BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

INTRODUCCION
Las bacterias vistas al microscopio generalmente aparecen como esferas o como bastones rectos o curvos, estas
pueden clasificarse dependiendo de su forma, en cocos (esfricas), bacilos (bastones rectos) y espirilos (bastones
curvos). Otra forma de clasificar las bacterias es aerobia, las que necesitan aire para vivir, anaerobia, que no pueden
vivir en presencia de aire y por ltimo, aquella que indiferentemente pueden vivir con aire o sin ste.
Tambin las bacterias se pueden dividir en dos grupos: ram !ositivo (") y ram negativo (#). $sta divisi%n se basa
en la capacidad de reacci%n de las bacterias frente al mtodo de coloraci%n, desarrollado por &'ristian ram en ())*.
Las que se ti+en con el colorante son ram " y aquellas que no toman el colorante son ram #.
,ormalmente a los gneros de ram negativos y positivos se les reali-a pruebas bioqu.micas como son: L/0, 1/O,
2/1, &/T30TO, 4L/$3, T2/, 53$0, 6$,/L0L0,/,0 entre otras...que ayudan en su identificaci%n, en el caso
de las ram negativas, e7isten otros tipos de medios de cultivo, as. como pruebas, como es el caso de la catara-a y
coagulasa.
5no de los gneros mas importantes del mundo microbiol%gico bacteriano son las enterobacterias las cuales son de
tipo ram negativo, que por definici%n son microorganismos entericos que producen enfermedad en el 'ombre y en
todas las especies, como enteritis o la t.pica diarrea, su aislamiento y cultivo son en medios selectivos diferenciales y
perfiles bioqu.micos. 5na de las especies m8s sobresalientes es la E.Coli.
La Escherichia Coli es una bacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales, incluido el 'umano y,
por ende, en las aguas negras. 6ue descrita por primera ve- en ())9 por T'eodor von $sc'eric', bacteri%logo alem8n,
quin la denomin% Bacterium coli. !osteriormente la ta7onom.a le ad:udic% el nombre de Escherichia coli, en 'onor a
su descubridor.
;sta y otras bacterias son necesarias para el funcionamiento correcto del proceso digestivo. 0dem8s produce
vitaminas < y 4. $s un bacilo que reacciona negativamente a la tinci%n de ram, es anaerobio facultativo, m%vil por
flagelos peritricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas, es capa- de fermentar la glucosa y la lactosa, en *)
'oras con producci%n de gas y 8cidos org8nicos (fermentaci%n 8cido mi7ta). 2i el microorganismo fermenta la lactosa
y=o la sacarosa, como las concentraciones de estos a-cares son (> veces mayores a la glucosa, se producir8 gran
cantidad de 8cido (que no puede ser neutrali-ado por la producci%n de aminas en la superficie), por lo tanto todo el
tubo (pico y fondo) virar8 al color amarillo (8cido). $s decir las colonias que fermentan la lactosa producir8n
suficiente 8cido para causar el vire del indicador.
La supervivencia de estas bacterias en medios no entricos es limitada por lo que su presencia indica una
contaminaci%n reciente. !or estas ra-ones, E. coli es el microorganismo .ndice ideal para la detecci%n de
contaminaciones recientes.
Los Proteus mirabilis son una bacteria ram.#negativa, facultativo anaerobia que pertenece a la familia de las
$nterobacteriaceae, este demuestra salida en en:ambre, motilidad, y actividad del ureasa. Los cuales causan el ?>@
de todas las infecciones del AProteus.
$s decir al igual que otras enterobacterias como E.coli, causa con m8s frecuencia infecci%n urinaria y cut8nea. $st8
tambin implicado en septicemia especialmente en pacientes inmuncomprometidos, y ocasionalmente produce
infecci%n pulmonar. 2e cree que el germen alcan-a la v.a area por in'alaci%n, implic8ndose el papel de la
coloni-aci%n intestinal como posible reservorio. Los mirabilis del !roteus, se pueden diagnosticar en el laboratorio
debido al motilidad caracter.stico de la salida en en:ambre, y la in'abilidad de metaboli-ar la lactosa (en una placa de
agar de 1ac &onBey, por e:emplo.) a causa de ello originan coloraciones incoloras. $s decir el agar de 1ac &onBey
es de gran apoyo ya que es un medio diferencial que permite distinguir entre enterobacterias que 'idroli-an lactosa y
las que no lo 'acen, por decir si la bacteria es lactosa positiva la 'idr%lisis de la lactosa produce 8cidos org8nicos y las
colonias que la 'idroli-an adquieren un color ro:o o rosa, en el caso de que las colonias fueran lactosas negativas
permanecen incoloras aunque el medio vira a amarillo por la subida de pC que origina la utili-aci%n de las prote.nas
(peptona) que se encuentran en el medio.
eneralmente los proteus son susceptibles a la mayor.a de los antibi%ticos aparte de la tetraciclina, no obstante (>@#
D>@ de tensiones de los mirabilis del !roteus.
Las caracter.sticas m8s comunes del genero proteus es que pueden utili-ar la urea y el citrato, al igual que producir el
gas del sulfuro del 'idr%geno, y formar las pel.culas claras en medios del crecimiento.
&omnmente las bacterias pueden ser encontradas a travs de las piedras, y estas bacterias que est8n al acec'o en las
piedras pueden dar una infecci%n despus del tratamiento antibi%tico.
$n el caso de los entericos positivos como los estafilococos, estreptococos, &orinebacterias, &lostridios entre otros,
crecen en medios enriquecidos como el agar sangre o normalmente los medios suelen ser combinados, por e:emplo:
5n medio de Aeosina a-ul de metilenoE es un medio selectivo diferencial. $ste medio se utili-a para diferenciar las
bacterias ram positivas, a las que in'ibe el crecimiento, de las ram negativas como las enterobacterias (E. coli).
$ste medio contiene lactosa como nutriente, y al ser tomado por las enterobacterias se produce 8cido, que 'ace que el
pC del medio ba:e, por lo que el color del medio pasar8 a ser violeta oscuro. 2i por el contrario las bacterias
e7istentes en el medio no utili-an lactosa, no se produce 8cido, por lo que dan lugar a colonias incoloras.
Las infecciones bacterianas son las m8s frecuentes, representando entre el 9> y )>@ de todas las complicaciones
infecciosas generalmente representadas por bacterias ram positivas que negativas, prevaleciendo el Staphylococcus
aureus, pero ninguna bacteria esta e7enta de causar enfermedad, por que en casos son indispensables ciertos factores.
MATERIALES Y METODOS
0 partir de una cepa microbiana, etiquetada como cepa numero (D y (F se tomo una muestra, la cual se sembr% en
agar 1ac &onBey, en forma de estriado, para despus incubar a FG &, durante D* 'oras.
!asado el tiempo, se reali-aron las observaciones en cada placa, a partir de ello se procedi% a la identificaci%n de
microorganismos con la ayuda de una tinci%n ram, la cual fue necesaria para la obtenci%n de datos mas cercanos al
microorganismo presente.
Hebido a la obtenci%n de una colonia lactosa negativa y positiva, se reali-aron pruebas bioqu.micas, es decir se tomo
una peque+a muestra del cultivo y se inoculo de forma recta y estriado en cada una de las pruebas, segn 'alla sido
el caso, despus del sembrado del microorganismo se incubaron a FG &, durante D* 'oras, para despus discutir las
observaciones.
RESULTADOS
<as8ndonos en la actividad reali-ada, se discuti% lo siguiente:
$n la siembra de la cepa (D, en medio 1ac &onBey se observo que la colonia era de forma redonda y de tama+o
peque+a, con un color rosa p8lido, en base a sus caracter.sticas f.sicas se dedu:o que era lactosa negativa.
!ara la cepa (F se observaron colonias en forma redondas, de tama+os grandes y c'icos, con un color rosa fuerte, en
base a sus caracter.sticas f.sicas se dedu:o que era lactosa positiva.
Tincin de Gram:
&epa (D: se encontraron bacilos en color morado, sin presencia de otro microorganismo.
&epa (F: se observaron microorganismos cocobasilares.
$n el caso de las pruebas bioqu.micas, mediante cambios de coloraci%n, motilidad y presencia de CD2, segn 'aya
sido el caso, se dedu:o la presencia de E.coli en la cepa nmero (F y proteus mirabilis en cepa (D.
&recimiento de E. coli
en agar 1ac &onBey.
&recimiento de Proteus Mirabilis en agar
1ac &onBey
PRUEBA DE CATALASA
Introdccin
$stafilococo, del griego Staphyl, que significa racimo de uvas, es una variedad bacteriana de la familia de los cocos.
!oseen forma esfrica y se agrupan formando grandes masas bacterianas en forma de racimo. 2on del tipo conocido
como ram !ositivo. Los estafilococos son la variedad m8s virulenta de la familia de los cocos, y son responsables
de un gran espectro de enfermedades, desde infecciones cut8neas 'asta neumon.a, sepsis, etc.
$stos microorganismos est8n presentes en la mucosa y en la piel de los 'umanos y de otros mam.feros y aves. $l
gnero comprende en la actualidad a FD especies y (9 subespecies, muc'as de las cuales se encuentran en los
'umanos. Las especies que se asocian con m8s frecuencia a las enfermedades en 'umanos son Staphylococcus aureus
(el miembro m8s virulento y conocido del gnero), Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophticus,
Staphylococcus capitis y Staphylococcus haemolyticus.
Los estafilococos crecen f8cilmente sobre casi todos los medios bacteriol%gicos, en condiciones aer%bicas se da el
me:or crecimiento. 2u mayor velocidad de crecimiento es a 9#D9I&. !ero tambin se puede ver en activa fisi%n binaria
entre F> y DG I&
Los $stafilococos producen catalasa, lo que los diferencia de los estreptococos.

Staphylococcus Streptococcus
!ndamento
La en-ima descompone el per%7ido de 'idr%geno CDOD
1todo:
0+adir una gota de CDOD a un cultivo denso y buscar burbu:as (OD)
2e utili-a para comprobar la presencia del en-ima catalasa que se encuentra el la mayor.a de las bacterias aerobias y
anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal e7cepci%n es 2treptococcus.
DCDOD ###&atalasa###J DCDO " OD
Originariamente, esta prueba era utili-ada para diferenciar entre los siguientes gneros:
Streptococcus (#) de Micrococcus (") y=o Staphylococcus (").
Bacillus (") de Clostridium (#).
Lysteria monocytoenes (") y=o Corynebacterium (", con las e7cepciones de C.pyoenes y C.haemolyticum, ambos #)
de Erysipelothri! (#)
MATERIALES Y METODOS
5na prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede 'acerse siguiendo dos tcnicas:
(#. 1todo del portaob:etos (recomendado):
&on el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de ()#D* 'oras y colocar sobre un portaob:etos limpio de
vidrio.
0gregar con gotero o pipeta !asteur una gota de CDOD al F>@ sobre el microorganismo sin me-clarlo con el cultivo.
Observar la formaci%n inmediata de burbu:as (resultado positivo).
Hesec'ar el portaob:etos en un recipiente con desinfectante.
2i se invierte el orden del mtodo (e7tender la colonia sobre el agua o7igenada) pueden producirse falsos positivos.
RESULTADOS
0l reali-ar la prueba de la &atalasa arro:o un resultado positivo indicando que el microorganismo encontrado se trata
de un Staphylococcus y no un Streptococcus. La funci%n de esta prueba es diferenciar los gneros de 2tap'ylococcus
de los gneros de Streptococcus.
PRUEBA DE COAGULASA
Introdccin
Los estafilococos coagulasa negativos son un grupo de microorganismos frecuentes en la piel, causa de infecciones
nosocomiales sobre todo en recin nacidos de ba:o peso y en pacientes inmunocomprometidos (con 2/H0, con
c8ncer, etc.). 5na alta proporci%n de los esta"ilococos coagulasa negativos aislados son portadores del gen mc0 que le
confiere resistencia a las betalactamasas (meticilina). 2e 'an identificado 'asta el presente FG especies de
estafilococos coagulasa negativos, de ellas (F pueden originar infecciones en 'umanos. La sensibilidad a la
novoviocina se utili-a para clasificar el estafilococo coagulasa negativo en dos grupos. La cepas con susceptibilidad a
la novoviocina incluyen entre otras Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus
hominis, Staphylococcus ludunensis, y Staphylococcus schle"ieriK por el contrario entre las cepas resistentes a la
novoviocina se incluyen Staphylococcus saprophyticus y Staphylococcus !ylosus que originan infecciones urinarias
en 'uspedes inmunocompetentes.
0l ser el estafilococo coagulasa negativo un comensal 'abitual de la piel, la distinci%n entre infecci%n y
contaminaci%n puede resultar en ocasiones dif.cil. !or ello, 'abitualmente se considera como criterio necesario de
infecci%n adem8s de un 'emocultivo positivo, la e7istencia de manifestaciones cl.nicas de infecci%n o una elevaci%n
de algn par8metro inflamatorio. 0lgunos son m8s estrictos en los criterios diagn%sticos de infecci%n por estafilococo
coagulasa negativo y consideran necesario al menos D 'emocultivos positivos.

Staphylococcus coaulasa neati#a staphylococcus aureus
"ndamento
$sta prueba se utili-a para diferenciar al Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otras especies del gnero
Staphylococcus. La coagulasa es una en-ima que estimula la conversi%n del fibrin%geno en fibrina, por lo que
comprueba la facultad de un microorganismo de coagular el plasma por acci%n de esta en-ima. 2i es coagulasa
positivo, se produce una turbide- alrededor de la colonia, debida a la coagulaci%n del plasma. !or otro lado,
reali-amos esta prueba cultivando a las bacterias en un medio rico en manitol (adem8s de plasma).
$l manitol es un a-car y gracias a este medio podremos distinguir si el microorganismo lo utili-a como fuente de
carbono. 2i es capa- de usarlo, se produce una acidificaci%n del medio, lo que da lugar a un vira:e del indicador de
pC de ro:o a amarillo.
MATERIALES Y METODOS
!ara esta prueba se a+ade una suspensi%n densa de bacterias a un tubo peque+a con plasma. L se incuba a FG
o
&.
2e observa la coagulaci%n a las * y D* ' sin sacarlos de la estufa.
2i aparece un coagulo en la suspensi%n el resultado ser8 positivo.
He no observarse nada en la soluci%n, el resultado se tomara como negativo.
RESULTADOS
$l resultado arro:ado despus de 'aber reali-ado la prueba de la coagulasa fue negativo por lo que se compraba que
el microorganismo encontrado es un 2tap'ylococcus coagulasa negativo. &on este resultado se puede asegurar de que
la especie estudiada no se trata de un Staphylococcus aureus.
SIM #SUL!URO$INDOL$MOTILIDAD%
Introdccin

$s un medio semis%lido destinado a verificar la movilidad, producci%n de indol y de sulfuro de 'idr%geno en un
mismo tubo. $s til para diferenciar miembros de la familia $nterobacteriaceae.
!ndamento
$l tript%fano es un amino8cido constituyente de muc'as peptonas, y particularmente de la tripte.na, que puede ser
o7idado por algunas bacterias para formar indol. $n el proceso interviene un con:unto de en-imas llamadas
triptofanasa. $l indol producido se combina con el alde'.do del reactivo de 4ovacMs o de $rlic', para originar un
compuesto de color ro:o. Las cepas m%viles pueden apreciarse en este medio, por la turbide- que producen alrededor
de la punci%n de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulf'.drico se distinguen por la formaci%n de un
precipitado negro de sulfuro de 'ierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pC mayor a G.D.
Reaccione&
!roduccion de indol
Triptofano ( &((C(D,DOD ) indol ( &)CG, )
!roduccion de CD2
" '
(
')S
&isteina Non 'idrogeno 0cido sulf'idrico
MATERIALES Y METODOS
Siem*ra
0 partir de un cultivo de ()#D* 'oras en medio s%lido, sembrar por punci%n profunda con agu:a de inoculaci%n recta.
2e debe inocular el centro del tubo, y la punci%n debe abarcar D tercios de profundidad del medio de cultivo desde la
superficie.
Inc*acin
Hurante D* 'oras, a F9#FGO&, en aerobiosis.
Luego de la incubaci%n, agregar F#9 gotas de reactivo de 4ovacMs o de $rlic'.
RESULTADOS
&epas m%viles: producen turbide- del medio, que se e7tiende m8s all8 de la l.nea de siembra.
&epas inm%viles: el crecimiento se observa solamente en la l.nea de siembra.

&epas 2CD positivas: ennegrecimiento a lo largo de la l.nea de siembra o en todo el medio.
Triptofanasa

&epas 2CD negativas: el medio permanece sin cambio de color.
&epas indol positivas: desarrollo de color ro:o luego de agregar el reactivo de 4ovacMs o de $rlic'.
&epas indol negativas: sin cambio de color.
2ulfuro indol motilidad
2e observa la producci%n de sulfuros, que se precipitan con iones frricos, a partir del tiosulfato de sodio presente en
el medio. La prueba positiva se muestra un precipitado negro en el medio de cultivo donde creci% la bacteria as.
tambin una turbide- en el medio debido ala motilidad de la bacteria
2ulfuros indol motilidad
2e observa una coloraci%n caf oscuro alrededor de la punci%n lo que indica el crecimiento, as. tambin la motilidad
de la bacteria y la falta de producci%n de sulfuro en el medio.
S+"ro indo+ moti+idad
2e
observa la capacidad de la bacteria para desdoblar el tript%fano por medio de la en-ima triptofanasa y producir
/,HOL. 0l adicionar 4ovacs sobre el medio cuando 'ay producci%n de /ndol se forma un anillo ro:o (tubo de la
derec'a). He lo contrario se forma un anillo amarillo (tubo del centro y la i-quierda).
Re&+tado& o*tenido& en +a rea+i,acin de +a -re*a
1O. $ncontrado !rueba bioqu.mica 1ovilidad /ndol CD2
$. coli 2/1 !ositivo !ositivo ,egativo
!.mirabilis 2/1 ,egativo !ositivo !ositivo
PRUEBA DEL CITRATO
Introdccin
$sta prueba sirve para determinar si un organismo es capa- de utili-ar citrato como nica fuente de carbono y
compuestos amoniacales como nica fuente de nitr%geno en su metabolismo, provocando una alcalini-aci%n del
medio. $ntre las enterobacterias estas caracter.sticas se dan en los siguientes gneros: Enterobacter, $lebsiella,
Serratia, Citrobacter y algunas especies de 2almonella. 2in embargo, Escherichia, Shiella, Salmonella typhi y
Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.
2e cultiva el microorganismo en agar citrato de 2immons. $ste medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio
como fuentes de carbono y de nitr%geno respectivamente y a-ul de bromotimol como indicador de pC. 2%lo las
bacterias capaces de metaboli-ar el citrato podr8n multiplicarse en este medio y liberar8n iones amonio lo que, :unto
con la eliminaci%n del citrato (8cido), generar8 una fuerte basificaci%n del medio que ser8 aparente por un cambio de
color del indicador de pC, de verde a a-ul.
!ndamento
$n el medio de cultivo, el fosfato monoam%nico es la nica fuente de nitr%geno y el citrato de sodio es la nica fuente
de carbono. 0mbos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema
buffer, el magnesio es cofactor en-im8tico. $l cloruro de sodio mantiene el balance osm%tico, y el a-ul de bromotimol
es el indicador de pC, que vira al color a-ul en medio alcalino. $l medio de cultivo es diferencial en base a que los
microorganismos capaces de utili-ar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente
de nitr%geno, con la consiguiente producci%n de alcalinidad.

$l metabolismo del citrato se reali-a, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del 8cido
tricarbo7.lico. $l desdoblamiento del citrato da progresivamente, o7alacetato y piruvato. $ste ltimo, en presencia de
un medio alcalino, da origen a 8cidos org8nicos que, al ser utili-ados como fuente de carbono, producen carbonatos y
bicarbonatos alcalinos. $l medio entonces vira al a-ul y esto es indicativo de la producci%n de citrato permeasa.
/ndependientemente de los productos terminales producidos, el primer paso de la fermentaci%n del citrato da por
resultado la producci%n de piruvato. La degradaci%n del piruvato depende entonces, del pC del medio.
Reaccione& de+ citrato
&itrato o7alacetato " acetato
!iruvato " &OD

Los productos obtenidos del metabolismo del citrato dependen del medio. 2i el pC aumenta (alcalino), se produce
m8s acetato y formato con una disminuci%n de la producci%n del lactato y &OD, por encima de pC G no 'ay
producci%n de lactato y los productos son:
&itrato &OD " acido formico " D acido actico
&on el pC acido el acetilmetilcarbinol (acetoina) y el lactato son los principales productos de utili-aci%n del citrato.
/ndependientemente de los productos terminales producidos, el primer paso de la fermentaci%n del citrato da como
resultado la producci%n de piruvato. La degradaci%n del piruvato depende entonces del pC del medio

MATERIALES Y METODOS
Siem*ra
0 partir de un cultivo de ()#D* 'oras en medio s%lido, sembrar por punci%n profunda con agu:a de inoculaci%n recta y
estriado en la superficie.
Inc*acin
Hurante D* 'oras, a F9#FGO&, en aerobiosis.
RESULTADOS
!rueba de citrato 2immons positiva: crecimiento con un color a-ul intenso en el pico de flauta
!rueba negativa: ,o se observa crecimiento ni cambio de color (verde)
POSITIVA NEGATIVO


Re&+tado& o*tenido& en +a rea+i,acin de +a -re*a
1O. $ncontrado !rueba bioqu.mica 3esultado
$. coli &itrato ,egativo
!.mirabilis &itrato ,egativo
.LIGLER #AGAR CON 'IERRO%
Introdccin
$l agar con 'ierro de 4ligler (4/0) y el agar con a-car triple y 'ierro (T2/) son medios de cultivo diferenciales en
tubo que cumplen un doble prop%sito: a) la determinaci%n de fermentaciones de 'idratos de carbono y b) la
determinaci%n de la producci%n de CD2.
$l 4/0 contiene dos 'idratos de carbono: (@ de lactosa y >.(@ de glucosa. $l T2/ puede sustituir el 4/0: la
diferencia primaria es el agregado de un tercer 'idrato de carbono, la sacarosa, a una concentraci%n del (@.
$n el 4/0, algunos microorganismos pueden fermentar ambos 'idratos de carbono, otros fermentan solo la glucosa:
incluso otros no pueden fermentar ni la lactosa ni la glucosa. La fermentaci%n de los 'idratos de carbono puede
ocurrir con producci%n de gas o sin ella (&OD " CD).
La fermentaci%n tiene lugar tanto en aerobiosis (en el pico de flauta) como en anaerobiosis (en el fondo). $n el pico
de flauta, el monosac8rido glucosa es cataboli-ado inicialmente por la v.a metab%lica anaerobia de $mbden#
1eyer'of#!arnas, usadas por aerobios y anaerobios para producir el intermediario clave 8cido pirvico. $l 8cido
pirvico es degradado luego a travs del ciclo de 4rebs por aerobios o anaerobios facultativos para rendir &OD, CDO
y energ.a.
!ndamento
Heterminar la capacidad de un microorganismo para atacar un 'idrato de carbono espec.fico incorporado en un medio
de desarrollo basal, con producci%n de gas o sin ella, :unto con la determinaci%n de la posible producci%n de 8cido
sulf'.drico (CD2).
La producci%n de CD2 y=o los patrones de fermentaci%n por lo general son caracter.sticos de grupos bacterianos
espec.ficos, gneros o especies, sobre todo entre los miembros de la familia $nterobacteriaceae.
Las reacciones del 4/0 se usan principalmente para identificar a los miembros de la familia $nterobacteriaceae
(entricos), que por definici%n son bacilos ram negativos catalasa positivos, todos los cuales fermentan la glucosa
con producci%n de 8cido. 0s. mismo, e7isten muc'os bacilos intestinales ram negativos no entricos cuya
identificaci%n o separaci%n de la familia $nterobacteriaceae es facilitada por sus reacciones en el 4/0. 2e observan
tres patrones de fermentaci%n b8sicos en el medio 4/0: a) fermentaci%n solo de la glucosa, b) fermentaci%n de
glucosa y de lactosa y c) ausencia de fermentaci%n de glucosa o de lactosa.
MATERIALES Y METODOS
Siem*ra
0 partir de un cultivo de ()#D* 'oras en medio s%lido, sembrar por punci%n profunda con agu:a de inoculaci%n recta y
estr.a en la superficie.
2e debe inocular el centro del tubo, y la punci%n debe abarcar D tercios de profundidad del medio de cultivo desde la
superficie.
Inc*acin
Hurante D* 'oras, a F9#FGO&, en aerobiosis
Reaccin
RESULTADOS
6ermentaci%n solo de la glucosa (alcalino=8cido)
$l primer patr%n del 4/0 despus de las ()#D* 'oras de incubaci%n es un pico de flauta alcalino de un fondo 8cido.
$sta reacci%n se observa con los microorganismos capaces de fermentar solo la glucosa: son los no fermentadores de
la lactosa.
$l pico de la flauta es alcalino (ro:o), lo cual indica la degradaci%n aerobia de la glucosa. Hespus de ()#D* 'oras de
incubaci%n, la concentraci%n ba:a de la glucosa (>.(@) se agota y el microorganismo empie-a a usar las peptonas del
medio como nutrientes de desarrollo.
$l catabolismo de la peptona libera amoniaco (,CF) que alcali-a el pC con el ro:o fenol, el indicador de pC
incorporado en el medio.
2in embargo, el fondo del 4/0 tiene un color amarillo debido ala degradaci%n anaerobia de la glucosa. La glucosa
aqu. tambin es degradada despus de ()#D* 'oras de incubaci%n: sin embargo, se forman productos finales 8cidos lo
que produce un pC 8cido (color amarillo)K la reacci%n 8cida se mantiene en el fondo debido a la tensi%n de o7igeno
mas ba:a.
6ermentaci%n de lactosa y de glucosa (8cido=8cido)
0lgunos microorganismos pueden fermentar la lactosa y la glucosa para obtener sus nutrientes y producen una
reacci%n en el 4/0 con un pico de flauta 8cido y un fondo 8cido (8cido=8cido) despus de ()#D* 'oras de incubaci%n.
La concentraci%n de lactosa ((@) es (> veces la de la glucosa. $n ()#D* 'oras, la lactosa (presente en mayor
cantidad) no se 'a agotado y todav.a e7iste un medio 8cido, si el mismo tubo de 4/0 se leyera despus de *) 'oras o
m8s, el pico de flauta se pondr.a finalmente alcalino debido al agotamiento de la lactosa y al uso de las peptonas.
0usencia de fermentaci%n de lactosa y de glucosa
(0lcalino=alcalinoK alcalino=sin cambios)
Peptonas
Aerbicamente
Anaerbicamente
Amoniaco (NH
3
)
&iertas bacterias, principalmente los bacilos ram negativos no entricos, no pueden fermentar ni la glucosa ni la
lactosa. $stas bacterias est8n presentes en el tracto intestinal :unto con los miembros de la familia $nterobacteriaceae
y es necesario identificarlas definitivamente como no entricas. Hado que estas bacterias no pueden obtener sus
nutrientes a partir de los 'idratos de carbono, dependen de la peptona del medio. $stos microorganismos no entricos
pueden usar la peptona de manera aer%bica o anaer%bica y producen dos reacciones posibles en el 4/0. 5n
microorganismo que produce un 4/0 con un pico de flauta alcalino y el fondo alcalino degrada la peptona aer%bica y
anaer%bicamente. 5na reacci%n con un pico de flauta alcalino y ningn cambio en el fondo es el resultado de un
microorganismo que puede cataboli-ar la peptona s%lo aer%bicamente: por ende, s%lo el pico de flauta muestra un
cambio de color (ro:o). &uando las peptonas son degradadas y producen un pC alcalino debido a la liberaci%n de
amoniaco (,CF), el medio adquiere un color ro:o profundo.
!or consiguiente, una reacci%n en 4/0 puede interpretarse de cuatro maneras, segn las bacterias a probar:
0lcalino=8cido: s%lo la glucosa es degradada.
Pcido=8cido: glucosa y lactosa degradadas.
0lcalino=alcalino: ni la glucosa ni la lactosa son degradadas, uso de las peptonas.
0lcalino=sin cambios: ni la glucosa ni la lactosa son degradadas: uso de las peptonas.
3$0&&/O, 4/0
0lc=0 (ro:o=amarillo) 2%lo la glucosa sola fermentada !eptonas usadas
0=0 (amarillo=amarillo) lucosa fermentada, Lactosa fermentada
0lc=0lc (ro:o=ro:o) 0usencia de fermentaci%n de la glucosa y la lactosaK
peptonas usadas
6ormaci%n de 'Ds
Otro sistema para la diferenciaci%n es aportado por los indicadores de CD2 presentes en el medio: una sal, el citrato
de amonio frrico, y otro producto qu.mico, el tiosulfato de sodio. 0mbos indicadores deben estar presentes, ya que el
resultado final es un procedimiento en dos pasos.
!aso (
$l CD2 es un gas incoloro: por ello, es necesario un segundo indicador para visuali-ar la producci%n de CD2.
!aso D
$l precipitado negro del sulfuro ferroso que indica la producci%n de CD2 puede enmascarar la condici%n 8cida
producida en el fondo del 4/0: por consiguiente, si se produce CD2, e7iste una condici%n 8cida aun cuando no sea
evidente.
Bacteria (en ambiente cido) + tiosulfato de sodio H
2
S gaseoso
H
2
S + iones frricos
Sulfuro ferroso (Precipitado negro insoluble)
Re&+tado& o*tenido& en +a rea+i,acin de +a -re*a
1O. $ncontrado !rueba bioqu.mica 3esultado
$. coli 4igler ,egativo
!.mirabilis 4igler ,egativo
MIO #MOTILIDAD/ INDOL/ ORNITINA DESCARBO0ILASA%
Introdccin
1edio usado para la identificaci%n de $nterobacterias bas8ndose en su movilidad, actividad de ornitina
descarbo7ilasa y producci%n de indol.
1edio de cultivo semis%lido, altamente nutritivo debido a la presencia de e7tracto de levadura, peptona y tripteina.
0dem8s, la tripteina aporta grandes cantidades de tript%fano, sustrato de la en-ima triptofanasa, para la reali-aci%n de
la prueba del indol. La de7trosa es el 'idrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la detecci%n de la
en-ima ornitina descarbo7ilasa, el prpura de bromocresol es el indicador de pC, que en medio alcalino es de color
prpura y en medio 8cido es amarillo.
!ndamento
!or su composici%n, es posible detectar F reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina
descarbo7ilasa e indol.
La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde m8s all8 de la l.nea de
inoculaci%n.
La reacci%n positiva a la ornitina esta dada por un color prpura del medio. Hebido a la fermentaci%n de la glucosa
se reduce el pC produciendo una condici%n 8cida y originando que el indicador de pC prpura de bromocresol vire al
amarillo. La presencia de acide-, otorga condiciones optimas para la actividad de la en-ima ornitina descarbo7ilasa,
la cual descarbo7ila la ornitina presente. !or descarbo7ilaci%n, se alcalini-a el medio, con el consecuente vira:e del
indicador 'acia el color prpura.
$l indol producido a partir del tript%fano por los microorganismos que contienen la en-ima triptofanasa. $l desarrollo
de un color ro:o luego de agregar unas gotas de reactivo de 4ovacQs o de $rlic', indica un resultado positivo.
MATERIALES Y METODOS
Siem*ra
0 partir de un cultivo de ()#D* 'oras en medio s%lido, sembrar por punci%n profunda con agu:a de inoculaci%n recta.
2e debe inocular el centro del tubo, y la punci%n debe abarcar D tercios de profundidad del medio de cultivo desde la
superficie.
Inc*acin
He () a D* 'oras, a F9O&, en aerobiosis
!ara la prueba de indol se a+aden de F a * gotas de reactivo de 4ovacQs, y se agita suavemente el tubo.
RESULTADOS
O*&er1acione&
La movilidad es indicada por turbide- del medio o por crecimiento e7tendido a partir de la l.nea de inoculaci%n.
La ornitina descarbo7ilasa es indicada por el color prpura del medio. La ornitina negativa es indicada por un color
amarillo, en el fondo puede ser prpura al final.
La aparici%n de color rosa o ro:o en el reactivo se interpreta como prueba positiva de indol.
Inter-retacin de re&+tado&
(.# 1OR/L/H0H
!ositivo: presencia de turbide- o crecimiento m8s a all8 de la l.nea de siembra

,egativo: crecimiento solamente en la l.nea de siembra
D.# O3,/T/,0 H$2&03<OS/L020
!ositivo: color prpura
,egativo: color amarillo, a veces se puede observar color prpura en el fondo
F.# !35$<0 H$L /,HOL:
!ositivo: color ro:o al agregar el reactivo de 4ovacQs
,egativo: el color del reactivo de 4ovacQs permanece incoloro#amarillento

Re&+tado& o*tenido& en +a rea+i,acin de +a -re*a
1O. $ncontrado !rueba bioqu.mica 1ovilidad /ndol Ornitina
$. coli 1/O !ositivo ,egativo !ositivo
!.mirabilis 1/O !ositivo !ositivo !ositivo
TRIPLE A2UCAR #TSI%
Introdccin
$ T2/ es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producci%n de 8cido y gas a partir de
la glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio. Tambin permite la identificaci%n de la producci%n de 2CD.
$sta es una prueba espec.fica para la identificaci%n a nivel de gnero en la familia $nterobacteriaceae. &on ob:etivo
de diferenciar entre:
<acterias fermentadoras de la glucosa
<acterias fermentadoras de la lactosa.
<acterias fermentadoras de sacarosa.
<acterias aerogenicas.
<acterias productoras de 2CD a partir de sustancias org8nicas que contengan a-ufre.
!ndamento
$l agar se prepara en forma de pico de flauta. $sto determina que e7istan dos c8maras de reacci%n dentro del mismo
tubo. La porci%n inclinada (pico) e7puesta en toda su superficie al o7.geno es aerobia y la porci%n inferior (fondo)
est8 protegida del aire y es relativamente anaerobia.
0l crecer un microorganismo en el T2/, el pico tiende a virar al pC alcalino (color ro:o por el ro:o fenol) por la
producci%n de aminas, debido a la utili-aci%n aerobia de las peptonas. $n el fondo del tubo #donde no 'ay o7.geno# la
degradaci%n de peptonas es menor y no se generan aminas, de manera que se pueden detectar la producci%n de
peque+as cantidades de 8cido (color amarillo por el ro:o fenol). 2i se inoculan microorganismo no fermentadores no
se formar8n 8cidos, pero por la producci%n de aminas en el pico, todo el medio quedar8 ro:o.
La glucosa en el T2/ est8 en una proporci%n (> veces menor que la lactosa y la sacarosa. 2i el T2/ es inoculado con
una bacteria fermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, la cantidad de 8cido producida por
fermentaci%n ser8 ba:a (porque la cantidad de glucosa inicial es ba:a). $n las primeras 'oras ((> a (T 'rs.) de
incubaci%n se producir8 vira:e del indicador al amarillo en todo el tubo (pico y fondo), pero al continuar la
incubaci%n, el pico del tubo retornar8 al ro:o por la producci%n de aminas debida a la degradaci%n aerobia de las
peptonas antes descrita.
2i el microorganismo fermenta la lactosa y=o la sacarosa, como las concentraciones de estos a-cares son (> veces
mayores a la glucosa, se producir8 gran cantidad de 8cido (que no puede ser neutrali-ado por la producci%n de aminas
en la superficie), por lo tanto todo el tubo (pico y fondo) virar8 al color amarillo (8cido).
La producci%n de CD2 a partir de tiosulfato se pone en evidencia por precipitaci%n del sulfuro ferroso (negro). &omo
esta reacci%n se da preferencialmente en medio 8cido, un ennegrecimiento del fondo del tubo (que puede cubrir todo
el fondo del tubo y enmascarar el color amarillo) se lee como fermentaci%n de algunos de los a-cares del medio.
0dem8s puede observarse la producci%n de gas (CD y &OD), ya sea como burbu:as en el fondo del tubo, por ruptura
del agar o despla-amiento del mismo 'acia la superficie.
MATERIALES Y METODOS
Siem*ra
&on un asa recta de micromel tomar una colonia del microorganismo a investigar.
/nocular los tubos de T2/ con punta (alambre recto). !ara eso introducir la punta
'asta F a 9 mm del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo, estriar el pico con
un movimiento 'acia uno y otro lado. /ncubar a FG O& durante ()#D* 'rs., pero no
m8s de D* 'rs.
Inc*acin
He () a D* 'oras, a F9O&, en aerobiosis
!ara la prueba de indol se a+aden de F a * gotas de reactivo de 4ovacQs, y se agita suavemente el tubo.
DISCUSION Y RESULTADOS
Taco 8cido (amarillo): lucosa fermentada.
<isel 8cido (amarillo): Lactosa y=o sacarosa fermentada.
Taco 8cido (amarillo): lucosa fermentada.
<isel alcalino (ro:o): Lactosa y=o sacarosa no fermentada.
Taco alcalino (ro:o) y <isel alcalino (ro:o): ,inguno de los tres glcidos es fermentado.
La aparici%n de burbu:as en el taco indica que la fermentaci%n se 'a efectuado con producci%n de gas.
5n ennegrecimiento en el medio indica la producci%n de 8cido sulf'.drico.

0 < & H
0 lucosa, lactosa y=o sacarosa fermentada
< lucosa fermentada con producci%n de 8cido sulf'.drico y gas
& lucosa fermentada con producci%n de 8cido sulf'.drico
H ,inguno de los tres a-cares es fermentado
$n el e7perimento que reali-amos en el laboratorio de microbiolog.a inoculamos dos microorganismos desconocidos
en tubos diferentes de agar T2/. L por medio de esta prueba bioqu.mica acompa+ada de otras mas determ.nanos que
los microorganismos encontrados eran los siguientes.
Re&+tado& o*tenido& en +a rea+i,acin de +a -re*a
1oo. $ncontrado !rueba bioqu.mica CD2 1OT/L/H0H 6$31$,T0&/O,
H$ 0U5&03$2
$. coli T2/ ,egativo !ositivo !ositivo
!.mirabilis T2/ !ositivo ,egativo ,egativo
LIA #AGAR 'IERRO LISINA%
Introdccin
$sta prueba permite diferenciar el microorganismo. Vue producen descarbo7ilaci%n o desaminaci%n de la lisina. 2e
puede detectar adem8s la producci%n de CD2. $s muy utili-ado en las tcnicas de bsqueda de Salmonella,
principalmente para descartar otras bacterias que dan colonias de aspecto similar en los medios diferenciales
utili-ados durante el aislamiento selectivo.
La glucosa es el 'idrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utili-ado para detectar la presencia de las
en-imas decarbo7ilasa y deaminasa. $l citrato de 'ierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la
producci%n de 8cido sulf'.drico. $l prpura de bromocresol, es el indicador de pC, el cual es de color amarillo a pC
igual o menor a 9.D, y de color violeta a pC igual o mayor a T.).
Las descarbo7ilasas son un grupo de en-imas sustrato#especificas, capaces de actuar sobre la porci%n carbo7ilo
(&OOC) de los amino8cidos, con formas de aminas de reacciona alcalina. $sta reacci%n conocida como
descarbo7ilaci%n, produce di%7ido de carbono con producto secundario. &ada una de las descarbo7ilasas es espec.fica
para un amino8cido.
Lisina, ornitina y arginina son los tres amino8cidos ensayados 'abitualmente en la identificaci%n de las
enterobacterias y producen las siguientes aminas espec.ficas.
La cadaverina (o (,9#diaminopentano o pentametilenodiamina pentano#(,9#diaminaK o &9C(*,D) es una amina
biognica que se obtiene por la descomposici%n del amino8cido lisina. 2e encuentra principalmente en la materia
org8nica muerta, y es responsable en parte del fuerte olor a descompuesto.

La formaci%n de la cadaverina se esquemati-a de la siguiente manera:
#N')% $ #C')%3$C' #COO'%$N') #Li&ina% N')$#C')%4$N') #Cada1erina%

La !utrescina es un compuesto qu.mico org8nico ,CD(&CD)*,CD ((,*#diaminobutano o butanodiamina) que se crea al
pudrirse la carne, d8ndole adem8s su olor caracter.stico.
$st8 relacionada con la cadaverinaK ambos se forman por la descomposici%n de los amino8cidos en organismos vivos
y muertos.
La putrescina es producida en peque+as cantidades por las clulas vivas gracias a la acci%n de la ornitina#
descarbo7ilasa.
Las poliaminas, de las que la putrescina es uno de los e:emplos m8s simples, parecen ser factores de crecimiento
necesarios para la divisi%n celular.
Otros compuestos qu.micos que se caracteri-an por su mal olor son el metanotiol y el 8cido but.rico.
La arginina se sinteti-a de citrulina por acci%n secuencial de las en-imas citos%licas argininosuccinato sintetasa
(022) y de la argininosuccinato liasa (02L). $sto es energticamente costoso, ya que la s.ntesis de cada molcula de
argininosuccinato requiere la 'idr%lisis de adenosin trifosfato (0T!) a adenosin monofosfato (01!)K i.e., dos 0T!
equivalentes.
La citrulina es un compuesto que interviniente en el ciclo de la urea. 2e forma por transferencia del grupo carbamoilo
proveniente del an'.drido del 8cido fosf%rico al grupo d#amino de la ornitina. $l en-ima ornitina transcarbamoilasa es
tambin mitocondrial. La citrulina difunde desde la mitocondria al citosol, donde contina el resto del ciclo de la
urea.
$l ,O se produce mediante la acci%n de la en-ima llamada %7ido n.trico sintasa (,O2, siglas que provienen del
ingls nitric o7ide synt'ase), la cual contiene diferentes molculas accesorias que traba:an en con:unto para formar el
,O a partir del amino8cido arginina y OD. Hurante esta reacci%n la arginina se convierte en una molcula de citrulina
al liberar ,O y consumir OD (el cual dar8 lugar a una molcula de agua)
La citrulina puede proveerse de mltiples fuentes:
He la arginina v.a %7ido n.trico sintetasa (,O2)K
He la ornitina v.a catabolismo de la prolilla o de la glutamina = glutamatoK
He la dimetilarginina asimtrica (0H10) v.a HH0C.

La actividad de la en-ima ,O2 se regula mediante la disponibilidad de diversas materias primas (o substratos), como
son la arginina, el OD y otras molculas que son necesarias para la s.ntesis del ,O.
$n la conversi%n de arginina a citrulina interviene una di'idrolosa m8s bien que una descarbo7ilasa, ya que en primer
trmino un grupo ,CD es eliminado de la arginina. La citrulina es transformada en ornitina, que luego sufre
descarbo7ilaci%n para formar putrescina. !or decarbo7ilaci%n de la lisina, se produce la amina cadaverina, que
alcalini-a el medio y esto produce el vira:e del indicador al color violeta. La decarbo7ilaci%n de la lisina, tiene lugar
en medio 8cido, por lo que es necesaria que la glucosa sea previamente fermentada.
Los microorganismos que no producen lisina decarbo7ilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un
vira:e de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las D* 'rs. de incubaci%n se observa el pico de color
violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.
La producci%n de sulfuro de 'idr%geno, se visuali-a por el ennegrecimiento del medio debido a la formaci%n de
sulfuro de 'ierro.
Las cepas de los gneros !roteus, !rovidencia y algunas cepas de 1organella, desaminan la lisina, esto produce un
8cido alfa#ceto#carb%nico, el cual, con la sal de 'ierro y ba:o la influencia del o7.geno forma un color ro:i-o en la
superficie del medio.
Siem*ra
!ara eso introducir la punta 'asta F a 9 mm del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo, estriar el pico con un
movimiento 'acia uno y otro lado.
Inc*acin
He () a D* 'oras, a FGO&, en aerobiosis
RESULTADOS
!ico alcalino=fondo alcalino=CD2 ", descarbo7ilaci%n de lisina positiva. $:.: Salmonella choleraesuis.
!ico ro:o=fondo 8cido=CD2#, desaminaci%n de lisina positiva, descarbo7ilaci%n de lisina negativa. $:.: Proteus
mirabilis.
!ico alcalino=fondo 8cido=CD2# descarbo7ilaci%n de lisina negativa. $:. E. coli
!ico alcalino=fondo 8cido=CD2" descarbo7ilaci%n de lisina negativa, producci%n de CD2. $:. Citrobacter "reundii
&oloraciones de las reacciones de la prueba bioqu.mica L/0.
Re&+tado& o*tenido& en +a rea+i,acin de +a -re*a
1icroorganismo !rueba bioqu.mica 3esultado
Escherichia coli L/0 ,egativa
Proteus mirabilis L/0 !ositiva
PRODUCCI5N DE UREASA
Introdccin
Hetermina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos molculas de amoniaco por acci%n del
en-ima ureasa. $sta actividad en-im8tica es caracter.stica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para
diferenciar este gnero de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado. Los microorganismos que
poseen la en-ima ureasa tienen la capacidad de 'idroli-ar urea con la liberaci%n de amoniaco.
$l caldo urea de stuart est8 fuertemente estabili-ado con sales de fosfato a un p' de T.). $l organismo en estudio debe
producir cantidades relativamente grandes de amoniaco a fin de superar el sistema estabili-ador y elevar el p' del
medio lo suficiente como parar provocar el via:e del indicador (por encima de ).>).$l caldo urea de stuart es, por lo
tanto, virtualmente selectiva para especies del genero !roteus.
!ndamento
Hetermina la capacidad de un organismo para desdoblar la urea, en amoniaco y &>D, por acci%n de la en-ima ureasa.
La visuali-aci%n del proceso se fundamenta en que la alcalini-aci%n producida en el medio de cultivo se detecta
mediante un indicador de pC (ro:o de fenol).
MATERIALES Y METODOS
Siem*ra
/nocular los tubos (asa recta). !ara eso introducir la punta 'asta F a 9 mm del fondo del tubo. Tras retirar la punta del
fondo, estriar el pico con un movimiento 'acia uno y otro lado.
Inc*acin
/ncubar a F9#FGO & durante veinticuatro#cuarenta y oc'o 'oras.
DISCUSION DE RESULTADOS
2e considera la prueba positiva si el medio adquiere una tonalidad rosada, y negativa si mantiene su coloraci%n
inicial.
3eacci%n negativa
3eacci%n positiva
Re&+tado& o*tenido& en +a rea+i,acin de +a -re*a
<acteria !rueba bioqu.mica 3esultado
$sc'eric'ia coli 5rea ,egativo
!roteus mirabilis 5rea ,egativo