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ndice

1. Introduccin.................................................................................................................. 2. Urocultivo...................................................................................................................... 3. Coprocultivo.................................................................................................................. 4. Exudado faringeo........................................................................................................... 5. Exudado vaginal y uretral.............................................................................................. 6. Cultivo de secrecin de heridas, exudados y trasudados................................................ 7. Hemocultivos................................................................................................................. 8. Cultivo de liquido cefalorraqudeo y otros lquidos corporales...................................... 9. Vibrio cholerae.............................................................................................................. 10. Bacterias gram negativas no fermentadoras................................................................... 11. Anaerobios.................................................................................................................... 12. Prueba de sensibilidad a los antimicrobianos................................................................. 13. Interpretacin de pruebas bioqumicas........................................................................... 14. Indicaciones para el proceso de las muestras................................................................. 15. Tcnica de tincin de gram............................................................................................ 16. Tcnica. De tincin de Ziehl Neelsen............................................................................ 17. Preparacin de soluciones y colorantes.......................................................................... 18. Bibliografa....................................................................................................................

INTRODUCCION Dada la importancia que tiene la Bacteriologa Mdica en el diagnostico de las enfermedades es necesario que el personal de laboratorio est capacitado para desempear las tcnicas adecuadas que nos van a llevar a aislar e identificar los microorganismos que se encuentran como agentes causales de una infeccin. Es por esto que para poder cumplir con las actividades eficazmente, el bacterilogo y dems personal que colaboran en la realizacin de dichas funciones, necesitan conocer muy a fondo todas las tcnicas del laboratorio de Bacteriologa Medica, para ello deben contar con un manual de consulta que seale la informacin fundamental respecto a cada uno de los cultivos, as como las pruebas diferenciales y confirmatorias de cada microorganismo aislado de los especimenes estudiados y de esta manera proporcionar una informacin til para el diagnostico. Este manual comprende la metodologa a seguir en el desarrollo de los cultivos de mayor importancia medica, como son: Urocultivo, Coprocultivo, Hemocultivo, Cultivo de Exudado Farngeo, Cultivo de Exudado Vaginal, Uretral, Cultivo de Liquido Cefalorraqudeo y Cultivo de Secrecin de Heridas, Exudados, Trasudados y otros Lquidos Corporales. Los datos generales de cada uno de los cultivos aqu citados aportan informacin suficiente del mtodo, as como de la Flora normal y patologa de cada espcimen estudiado, lo cual nos sirve de apoyo para determinar y diferenciar los agentes causales de una infeccin dad, as como la sensibilidad a los diferentes antimicrobianos. Comprende tambin control de calidad de bacteriologa medica (como son medios de cultivos REACTIVOS Y EQUIPOS). Al final de este, se incluyen la preparacin de colorantes, tcnicas de tincin de Gram y preparacin de soluciones.

UROCULTIVO Cultivo de orina Generalidades Las infecciones bacterianas del tracto urinario afectan a las personas de todas las edades y ambos sexos, el nico medio seguro para el diagnostico especifico es la demostracin de las bacterias y los mtodos de cultivo adecuados. Los estudios de laboratorio y el cultivo de orina son partes necesarias de la evaluacin del enfermo en busca de infecciones de vas urinarias, con mayor frecuencia en la vejiga. La orina de riones y vejiga, suelen ser estriles, pero en la uretra suelen existir nmeros pequeos de bacterias. En consecuencia, la orina puede contener diversos microorganismos. A pesar de lo expuesto, la bacteria suele ser resultado de la prevalencia de un tipo particular de bacterias. Por tal razn, la presencia de mas de dos especies bacterianas diferentes en una muestra de orina, sugiere fuertemente contaminacin durante la obtencin. Sin embargo, la negatividad de un solo cultivo no siempre excluye la presencia de infeccin, por que suele haberlas, como el caso de pielonefritis crnica. Aislamiento de una bacteria patgena conocida no confirma obligadamente la existencia de infeccin de vas urinarias, porque las muestras suelen estar contaminadas por microorganismos de uretra y genitales externos, la orina constituye un excedente medio de cultivo para los grmenes patolgicos comunes de las vas urinarias y cuando las bacterias pasan a la orina se multiplican extraordinariamente superando a veces un milln por millones como las muestras de orina, obtenidas en forma natural o por cateterismo suele contaminarse. En el momento de su recoleccin, la presencia de microorganismos aun las patologa conocidas, no establece necesariamente el diagnostico de infeccin de las vas. Los resultados importantes de los cultivos de orina son posibles solo despus de estudio cuantitativo. Para diferenciar entre bacterias verdaderas y contaminacin se necesita conocer el nmero de microorganismos en 1 ml de orina, estimada por una tcnica de cultivo llamada recuento de colonias, mtodo que permite diferenciar con toda precisin entre infeccin y contaminacin. La flora bacteriana de orina normal difiere de las muestras infectadas. Los microorganismos mencionados en primer termino son las que se encuentran con mayor frecuencia en la orina normal. Por supuesto, ellas representan contaminaciones de uretra, vagina, etc. ya que la orina de la vejiga es normalmente estril. Estafilococos, coagulosa-negativas. Bacilos difteroides. Bacilos coniformes. Enterococos. Lactobacilos. 5

Estreptococos alfa hemolticos y beta hemolticos. Levaduras saprofitas. Especies de bacillus. La flora de la orina infectada incluye, por lo comn una o varias de las siguientes bacterias. Materia: Frasco estril Benzal Diluido 1:1000, algodn. Placas con agar, Mac Conkey. Placas con agar GS. Placas con agar Biggy. Asa calibrada para inocular 0.001 ml. Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter. Proteus mirabilis y otras especies de Proteus y serratea. Especies de providencia y morganella. Pseudomonas aeruginosa y otras especies de Pseudomonas. Enterococos (Streptococos fecalis). Staphylococcus, coagulosa-positiva y coagulosa-negativa (S. saprophyticus). Especies de Alcaligenes. Cndida albicans y otras levaduras. Gardnerella, vaginalis. Mycobacterium Tuberculosis y otras micobacterias. Estreptococos beta hemoltico por lo general de los grupos B y D. Neisseria gonorrea. Especies de Salmonella y Shigellas.

Desarrollo: 1. Agitar el frasco y tomar una asada de orina con el asa calibrada y descargar en lnea recta en el centro de la placa de MacConkey, gelosa sangre y Sabouraud y estriar masivamente. 2. Incubar las placas a 37C por 24-72 hrs., excepto la placa de Biggy que se incuba a temperatura ambiente. 3. Contar el nmero de colonias que desarrollan en las placas y multiplicar por 1000. 4. Si en numero de bacterias es mayor de 100,000 por ml se procede a identificar el microorganismo por los mtodos usuales y realizar antibiogramas.

5. Finalmente informar en numero de bacterias por ml as como que microorganismos se identifico, y su comportamiento frente a los diferentes antimicrobianos.

UROCULTIVO
MUESTRA
METODO DE ASA CALIBRADA 1:100 Sembrar una asada en cada uno de los medios, estriar como se indica en el diagrama.

GELOSA SANGRE 37AC 24-48 hrs. STAPHYLOCOCCUS STREPTOCOCCUS Tipificacin de ltex o coagulasa susceptibilidad

AGAR MACCONKEY 37 AC 24-48 hrs. ENTEROBACTERIAS PSEUDOMONAS Pruebas Bioqumicas Susceptibilidad

SABOURAUD. T. AMB. 24-48 hrs. CANDIDAS Tubo Germinativo

COPROCULTIVO El estudio bacteriolgico de las heces es til para identificar patgenas que ocasionan trastornos gastrointestinales como fiebre tifoidea y disentera y estados de portador. El objetivo principal de realizar un coprocultivo es que este sirva como apoyo al diagnostico clnico. La flora bacteriana normal en las heces incluye patgenas. Las mas comunes en vas gastrointestinales son Shigella, Salmonella y Camphylobacter, fectus, subespecie jejuni; entre los microorganismos patgenas menos comunes estn Vibrio cholerae, Clostridium perfringens y Staphylococcus aureus que suelen ocasionar sntomas gastrointestinales despus de la proliferacin excesiva de microbios oportunistas que son resultado de la destruccin de la flora normal por antibiticos Escherichia coli, bacillus cereus, Yersinia enterocolitica, Aeromonas hidrophyla y Vibrio parahemoliticus entero toxgenos. El 96 a 99 % de la flora intestinal normal comprende anaerobios que incluyen bacteroides lactobacillos anaerbicos, Clostridium, estreptococos anaerbicos; de 1 a 4 % restante esta integrada por aerobios que incluyen bacilos Gram-negativos (Predomina E. coli) y nmeros pequeos de Pseudomonas y Proteus, cocos Gram (+) Enterococos y nmeros pequeos de Lactobacilos y Cndidas. Material: Cajas petri con medio MacConkey. Cajas petri con agar SS. Tubo con caldo tetrationato o caldo selenito. Hisopos estriles. Tubos de 13 x 100 con medio TSI Tubos de 13 x 100 con medio LIA. Tubos de 13 x 100 con medio MIO. Tubos de 13 x 100 con agar UREA. Tubos de 13 x 100 con caldo malonato. Tubos de 13 x 100 con citrato de Simona. Frasco gotero con solucin salina estril. Gradilla. Frasco con fenol al 5% o benzal. Mechero. Solucin de yodo para el caldo tetrationato o selenito. Asa de platino. Antisueros polivalentes, para Salmonellas, Shigellas y Vibrio cholerae.

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Factores que interviene en los resultados 1. La tcnica inadecuada de reunin o la presencia de orina, contaminan la muestra de heces. 2. La administracin de antibiticos hace que disminuya el numero de bacterias en la muestra e inhibe el desarrollo in Vitro de las bacterias. 3. El hecho de no transportar rpidamente la muestra permite la proliferacin de microorganismos no patgenos, lo cual influye en los resultados del estudio. 4. La refrigeracin, hay microorganismos sensibles al fri. Sembrado de la muestra 1. Inmediatamente que la muestra llega al laboratorio se procede al sembrado. 2. En cada medio se deposita con un hisopo una pequea porcin y se produce a realizar estras cruzadas; esterilizando en cada estra el asa de nicromo. 3. En el caldo de tretationato se le agregan 4 gotas de yodo y despus se agrega, 2 gramos de muestra. 4. Todo se incuba a 36C 2C durante 24 Hrs. 5. Se produce la lectura siguiendo la marcha descrita.

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COPROCULTIVO
MUESTRA SIEMBRA DIRECTA Caldo de Tetrationato + 4 gotas de yodo + 2 grs. de la muestra. Inc 8-24 hrs. y resembrar

SS SS
INVESTIGAR COLONIA SOSPECHOSA DE: SALMONELLA E. COLI SHIGELLA. REALIZAR: BIOTIPO TIPIFICACION CON ANTIGENOS PARA DETERMINAR ESPECIES

SB 37C

MAC CONKEY

INVESTIGAR COLONIA SOSPECHOSA DE: E. COLI SALMONELLA SHIGELLA. REALIZAR BIOTIPO TIPIFICACION CON ANTIGENOS PARA DETERMINAR ESPECIES

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CULTIVO DE EXUDADO FARINGEO El estudio de Exudado Faringeo y Nasofaringeo es importante para el diagnostico de ciertas infecciones, entre ellas estn Streptococcus, la Difteria, la Tosferina; as como para establecer el foco de infeccin de enfermedades como: Fiebre Reumtica y Glomrulonefritis Hemorrgica aguda y en la demostracin de portadores de estreptococos beta hemolticos (Pyogenes) Haemophylus influenza en nios menores de 5 aos. La flora normal en vas respiratorias altas y bajas con frecuencia esta construida por: Streptococcus viridans Branhamella catarrhalis, Staphylococcus coagulasa-negativa (se puede confundir con estreptococos beta hemolticos) bacilos difteroides, levaduras y bacteroides. Entre los patgenos se encuentran: Estreptococos beta hemolticos del grupo A (Pyogenes) y ocasionalmente del grupo C y G Corynebacterium pertusis Haemophylus influenzae capsulado Mycabacterium, rara vez micoplasma pneumoniae Pseudomona aeruginasa, Streptococcus pneumoniae y cndida albicans. Material: Cajas de petri con Gelosa Sangre (Carnero). Caja de petri con Gelosa Chocolate. Cajas de petri con agar Biggy. Equipo para tincin de Gram. Hisopos estriles. Abatelenguas Medio de transporte Stuart. Pastorex Streptococcus. Disco para diferenciacin de Streptococcus Pneumoniae. Tcnica de sembrado a) b) c) d) Inocular en Gelosa Sangre de Carnero, Chocolate y aislar con estra cruzada. Colocar en la estufa a 35C 2C. A si tambin sembrar en Agar Sabouraud. Encubar a Temp. Amb. Leer las cajas de cultivo, observando el crecimiento bacteriano, a las 24 y 48 hrs. de incubacin

Identificar Streptococcus Beta Hemoliticus y Streptococcu pnemoniae.

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Utilizando prueba de ltex para Streptococcus Beta Hemoltico o sensidiscos de optoquina para Streptococcus Pneumoniae., o si se prefiere se identifican en mtodo automatizado. Nota: En pacientes menores de 5 aos sembrar en agar Chocolate, para Hasemophylus influenza de acuerdo al diagnostico del medico.

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Exudado

faringeo

MUESTRA SEMBAR EN:

GELOSA SANGRE DE CARNERO 5% CHOCOLATE

AGAR SABOURAUD

GELOSA

37 C 24-48 H. STREPTOCCUS BETA HEMOLITICUS STRPTOCOCCUS PNEUMONIAE IDENTIFICACION EN LATEX METODO AUTIMATIZADO MICRO-SCAN

TEMP. AMB. 24-48 H. CANDIDAS TUBO GERMINATIVO

37 C 48 H. EN CO2 AL 5% HAEMPPHYLUS INFLUENZA METODO AUTOMATIZADO MICRO-SCAN

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NOTA: SOLO PARA NIOS MENORES DE 5 AOS

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EXUDADO VAGINAL Y URETRAL Algunas bacterias patgenas, levaduras y protozoarios se hallan colonizando el epitelio del aparato genital masculino y femenino. Las infecciones frecuentemente se indican en la uretra anterior del varn y en la uretra, glndulas vulvovaginales y cuello uterino de la mujer. Los microorganismos mas frecuentes aislados del aparato genital son los siguientes: Bacilos coniformes, Enterococos y otros comensales intestinales incluyendo especies de anaerobios, bacteroides y otros. Lactobacillos. Gardnerella vaginalis Cndida Albicans, otras especies de cndida y levaduras. Saprfitas. Estreptococos Beta Hemolticas del grupo B y D. Mycobacterias no patgenas. Neisseria gonorrhoea. Treponema pallidum. Chlamydia trachomatis. Haemophilus ducreyi. Virus del Herpes Simple. Tricomonas Vaginalis.

En un exudado cervico vaginal la flora vaginal normal vara considerablemente con la edad, el PH de las secreciones y la cantidad de glucgeno presente en el epitelio; no obstante en la mayora de los casos dicha flora est constituida predominantemente por bacilos de Doderlain y en menor proporcin bacilos entricos gram (-), bacteroides SP, Enterococos y estafilocos coagulasanegativa. Cuando aparece un desequilibrio, frecuentemente de origen hormonal, se observa la desaparicin del bacilo de Doderlain lo que ocasiona que aparezca una flora alterada proveniente el exterior que puede causar vaginitis, tales como: Tricomoniasis, Candidosis, CERVICITIS gonoccica y un grupo heterogneo como son: gardnerella vaginalis y algunos causados por germen es anaerobios, as como son: Chlamydia tracomatis, Micoplasma H. Equipo y material: Guantes estriles. Hisopos estriles. Asa bacteriolgica. Especulo vaginal. Tayer-Martin. 19

Placas con medios de Gelosa Sangre (Carnero). Placas con medio de Casman. Agar Sabouraud en placa. Medio de transporte Stuart. Solucin salina en tubo (aprox. 1.2 a 2 ml) 2 Laminilla. Solucin KOH al 10%. Tubo de transporte para Chamydia T. Tiras de PH. Enfermedades de transmisin sexual. Principal mtodo de deteccin

POR MICROSCOPIA:

Tricomoniasis Sarna Pediculosis Gonorrea Vaginosis Bacteriana Candidosis Cervicitis o Uretritis Chamydiasis Micoplasma Hominis Ureaplasma Urealiticus.

POR CULTIVO:

BUSQUEDA DE ANTIGENOS:

Las infecciones vaginales se clasifican en 3 tipos: Vaginitis especficas: Proceso inflamatorio caudado por un germen especifico: Cndida, Chamydia T, Trichomona Vaginal, Neisseria, Microplasma Hominis y Ureaplasma U. Hay ms leucocitos polimorfonucleares presentes en gran cantidad. Vaginitis inespecficas: Proceso inflamatorio causado por una proliferacin anormal de la flora saprofita vaginal (la flora bacilar esta disminuida). Leucocitos polimorfonucleares presentes en gran cantidad.

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Vaginosis bacteriana: Alteracin de la ecologa vaginal con desplazamiento de la flora lactobacilar normal por microorganismos saprofitos. No causa respuesta inflamatoria (por lo cual no hay leucocitos presentes si los hay estos son escasos). En este padecimiento frecuentemente encontramos una asociacin entre un microorganismo aerobio con un microorganismo anaerobio, el ejemplo tpico es la Gardnerella Vaginalis asociada al Mobiluncus.

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TABLA Descarga Vaginal: Resumen de Diagnostico

Caractersticas

Normal

Vaginosis Bacteriana Homognea >4.5 Presente Presente Ausente No

Candidosis Flocular <4.5 Ausente Ausente Ausente Si

Tricomoniasis Homognea/Espumosa >4.5 Puede estar presente o ausente Ausente Presente Si/No

Tipo de Descarga Flocular Vaginal pH Olor aminado Clulas Indicadoras Tricomondidos Lactobacilos > otras bacterias <4.5 Ausente Ausente Ausente Si

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EXUDADO VAGINAL Metodologa Lecturas de placas si hay desarrollo se seleccionan colonias por su morfologa. EN BASE A LO ANTERIOR FLORA GRAM NEGATIVA FLORA GRAM POSITIVA (COCOS) Solo en secrecin Uretral
COCOS COCOBACILOS GRAM (- ) (+) AISLAMIENTO (CASMAN) LACTOBACILLUS GARDNERELLA VAGINALIS STREPTOCOCOS STAPHYLOCOCOS AURES AISLAMIENTO (SM) PRUEBAS: COAGULASA ANTIBIOGRAMA

AISLAMIENTO DIPLOCOCOS GONOCOCO

AISLAMIENTO GELOSA SANGRE PRUEBA: (LATEX) DIFERENCIACIO N DE GRUPO

SABOURAUD

Colonias desarrollas a temp. amb. 24-72 hrs.

Tubo Germinativo en suero para Candida albicans

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EXUDADO
MUESTRA es

VAGINAL
TINCION DE GRAM Morfologa Bacteriana Polimorfonuclear Clulas Claves

MEDIO DE TRANSPORTE

Solucin Salina Observacin en fresco Trichomonas Vaginalis Levaduras Mobiluncus

Thayer Martn 37 AC 24-48 hrs. N. Gonorrhoae Gardnerella Vaginalis

Gelosa Sangre 24-48 37 AC

Saboraoud Temp. Amb. 24-48hrs

KOH al 10% Prueba de Aminas

Streptococcus P. Ltex Para diferenciacin

Cndida Albicans Cndida SP Tubo germ.

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VULVO
MUESTRA

VAGINALES
TINCION DE GRAM Morfologa Bacteriana Polimorfonuclear es Clulas Claves

MEDIO DE TRANSPORTE

Solucin Salina de en fresco Aminas Trichomonas Vaginalis

Thayer Martn Sal y Manitol Casman Observacin 37 AC 24-48 24-48 hrs. CO2 al 5% N. Gonorrhoae 37 AC

Gelosa Sangre 24-48 37 AC

Saboraoud

KOH al 10% Prueba

Temp. Amb. 24-48hrs

Sthaphylococcus Coagulasa

Streptococcus P. Ltex

Cndida Albicans

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Levaduras Mobiluncus germ.

Gardnerella Vaginalis

Para diferenciacin

Cndida SP Tubo

Uretrales
MUESTRA es Clulas Claves MEDIO DE TRANSPORTE TINCION DE GRAM Morfologa Bacteriana Polimorfonuclear

Solucin Salina 10% Observacin Prueba de en fresco Aminas

Thayer Martn Sal y Manitol Casman 37 AC 24-48 hrs. 24-48 37 AC

Gelosa Sangre 24-48 37 AC

Saboraoud Temp. Amb. 24-48hrs

KOH al

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CO2 al 5 % Trichomonas Vaginalis Levaduras Mobiluncus germ. N. Gonorrhoae Gardnerella Vaginalis Sthaphylococcus Coagulasa Streptococcus Cndida Albicans P. Ltex Para diferenciacin Cndida SP Tubo

PRUEBA

DE

AMINAS

GOTERO OLOR AMINAS PORTA OBJETO PACIENTE SECRECION DEL

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CUANDO SE AGREGA UNA SOLUCION E KOH AL 10 % EN LAS SECRECIONES VAGINALES DE UNA PACIENTE CON VAGIINOSIS BACTERIANA, SE LIBERAN AMINAS CON UN OLOR FETIDO O A PESCADO

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Tcnica de sembrado: 1. Tomar del medio de transporte la muestra y proceder al sembrado con estras cruzadas. 2. En los medios descritos en la marcha. Los medios de Casman y Tayler Martn se incuba en CO2 al 5% a 36C. 3. Teir el frotis con tincin de Gram. 4. Leer el tubo de la solucin salina y el tubo de KOH al 10%. Proceder a la identificacin siguiente la marcha descrita para este estudio

Pruebas del pH de las secreciones vaginales normales.

Prueba del pH de las secreciones vaginales de una paciente con vaginosis bacteriana.

4.5

5.0

5.5

6.0 pH

6.5

7.0

7.5

Escala de pH

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CULTIVO DE SECRECION DE HERIDAS Exudados, trasudados y punta de catter. El cultivo de secrecin de una herida, Exudados, trasudados y punta de catter, comprenden el anlisis de microorganismos del liquido obtenido de una lesin, para confirmar la presencia de infecciones. Los cultivos de dicho material pueden hacerse para identificacin de microorganismos aerobios (que por lo regular necesitan oxigeno para proliferar y aparecen en heridas superficiales) o anaerobios (microorganismos que necesitan porco o nulo oxigeno y aparecen en zonas con poco riesgo como incisiones postoperatorias, ulceras, tejidos gangrenados). Las indicaciones para cultivo de material de la herida incluyen fiebre e inflamacin y secrecin en el tejido lesionado. Los aerobios que con mayor frecuencia contaminan una herida incluyen Staphylococcus aureus, Strepto Beta Hemoltico del grupo A, E. Coli y otras enterobacterias, Pseudomonas y otros bacilos y cocobacilos no fermentados as como anaerobios. Material y equipo: Hisopos estriles y un tubo con medio Stuar. Aplicadores estriles de algodn o una jeringa de 10 ml y un tubo con medio especial que contenga CO2 o nitrgeno (para anaerobios). Guantes estriles. Torundas con algodn. Placas con medio Gelosa sangre (Carnero). Placas con medio Sal y Manitol. Placas con medio Mac Conkey. Placas con medio Cetrimida. Placas con medio Sabouraud. Pruebas Bioqumicas o panel automatizado.

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EXUDADOS
MUESTRA

SECRECIONES
TINCION DE GRAM MEDIO DE TRANSPORTE STUAR

SABOURAUD SANGRE

CETRIMIDA

MACCONKEY

SAL Y MANITOL

GELOSA

CANDIDA PSEUDOMONAS STREPTOCOCCUS T. GERMINATIVO BIOQUIMICA METODO LATEX AUTOMATIZADO MICRO-SCAN

ENTEROBACTERIAS BIOQUIMICAS METODO AUTOMATIZADO MICRO-SCAN

STAPHYLOCOCCUS COAGULASA ANTIBIOGRAMA PRUEBA DE

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CUANDO SOLICITEN CULTIVO PARA HONGOS SEMBRAR EN AGAR DEXTROSA DE SABOURAUD O/Y MICOCEL Y PONER LA MUESTRA EN KOH AL 10 % Y LEER.

EXUDADO
MUESTRA

OTICO
TINCION DE GRAM

MEDIO DE TRANSPORTE STUAR

AGAR SABOURAUD SAL Y MANITOL T- AMB 37C 24-48 H 24-48H

MACCONKEY

GELOSA CHOCOLATE

GELOSA SANGRE

37C 24-48 H

37C 24-48 H

37C 24-48 H

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C. ALBICANS ENTEROBACTERIAS HAEMOPHILUS STAPHYLOCOCCUS T. GERMINATIVO PSEUDOMONAS NEISSERIA LATEX P. BIOQUIMICAS METODO ANTIBIOGRAMA METODOS AUTOMATIZADO MICRO-SCAN SCAN AUTOMATIZADO MICRO-SCAN

STRPTOCOCCUS COAGULASA IDENTIFICACAR EN MICRO-

EXUDADO
MUESTRA

CONJUNTIVAL
TINCION DE GRAM

MEDIO DE TRANSPORTE STUAR

AGAR SABOURAUD SAL Y MANITOL

MACCONKEY

GELOSA CHOCOLATE

GELOSA SANGRE

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T- AMB 37 AC 24-48 H 24-48H


C. ALBICANS STAPHYLOCOCCUS T. GERMINATIVO

37 AC 24-48 H
ENTEROBACTERIAS PSEUDOMONAS P. BIOQUIMICAS METODOS AUTOMATIZADO MICRO-SCAN

37 AC 24-48 H
HAEMOPHILUS NEISSERIA METODO AUTOMATIZADO

37 AC 24-48 H
STRPTOCOCCUS LATEX IDENTIFICACAR MICRO-SCAN COAGULASA ANTIBIOGRAMA EN MICRO-SCAN

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HEMOCULTIVO La demostracin de la presencia de un microorganismo a partir de la muestra de sangres, generalmente refleja una infeccin activa y diseminadas en los tejidos. La presencia de bacterias en sangre puede originarse por: Bacteriemia, Septicemia o piemia. BACTERIEMIA, se denomina as a la sola presencia (o invasin) de bacterias en sangre. SEPTICEMIA, la presencia de bacterias en sangre acompaadas de escalofros, fiebres y postracin ocasionado por la presencia de bacterias en proceso activo de multiplicacin y liberando toxinas agresivas y factores asociados a su patogenicidad en el torrente, sanguneo. PIEMIA, es una septicemia que origina la infeccin purulenta, es producida por microorganismos piogenes y da lugar a la formacin de abscesos en distintas partes del cuerpo. Por lo tanto el hemocultivo constituye un recurso muy importante para el diagnostico de infecciones sistemticas que presentan en su evaluacin una etapa de bacteremia o septicemia. En algunas enfermedades la positividad del cultivo sanguneo depende del estudio de la enfermedad. As en el caso de la fiebre, tifoidea, la recuperacin de los agentes involucrados, solo es generalmente afectivas durante la primera semana de la enfermedad por otro lado en la brucelosis los cultivos positivos se obtienen generalmente durante la exacerbacin de los sntomas y la elevacin de la temperatura, ya que la recuperacin durante la fase crnica no es fcil en condiciones optimas de laboratorio se deben tomar por lo menos tres muestras en 24 horas, con intervalos de 1 hora previa a la aparicin de la fiebre y considerar que la muestra contiene bajo numero de bacterias y que en algunas ocasiones estas se eliminan a la sangre en forma intermitente. La sangre para el Hemocultivo, se toma en condiciones optimas colocndose un frasco de un medio de cultivo enriquecido, el cual se recomienda vaya a condicionado de sustancias neutralizantes de los antimicrobianos inhibidores de la accin completa del suero y de la fagocitosis. La dilucin recomendada, al efectuar la muestra es de 1:10. Es por eso que si el frasco de cultivo contiene 20 ml. de caldo, se debern extraer 2 ml. de sangre. Material: 1 frasco de Hemocultivo. Jeringas estriles y agujas estriles. Ligaduras. Algodn. Frasco con tinturado yodo al 3 %. Alcohol isopropanol al 80 % ( alcohol etlico). Equipo para tincin de Gram. Placas de Agar Sangre. 37

Placas de Gelosa Chocolate o Thayler Martn. Placa de Agar MacConkey. Placa de Sabouraud. Placa se Sal y Manitol.

Ventajas del sistema automatizado de hemocultivos y cultivos de liquidos corporales 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Disminucin de cultivos falso negativo. Reduccin en el tiempo. Reduccin del manipuleo de las muestras ya que eliminamos el proceso de resiembras. Aumento en el porcentaje de recuperacin de microorganismos en los cultivos positivos. Entrega rpida y oportuna de resultados al medico. Reduccin de tiempo de trabajo, dedicado usualmente en el hemocultivo. En los medios de cultivos podemos trabajar muestras de sangre y otros fluidos corporales estriles con los mismo beneficios 8. Control de calidad adecuado. 9. Contienen factores que neutralizan el antibitico y permiten la recuperacin del microorganismo. NOTA: EL proceso para ingresar la botella al Bacter 9050; se describe en el Manual del Bactec.

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HEMOCULTIVO
Despus de que el equipo automatizado nos indica la botella POSITIVA. Realizar la marcha siguiente: TINCION DE GRAM

GELOSA SANGRE SABOURAUD. 37 C 24-48 H


STRPTOCOCCUS P. LATEX DIFENGNCIACION DE GRUPO

GELOSA CHOCOLATE 37 C 24-48 H CO2 al 5%

MACCONKEY 37 C 24-48 H

SAL Y MANITOL T. AMB 37 C 24-48 HRS. 24-48 H


STAPHYLOCOCCUS GERMINAT. T. COAGULASA ANTIBIOGRAMA

HAEMOPHILUS NEISSERIA SISTEMA AUTOMATIZADO MICRO-SCAN

ENTEROBACTERIAS PSEUDOMONAS/BNF BIOQUIMICAS SISTEMA AUTOMATIZADO MICRO-SCAN

C. ALBICANS

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CULTIVO DE LQUIDO CEFALORRAQUIDEO El examen bacteriolgico del liquido cefalorraqudeo es un paso fundamental en el diagnostico de todo caso de meningitis sospechosa. La meningitis bacteriana aguda es una infeccin de las meninges-membranas que recubren el sistema nervioso central, con repercusiones en el encfalo y en la medula espinal con alteraciones ms o menos caractersticas del lquido cefalorraqudeo ocasionada por diversos microorganismos Gram (-) sobre todo Hemophilus Influenzae, Neisseria meningitidis y Streptococcus pneumoniae. La Meningitis bacteriana puede se tambin secundaria a infecciones de otras partes del organismo y raras veces pueden recuperarse especies de Salmonella, bacilos coniformes, estafilococos o micobacterias; en la meningitis neonatal el microorganismo aislado con mas frecuencia es Escherichia Coli junto con Estreptococos betahemolticos del grupo B y G listeria monocytogenas (que tambin pueden afectar a los adultos), en pacientes inmunosuprimidos podemos encontrar Criptococcus neoformans. En la meningitis bacteriana generalmente el liquido cefalorraqudeo es purulento, con un recuento de leucocitos aumentado por lo comn mas de 1000/mm3, predominio de clulas polimorfonucleares y reduccin de la concentracin de glucosa en liquido medular.

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LIQUIDOCEFALORRAQUIDEO
Despus de que el equipo automatizado nos indica la botella POSITIVA. Realizar la marcha siguiente: TINCION DE GRAM

GELOSA SANGRE SABOURAUD. 37 C 24-48 H


STRPTOCOCCUS P. LATEX DIFENGNCIACION DE GRUPO

GELOSA CHOCOLATE 37 C 24-48 H CO2 al 5 %

MACCONKEY 37 C 24-48 H

SAL Y MANITOL T. AMB 37 C 24-48 HRS. 24-48 H


STAPHYLOCOCCUS GERMINAT. T. COAGULASA ANTIBIOGRAMA

HAEMOPHILUS NEISSERIA SISTEMA AUTOMATIZADO MICRO-SCAN

ENTEROBACTERIAS PSEUDOMONAS/BNF BIOQUIMICAS SISTEMA AUTOMATIZADO MICRO-SCAN

C. ALBICANS

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COLERA El clera es una infeccin persistente en nuestra poca, y sigue siendo un problema de importancia en reas como Asia. frica y Oceana. En su mayor parte, las epidemias importantes se han limitado a zonas con escaso saneamiento ambiental, aunque se ha elevado la probabilidad de apariciones de casos de clera importados en pases con buenos servicios sanitarios, debido a la transportacin rpida, al turismo y a los viajes internacionales. El hecho de encontrarlo en naciones desarrolladas como Estados Unidos es de llamar la atencin, en Mxico, no se haban reportado casos de clera desde el siglo pasado; sin embargo en 1983 se publico el caso de una turista Estadounidense que presento la enfermedad cuatro das despus de retornar a su pas procedente de un viaje por las costas del estado de Quintana Roo (Cancn). Lo anterior, enfatiza la importancia de mantener una vigilancia Epidemiolgica, y ms actualmente con el problema que se tiene en Per. El clera en su forma mas grave, es una enfermedad que consiste en una diarrea aguda, caracterizada por una perdida masiva de lquidos y electrolitos; vomito, deshidratacin rpida y acidosis, lo que, a menos que no se trate, provoca un colapso cardiovascular y la muerte dentro de las 24 horas de su aparicin. En realidad, tales casos son la excepcin ms que la regla, y los estudios epidemiolgicos indican que, para cada caso grave, se presenten de 25 a 100 diferentes infecciones que varan de leves a sintomticas. Esta enfermedad se adquiere por la ingestin de agua o alimentos contaminados con vmitos o heces de pacientes y en menor grado la transmisin ocurre de persona a persona, por contacto directo, las manos sucias y las moscas. Las manifestaciones clnicas de la enfermedad se deben a la produccin de una enteroxina, la cual es una exotoxina conocida como toxina colrica; que esta compuesta de una subunidad A (con dos subunidades, A1 y A2) y cinco subunidades B; esta ultima une a la toxina con el receptor gangliosido GM1. la subunidad A1 penetra la membrana celular y activa el AMP cclico, lo que inhibe la absorcin de Nac1 e incrementa la secrecin de cloro y bicarbonato, produciendo diarrea secretora que puede ser tan severa para producir un litro por hora de gasto fecal. Aunque el cuadro clnico es muy significativo, el diagnostico se hace al aislar Vibrio cholerae de las heces o vomito de los pacientes. Tambin se pueden determinar anticuerpos antitoxinas y vibriocidas. La recoleccin de muestras de heces para el laboratorio, en la fase aguda puede hacerse mediante hisopado rectal, durante la convalecencia es mejor la toma de la materia fecal. Cuando la muestra no se procesa de inmediato, debe usarse un medio de transporte, en este caso, Cary-Blair donde Vibrio sobrevive hasta 3 semanas El tratamiento se basa en la restitucin de lquidos, que en los casos menores graves puede hacerse por va oral. La tetraciclina es el antibitico de eleccin y se puede considerar al cloranfenicol, eritromicina y furozolidona como alternativas.

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Es reconocido que el principal mecanismo de control para el clera es elevar el nivel de saneamiento en la comunidad de reas endmicas. El uso de vacunas no ha sido eficaz, ya que solo protege en un 50 % y con una duracin de tres meses y no previene la diseminacin del microorganismo. No queda ms que enfatizar la importancia de la Vigilancia de epidemiolgica, con la finalidad de conocer el papel de Vibrio Cholerae como causa de diarreas en nuestro medio. Gnero vibrio En los ltimos aos, el genero Vibrio ha cambiado de un grupo heterogneo de organismos pobremente caracterizados a un grupo natural bien entendido. En genero Vibrio es ahora mucho mas homogneo y esta clasificado dentro de la familia Vibrionaceae junto con otros tres gneros: Photobacterium, Aeromonas y Plesiomonas. Las especies de Vibrio causan infecciones en humanos las cuales pueden ser clasificadas como intestinales o extraintestinales, dentro de las infecciones del tracto intestinal en cinco especies se ha demostrado que causan o estn asociadas con diarrea. V. Cholerae es bien conocido como causa del clera y V. Parahemolyticus produce gastroenteritis aguda. Ms recientemente, V. Fluviales, V. Hollisae y V. Mimicus han sido implicados como productores de diarrea. V. Fernissii se ha aislado de unos pocos casos de diarrea pero no hay evidencia real que el pueda causarla. ESPECIE DE VIBRIO ASOCIADOS A INFECCIONES HUMANAS V. Alginolyticus V. Cholerae V. Damsela V. Fluvialis V. Frunc V. Hollisae V. Metschnikovii V. Mimicus V .Parahemolyticus V. Vulnificus

V. cholerae sero grupo 01 y no 01 A mediados de los aos 30 fue reconocido que la gran mayora de lo Vibrio aislado de casos de clera, aglutinaban con un solo antisuero. La aglutinacin con este antisuero (mas tarde llamado antisuero V. cholerae 01) fue tomado como criterio para identificar un organismo V. cholerae.

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Aquellos organismos que no aglutinan con el mencionado antisuero, con conocidos como V. cholerae no 01. Hoy es aceptado que hay dos grupos de V. cholerae, serogrupos 01 y no 01. V. cholerae 01 es el serogrupo aislado de casos de clera, y toxina, produce diarrea severa, de tipo agua de arroz. a travs de la accin de su

V. cholerae no 01 puede causar une enfermedad parecida al clera, pero tiene un mayor espectro de enfermedades, incluyendo infecciones extraintestinales. Vibrio cholerae Definicin. 1. Bacilo Curvo Gran Negativo, oxidasa y catalasa positivo, con metabolismo fermentador. 2. Utiliza la sacarosa. Pertenece al Serogrupo 01. 3. No es halofilico. Medios de cultivo. Agar TCBS (Tiosulfato, Citrato, Sales Biliares y Sacarosa). Este medio de color verde posee como indicadores de cambio de ph azul de timol y azul de bromotimol; las cepas de V. cholerae, como utilizan la sacarosa se tornan de color amarillo al igual que el rea que las circunda. Tambin puede ser empleado el agar Mac Conkey, donde crecern con la tonalidad de una capa lactosa negativa, mayor de 1 mm De dimetro. Para aislar esta bacteria tanto de alimentos como de muestras clnicas se requiere el uso de metodologa de enriquecimiento. Identificacin. Gram Catalasa Oxidasa TSI LIA MIO Citrato Urea Bacilos Gram Negativos. Crecimiento en agar TCBS, colonias amarillas. Positiva. Positiva. A/A K/N (+); (+); (+). (+) (-)

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DNAsa Malonato

(+) (-)

Crecimiento en caldo nutritivo con 0 % NaCl 1 % NaCl 6 % NaCl 8 % NaCl (+) (+) d (53%) (-)

Aminoacido en base de moeller Arginia 1% Lisina 1% Ornitina 1% ONPG Prueba del collar (String test) Aglutinacin con antisuero 01 (-) (+) (+) (+) (+) (+)

NOTA: emplear tambin el mtodo automatizado Micro-Sean.

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AISLAMIENTO DE VIBRIO CHOLERAE MUESTRA Cari Blair Transportar al laboratorio Sembrar en Agar en Enriquecimiento Agua Peptonada alcalina Incubar toda la noche Incubar 5-8 hrs. Sembrar en agar TCBS Incubar toda la noche

Colonias Sospechosas Identificacin Bioqumica Antisuero V. Cholerae 01

Colonias Sospechosas.

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CONOCIMIENTO DE LAS BACTERIAS GRAM NEGATIVAS NO FERMENTADORAS (BGN N F) Hasta hace poco las bacterias no fermentadoras eran consideradas como comensales de escasa importancia clnica; sin embargo, estudio recientes han demostrado que casi un 15 % de todos los aislamientos realizados en los laboratorios de Microbiologa Clnica, corresponden a este grupo de bacterias, en donde Pseudomonas aeruginosa surge como un importante patgeno oportunista. El origen de este tipo de infecciones es mltiple y depende de varios factores tales como: el uso de sustancias inmunosupresoras, agentes antimicrobianos, procedimientos quirrgicos e instrumentacin mecnica. Se han observado que las infecciones nosocomiales ocurren en pacientes que han sufrido quemaduras, mas que en otra situacin clnica. La infeccin se produce por microorganismos en la flora normal del paciente, del ambiente o de ambos. Otro tipo de pacientes tambin susceptibles a la infeccin por este grupo de bacterias, son aquellos que sufren de enfermedades neoplsicas malignas, en especial leucemia y linfomas. Existen informes en los que se seala que Pseudomonas maltophilia ha sido aislada directamente de pus obtenida de lesiones malignas y de fistulas cancerosas. Burkholderia cepacie se han encontrado en enfermedades pulmonares de pacientes que sufren fibrosis quistica, aunque su papel en estos casos aun no han sido aclarado. El segundo genero bacteriano, aislado con mayor frecuencia es ACINETOBACTER el cual se asocia con diversas situaciones como septicemia, meningitis, endocartis, osteomielitis, neumona, infecciones en vas genitourinarias, ojos, odos, piel y abscesos, infecciones nosocomiales. Los dems gneros de este grupo, aunque no menos importante se aslan con menor frecuencia, estos son: MORAXELLA, ALCALIGENES, FLAVOBACTERIUM, ACHROMOBACTER, EIKNELLA. Los gneros XANTHOMONAS Y AGROBACTERIUM han sido aislados muy rara vez de fuentes humanas y sobre todo son fitopatogenos. Como caracterstica comn, los BGNnF se pueden aislar y recuperar en medios de cultivos convencionales, como es el caso de la gelosa sangre de carnero. Para su identificacin han sido propuestos un gran nmero de protocolos, de los cuales tres han resistido la prueba del tiempo, adems han logrado aclarar de manera sustancial la caracterizacin y significacin medica de dichos microorganismos. Estos esquemas fueron propuestos por la Dra. King ( ) y revisandos por Weaver ( ); Gilardi ( ) y Pickett. De estos, el esquemas de King Weaver fue el primero que se propuso. La diferenciacin de los microorganismos se basa en cuatro caractersticas: la utilizacin

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de glucosa, capacidad de desarrollo en Agar Mac Conkey, produccin de citocromo oxidasa y la movilidad. En el esquema de Gilardi, se emplean las pruebas de laboratorio mas accesibles omitiendo las que implican requerimientos especiales o periodos prolongados de incubacin. Entre las pruebas que planeta dicho esquema tenemos: utilizacin de carbohidratos, hemlisis, desarrollo de Agar Mac Conkey y Agar Salmonella Shigella (SS), crecimiento a 42 AC, susceptibilidad a Penicilina y Polimixina. El tercer protocolo, de Pickett sugiere algunas pruebas adicionales no comunes, tales como: utilizacin del cido Indolpiruvico (API) y del cido Fenilpiruvico.

Apndice N 1 Cepa Pura

Tincin de Gram Prueba de Catalasa Prueba de Oxidasa Siembra en medios para movilidad Siembra en Mac Conkey Adems siembra en los diferentes Medios que aparecen en la tabla

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Apndice N 2 Espcimen Clnico Preparacin adecuada

A.- Tincin de Gram Siembra en Agar Sangre de Carnero Siembra en Agar Mac Conkey Siembra en Agar Sal y Manitol

Incubar a 35 AC

B.- Revisar morfologa colonial Tincin de Gram Verificacin del Crecimiento Realizacin de Pruebas Bioqumicas Mtodo Automatizado Micro-Scan.

MEDIO OF PARA PRUEBA DE OXIDACION-FERMENTACION (HUGH Y LEIFSON)

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Microorganismos sacarolticos degradan la glucosa fermentara u oxidativamente. Los subproductos de la fermentacin son cidos mixtos relativamente fuertes, que se pueden detectar en un medio de fermentacin convencional (TSI, KIA). En un cambio, los cidos formados por la degradacin oxidativa de la glucosa son sumamente dbiles y para su deteccin se requiere un medio de oxidacin-fermentacin mas sensibles, como el descrito por Hugo y Leifson (medio OF). El medio OF, cuando es suplementado con un carbohidrato apropiado, es usado para la determinacin del metabolismo o fermentativo de carbohidratos por bacilos gram-negativos como un medio de diferenciacin entre especies. El medio OF desarrollado por Hugo y Leifson en 1953, quienes describieron la significancia taxonmica del metabolismo fermentativo vs. oxidativo de carbohidratos por bacterias gram-negativas. Ellos mostraron que cuando un organismo es inoculado en dos tubos de medio OF conteniendo un carbohidrato y el medio en uno de los tubos es cubierto con petrolato fundido antes de la incubacin, los patrones de metabolismo son de significado diferencial. Los organismos oxidativos producen una reaccin cida nicamente en el tubo abierto con poco o ningn crecimiento y sin formacin de cido en el tubo cubierto. Los organismos fermentados producen una reaccin cida en ambos tipos de tubos. Los cambios en los tubos cubiertos se deben a una verdadera fermentacin, mientras cambios en los tubos abiertos son debidos a la utilizacin oxidativa del carbohidrato presente. Si el carbohidrato no es utilizado por ningn mtodo, no hay produccin de cido en ningn tubo. El medio OF de Hugo y Leifson difiere de los medios de fermentacin de carbohidratos en lo siguiente: a) La concentracin de protena (peptonas) has sido disminuida del 1 % al 0.2 %. b) La concentracin de carbohidratos esta aumentada del 0.5 % al 1%. c) La concentracin de agar esta disminuida del 1.5 % al 0.25 % por lo cual su consistencia es semislida. La menor relacin proteinita-carbohidrato reduce la formacin de aminas alcalinas que pueden neutralizar las cantidades de cidos dbiles derivados del metabolismo oxidativo. La concentracin relativamente mayor de carbohidratos sirva para aumentar potencialmente la produccin de cido. La consistencia semislida permite que los cidos formados en la superficie difundan por todo el medio, facilitando la visualizacin del viraje del indicador del pH. Este medio es tambin adecuado para determinar la movilidad.

Medio OF de Hugo y Leifson Peptona Glucosa 2.00 g 10.00 g.

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Azul de bromitimol Agar Cloruro de sodio Fosfato dipotsico Agua destilada

0.03 g. 2.50 g. 5.00 g. 0.30 g. 1000 ml.

El medio se obtiene comercialmente. Seguir las indicaciones del fabricante para su preparacin. Procedimiento: Inocular dos tubos para cada uno de los carbohidratos usados con el organismo a probar. Los tubos debern ser picados hasta aproximadamente de pulgada del fondo usando una aguja de inoculacin y un inoculo ligero. Cubrir un tubo de cada par con una capa de 1 cm. de aceite mineral estril o parafina fundida, dejando el otro tubo abierto al aire. Incubar ambos tubos a 35C + 2C en una atmsfera aerbica por 48 horas no dar como negativo hasta despus de 4 das de incubacin Interpretacion:

Tubo abierto cido (amarillo) cido (amarillo) Alcalino (verde)

Tubo cubierto Alcalino (verde) cido (amarillo) Alcalino (verde)

Tubo de metabolismo Oxidativo Fermentativo No sacaroltico

Ver tambin si el organismo es mvil o no por el crecimiento nicamente a lo largo de la lnea de incubacin (inmvil) o en todo el medio (mvil). Controles: Fermentadores de glucosa: Oxidador de glucosa: No Sacaroltico: Escherichia coli. Pseudomonas aeruginosa. Moraxella spp.

Caracteristicas de: Branhamella catarihalis Es un habitante de la nasofaringe 10-97 % Diplococos..................Gram (-) 54

Oxidasa.......................(+) Inmvil Catalasa......................(+) Basal Of = inerte

Infecciones causadas por B: Catarrhalis Otitis Meningitis Bacterema Septicemia Neumona Caracteristicas de algunas pseudomonas Ps aeruginosa Ps fluorescens Ps putida. Ps Maltophilia Ps cepacia Ps mellei

Productoras de Pigmento

Oxidasa (-)

Pigmentos producidos por Pseudomonas A- Pioverdina: B- Piocianina: Amarillo Verdoso/Caf Azul

A + B = Color Verde Brillante Piorubina: Rojo

Piomelanina: Caf Identificacion de Pseudomonas aeruginosa Morfologa y olor Beta-hemlisis Productora de piocianinas Crece a 42C 55

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HACER FROTIS, PURIFICAR, IDENTIFICAR TABLA N1


IDENTIFICAR PRESUNTIVA DE LAS BACTERIAS GRAM NEGATIVAS NO FERMENTADORAS

E. CORRODENS MORFOLOGIA OXIDASA CATALASA METABOLISM O BASAL OF MOVILIDAD CEC. MC. C. CBGN + I

ACINETOBACTER CBGN + 0 (I)

ALCALIGENENES B. MEDIANOS GN + + I (NO OXID)

ACHROMO BACTER BGN MEDIANOS + + 0

FLAVOBACTERIU M BGN CORTOS V (88) V (88) 0

MORAXEL LA BGN CORTOS CBGN + I (NO SAC)

PSEUDOM ONAS. BGN CURVOS + + 0

+ +

+ +

+ (ESCASO) +

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ESQUEMA DE KING WEAVER PARA LA IDENTIFICACION DE BGNnF


GENERO Pseudomonas Acinetobacter Flavobacteriu m Moraxella Xanthomonas Alcaligenes METABOLISM MOVILIDAD O Oxidativo Oxidativo Inerte Oxidativo Oxidativo e Inerte Oxidativo Oxidativo e Inerte Positiva Negativa Variable Negativa Positiva Positiva OXIDASA Positiva Negativa Positiva Positiva Negativa o Positiva Positiva DESARROLLO EN Mc. C Positivo Positivo Escaso o Negativo Escaso o Negativo Negativo Negativo

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METODOLOGIA PARA AISLAMIENTOS DE ANAEROBIOS Examen directo de la muestra: TINCION DE GRAM. El examen microscpico directo de la muestra proporciona informacin valiosa sobre el tipo de clula presentes as como la morfologa y afinidad tintoral de los microorganismos presentes a su vez es un excelente control de cantidad por que si los morfotipos observados no se recuperan en los cultivos aerbicos o anaerbicos, el procedimiento puede ser defectuoso por alguna de las siguientes causas: a) b) c) d) e) Coleccin y/o manejo inadecuado de la muestra. Medios de aislamiento primario mal elegidos o deficientes. Defectos en el sistema anaerbico utilizados. Subcultivos incorrectos. Poco entrenamiento del personal para lograr la identificacin.

Con los datos obtenidos del examen microscpico directo y la coloracin del Gram, deber proporcionarse un informe preliminar el mismo da tomando en cuenta las siguientes ideas o ejemplos que se describen a continuacin: Tomando en consideracin que nicamente se reportara la morfologa sin adelantar la posibilidad de algn genero o especie como certeza: hasta que no se haya confirmado con el cultivo. Procedimiento de inoculacin. 1. Use siempre pipetas Pasteur estriles con algodn en la boquilla. 2. Los medios lquidos debern hervirse 10 minutos y enfriarse inmediatamente antes de utilizarse. 3. La pipeta Pasteur debe introducirse hasta el fondo y sin formar burbujas sacarla lentamente dejando el inoculo en todo lo largo del tubo. 4. Los medios slidos (que se habrn incubado por 6 a 24 horas en anaerobiosis para lograr mejor reduccin). Se inoculan dejando una gota con la pipeta Pasteur en la superficie del agar y luego se estran con asa de platino o de acero inoxidable. 5. Si se reciben hisopos deben agitarse primero en 0.5 ml de caldo Tioglicolato estril y luego inocular con pipeta Pasteur como se indico. 6. Antes de descartar las pipetas prepare laminillas para la tincin de Gram y de esporas. 7. Inmediatamente terminada la inoculacin de los medios introducir caja y tubos en ambiente anaerbicos. 8. Si se reciben otros productos no habr la misma jarra. El contacto con el oxigeno en las primeras 24 horas de crecimiento puede matar algunos gneros de anaerobios obligados.

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Cultivo: 1. Para el aislamiento primario se sugiere como mnimo los medios de cultivo siguientes: Gelosa Sangre de Carnero incubada en aire. Gelosa Chocolate incubada en atmsfera de CO2. Agar MacConkey incubada en presencia de oxigeno. Gelosa Sangre anaerbica incubada en anaerobiosis. (CDC). Tioglicolato enriquecido incubado en anaerobiosis. Tioglicolato incubado en presencia de oxgeno.

2. Para la Resiembra a partir del: Tioglicolato no enriquecido despus de haberse incubado en aire por espacio de 24 horas sembrar en: Gelosa Sangre de Carnero

Tioglicolato enriquecido incubado en anaerobiosis despus de 48 horas sembrar en: Gelosa Sangre anaerbica (CDC).

Finalmente resembrar en: Gelosa Chocolate. a) Bacilos Gram Positivos grandes, gruesos en un fondo necrtico con pocos o ningn leucocito, en un paciente con sospecha de Gangrena gaseosa; muy probablemente se trate de un Clostridium perfringens (ser muy raro observar esporas en frotis directo o cultivo primario en este microorganismo). b) Bacilos Gram Negativos plidos, irregularmente teidos, pleomorficos o con tincin polar en una muestra del genero Bacteroides, una Enterobacteria o un No Fermentador de glucosa. c) Bacilos Gram Negativos plidos, filamentos, muy delgados, con puntos finos. Posiblemente Fusobacterium nucleatum. d) Grupos o Cadenas de Cocos Gram Positivos en un exudado obtenido de una herida intrabdominal con presencia de numerosos neutrofilos; posiblemente Streptococcus, Staphylococcus, Peptostreptococcus Peptocococcus. e) Bacilos Filamentosos muy aglomerados como grnulos de azufre en una lesin cervicofacial: posiblemente Actinomyces.

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FLUJO DE TRABAJO PARA IDENTIFICACION DE ANAEROBIOS


MUESTRA ADECUADA SEMBRAR GELOSA SANGRE Incubar 37 AC 24 hrs. Con oxigeno IDENTIFICAR GELOSA CHOCOLATE CALDO TIOGLICOLATO GELOSA SANGRE ANAEROBICA FROTIS

Incubar 37 AC 24 hrs. Incubar 37 AC 48 hrs. Incubar 37 AC 48 hrs. Con dixido de En anaerobiosis En anaerobiosis carbono IDENTIFICAR RESEMBRAR A GELOSA SANGRE ANAEROBICA CDC Incubar 37 AC 48 hrs. En anaerobiosis SEMBRAR CADA COLONIA A CUADRITOS

GELOSA SANGRE ANAEROBICA Incubar 37 AC 48 hrs. Incubar 37 AC 48 hrs. Incubar 37 AC 48 hrs. Con oxigeno En dixido de carbono En anaerobiosis CONTINUAR SOLO CON LOS CUADROS QUE CRECEN EN ANAEROBIOSIS HACER UN FROTIS, PURIFICAR E IDENTIFICAR.

GELOSA SANGRE

GELOSA CHOCOLATE

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PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS (TECNICA DE BAUER-KIRBY) 1) Seleccionar de 4 a 5 colonias bien aisladas del mismo tipo morfolgico de un cultivo de agar en placa. 2) Transferir las colonias a un tubo con 4-5 ml de solucin salina estril y ajustar al tubo 0.5 de nefelmetro de Mcfarland. 3) La turbidez puede ajustarse con solucin salina. 4) En un lapso menor de 15 minutos despus de ajustada la turbiedad del inoculo humedecer un hisopo estril en la suspensin, rotando varias veces el mismo en las paredes del tubo para quitar el exceso del liquido. 5) Inocular la superficie seca de una placa de agar Mueller-Hinton, rotndola en ngulos de 60 y frotando el hiposo. 6) En un lapso de 3 a 5 minutos, pero no mas de 15 minutos despus de incubar la placa, se ponen los discos impregnados con los antibiticos apropiados. 7) Incubar la placa de manera invertida durante 16-18 horas a 35C. 8) Examinar la placa y medir los dimetros de las zonas de inhibicin, incluyendo el dimetro del disco. 9) Interpretar los tamaos de las zonas de inhibicin de acuerdo a las tablas respectivas, y reportar al organismo como susceptibles, modernamente susceptible, intermedio y resistente.

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INTERPRETACION DE PRUEBAS BIOQUIMICAS Agar Triple Azcar Hierro (TSI). En este medio, se observa fermentacin de lactosa, glucosa y sacarosa produccin de cido sulfhdrico y gas. OBSERVACION Amarillo todo el medio INTERPRETACION Fermentacin de glucosa, lactosa y sacarosa Roja la superficie del medio. Fermentacin de lactosa negativa, utilizacin de peptonas. Precipitado negro en el medio Produccin de cido sulfhdrico. Desplazamiento del medio o formacin Produccin de gas a partir de glucosa. de burbujas Color Reaccin Abreviatura Amarillo cido A Rojo Alcalina K

Medio mio (movilidad, indol, ornitina) En este medio se observa la movilidad, la produccin de indol y la descarboxilacin de la ornitina. OBSERVACIONES Si se observa crecimiento a lo largo de la picadura. Cuando difunde el crecimiento fuera de la picadura y se observa turbio el medio. Anillo Rojo al agregar el reactivo de Ehrlich kovacs. Anillo Amarillo al agregar el reactivo de Ehrlich. Medio color violeta Medio color Amarillo INTERPRETACION Movilidad Negativa Movilidad Positiva Indol Positivo Indol Negativo. Descarboxilacin de la Ornitina Positiva. Descarboxilacin de la Ornitina Negativa.

Caldo de malonato

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Ver la utilizacin del malonato como fuente de carbono. OBSERVAION Color Azul Color Verde/Amarillo Agar citrato de Simmons. En este medio se va la utilizacin del citrato como fuente de carbono. OBSERVACION Color Verde Color Azul Agar urea de Christensen Determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar la urea, por accin de la enzima ureasa. OBSERVACION Color Rosa Color Amarillo Agar de hierro y lisina (LIA) Se utiliza este medio para observar descarboxilacin o desaminacin de lisina. OBSERVACIONES Morado todo el medio. Amarillo en el fondo del medio y morado la superficie. Roja la superficie y amarillo el fondo del medio. Precipitado negro en el medio. Color Reaccin Abreviatura Morado Alcalina K Morado claro Neutra N INTERPRETACION Descorboxilacin de la lisina positiva. Descarboxilacin y desaminacin de la lisina negativa. Desaminacin de lisina positiva. Produccin de cido sulfhdrico. Amarillo cida A Rojo Desaminacin oxidativa. R INTERPRETACION Ureasa Positiva. Ureasa Negativo. INTERPRETACION Resultado Negativo Resultado Positivo. INTERPRETACION Positivo Negativo

Prueba de la catalasa Comprobar la presencia de la enzima catalasa. 66

OBSERVACION Formacin de burbujas Sin formacin de Prueba de la oxidasa. Determinar la presencia de las enzimas oxidasas. OBSERVACION La colonia toma un color rosado, despus marrn y finalmente negro. No se produce cambio de color en las colonias, o solo adquieren un color rosado plido por el reactivo. Agar DNAasa (medio con azul de toluidina). Demostracin la presencia de desoxirribonucleasa. OBSERVACION Halos Rojo-Rosado Sin cambio de color

INERPRETACION Positiva Negativa.

INTERPRETACION Positiva. Negativa.

INTERPRETACION Positiva. Negativa

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INDICACIONES PARA EL PROCESO DE LAS MUESTRAS. Todas las muestras debern ser procesadas en el laboratorio en cuanto sea posible. Sin embargo, si ocurriera algn retraso, el microbiolgico debe estar familiarizado con el hecho de que muestras pueden ser refrigeradas y cuales no. La nica muestra que puede ser refrigerada sin comprometer los resultados es la orina. Los especimenes que no deben refrigerarse son: sangre, heces (para aislamiento de Shigella) liquido cefalorraqudeo y otros lquidos corporales; muestras para anaerobios y exudado cervical y/o uretral (para aislamiento de gonococcus). Microorganismos sensibles a alteraciones en un medio ambiente. ORGAMISMO N. Meningitidis N. Gonorrhoeae Shigella sp TIPO DE MUESTRA Liquido Cefalorraqudeo Genital Heces/ hisopado rectal COMENTARIO Sensible al fri: procesar inmediatamente. Requiere 5-10 % de CO2 sensible al fri. Sensible a cambios de temperatura y pH: procesar inmediatamente. COMENTARIO Sensible al oxigeno

ORGANISMO H. Influenzae

TIPO DE MUESTRA Sangre, lquido cefalorraqudeo, secrecin ptica y ocular. Heridas, exudados, sangre, tejidos. Respiratoria.

Anaerobios. S. Pneumoniae,

Sensible al fri y O2 Sensible al frio; procesar antes de 2 h.

* Todos los especimenes que contienen microorganismos sensibles al fri, debern conservarse a temperatura ambiente o 35C.

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CONTROL DE CALIDAD EN EL AREA DE BACTERIOLOGA. 1. Al inicio del da se checa la temperatura del refrigerador y de la estufa incubadora, registrando dichas temperaturas en la hoja de control. 2.Cada que se preparan Medio de Cultivos: Antes: Se verifica que no estn hidratados. Despus de pesar, hidratar y hervir antes de esterilizar se les ajusta el pH con el potencimetro (peachimetro), la mayora de ellos debern tener un pH de 7 y solo cuando se trate de Agua Peptonada y TCBS para aislamiento de Vibrio se ajustara a un pH de 8.4 2.

3. Una vez que se preparan los medios de cultivo y bioqumicas se someten a prueba de esterilidad escogiendo al azar un 5 % de cada lote que se preparo, ponindose a incubar a 37C por espacio de 48 horas, finalmente se revisaran las placas y los tubos para verificar su esterilidad. 4. A los medios de cultivo que sern utilizados se les realizara prueba de selectividad, utilizando cepas conocidas. Actualmente contamos con las cepas siguientes: Vibrio CH 01, Salmonella C2, Shigella Boydii, E. Coli, Klebsiella Pneumoniae, Pseudomona aeruginosa, Morganella Morganni, Staphylococcus Aureus, Cndida Albicans, Criptococcus Neoformans, Bacillus Cereus, Haemophylus Influenzae, Listeria Monocytogenes. 5. Cada que se abre un nuevo lote de reactivo y colorantes, estos son sometidos a prueba de funcionalidad con cepas conocidas. 6. Antes de usar el potencimetro, este se calibra con soluciones reguladoras, una de pH 4 y otra de pH 7. 7. Al equipo automatizado para hemocultivo se le realiza control de calidad diariamente antes de ser utilizado. 8. Cada semana se hace evaluacin de la funcionalidad de las autoclaves del rea de Bacteriologa con el uso de ampolletas Sterikon. 9. Todos estos resultados son registrados en las libretas correspondientes para este fin.

TINCIONES 71

En general las bacterias y otros microorganismos son transparentes, lo que dificulta su estudio cuando los exmenes se realizan en fresco, por esta razn cuando se quieren conocer los detalles morfolgicos es necesario recurrir a tinciones. Aunque existen mltiples tipos de tinciones vamos a referirnos aqu a los 2 mtodos de coloracin especiales mas comnmente empleados. La tincin de Gram y la tincin de ZiehlNeelsen. Tincin de Gram: Fundamento Es una tincin diferencial depende de la naturaleza y composicin qumica de la pared bacteriana. Las bacterias Gram negativas son ms permeables al alcohol debido a su alto contenido de lpidos. Cuando la bacteria se tie con el complejo colorante bsico mordiente, este queda atrapado en las bacterias Gram Positivas y no puede ser arrastrado por el decolorante a causa de la naturaleza fsico-qumica de su pared por el contrario en las Gram Negativas es arrastrado por su alto contenido lipdico. Etapas de la tincin de Gram Resultados PASOS Colorante Bsico Mordiente Decoloracin Contraste Mtodo: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Se realiza un extendido y dejar secar al aire posteriormente se fija con calor. Cubrir el frotis con cristal violeta y dejar durante 10 segundos. Escurrir y lavar con agua destilada. Cubrir la preparacin con Lugol 10 segundos. Lavar nuevamente con agua destilada y decolorar con alcohol-cetona. Cubrir la preparacin con safranina durante 10 segundos y lavar y dejar secar. Examinar con aceite de inmersin en objetivo de 100x METODO Cristal Violeta Lugol Alcohol Cetona Safranina GRAM ( + ) Se tie de violeta Permanece Violeta Permanece Violeta Permanece Violeta GRAM ( ) Se tie de violeta Permanece Violeta Se decolora Se tie de rosa.

TINCION DE ZIEHLNEELSEN:

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Fundamento: El fundamento de esta tcnica diferencial, se basa en la propiedad del cido alcohol resistencia de algunas bacterias. Estos microorganismos se consideran Gram Positivos, pero se colorean difcil e irregularmente, de ah que se emplea este tipo de tincin. Esta consigue por el calor la Fucsina penetre profundamente y puede resistir la accin de colorante de una solucin de cido- alcohol, apareciendo los bacilos de color rojo sobre un fondo azul. Se considera que la cido-resistencia es debido al alto contenido lipdico de estas bacterias, fundamentalmente fosfolpidos, ceras y cidos mucnicos por que esta muy ligado a los lpidos ya que es mas solubles en ellos que en el decolorante (alcohol-cido). Etapas de la tincin de ZiehlNeelsen. Resultados PASOS Colorante bsico Mordiente Decolorante Contraste Mtodo: 1. 2. 3. 4. Realizar un frotis de 1 -2 cm. Dejar secar al aire. Fijar el frotis con calor. Cubrir el frotis con fucsina durante 5 min, calentar hasta emitir vapores, evitando que hierva y lavar con agua. 5. Decolorar con alcohol cido durante 2 min. hasta que ya no haya restos de fucsina. 6. Lavar con agua y cubrir el frotis con azul de metileno 2 minutos. 7. Lavar y dejar secar al aire. METODO Fucsina Calor Alcohol-cido Azul de metileno ACIDO-ACOHOL RESISTENTES Se tie de rojo Permanece rojo Permanece rojo Permanece rojo NO ACIDOSALCOHOL RESISTENTES Se tie de rojo Permanece rojo Se decolora Se tie de azul

PREPARACIN DE SOLUCIONES y COLORANTES

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Medio de caty-blair Tioglicolato de Sodio Fosfato de Sodio Dibsico Na2HPO4 Cloruro de Sodio Agar Agua Destilada 1.5 g. 1.1 g. 5.0 g. 5.0 g. 991.0 ml.

PREPARACION: Disolver los ingredientes en el agua mientras se calienta en el bao Mara hirviendo, hasta que la solucin se aclare (no se deje hervir el medio). Una vez enfriada la preparacin a 50C, aadir 9 ml de solucin de cloruro de calcio al 1% recin preparada y ajustar el pH a 8.4 (con 10 ml de hidrxido de sodio). Es importante distribuir cantidades de 7 ml en tubos limpios y esterilizados de 9 ml con tapn de rosca, dejando un pequeo espacio de aires en la parte superior y con los tapones sin enroscar. Esterilizar a vapor fluente en una olla de presin durante 15 minutos y enroscar los tapones despus de esterilizar y enfriar. Registrar la fecha del lote, rotular y almacenar en lugar oscuro y seco. Este medio de transporte puede utilizarse durante 18 meses o mas siempre que se mantenga en condiciones apropiadas de almacenamiento, periodo durante el cual no se tiene que observar ninguna perdida de volumen ni contaminacin o alteracin de color.

AGAR TCBS

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(Agar tiosulfato, citrato biliares y sacarosa) El agar TCBS es altamente selectivo para el aislamiento de V. Cholerae y V. Parahemolyticus, as como tambin para otros vibrios. La inhibicin de bacterias Gram positivas es llevado a cabo por la incorporacin de oxgall, el cual es una sustancia que contiene una mezcla de sales biliares, y colato de sodio, una sal biliar nuera. El Tiosulfato de Sodio sirve como fuente de azufre y en combinacin con citrato feri, detecta la produccin de cido sulfhdrico. La sacarosa se incluye como un carbohidrato fermentable por el metabolismo de vibrios. El azul de bromotimol son indicaciones de cambios de pH. Formula por litro de agua Extracto de Levadura Digerido pancretico de casena Digerido peptico de tejido animal Citrato de sodio Tiosulfato de sodio Oxgall, deshidratado Colato de sodio Sacarosa Cloruro de sodio Citrato frrico Azul de timol Azul de bromotimol Agar pH final 8.6 0.2. Preparacin 1. Suspender 88 g del medio en polvo en 1 litro de agua destilada. 2. Calentar, agitando frecuentemente y dejar hervir por 1 minuto. 3. Enfriar a 45-50C y vaciar en placas de petri. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. NOTA: As como se preparan estos medios de cultivos, se realizan los otros medios, siguiendo las indicaciones de la etiqueta de cada uno. 5.0 g. 5.0 g. 5.0 g. 10.0 g. 10.0 g. 5.0 g. 3.0 g. 20.0 g. 10.0 g. 1.0 g. 0.04 g. 0.04 g. 14.0 g.

GRAM MODIFICADO, POR HUCKER

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Cristal violeta (Sol. Concentrada): Cristal Violeta................................................20 g. Alcohol etlico absoluto...100 ml. Solucin conc. de oxalato: Oxalato de amonio..1 ml. H2O destilada.100 ml. Solucin de trabajo: Diluir el cristal violeta 1:10 con agua destilada y mezclar con 4 volmenes de la solucin de oxalato. Guardar en frasco con tapn esmerilado. Solucin de Yodo (Lugol): Yodo...1 g. Yoduro de potasio..2 g. Disolver completamente en 5 ml de agua destilada y agregar: H2O destilada.240 ml. Biocarbonato de sodio al 5 % en solucin acuosa ....60 ml. Mezcla bien y conservado en frasco mbar con tapn esmerillado. Alcohol Acetona para decolorar: Alcohol etlico absoluto...250 ml. Acetona...250 ml. Mezclar y conservar en frasco con tapn esmerilado. Solucin de Safranina concentrada: Safranina 0..2.5 g. Alcohol etlico absoluto...100 ml.

Solucin de trabajo: diluir la safranina 1:5 o 1:10 con tapn esmerilado.

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CUANTIFICACION DEL ESTRIADO DE LAS PLACAS EN MUESTRAS RESPIRATORIAS. Colonias en el rea estriada 1 + ++ +++ ++++ Mtodo: Fijar el frotis con calor. Cubrir el frotis con cristal violeta y dejar durante 10 segundos. Escurrir el colorante y lavar el resto con lugol. Cubrir la preparacin con lugol y dejar 10 segundos. Lavar con agua de la llave. Decolorar con alcohol-acetona o alcohol etlico durante 10 o 20 segundos. Cubrir la preparacin con safranina durante 10 segundos, lavar y dejar secar al aire. Examinar con aceite de inmersin. 10 10 10 10 5 5 5 5 5 2 3

Shaeffer-fulton para tincin de esporas (4). Verde de malaquita al 5 % en agua. Safranina al 0.5% en agua destilada. Mtodo: Cubrir la preparacin con verde de malaquita y calentar a emisin de vapor durante 1 minuto. Lavar con agua de la llave. Cubrir la preparacin con safranina durante 15 minutos. Lavar con agua y dejar secar al aire. Esporas de color verde y soma celular rojo.

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Solucin de KOH al 10 % KOH.10 GRS. H2O...100 ML. Tincin de Ziehl-Neelsen. 1. 2. 3. 4. Realizar un frotis de 1 -2 cm. Dejar secar al aire. Fijar el frotis con calor. Cubrir el frotis con fucsina durante 5 min, calentar hasta emitir vapores, evitando que hierva y lavar con agua. 5. decolorar con alcohol cido durante 2 min. hasta que ya no haya restos de fucsina. 6. Lavar con agua y cubrir el frotis con azul de metileno 2 minutos. 7. Lavar y dejar secar al aire. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO Cuando hay sospecha de meningitis se recomienda el anlisis qumico, citolgico y cultivo. Centrifugar el espcimen a 250 rpm durante 15 minutos. Extraer el sobrenadante con una pipeta Pasteur estril frente a un mechero pasar a otro tubo. Del sedimento se realizara el cultivo como se indica en la marcha de LCR y hacer una tincin de Gram. NOTA: Si el paciente se encuentra bajo tratamiento de antibiticos es recomendable inocular la muestra de LCR, as como otros lquidos corporales, en un frasco de hemocultivo del sistema automatizado, estos frascos contienen factores que neutralizan el antibitico y permiten la recuperacin del microorganismo. Una vez inoculada la muestra en el frasco se siguen los procedimientos del sistema automatizado, en el manual del equipo BACTEC-9050.

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BIBLIOGRAFIA

1. Aguirre L. E., P. Surez A., Carral P., I. Gaya C. 1987. Mtodos para identificar Bacilos Gram Negativos no Fermentadores. Insectologa 7 (6): 287-298. 2. Gilardi G. L. 1985. Pseudomonas En Lennette E. H., A. Balows., W. J. Hausler Jr., y H. J. Shadomy (De) Manual of Clinial Microbiology, Washington USA : 3. Boyle-Scott, Ed. Panamericana, Diagnostico Microbiolgico. 4. Elmer W. Koneman, M. D. Ed. Panamericana, Diagnostico Microbiolgico, Textos y Atlas. 5. Patrick R. Murria Microbiologa Medica Ed. Harcourt Bra. Ce.

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