro con fuchsina carbnica de Ziehl-Neelsen; debe quedar

bien empapado.
13-
Calentar cuidadosamente la lmina por debajo, ya sea con un mechero de

alcohol o con un hisopo grande empapado en alcohol. Calentar suavemente
hasta el aparecimiento de humos blancos. No debe hervir. Dejar colorear el
frote por 5 minutos sin calentar ms. Si la lmina se seca agregar ms fuchsina
sin volver a calentar.
14-
Remover el papel filtro y lavar con agua corriente (usar poca presin).
15-
Decolorar el frote con alcohol-cido hasta que ya no salga ms colorante rojo

(aproximadamente 2 minutos). Debe insistirse en la decoloracin ya que es el
paso diferencial. Los frotes gruesos requieren mayor tiempo de decoloracin,
pero tampoco se debe decolorar excesivamente.
16-
Lavar brevemente con agua corriente.
17-
Cubrir el frote con azul de metileno por 1 2 minutos.
18-
Lavar con agua corriente.
19-
Dejar secar al aire o flamear muy brevemente, pero no secar con papel absorbente.
10-
Examinar el frote con el lente de inmersin, con cuidado de limpiar el aceite

del lente entre cada frote para no acarrear micobacterias de una muestra a
otra.
11-
No efectuar coloraciones simultneas de varias muestras en recipientes de

Coplin, porque tambin puede haber transferencia de micobacterias entre las
muestras.
REACTIVOS PARA ZIEHL-NEELSEN

1-
Fuchsina carblica de Ziehl-Neelsen (colorante principal)

Solucin saturada de fuchsina bsica .............................. 10 ml
Preparar solucin saturada de fuchsina bsica as:
Disolver 3 gramos de fuchsina bsica en 100 ml de alcohol etlico al 95%.
208
Solucin acuosa de fenol al 5% ........................................ 90 ml

Preparar solucin de fenol al 5%, as: (Fundir los cristales de fenol en bao de
Mara, medir 5 ml con probeta, (no con pipeta), y luego llevar a volumen de
100 ml con agua destilada estril.
2-
Alcohol-cido (decolorante):
Acido clorhdrico concentrado ......................................... 93 ml
Alcohol etlico al 95% ........................................................ 95 ml
3-
Azul de metileno (colorante de contraste):

Cloruro de azul de metileno ........................................... 0.3 gramos
Agua destilada .................................................................. 100 ml
Segn F. Ziehl (1882), y Neelsen (1885), Alemania.
COLORACIN DE KINYOUN:
Esta coloracin da buenos resultados, comparables al Ziehl-Neelsen, si se efecta segn la tcnica exacta. Tiene la ventaja que no necesita calentamiento. Proceder as:
1-
Preparar el frote igual que para Ziehl-Neelsen y fijarlo con calor.
2-
Colocar la lmina en la gradilla de coloracin y dejar que enfre. Cubrir el

frote con fuchsina de Kinyoun y dejar que se coloree por 4 minutos. No es
necesario calentar.
3-
4-
Decolorar el frote con alcohol-cido hasta que ya no salga ms colorante rojo.

Insistir en este paso pues es el que diferencia a las bacterias.
5-
6-
Cubrir el frote con azul de metileno por 1 2 minutos.
7-
8-
Dejar secar y examinar con el lente de inmersin. En general tomar las mnimas precauciones que para la coloracin de Ziehl-Neelsen.
209
REACTIVOS PARA KINYOUN

1-
Fuchsina carblica de Kinyoun:

Fuchsina bsica .................................................................... 4 gramos
Fenol fundido ................................................................... 128 ml
Alcohol etlico al 95% ...................................................... 120 ml
Agua destilada .................................................................. 100 ml
Disolver la fuchsina en el alcohol y luego adicionar el agua lentamente con
agitacin. Fundir cristales de fenol en bao de agua caliente a 56 C, medir
con pipeta 8 ml y adicionar a la fuchsina.
2-
Alcohol cido: igual al de Ziehl-Neelsen (cido clorhrico concentrado: 3 ml,

ms alcohol etlico al 95%: 97 ml)
3-
Azul de metileno: igual al de Ziehl-Neelsen (0.3 gramos de cloruro de azul

de metileno, disolver en 100 ml de agua destilada).
Segn Kinyoun: Am. J. Pub. Health, 5: 867, 1915.
INTERPRETACIN E INFORME DE BACILOSCOPIAS:

La caracterstica de alcohol-cido resistencia tpica de las micobacterias hace
que la baciloscopa tenga una importancia fundamental. Se usa para seguir el curso
del tratamiento y para dar de alta al paciente en el hospital, para continuar su tratamiento ambulatorio.
Tomar muy en cuenta las siguientes consideraciones:
1-
Sin excepcin alguna, utilice la siguiente clave para reportar todos los frotes para micobacterias. Esta forma de reportar ha sido estandarizada por la
Asociacin Nacional de Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias de Estados Unidos, con el objeto de poder comparar resultados de distintos laboratorios y orientar adecuadamente al mdico.
210
REPORTE DE FROTES PARA MICOBACTERIAS

NMERO DE BACILOS
ALCOHOL-CIDO RESISTENTE
0
REPORTE
No se observan bacilos alcohol-cido resistentes
1 a 2 en todo el frote
Informar el nmero de BAAR encontrados y pedir

nueva muestra
3 a 9 en todo el frote
+ o escasos
10 ms en todo el frote
++ o regular cantidad
1 ms por campo
+++ o abundantes
2-
Un frote para diagnstico de tuberculosis o cualquiera otra micobacteriosis

debe examinarse de 10 a 15 minutos antes de darse por negativo. Si se trata
de L.C.R. debe observarse an por ms tiempo.
3-
La especie del microorganismo alcohol-cido resistente no puede determinarse slo por la morfologa microscpica, debe hacerce por cultivo. Sin embargo, algunas caractersticas pueden orientar, por ejemplo:
Nocardia spp. frecuentemente produce ramificaciones y Mycobacterium kansasii
puede formar clulas largas y anchas, con coloracin en bandas.
4-
La caracterstica alcohol-cido resistente de un microorganismo puede variar

con la edad del cultivo o exposicin a drogas.
5-
Con el lente de inmersin, Mycobacterium tuberculosis aparece tpicamente como

bacilos bien definidos, ligeramente curvos, de color rojo brillante (se aprecia
mejor con luz intensa). Pueden aparecer con coloracin discontinua en forma
de varios grnulos de color rojo ms intenso, observar con atencin grnulos
rojos en la preparacin ya que pueden ser parte de un BAAR.
6-
En el frote pueden aparecer artefactos alcohol-cido resistentes, especialmente si el frote es grueso o no fue suficientemente decolorado. Slo bacilos bien
definidos deben considerarse BAAR.
7-
En caso que se observen muy escasos BAAR debe repetirse el frote. Si el frote
211
es muy grueso es probable que se desprenda de la lmina durante la coloracin,

por esto debe evitarse la transferencia de BAAR de una preparacin a otra
por medio de aceite de inmersin, lentes sucios o colorantes.
18-
Ocasionalmente, la buena seleccin de las partes anormales de la muestra

para preparar el frote puede dar resultados mucho mejores que el uso de concentraciones.
19-
Puede ocurrir que la misma muestra sea negativa por frote, pero positiva por
cultivo, ya que la baciloscopa es menos sensible para detectar micobacterias
que el cultivo.
10-
Nunca dejar el azul de metileno por ms tiempo del indicado: 1 2 minutos.
11-
A veces es difcil distinguir los artefactos acidfilos (rojos) de verdaderos bacilos alcohol-cido resistentes. La observacin de cuerpos esfricos alcoholcido resistentes debe mencionarse como sospechosa. Los grnulos de
Much son micobacterias, sin pared celular (esferoplastos), son gram-positivo y no alcohol-cido resistentes.
12-
La liberacin irregular de micobacterias de los focos endotraquiales puede

dar frotes positivos y negativos en el mismo paciente.
13-
Los BAAR observados no presentes originalmente en la muestra, pueden provenir del agua del chorro, colorantes contaminados, recipientes o de
portaobjetos sucios.
CULTIVO PARA MICOBACTERIAS

Los procedimientos para obtener el crecimiento in vitro de las microbacterias
son especializados; deben seguirse estrictamente las instrucciones para tener xito
en su recuperacin. Por lo general, las muestras para cultivo de micobacterias contienen muchas bacterias de las microbiotas, especialmente el esputo que siempre se
contamina con microbiota de la boca. Adems el esputo es una muestra difcil de
manipular por su mucosidad, tenacidad y adherencia. Por estas razones para su
cultivo, el esputo debe digerirse para hacerlo lquido y descontaminarse; es decir,
darle algn tratamiento qumico para destruir las bacterias contaminantes que crecen rpido, pero sin destruir a las micobacterias.
212
DIGESTIN Y DESCONTAMINACIN DE ESPUTOS

Para efectuar la digestin/descontaminacin de esputos pueden usarse dos
mtodos:
aMtodo convencional de hidrxido de sodio
bMtodo de N-acetil-levo-cistena (NALC)
El mtodo de hidrxido de sodio es muy fuerte y destruye un porcentaje considerable de micobacterias. Por esa razn, debe hacerse todo lo posible para
implementar la tcnica de NALC. El mtodo de la acetil-cistena proporciona mayor porcentaje de aislamiento de micobacterias pero su desventaja consiste en la
dificultad de conseguir esta sustancia qumica en nuestro medio. La N-acetil levocistena (NALC), puede obtenerse de las siguientes compaas:
aBBL, Cockeysville, Maryland, USA.
bMead Johnson Research Center, Evansville, Indiana, USA.
cSigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA.
La NALC digiere el moco del esputo por ruptura de las uniones disalfuro de
la mucina y adems destruye las bacterias comunes sin daar a las micobacterias.
Al procesar esputos u otras muestras para cultivo, debe hacerse con sumo
cuidado y dentro de una campana bacteriolgica. Descartar todo el material contaminado en recipientes con fenol al 5 por ciento. Evitar los aerosoles que se producen al flamear las asas; introducirlas antes de flamear dentro de un recipiente con
alcohol y arena en el fondo (el alcohol debe quedar 2.5 cms por encima de la arena).
Mtodo de digestin/descontaminacin con N-acetil-levo-cistena (NALC).
(Segn Kubica et al. Am. Rev. Respir. Dis. 89:284, 1964)
1-
El reactivo para digerir/descontaminar es inestable pues es inactivado por

oxgeno, iones de metales pesados y hemoglobina. Por esta razn, el reactivo
debe prepararse diariamente y slo dura un da. Si sobra solucin NALC,
puede guardarse en frasco bien cerrado y usarse al da siguiente, pero nunca
al tercer da despus de preparada. El polvo de NALC debe mantenerse refrigerado. Debe prepararse slo la cantidad de solucin que se usar en un da
mezclando los tres componentes as:
213
Cantidad a
preparar
NaOH al 4%
estril
Citrato de sodio
al 2.9% estril
Polvo de NALC
(refrigerado)
125 ml
12.4 ml
12.5 ml
0.125 g
150 ml
25 ml
25 ml
0.25 g
100 ml
50 ml
50 ml
0.5
Las soluciones individuales deben prepararse as:

-
Hidrxido de sodio Na0H al 4% (1N): Disolver 40 g de hidrxido de

sodio para anlisis en 1 litro de agua destilada. Autoclavear y guardar a
temperatura ambiente. Si precipita descartar.
Citrato de sodio al 2.9% (0.1M): Disolver 29.4 g de citrato de sodio

anhidro en 1 litro de agua destilada. Autoclavear y guardar a temperatura ambiente. Si precipita descartar.
2-
Colectar la muestra de esputo segn lo indicado. Transferir aproximadamente 10 ml a un tubo plstico, descartable de 50 ml. Esto debe hacerse bajo una
campana bacteriolgica. Limpiar la superficie de trabajo peridicamente, con
desinfectante.
3-
Agregar un volumen igual del reactivo de acetil-cistena, pero no ms que el

volumen de esputo. Si el esputo es muy escaso o mucoso agregar el NALC
directamente al recipiente de coleccin y luego pasar al tubo.
4-
Tapar bien el tubo, y agitar bien en agitador vortex de 5 a 20 segundos o

hasta que el esputo se digiera. La agitacin demasiado violenta puede desnaturalizar el reactivo NALC.
5-
Dejar en reposo exactamente 15 minutos a temperatura ambiente, para que la

muestra se descontamine.
6-
Llenar el tubo con agua destilada estril, hasta que el nivel del lquido quede
12 mm por debajo del borde. Tapar el tubo y agitar por inclinacin para mezclar bien.
7-
Centrifugar a 3,000 rpm (1800 a 2400 g) por 15 minutos.

214
18-
Decantar el tubo a manera de guardar el sedimento (sobre un recipiente con

desinfectante, formol al 10%). Flamear la boca de los tubos para evitar contaminacin.
19-
Con una pipeta serolgica estril, adicionar al sedimento 1.0 ml de albmina

bovina al 0.2% (aproximadamente 20 gotas), mezclar bien a mano. Efectuar
aspticamente un frote si este no se ha hecho de esputo original, colorear con
Ziehl-Neelsen o Kinyoun.
10-
Con pipeta capilar estril, inocular dos gotas del sedimento con albmina en
la superficie de un tubo (dos de preferencia segn disponibilidad), de medio
de cultivo Lowenstein-Jensen.
11-
Colocar los tubos dentro de la incubadora a 36 C, inclinados de manera que

la superficie del medio quede totalmente horizontal por 1 a 2 das para distribuir bien el inculo; luego incubar verticalmente en gradilla.
12-
De preferencia colocar a cada tubo un capuchn de cartulina negra para evitar que al cultivo le de la luz. Dejar el tapn de rosca ligeramente flojo.
DIGESTIN/DESCONTAMINACIN DE ESPUTOS POR EL MTODO

CONVENCIONAL DE HIDRXIDO DE SODIO
Este procedimiento es muy utilizado, pero el porcentaje de recuperacin de
micobacterias es menor que el que se obtiene con el mtodo de la acetil-cistena.
Utilizar este mtodo slo si no se consigue el polvo de NALC.
1-
Trasladar aspticamente el esputo a una caja de Petri, sobre fondo oscuro.

Con dos aplicadores con las puntas quebradas, seleccionar las porciones anormales del esputo (pus, sangre, etc.).
2-
En un tubo de centrfuga grande, colocar una fraccin anormal del esputo.

Adicionar igual volumen de hidrxido de sodio al 3.5% con 0.004% de rojo
fenol. Agitar vigorosamente por 10 minutos, de preferencia en mquina
homogenizadora.
3-
Centrifugar el tubo a 3,000 rpm por 20 minutos.
4-
Decantar cuidadosamente el sobrenadante sobre un recipiente con desinfectante.

215
5-
Con pipeta Pasteur estril, adicionar lentamente cido clorhdrico 2N, hasta
obtener un color amarillo definitivo.
6-
Neutralizar el sedimento con unas pocas gotas de hidrxido de sodio al 3.5%

hasta un punto final con un color rosado dbil.
7-
Inocular un tubo del medio de Lowenstein-Jensen con dos asadas del sedimento.
8-
Incubar a 36 C segn lo indicado.
Reactivos para la tcnica de digestin/descontaminacin con Na0H:

1-
Hidrxido de sodio al 3.5% con 0.004% rojo fenol:

Pesar 35 gramos de hidrxido de sodio para anlisis, colocar las lentejas ya
pesadas dentro de un baln aforado de 1 litro. Poner el baln en bao de agua
fra, y adicionar lentamente agua destilada con agitacin constante hasta casi
llegar a la marca. Dejar enfriar y luego aforar exactamente a la marca de un
litro. Pesar 0.04 g (40 mg) de rojo fenol en polvo. Adicionarlo al hidrxido y
mezclar bien hasta obtener una solucin rosado fuerte.
2-
Acido clorhdrico 2N:

Medir 16 ml de cido clorhdrico concentrado en el fondo de un baln aforado
de 1 litro. Adicionar lentamente agua destilada hasta aforar a la marca de 1
litro.
Procedimiento de digestin/descontaminacin para esputos de pacientes cuyas

muestras estn constantemente contaminadas con Pseudomonas sp. o Proteus sp:
1-
Agregar al esputo un volumen igual de cido oxlico al 5% (si no se cuenta

con este reactivo usar cido sulfrico al 4%).
2-
Mezclar en agitador vortex y dejar en reposo 30 minutos a temperatura ambiente, con agitacin ocasional.
3-
Agregar solucin salina estril para bajar el peso especfico y diluir el cido.
4-
Centrifugar a 3,000 rpm (1800 a 2400 g) por 15 minutos.

216
5-
Decantar el lquido sobrenadante y neutralizar el sedimento con NaOH al

3.5% con 0.004% de rojo fenol.
6-
Inocular dos asadas del sedimento en Lowenstein-Jensen.
Procedimiento para lavados gstricos

Si el material es mucoide:
1-
Agregar una pizca (50 a 100 mg) de polvo NALC a 20-50 ml del lavado gstrico.
2-
Mezclar manualmente en agitador vortex.
3-
Centrifugar a 3,000 rpm por 30 minutos.
4-
Decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 2 a 5 ml de agua

destilada estril.
5-
Agregar un volumen igual de la solucin NALC-NaOH y proceder igual que

esputo.
Si el material es fluido:
1-
Centrifugar toda la muestra por 30 minutos a 3,000 rpm.
2-
Decantar el lquido sobrenadante y resuspender el sedimento en 2 a 5 ml de

agua destilada estril. Unir todos los sedimentos si se centrifugan varios tubos.
3-
Agregar igual volumen de la solucin NALC-NaOH y proceder igual que

esputo.
Procedimiento para orina:

1-
Centrifugar toda la muestra de la primera orina de la maana por 30 minutos

a 3,000 rpm. Puede ser necesario utilizar varios tubos estriles.
2-
Decantar los sobrenadantes, y unir los sedimentos.
3-
Agregar al sedimento igual volumen de cido sulfrico al 4%.

217
4-
Mezclar y dejar en reposo por exactamente 15 minutos.
5-
Llenar el tubo con agua destilada estril.
6-
Centrifugar a 3,000 rpm por 15 minutos.
7-
Decantar el sobrenadante y agregar al sedimento unas gotas de albmina

bovina al 0.2%.
Procedimiento para hisopo farngeo:

1-
Trasladar el hisopo con pinzas flameadas a un tubo de centrfuga estril (slo

la punta).
2-
Agregar 2 ml de agua destilada estril o solucin salina estril.
3-
Agregar 2 ml de la solucin digestora NALC-NaOH.
4-
Agitar en agitador vortex.
5-
Dejar en reposo 15 minutos.
6-
Remover el hisopo del tubo con pinzas flameadas.
7-
Llenar el tubo con agua destilada estril hasta 12 mm del borde.
8-
Centrifugar 15 minutos a 3,000 rpm y continuar el procedimiento como esputo.
Procedimiento para tejido o piel:

1-
Utilizar macerador de tejidos o mortero estril para triturar la muestra aspticamente en solucin salina estril. Si el tejido es mucoso (por ejemplo pulmn), adicionar una pizca de polvo NALC. Si se desea investigar hongos patgenos es mejor no triturar, mejor cortar en pedazos finos con tijeras estriles.
2-
Si la muestra fue colectada aspticamente, inocular directamente un pequeo

trozo en Lowenstein-Jensen.
3-
Si el tejido no ha sido colectado aspticamente, colocar el macerado en un

tubo estril y procesar como esputo.
218
Procedimiento para otros fluidos corporales:

Si el material es muco-purulento:
1-
Procesar igual que esputo si el volumen es de 10 ml o menos.
2-
Si el volumen es mayor de 10 ml, proceder como lavado gstrico mucoso.
Si el material es fluido:
1-
Si el material se obtuvo aspticamente, centrifugar o inocular el sedimento

directamente en Lowenstein-Jensen.
2-
Si el material no se obtuvo aspticamente, proceder como esputo si el volumen es menor de 10 ml, si es mayor procesar como lavado gstrico fluido.
3-
Efectuar procedimientos especiales para aislamiento de micobacterias de sangre o heces fecales, debe justificarse plenamente y por lo general no se efecta. Mdula sea: sembrar directamente en Lowenstein-Jensen.
INTERPRETACIN DEL CULTIVO

Examinar los tubos con lupa o microscopio estereoscpico y buena luz, a los 5
das despus de inoculados, y luego una vez por semana, los das lunes, para observar crecimiento. Los tubos negativos deben incubarse hasta 6 a 8 semanas, a
36 C, antes de ser descartados como negativos. Debe reportarse como negativo a
las 6 semanas; si hay crecimiento posterior debe modificarse el reporte.
Las micobacterias pueden producir en el medio de Lowenstein-Jensen dos
tipos de colonias:
-
Eugnicas: Colonias secas, superficie rugosa, bordes irregulares color

crema amarillento. Son tpicas de la mayora de micobacterias especialmente M. tuberculosis. M. kansasii es menos rugoso.
Disgnicas: Colonias brillantes de superficie lisa y bordes enteros tpicas de Mycobacterium bovis y Mycobacterium avium-intracelulare. Al observarse estos tipos de crecimiento en el tubo de Lowenstein-Jensen de
preferencia observados con microscopio estereoscpico, hacer frote en
una gota de solucin salina o colorear con Ziehl-Neelsen.
219
Si se observan colonias eugnicas de color crema formadas por bacilos

alcohol-cido resistentes (las cepas ms virulentas con factor cordn:
forman cordones sinuosos de bacilos agrupados paralelamente), y no
produce pigmento, presuntivamente se trata de Mycobacterium tuberculosis.
Reportar el crecimiento observado cuantitativamente segn esta tabla:
Nmero de colonias
Reporte de cantidad
No se observan colonias
Negativo para Mycobacterium tuberculosis
Menos de 50 colonias
Mencionar el nmero de colonias
50-100 colonias
+(1+)
100-200 colonias
++ ( 2 + )
Casi confluente (200-500)
+++ ( 3 + )
Confluente (ms de 500)
++++ ( 4 + )
Por ejemplo si el tubo de Lowenstein-Jensen presenta el crecimiento de 70

colonias eugnicas de BAAR, identificadas como M. tuberculosis por niacina, e informar:
Se aisl Mycobacterium tuberculosis +.
Identificar M. tuberculosis por las siguientes caractersticas:
1-
Crecimiento lento de colonias eugnicas no pigmentadas en LowensteinJensen que crecen entre 4 y 7 semanas.
2-
El Ziehl-Neelsen de estas colonias revela BAAR cortos, ligeramente

curvos de coloracin slida, a veces agrupados en cordones.
3-
Confirmar con la reaccin de produccin de niacina positiva.
Prueba de niacina:
La produccin de la vitamina niacina (cido nicotnico) en el medio
Lowenstein-Jensen es tpica de M. tuberculosis. Las otras micobacterias son niacina
negativo, por lo que con esta nica prueba se logra una diferenciacin adecuada.
Esta diferenciacin se conoce desde 1955 segn Konno et al. (Science, 124: 985, 1956
y Am. Rev. Resp. Dis. 75: 529, 1957).
220
Las colonias eugnicas no pigmentadas sobre el medio, producen niacina la

cual se difunde hacia el medio. La niacina se produce lentamente al igual que se
desarrollan las colonias. Por esta razn, la prueba slo puede hacerse en cultivos
puros que tengan de 50 a 100 colonias (1 +), y de 3 a 4 semanas de incubacin.
Se utiliza un procedimiento sencillo de extraccin de la niacina que se encuentra en el medio (no en las colonias), la cual luego se identifica por la produccin de un color amarillo en las tiras que contienen los reactivos qumicos adecuados. Proceder as si el cultivo llena los requisitos mencionados:
1-
Al tubo de Lowenstein-Jensen, con un cultivo puro de colonias eugnicas

(50 a 100) no pigmentadas y 3 a 4 semanas de incubacin, agregar 1.5 ml
de agua destilada estril o solucin salina estril. No usar cultivos contaminados que presentan coloracin azul en el Lowenstein-Jensen.
2-
Con el asa espatulada o pipeta capilar, cortar profundamente varias veces el medio de cultivo dentro del tubo, para que el agua o solucin
salina penetre y extraiga la niacina.
3-
Inclinar el tubo sobre algn soporte, de manera que la superficie del

medio quede horizontal y cubierta de lquido.
4-
Dejar el tubo en reposo en esta posicin por 30 minutos.
5-
Colocar el tubo verticalmente en una gradilla con mucho cuidado,

succionar aproximadamente 0.6 ml de extracto con pipeta Pasteur y
bulbo. Pasarlo al fondo de un tubo 13 X 75 mm con tapn de rosca.
Marcar el tubo con el nmero de muestra.
6-
Como control negativo, pipetear 0.6 ml del agua o solucin salina utilizada para hacer el extracto en otro tubo 13 X 75 mm. Marcar el tubo
control negativo.
7-
Con pinzas flameadas, dejar caer en ambos tubos una tira reactiva de
niacina (DIFCO 3182-30-8, Bacto-TB Niacina Test Strips), de manera que
la flecha indicadora quede apuntando al fondo del tubo; tapar los tubos
inmediatamente. Mantener las tiras en refrigeracin.
8-
Agitar los tubos suavemente; repetir esta agitacin suave de 5 a 10 minutos.

221
9-
Despus de 12 a 15 minutos, pero no despus de 30 minutos, comparar

el color de los extractos.
10-
Interpretacin: la prueba de niacina es positiva si aparece color amarillo en el extracto de la muestra, y el control negativo no presenta color.
Autoclavear los tubos con extractos de muestras.
Si el cultivo en Lowenstein-Jensen presenta crecimiento de colonias

pigmentadas (amarillo-anaranjado), o de crecimiento rpido (antes de 5 das), o
niacina negativo, se debe sospechar de otras especies atpicas del gnero
Mycobacterium o ms correctamente de los grupos de Runyon.
En Guatemala son mucho menos frecuentes que Mycobacterium tuberculosis.
En este caso el personal tcnico deber entregar el cultivo al microbilogo a cargo
del laboratorio, quien clasificar el BAAR aislado en alguno de los cuatro grupos
de Runyon por medio de pruebas especiales.
Grupos de Runyon (micobacterias atpicas):
Grupo I:
Fotocromgenos: producen pigmento slo cuando el cultivo se expone a la luz. En
la obscuridad producen colonias sin pigmentacin, son de crecimiento lento. Ejemplos: Mycobacterium kansasii y Mycobacterium marinum (crece a 30C).
Grupo II:
Escotocromgenos: producen pigmento tanto en la oscuridad como en la luz y son
de crecimiento lento. Ejemplo: Mycobacterium scrofulacem, que causa adenopata
cervical en nios.
Grupo III:
No fotocromgenos: no producen pigmento y son de crecimiento lento. Ejemplo:
Mycobacterium avium-intracelulare.
Grupo IV:
Crecedores rpidos: se caracterizan por crecer antes de 7 das de incubacin. Ejemplo: Mycobacterium fortuitum, puede causar tuberculosis resistente a varias drogas.
222
BIBLIOGRAFA
1.
Antilln, F., M.M. Gamboa, J.R. Mora y E. Rodrguez. 1985. BACTERIOLOGA DIAGNSTICA: Tinciones, Medios de Cultivo, Pruebas de
Identificacin. Vicerrectora de Accin Social-Facultad de Microbiologa.
Oficina de Publicaciones, Universidad de Costa Rica. San Jos de Costa Rica.
2.
Anzueto, A., M.F. Torres y J.L. Bran. 1980. Leptospirosis Humana en

Guatemala. Primer caso confirmado. Rev. Col. Med. Guatemala, 31(2) y Serie
Separatas Anuario, Vol. 33, Universidad de San Carlos de Guatemala; y 1984.
Memorias VII Congreso Nacional de Medicina Veterinaria y Zootecnia, 23-26
septiembre.
3.
Balows A., W.J Hausler Jr., K.L. Herrmann, H.D. Isenberg and H.J. Shadomy.
1991. MANUAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Fifth Edition. American
Society for Microbiology. Washington, D.C. USA.
4.
Baron, J.E. and S.M. Finegold. Editors. 1990. DIAGNOSTIC MICROBIOLOGY

Bailey & Scotts. Eight Edition. The C.V. Mosby Company. USA.
5.
Bartlett, R.C, P.D. Ellner and J.A. Washington II. 1974. CUMITECH 1, BLOOD
CULTURES. Coordinating Editor, J.C. Sherris. American Society for
Microbiology, Washington, D.C., USA.
6.
Bartlett, J.G., K.J. Ryan, T.F. Smith and R.W.Wilson. 1987. CUMITECH 7A,
LABORATORY DIAGNOSIS OF LOWER RESPIRATORY TRACT
INFECTIONS. Coordinating Editor, J.A. Washington II. American Society for
Microbiology,Washington, D.C., USA.
7.
Bauer, A.W ., W .M.,Kirby, J.C. Sherris and M. Truck. 1966. Antibiotic

susceptibility testing standarized single disc method. Am. J. Clin. Pathol.,
42: 493.
8.
BBL. 1988. MANUAL OF PRODUCTS AND LABORATORY PROCEDURES.

6th Edition. D.A. Power & P.J. McCuen (Editors). Division of Bio Quest,
Division of Becton Dickinson and Company. Cockesville, Maryland, USA.
9.
Blaser, M.J. 1979. Campylobacter Enteritis: Clinical and Epidemiologic Features.

Ann. Int. Med., 91: 179-185.
223
10.
Blazevic, D.J., J.E. Stemper and J.M. Matsen. 1974. Comparison of

macroscopic examination, routine Gram stains, and routine subcultures in
the initial detection of positive blood cultures. Appl. Microbiol. 27:537-539.
11.
Bode, G. et al. 1989. Morphological and electrophoretic characterization of

urease from Campylobacter pylori. Gastroenterology. 96: A48.
12.
Bowen, M.K. et al. 1957. The optochin sensitivity test: A reliable method for
identification of pneumococci. J. Lab. Med. 49:641-642.
13.
Butzler, J.P. 1981. Campylobacter Enteritis. (In: ACUTE ENTERIC

INFECTIONS IN CHILDREN. New Perspectives for Treatment and
Prevention, p.63-72.) Holme, T. et al. editors.
14.
Butzler, J.P. 1984. CAMPYLOBACTER INFECTION IN MAN AND

ANIMALS. CRC Press Inc. Miami, Florida, USA.
15.
Butzler, J.P. et al. 1992. Campylobacter and Helicobacter Infections. Curr. Opin.
Infect. Dis. 5:80-87.
16.
Christie, R., N.E. Atkins and E.A.Munch-Pettersen. 1944. A note on a lytic

phenomenon shown by group B streptococci. Aus. J. Exp. Biol. 22:197- 200.
17.
DIFCO Laboratories, Inc. (Editor). 1953. DIFCO MANUAL OF DEHIDRATED

CULTURE MEDIA AND REAGENTS FOR MICROBIOLOGICAL AND
CLINICAL LABORATORY PROCEDURES. 9th. Edition. Difco Laboratories,
Inc. Detroit, Michigan, USA.
18.
DIFCO. 1992. PRODUCT CATALOG AND REFERENCE GUIDE. Difco

Laboratories, Inc. Detroit, Michigan, USA.
19.
Facklam, R.R. et al. 1974. Presumptive identification of group A,B and D

streptococci. Appl. Microbiol. 27:107-113.
20.
Gardner, P. and H.T. Provine. 1975. MANUAL OF ACUTE BACTERIAL

INFECTIONS, Early Diagnosis and Treatment. Little Brown and Company,
Boston, Mass., USA.
21.
Gillies, R.R. & T.C. Dodds. 1968. BACTERIOLOGY ILUSTRATED. Second

Edition. E.&S. Livingstone Ltd. Edimburgh and London, England.
224
22
Goodwin, C.S. et al.1989. Transfer of Campylobacter pylori and Campylobacter

mustelae to Helicobacter gen. nov. and Helicobacter mustelae comb. nov.
respectively. Int. J. Syst. Bacteriol. 39:397-405.
23.
Gunn, B.A. 1976. SXT and Taxo A Disks for Presumptive Identification of
Group A and B Streptococci in Throat Cultures. J. Clin. Microbiol. 4(2):192193.
24.
Holdeman, L.V., E.P. Cato & W .E. Moore (Editors). 1977. ANAEROBE
LABORATORY MANUAL. 4th. Edition. Virginia Politechnic Institute and State
University, Blacksburg, Virginia, USA.
25.
Isada C.M., B.L. Kasten, Jr., M.P. Goldman, L.D. Gray and J.A. Aberg. 1995.
INFECTIOUS DISEASES HANDBOOK, INCLUDING, ANTIMICROBIAL
THERAPY & LABORATORY DIAGNOSIS, 1995-1996. American Pharmaceutical Association. Lexi-Comp Inc. Hudson, Cleveland, USA.
26.
Isenberg, H.D. (Editor in Chief). 1992. CLINICAL MICROBIOLOGY

PROCEDURES HANDBOOK. Two volumes. American Society for
Microbiology. Washington, D.C., USA.
27.
Joklik, W .K., H.P. Willett, D.B. Amos and C.M. Wifert. 1988. ZINSSER
MICROBIOLOGY, Nineteenth Edition. Appletton & Lange, Norwalk,
Connecticut/San Mateo, California, USA.
28.
Kass, E.H. 1956. Asymptomatic infections of the urinary tract. Trans. Asso c.
Am. Phys. 69:56-63.
29.
Koneman, E.W . et al. 1988. Color Atlas and Textbook of DIAGNOSTIC

MICROBIOLOGY. Third Edition. J.B. Lippincott Company, Philadelphia,
Pennsylvania, USA.
30.
MacFaddin, J.F. 1980. BIOCHEMICAL TESTS FOR IDENTIFICATION OF

MEDICAL BACTERIA. Second Edition. Williams & Wilkins, Baltimore,
Maryland, USA.
31.
Mata, L.J., A. Cceres & M.F. Torres. 1971. Epidemic Shiga Dysentery in
Central America. The Lancet 1: 600-601.
225
32.
Mata, L.J., A. Cceres, R. Fernndez, M.F. Torres, M. Cordn y R. Rosales.

1971. Avances sobre el conocimiento de la disentera en Guatemala. Rev.
Lat-amer. Microbiol. 14: 1-10; y 1972. Rev. Col. Med. Guatemala 23: 30-42, y
Arch. Col. Med. El Salvador 25: 1-15.
33.
Mata, L.J. et al. 1983. Diarrhea Associated with Rotaviruses, Enterotoxigenic

Escherichia coli, Campylobacter, and Other Agents in Costa Rican Children. Am.
J.Trop. Med. Hyg., 32:146-153.
34.
Mata, L.J. 1992. El CLERA: HISTORIA, PREVENCIN Y CONTROL.

Primera edicin. Editorial Universitaria Estatal a Distancia- Editorial de la
Universidad de Costa Rica, San Jos de Costa Rica.
35.
Maxted, W.R. 1953. The use of bacitracin for identifying group A haemolytic
streptococci. J. Clin. Pathol. 6:224-226.
36.
MERCK, E. 1977. HANDBOOK OF MICROBIOLOGY. Dehidrated Culture

Media, Culture Medium Bases, Sundry Preparations for Microbiology. E.
Merck, Darmstadt, Germany.
37.
MERCK, E. 1992. MICROBIOLOGY MANUAL. E. Merck, Darmstadt,

Germany.
38.
Murray, P.R. and J.A. Washington II.1975. Microscopic and bacteriologic

analysis of expectorated sputum. Mayo Clin. Proc. 50:339-344.
39.
Murray, P.R. 1982. Macroscopic and microscopic evaluation of respiratory

specimens. Clin. Lab. Med. 2:259-267.
40.
NCCLS. 1995. National Committee for Clinical Laboratory Standards.

Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. Third
informational supplement. M100-S6. NCCLS 15(14). Wayne, Pennsylvania,
U.S.A.
41.
Nugent, R.P., M.A. Krhon and S.L. Hillier. 1991. Reliability of diagnosing
bacterial vaginosis is improved by a standardized method of Gram stain
interpretation. J. Clin. Microbiol. 29:297-301.
42.
OXOID. 1990. THE OXOID MANUAL. Compiled by E.Y. Bridson. 6th Edition
Unipath, Ltd. Basingstroke, Hampshire, England.
226
43.
Prez C.E., M. F. Torres, M. Serrano, R. Garavito y G. Dvila. 1986.

Importancia de Campylobacter jejuni y Cryptosporidium como agentes etiolgicos
de diarrea infantil en Guatemala. Memorias, III Congreso Nacional de
Microbiologa. Guatemala 2-6 diciembre; y Memorias, XXXVII Congreso
Nacional de Medicina, Guatemala.
44.
Prez, C.E. 1989. Campylobacter jejuni y Cryptosporidium como agentes

etiolgicos de diarrea infantil en Guatemala. Tesis de graduacin. Facultad
de Ciencias Qumicas y Farmacia. Universidad de San Carlos de Guatemala.
45.
Poujol, E.R. 1994. DATOS HISTRICOS DE LA MICROBIOLOGA EN

HONDURAS. Organizacin Panamericana de la Salud. Organizacin Mundial
de la Salud, Tegucigalpa, Honduras.
46.
Reller, L.B., P.R. Murray and J.D. MacLowry. 1982. CUMITECH 1A, BLOOD
CULTURES II. Coordinating Editor, J.A. Washington II. American Society for
Microbiology, Washington D. C., USA.
47.
Roberts, G.D., E.W. Koneman and Y.K. Kim. 1991. Mycobacterium. In: Balows
A. et al. MANUAL OF CLINCAL MICROBIOLOGY. Fifth Edition. American
Society for Microbiology. USA.
48.
Sabbaj, J., M.F. Torres & L. Loza. 1983. Comparative Clinical evaluation of
azlocillin and gentamicin. J. Antimicrobial Chemotherapy 11: 175-181.
49.
Schleifer, K.H. 1986. Gram Positive Cocci. In: Sneath, P.H. BERGEYS
MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY. Vol. 2. Williams & Wilkins,
Baltimore, Maryland. USA. pp. 99-1004.
50.
Schneider, R.E., C. Sols Guerra y M.F. Torres. 1985. Diagnstico endoscpico

y clnico de la colitis por Shigella. Rev. Col. Med., Guatemala.
51.
Schneider, R.E., M.F. Torres, C. Solis, L. Passarelli, F.E. Schneider & M.

Vettorazzi. 1990. A simple method to detect Helicobacter pylori in gastric
specimens. British Medical Journal 300: 1559.
52.
Selingson, D. editor. 1977. CRC HANDBOOK SERIES IN CLINICAL

LABORATORY SCIENCES. Section E: Clinical Microbiology. Vol. IA. Von
Gravenitz ed. CRC Press, Ohio. USA.
227
53.
Silva, H.S., and J.A. Washington II. 1980. Optimal time for routine early
subculture of blood cultures. J. Clin. Microbiol. 12:455-456.
54.
Skirrow, M.B.1977. Campylobacter enteritis: a new disease. Br. Med. J.

2:9-11.
55.
Torres, M.F. y R. Fernndez B. 1980. Infeccin humana por Pasteurella multocida:

Primer caso reportado en Guatemala. Rev. Col. Med. 31(1): 27-30; y Serie
Separatas Anuario Vol. 36, Universidad de San Carlos de Guatemala.
56.
Torres, M.F., L. Arango, H. Logemann de Toledo y J. Sabbaj. 1980. Nocardosis

pulmonar en Guatemala: Primer caso confirmado. Serie Separatas Anuario,
Vol. 33, Universidad de San Carlos de Guatemala; 1981. Rev. Lat-amer.
Microbiol. 23(3):127-130; y 1982. Rev. Col. Med. Guatemala 5:26-28.
57.
Torres, M.F. 1983. Evolucin histrica de la Microbiologa Mdica. Diario

Prensa Libre, 02 de noviembre.
58.
Torres, M.F. 1985. BACTERIOLOGIA. En: MANUAL DE NORMAS Y

PROCEDIMIENTOS EN MICROBIOLOGA MDICA. Instituto Guatemalteco de Seguridad Social (IGSS). Guatemala.
59.
Torres, M.F. 1986. Estandarizacin de la Bacteriologa Mdica en Guatemala,

Conferencia Magistral. Memorias, III Congreso Nacional de Microbiologa.
Guatemala 2-6 diciembre.
60.
Torres, M.F. y E.G. Arathoon. 1988. Informe cientfico preliminar: Primer Caso
de infeccin humana por Isospora belli diagnosticado en Guatemala. Revista
de la Asociacin Guatemalteca de Parasitologa y Medicina Tropical 3(1):2728.
61.
Torres, M.F. et al. 1991. ETIOLOGA Y DIAGNSTICO DE LABORATORIO

DE EL CLERA. Publicacin Tcnica No.1.Organizacin Panamericana de la
Salud, Oficina Sanitaria Panamericana, Organizacin Mundial de la Salud.
Guatemala.
62.
Torres, M.F. 1992. POR QU SANGRE DE CARNERO EN EL LABORATORIO CLNICO? Empresa BIO BACTE. Serviprensa Centroamericana,
Guatemala.
228
63.
Torres, M.F. y M. Paz de Ramrez. 1993. Recomendaciones de Bioseguridad

para el Laboratorio de Microbiologa. Revista de la Asocicin de Qumicos
Bilogos de Guatemala. 3: 21-23.
64.
Torres, M.F. 1994. Pocas vctimas, grande el miedo (Streptococcus pyogenes)

Diario Prensa Libre. 10 de julio, Revista Domingo, pgina 13.
65.
Torres, M.F. 1994. Caractersticas fsicas, hematolgicas y qumicas de la sangre

de carnero. Boletn de la Asociacin de Qumicos Bilogos de Guatemala. 4: 7.
66.
Vestal, A.L. 1969. PROCEDURES FOR THE ISOLATION AND IDENTIFICATION OF MYCOBACTERIA. U.S. Department of Health Education
and Welfare. Public Health Service. National Communicable Disease Center.
Laboratory Division. Atlanta, Georgia, USA.
67.
Vestal, A.L. 1977. PROCEDURES FOR THE ISOLATION AND IDENTIFICATION OF MYCOBACTERIA. U.S. Department of Health Education
and Welfare. Public Health Service Publication: 75-8230. Centers for Disease
Control, Atlanta, Georgia, USA.
68.
Vettorazzi, M.C. 1992. Deteccin de Helicobacter pylori en biopsias de mucosa

gastrointestinal y correlacin con microbiota gstrica autctona. Tesis de
graduacin. Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia. Universidad de San
Carlos de Guatemala.
69.
Washington II, J.A (Editor). 1985. LABORATORY PROCEDURES IN

CLINICAL MICROBIOLOGY. Springer-Verlag, New York, Heidelberg, Berlin,
Tokyo.
70.
World Health Organization. 1992. READINGS ON DIARRHEA, STUDENT

MANUAL. Control of Diarrheal Diseases Program. Unit 1: The Epidemiology
and Etiology of Diarrhoea. World Health Organization. Geneva, Switzerland.
229
Esta publicacin fue impresa en los talleres

grficos de Editorial Serviprensa C.A. de
Guatemala, C.A. en el mes de septiembre
de 1996. Esta edicin consta de 1,000
ejemplares en papel bond 80 gramos.

Manual de Torres

Cargado por

Información del documento

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Manual de Torres

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

MANUAL PRCTICO DE

1996, Miguel Francisco Torres Rubn

Guatemala, agosto de 1996

Licda. Heidi Logemann Lima

PRLOGO A LA SEGUNDA EDICIN

Carta a sus hermanas:

La mayora de los microorganismos no son capaces de causar enfermedades

En todos los ambientes que rodean al hombre existen microorganismos. Las

Siempre se subrayan discontinuamente o se escriben con letra cursiva

RECOMENDACIONES DE BIOSEGURIDAD PARA EL

Lavarse las manos frecuentemente

Equipo de seguridad necesario en un laboratorio de investigacin:

Extinguidores en lugares accesibles

121 C a diferentes intervalos de tiempo

Naturaleza y nmero de microorganismos contaminantes.

Grado de muerte microbiana requerida.

Anaerobias: Son incapaces de crecer en presencia de oxgeno, el cual les

Facultativas: Son capaces de crecern en ausencia de oxgeno y tienen la

Segn la temperatura ptima de crecimiento, las bacterias pueden ser:

Termfilas: Crecen a altas temperaturas (calor).

Crifilas: Crecen a bajas temperaturas (fro).

Psicrotrficas: Crecen a temperaturas de refrigeracin.

Segn su forma, las bacterias se clasifican en tres grupos:

Cocos: Son bacterias de forma esfrica o redondeada. Ejemplo, Foto A

Bacilos: Son bacterias alargadas, de forma similar a una salchicha o

Espiroquetas: Son bacterias alargadas y retorcidas en forma de resorte o

Dependiendo de su forma de agrupacin los cocos pueden clasificarse as:

Diplococos: Agrupacin de bacterias esfricas en grupos de dos, o

En cadenas. Ejemplo: estreptococos (Streptococcus spp.)

En racimos. Ejemplo: estafilococos (Staphylococcus spp.)

Este tipo de clasificacin no se aplica a los bacilos ni a las espiroquetas.

CMO ORGANIZAR EL REA DE TRABAJO DE BACTERIOLOGA

6. Una lmpara de mesa de pie corto (tipo escritorio) o de cuello de ganso;

Fig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGA

La coloracin de Gram puede aplicarse a frotes extendidos sobre portaobjetos

Tcnica de la coloracin de Gram:

4. Cubrir el frote con safranina slo por 30 segundos. Enjuagar suavemente

Bacterias gram-positivo: morado-azul obscuro.

El reporte correcto de una bacterioscopa (observacin de bacterias) con Gram

en singular con respecto al Gram, nunca gram-positivos o gram-negativos en

Agua destilada ................................................................... 300 ml

Solucin anticorrosiva para desinfectar bistures:

Fig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLGICAS Y SU USO

Asa en argolla o anillo, no calibrada. Generalmente de almbre de

Asa de platino en anillo. Calibrada para tomar 0.001 ml, para

ASAS PARA MICOLOGA Y MICOBACTERIAS:

Asa espatulada, para manipular colonias duras y tomar muestras.

Asa de almbre grueso en "L", para purificar colonias de hongos y

Aguja de diseccin con punta aguda, para purificar colonias pequeas

Fig . 3 INOCULACIN DE MEDIOS

2. Flamear primera vez al

3. Segunda estra cruzada,

4. Flamear segunda vez, al

5. Tercera estra. Debe tocar

heces frescas (la mejor muestra)

material obtenido por proctoscopa

Efecte el coprocultivo as:

Ya diseminadas de esta manera las muestras en la superficie de las cajas,

Fig. 4 MARCHA BACTERIOLGICA PARA COPROCULTIVO

Heces frescas Hisopo rectal Sedimento de

Diseminar por estras, incubar a 36o C

Seleccionar colonias segn el caso,

Despus de incubadas, observar cuidadosamente las dos o tres cajas de cada

Fig. 5 OBSERVACIN Y SEALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS