ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA CON SDS

SDS-PAGE


FUNDAMENTO TERICO

La electroforesis es una tcnica de separacin de molculas cargadas por
migracin en un campo elctrico. Las molculas se separan en funcin de su carga
elctrica, desplazndose al electrodo de carga contraria y a mayor velocidad cuanto
mayor es la carga de la molcula.
Cada molcula se desplaza en el campo elctrico alcanzando una velocidad
constante. En el estado estacionario, la fuerza impulsora (fuerza del campo elctrico) se
equilibra con la resistencia al avance (fuerza de friccin hidrodinmica) en el medio en
que se desplaza.
Se define la movilidad electrofortica como la velocidad de desplazamiento por
unidad de campo elctrico. En unas condiciones determinadas de electroforesis, la
diferente movilidad de cada molcula define su comportamiento y separacin en el
espacio. Diferentes molculas tendrn diferente movilidad electrofortica en un medio
determinado.
Hay tres tipos de electroforesis:
De frente mvil.
Zonal.
Continua.

Se pueden utilizar diferentes medios de soporte para evitar perturbaciones
mecnicas y los efectos de las corrientes de conveccin en la separacin. Como medios
de soporte se pueden utilizar papel, acetato de celulosa, geles de almidn, geles de
agarosa o geles de poliacrilamida.
Los geles de poliacrilamida son el resultado de la polimerizacin qumica de una
mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Controlando la concentracin de ambas
obtenemos geles de diferente grado de reticulacin (diferente dimetro de poro).
Uno de los mtodos de electroforesis ms comnmente aplicado para protenas
es el que emplea geles de poliacrilamida (PAGE = polyacrylamide gel electrophoresis)
en presencia del detergente aninico dodecilsulfato sdico (SDS). Esta tcnica es
conocida como SDS-PAGE. Para ello se prepara un gel en placa vertical.
En la preparacin del gel, la polimerizacin de los monmeros de acrilamida
produce cadenas lineales. Al incluir bisacrilamida, sta da lugar a puntos de
ramificacin en el polmero, lo que permite formar una matriz tridimensional, dando
lugar al gel de poliacrilamida. El tamao de los huecos o poros que forma la retcula del
polmero depende de la concentracin de acrilamida y del grado de entrecruzamiento (es
decir, de la proporcin de bisacrilamida con respecto al total). As, variando la
concentracin de acrilamida y bisacrilamida en la preparacin del gel se consiguen
distintos grados de porosidad y, por tanto, distintos intervalos de separacin de
protenas. Tambin se aade un tampn (comnmente Tris-HCl). Adems, se aade un
agente iniciador de la polimerizacn como el persulfato amnico, que al disolverse en
agua genera radicales libres que transforman la acrilamida en radical libre y se inicia
la polimerizacin. Tambin se aade al medio TEMED (N,N,N,N-tetrametil-etileno-
diamina) como catalizador porque puede existir en forma de radical libre. Las muestras
proteicas se tratan, previamente a su fraccionamiento, con SDS a 100 C. Como
consecuencia de este tratamiento y de la presencia posterior de SDS durante toda la
separacin (tanto en el tampn de electroforesis como en la composicin del gel), las
protenas se mantienen desnaturalizadas. El SDS tiene la propiedad de unirse a las
cadenas polipeptdicas en una proporcin masa:masa constante (1.4 g SDS/g de
protena), de modo que en el complejo SDS-protena la carga de la protena queda
enmascarada por la de las mltiples molculas de SDS y sta es proporcional al
tamao (n de aminocidos).
Esta electroforesis es discontinua pues utiliza dos geles:
Un gel concentrador con bajo grado de reticulacin y pH 6,8 ( gel acumulador o
stacking gel).
Un gel separador con grado de reticulacin mayor con valores entre 6% y 15%,
pudindose tambin utilizar gradientes de concentracin de acrilamida (gel separador).

En la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, la separacin de protenas
se hace en funcin de la masa molecular. Tanto es as que la representacin del
logaritmo de la masa molecular frente a la distancia migrada obedece a una lnea recta
para gran nmero de protenas. Para que esta dependencia sea correcta, es preciso
romper los puentes disulfuro intra- e intercatenarios, para lo cual es frecuente aadir
durante la preparacin de la muestra un agente reductor, generalmente 2-
mercaptoetanol. De este modo, la masa molecular observada corresponde a la de cada
subunidad de una protena, no a la protena completa, al existir una relacin lineal.
Para aplicar la muestra al gel, se le suele aadir un agente que la haga ms
densa, generalmente glicerina o sacarosa. Adems, para seguir el avance de la
separacin, se aade un colorante, como azul de bromofenol, que sirve como referencia
(tracking dye). ste tiene una movilidad mayor que la de cualquier macromolcula y,
por tanto, si se aplica corriente hasta que el colorante est a poca distancia del extremo
inferior del gel, se tiene la seguridad de que ninguna macromolcula se ha salido del gel
por avance excesivo.

MATERIAL Y REACTIVOS

Fuente de electroforesis.
Bao de incubacin
Cubeta de electroforesis con cristales, peines y separadores.
Formador de geles
Pipetas
Solucin de acrilamida/bisacrilamida: Contiene 30 % acrilamida + 0.8 %
bisacrilamida preparada en agua destilada
Disolucin de SDS: 10 % en agua destilada
Disolucin de persulfato amnico: 100 mg/mL en agua destilada
TEMED (solucin comercial)
Tampn del gel separador: Tris 1M; pH = 8,8
Tampn del gel acumulador: Tris 0,5 M; pH = 6,8
Tampn de Ruptura 5X que contiene: 2,5 ml de solucin de SDS 10%; 0,2 ml de
2-mercaptoetanol; 0,5 ml de azul de bromofenol 0,05%; 0,3 ml de tampn de
electroforesis; 1 ml de glicerol y 0,5 ml de Tris 0,5 M pH 6,8.
Tampn de electroforesis: contiene 14,4 g/l de glicina, 3 g/l de Tris (base) y 10
ml/l de SDS 10%.
Marcadores preteidos de peso molecular



PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL


MONTAJE DEL SISTEMA DE ELECTROFORESIS

Se utilizar un gel plano de 1,5 mm de grosor.
Montar el sandwich con dos placas de vidrio (uno tiene un rebaje) y los dos
separadores en vertical entre ellas y a ambos lados.
Introducirlo en el soporte formador de geles. Sujetar el conjunto.
Se emplear un gel separador con un 7,5 % de acrilamida y un gel acumulador con un
4,8% de acrilamida. Los geles se preparan mezclando, en un vaso de precipitados,
los componentes indicados en la tabla (el persulfato y el TEMED inician la reaccin de
polimerizacin, por lo que se deben aadir en ltimo lugar) y rpidamente proceder
al llenado con la mezcla (las cantidades indicadas dan para dos geles). La solucin de
acrilamida/bisacrilamida se debe utilizar con guantes y pipetear con propipeta.
Primero se polimeriza el gel separador (ver tabla). Para ello se rellena, con la
mezcla todava lquida, el espacio entre las dos placas hasta unos 3 cm del borde
superior del cristal corto, usando una pipeta pasteur. Aadir encima una pequea
cantidad de agua destilada (esto hace que la superficie del gel quede recta). Esperar a
que polimerice el gel (entre 30 y 60 min, observar la mezcla sobrante en el vaso).
Volcar para retirar el agua destilada. Secar con un papel de filtro. Aadir sobre este gel
separador la mezcla (ver tabla) del gel acumulador y antes de que polimerice
introducir en la parte superior el peine, que formar en el gel acumulador los pocillos
para luego poder aplicar las muestras. Se guarda el gel en la cmara fra hasta el da
siguiente.

Gel separador (7,5%):
Agua destilada 12 mL
Acrilamida/Bisacrilamida 6,25 mL
Tris 1 M pH 8,8 6,25 mL
SDS 10% 250 L
TEMED 12,5 L
Persulfato amnico (100 mg/1 ml) 200 L

Gel concentrador :

Agua destilada 5,8 mL
Acrilamida/Bisacrilamida 1,65 mL
Tris 0,5 M pH 6,8 2,5 mL
SDS 10% 100 L
TEMED 6,5 L
Persulfato amnico (100 mg/ 1 ml) 94 L






SEPARACION DE LAS PROTEINAS POR SDS-PAGE



PREPARACION DE LAS MUESTRAS

Una vez polimerizado el gel concentrador se aplica la muestra.
Las muestras deben de contener una masa proteica en torno a 24-30 g. Como
todas las muestras tienen que tener la misma cantidad de protena, se toma el
volumen que se necesite de cada una de las protenas problema.
Para ello, se toman 24 l de la solucin con la protena problema y se aade a la
muestra tampn de ruptura 5X en una relacin 4:1 (volumen:volumen) (por
tanto, 6 l).
Utilizar un tubo con 10 L de patrones preteidos de peso molecular conocido.
Esta mezcla ya contiene el tampn de ruptura.
Las patrones preteidos contienen las siguientes protenas. Se recoge el peso
molecular aparente.
Protena patrn preteida Peso molecular aparente (daltons)
Miosina 198.840
-Galactosidasa 115.700
Albmina srica 96.740
Ovoalbmina 53.540
Anhidrasa carbnica 37.130
Inhibidor de tripsina 29,130
Lisozima 19.540

Nota: El peso molecular aparente de la protena patrn preteida no se
corresponde con el peso molecular real de la protena utilizada.

Mantener las muestras durante 5 minutos a 100 C. Centrifugar los tubos a baja
velocidad durante un minuto para concentrar toda la muestra en el fondo del
tubo.
Retirar con cuidado el peine al gel preparado el da anterior. Sacar del formador
de geles el sandwich de placas de vidrio, separadores y gel y sujetarlo
en vertical en la cubeta de electroforesis.
Llenar las cmaras superior e inferior de la cubeta de electroforesis que
contienen los electrodos con tampn de electroforesis, de modo que entre en
contacto con ambos extremos del gel.
Se aplican las muestras y los patrones de peso molecular en los pocillos
del gel, usando micropipetas con puntas finas.
Se completa cada pocillo con tampn de ruptura 1X preparado diluyendo el
tampn de ruptura 5X en tampn de electroforesis. Se aade al pocillo.
Es conveniente anotar el orden de aplicacin de las muestras, as como
identificar el gel en el que estn las muestras que corresponden a cada taquilla.




DESARROLLO DE LA ELECTROFORESIS

Conectar los cables de la cubeta a una fuente de corriente continua (comprobar
la polaridad: rojo (+), negro (-)).
Aplicar 80 V hasta que el frente (visible por la banda azul de bromofenol) entre
en el gel separador; despus subir a 120 V.
Cuando el frente, se acerce al extremo inferior del gel, desconectar la corriente y
sacar el sandwich (tarda aproximadamente una hora y cuarto).
Separar las placas de vidrio con ayuda de una esptula y sacar el gel (usar
guantes para evitar tocar el gel con los dedos) con cuidado de no invertir su
orientacin.
Una vez finalizada la transferencia, se tie el gel de electroforesis mediante su
inclusin en solucin de tincin que contiene Azul de Coomassie, cido actico,
metanol durante 2 horas a temperatura ambiente.
Posteriormente, se pasa el gel a solucin de destincin que contiene cido
actico 10% y metanol 10% en agua, destiendo el gel durante toda la noche.




CUESTIONES:
1.- En una electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS, qu protenas
presentan mayor movilidad electrofortica en el gel separador?
2.-Qu sustancia se usa como marcador de frente?
3.- Por qu se utilizan dos geles (concentrador y separador) en la electroforesis en gel
de poliacrilamida en presencia de SDS?
4.- Qu posibles aplicaciones presenta este mtodo?
5.- Qu patrn de bandas se obtiene en la muestra de marcadores?
6.- Representar las movilidades electroforticas de los patrones de peso molecular
preteidos frente al logaritmo del peso molecular de cada patrn (en papel milimetrado).
7.- Calcular la movilidad electrofortica de la protena problema (a partir de la banda
que aparece en el gel tras tincin y distincin del mismo).
8.- Calcular el peso molecular de la protena problema.