INFORME N7: TECNICAS DE CULTIVO DE MICROORGANISMOS

I. INTRODUCCION
En todos los ambientes naturales habitan mltiples microorganismos de diversos tipos
que tienen distintas necesidades nutritivas basadas en mecanismos de sntesis propios y
rutas metablicas. Los fottrofos usan la luz mientras que los quimitrofos usan
compuestos qumicos.
Para efectuar el estudio de un organismo particular es necesario separarlo de la
poblacin mixta en la que se encuentra. Para tal fin se emplean tcnicas de
aislamiento que conduzcan a la obtencin de un cultivo puro.
Los dos mtodos de aislamiento fsico de los microorganismos ms comunes son: por
diluciones seriadas y siembra por vertido en placa, y siembra por agotamiento. Otros
mtodos son la utilizacin de medios de cultivos selectivos y diferenciales basndose
en el aprovechamiento de caractersticas particulares de los microorganismos, tales
como la formacin de esporas, el metabolismo anaerobio y/o facultativo, la
capacidad para utilizar sustratos poco comunes, etc.
Estos mtodos pueden combinarse dependiendo de los microorganismos que se
puedan encontrar en el ambiente y del microorganismo que se quiera separar por
medio de sus necesidades nutritivas y de su medio ptimo de crecimiento.

II. OBJETIVOS

Observar las caractersticas de crecimiento de los microorganismos al
trasplante en medios de cultivo lquidos y slidos.
Separar colonias individuales a partir de una mezcla de microorganismos,
utilizando tcnicas de aislamiento.


















III. MATERIALES Y METODOS
EJERCICO N1: Tcnicas de cultivo de microorganismos: Caractersticas de
crecimiento en medio de cultivo.
Materiales:
- Cultivo de microorganismos (muestra de E.coli)
- Asa de klle
- Mechero
- Tubos de agar nutritivo inclinado
- Tubos de agar nutritivo vertical
- Tubos con caldo nutritivo
Procedimiento:
1. Se Esteriliz el asa de klle por flameo a la llama.
2. Se tom el tubo con el cultivo de 18 horas, se retir el tapn, se flame
la boca del tubo al mechero y se obtuvo una pequea porcin del
cultivo con ayuda del asa de klle. Se flame la boca del tubo antes
de volver a taparlo.
3. Se tom el tubo con caldo nutritivo, y con los mismos cuidados
anteriores se introduzco el asa en el lquido para dejar el inculo. Se
Homogeniz la mezcla girando el tubo entre las palmas de la mano.
4. Se repiti el procedimiento 1 para obtener ms inculo, pero usando
esta vez aguja de klle.
5. Se tom el tubo con agar inclinado y se realiz la siembra depositando
el inculo a lo largo de una sola lnea descrita desde la base de la
inclinacin hasta el extremo.
6. Se repiti el procedimiento1 para obtener inculo, usando nuevamente
aguja de klle.
7. Se tom el tubo con agar vertical y se realiz la siembra por picadura
profunda del medio.
8. Se rotul los datos sembrados y se puso a incubar a 37C por 24horas.





EJERCICO N2: Tcnicas de cultivo de microorganismos: Aislamiento y Recuento de
placas.
Materiales:
- Tubos con caldo conteniendo una mezcla de microorganismos (Bacillus
sp, Escherichia coli, Staphylococcus sp)
- Asa de klle, aguja de klle
- Mechero
- Tubos con 12 ml de agar nutritivo licuado y mantenido a 50 C
- Placas petri esteriles
- Placas con agar nutritivo
- Placas con agar Mc Conckey
Procedimiento:
A) Aislamiento por estras o por agotamiento en superficie









1. Se tom de la mezcla de caldo (caldo de microorganismos), con la
ayuda del asa de klle/ aguja de klle un inculo. (para este paso se
consider todas las condiciones de trabajo en asepsia)
2. Se tom la placa de agar nutritivo con la mano izquierda y con la
ayuda de los dedos pulgar e ndice levante hacia un lado la tapa,
procurando que la parte expuesta se encuentre bajo la influencia de
la llama del mechero. Con el asa cargada de inculo, se hizo estras
sobre toda la superficie del medio. Se cerr la tapa.
3. Se esteriliz el asa a la llama nuevamente.
4. Se repiti los pasos para el medio agar Mc Conckey
5. Colocar las placas en incubacin a 37C por 24 horas.
6. Se observ el desarrollo de colonias individuales y se describi las
caractersticas.
B) Aislamiento por diluciones sucesivas o siembra por incorporacin








1. Se tom el tubo de caldo conteniendo la mezcla de
microorganismos y con la ayuda del asa de klle retirar un inoculo.
2. Se tom el primer tubo de agar licuado y se mantuvo la temperatura
a 50C y se transfiri aspticamente el inoculo. Se esteriliz el asa a
la llama del mechero. Con el tubo cerrado se mezclo el inoculo con
el medio, hacindolo girar entre las palmas de las manos.
3. Se transfiri una asada del agar mezclado con el inoculo hacia un
segundo tubo de agar licuado. Se repiti la operacin anterior para
obtener una mezcla homognea.
4. Se verti el contenido de cada tubo por separado en dos placas
petri estriles y se rotaron lentamente para distribuir el medio de
manera uniforme. Se Identific cada dilucin.
5. Se Incub las placas a 37C por 24 horas.
Se Examin el crecimiento de las colonias en las placas. Se hizo un recuento de las
colonias, se describi las caractersticas diferenciales de las colonias observadas








IV. MARCO TERICO
Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de ste
en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La poblacin de
microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando ste
contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro o axnico,
cuando contiene ms de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto.
Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada
en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios.
Un cultivo axnico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola
clula. Los cultivos axnicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -
por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano- existen cultivos mixtos. En un
cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo
axnico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo
axnico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos estn
por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes
usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes
deben ser eliminados de un cultivo para que ste pueda ser axnico. El segundo paso
para obtener un cultivo axnico es inocular o introducir, una sola clula de un
microorganismo en un medio slido o lquido, esterilizado previamente. De esta
manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podr multiplicar en
condiciones favorables. Un clon est constituido por una poblacin de clulas
descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente
grande como para ser visible sobre la superficie de un medio slido.
Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o
matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el
crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En esta transferencia se deben
considerar dos aspectos bsicos referentes a: no introducir microorganismos
indeseables (contaminantes) y concentracin o carga microbiana de la muestra
(inculo) a sembrar.
El are y todas las superficies estn densamente pobladas por microorganismos, por lo
tanto en la transferencia de una muestra microbiolgica a otro recipiente, se deben
tener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de contaminacin. Estos incluyen
el rea de trabajo, el lavado de las manos, la esterilizacin de todos los utensilios y
medios de cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una
zona estril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. Al conjunto
de procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminacin se le llama
tcnica asptica; el seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes
tales como:
La contaminacin y prdida del cultivo en estudio
La salida y dispersin de microorganismos del cultivo, lo que ocasionara la
contaminacin de utensilios, productos y del personal. Este ltimo aspecto es
particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de
microorganismos patgenos.

Con relacin a la concentracin del inculo, un error frecuente del principiante
consiste en tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de bacterias
del tamao de la cabeza de un alfiler contiene varios millones de microorganismos, es
obvio que con una cantidad pequesima (casi invisible) que se adhiera al asa, ser
ms que suficiente para efectuar una transferencia exitosa.
Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas: hisopo, pipeta
(para uso microbiolgico son terminales y la parte superior o boquilla debe estar
protegida con filtro de algodn), pipeta Pasteur, cable de Kolle o portasa con
alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, esptula y/o gancho. En la
transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculacin, hisopos,
pipetas o pipetas Pasteur que debern esterilizarse previamente.
La utilizacin de estos dispositivos, as como de los diferentes medios de cultivo tiene
aplicaciones especficas.
Un cultivo lquido puede ser transferido mediante un asa microbiolgica, un
hisopo, pipeta o pipeta Pasteur; el inculo se deposita dentro del caldo o
medio lquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un
desarrollo particular que se manifiesta en la superficie o a travs de todo el
lquido. Una de las ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a la
posibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de microorganismos
anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las poblaciones se
encuentran suspendidas y es fcil homogenizarlas, lo que permite estandarizar
la concentracin del inculo. La desventaja que presentan, e que en ellos e
difcil detectar contaminacin a simple vista.
Los medios semislidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra
(asa recta) o pipeta Pasteur; en este ltimo caso es necesario calentar el
medio y cuando se encuentra en estado lquido y a una temperatura de
aproximadamente 42C se agrega el inculo, se homogeniza y se deja
solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los
microorganismos y para favorecer la separacin de microorganismos con
diferentes requerimientos de oxgeno.
Los medios slidos e preparan en tubos o matraces dependiendo de la
cantidad o de las necesidades, despus de esterilizarlos, estos se inclinan o
vierten en cajas de Petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando la
superficie del agar con mucha suavidad; en estos medios, los microorganismos
al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a simple vista; a estos
agregados se les denominan colonias, las que presentan caractersticas que
varan con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo
empleado.

Siembra del Inoculo en Tubo
Siembra por estra en tubos con medio solido inclinado: Se toma con asa de
siembra previamente esterilizado por flameado una cantidad de muestra
adecuada. Se aade al tubo desde el fondo de la superficie de este,
realizando movimientos ascendentes en zig-zag hasta completar toda la
superficie del medio. Este mtodo es utilizado para conservar cepas durante
largos periodos, as como para la realizacin de ciertas bioqumicas, como, por
ejemplo, la prueba de la ureasa.

Siembra por picadura: Se suele tomar con hilo de siembra aunque en
ocasiones tambin pueden hacerse con asa de siembra. Consiste en introducir
el asa en el medio de cultivo semislidos como por ejemplo, el medio de
oxidacin fermentacin de Hugh-Leiffson.

Siembra del Inoculo en Placa
Aislamiento en estra: Se tomar con el asa de siembra (previamente
esterilizado por flameado) una cantidad adecuada de muestra problema
depositando el inoculo en uno de los extremos superiores de la placa; a partir
de aqu se realizaran movimientos en zig-zag de un extremo a otro de la placa
no tomndose en ningn momento nuevo inoculo y no levantndose el asa
hasta concluir la siembra de toda la placa.

Tcnica de siembra por dilucin: Se dispondr de una batera de tubos con
medio de cultivo especfico o agua estril segn los casos. Se adicionara una
cantidad de muestra solida o liquida en los tubos sabiendo la cantidad de
muestra o inoculo que se aade en el tubo inicial. Se agitara hasta
homogenizacin. Con pipeta estril se tomara una cantidad especfica o
exacta y se adicionara al segundo tubo, que se homogeniza. Repetimos la
operacin anterior con el tercer tubo y as sucesivamente hasta obtener la
dilucin deseada. Con la dilucin esperada, por ejemplo, 10
-3
y 10
-4
, inocular en
placas de cultivo una cantidad de inoculo exacta y extender con un asa ce
Digrasky previamente estril. Incubar a temperatura precisa durante unas 24
horas y posteriormente recontar. Existen muchas variaciones de este mtodo.
Una de ellas es hacerlo en medio de cultivo con agar, donde se mezcla en los
tubos la muestra y se diluyen hasta obtener la dilucin deseada; posteriormente
son vertidos en placa y se deja solidificar.

En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que aun
cuando la mayora de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos
requieren de pH alcalino o cido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se
favorecer el crecimiento del microorganismo de inters y la obtencin del cultivo.
Con este mismo propsito durante la incubacin se deben proporcionar las
condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio. El crecimiento ptimo de
los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayora de las veces estn
relacionadas con la de su hbitat natural.
Algunos microorganismos crecen por debajo de 15C, otros requieren temperaturas
ms elevadas (30 a 45C) y algunos hasta 80C. Para alcanzar y mantener estas
temperaturas se puede usar una incubadora microbiolgica o un bao de agua a
temperatura constante, en tanto que para los microorganismos que presentan su
crecimiento ptimo a temperaturas entre 20 y 25C se pueden incubar en la gaveta o
cajn del laboratorio, a temperatura ambiente.
En general las incubadoras microbiolgicas satisfacen las necesidades en cuanto a los
rangos de temperatura requeridas por los microorganismos. La desventaja que tienen
es que estos aparatos funcionan con are seco, lo que determina la deshidratacin de
los medios de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento de cualquier cultivo experimental
que se realice en incubadora no debe prolongare por ms de nueve das. Con
relacin a las necesidades gaseosas, no todos los microorganismo crecen en
presencia de oxgeno atmosfrico; los que slo crecen en presencia de are se llaman
aerobios obligados; los que slo crecen en ausencia de oxgeno se denominan
anaerobios obligados o estrictos, un tercer grupo se adapta a las dos condiciones y se
le conoce como facultativos. Existe una cuarta categora que comprende bacterias
que requieren oxgeno, pero slo lo utilizan cuando ste existe en concentraciones
reducidas; a estos se les llama microaeroflicos. El desarrollo de estos diferentes grupos
e favorece mediante la agitacin de los cultivos o mediante la exclusin de oxgeno
para lo que se emplean sustancias reductoras o equipos especiales.
Las bacterias son organismos procariticos, se encuentran ampliamente distribuidas en
la naturaleza, habitan en el agua, el suelo, en la superficie o en el interior de plantas y
animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en forma libre o en simbiosis con otros
organismos, ya sea como parsitos, comensales o mutualistas. Fisiolgicamente este
grupo presenta caractersticas muy variables, hay bacterias mviles e inmviles
fotosintticas y quimiotrficas, auttrofas y hetertrofas; se desarrollan en un rango
muy amplio de temperatura, pH y condiciones gaseosas.
En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se emplean para
caracterizarlas incluyen: tamao, morfologa celular, forma de agrupacin, reaccin a
la tincin de Gram, formacin de esporas, movilidad, presencia de inclusiones de
reserva y caractersticas culturales en medios lquidos y slidos en los que presentan
patrones de desarrollo en cuanto a la forma, tamao, elevacin y color de las
colonias.

V. RESULTADOS Y DISCUSIN








Imagen n1: de izquierda a derecha, resultados de la siembra en caldo nutritivo, agar
vertical y agar inclinado. Vase el crecimiento de microorganismos en cada una de
las muestras.

- En los experimentos de crecimiento en caldo, crecimiento en agar
vertical y en agar vertical con picadura profunda, se observa el
desarrollo de la E. coli tanto dentro del medio (agar) como en la
superficie de este. Esto queda explicado por Behrman etal. (2004) quien
dice que la E. coli es un microorganismo anaerobio facultativo, es decir,
puede desarrollarse tanto con presencia de oxigeno como sin l, pero
con mejor crecimiento en presencia de este. Asi en el experimento se
not que las capas superficiales eran ms gruesas mientras las que
estaban dentro del agar eran dispersas y de menor cantidad.
- Con respecto al desarrollo en agar inclinado se observ un crecimiento
filiforme.

Crecimiento filiforme
Consistencia de
crecimiento viscoso
Cantidad: moderada
Distribucin en la
superficie: Uniforme
Crecimiento
superficial y en
profundidad (ambas
a la vez)
Color de la pelcula:
amarillento
Color del precipitado
blanquecino
Formacin de pelcula,
masa de clulas en la
superficie del caldo,
turbidez (opacidad),
depsito de clulas en el
fondo del tubo (si se agita,
se re suspenden en el
caldo).






Imagen n2: de izquierda a derecha, agar manitol salado, agar Mc conkey
- En el Agar Mac Conkey se observo varias colonias teidas de un color
rojo intenso. Ya que este medio es selectivo y diferenciado para
enterobacterias fermentadoras de lactosa podemos afirmar que en la
muestra problema (mezcla) haban bacterias Escherichia coli, pues
esta tal como lo refiere Madigan (2006)es una enterobacteria
fermentadora de lactosa, la cual se tie de rojo porque al fermentar la
lactosa deja residuos cidos que cambian el pH del medio, haciendo
que el rojo neutro (indicador) vire y se intensifique. El halo que
presentan se debe a la precipitacin de las sales biliares, ingredientes
del agar Mac Conkey.
- En el Agar Manitol salado se pudo observar la presencia de unidades
formadores de colonias (UFC), cabe resaltar que cada UFC puede
proceder tanto de una sola clula como de un grupo de clulas del
mismo tipo de microorganismo. Las UFC eran de color blanquecino,
circulares y con un halo amarillento. El agar manitol salado es un
medio selectivo y diferenciado para Staphylococcus aureus, por ello

Se observ el crecimiento de
microorganismos, colonias
circulares de un tono perla

Se observ crecimiento de
microorganismos,
colonias muy juntas y mal
esparcidas, de coloracin
rojiza con un halo de color
rojo ms intenso.
se puede inferir que se trataba de esta bacteria. Las colonias estaban
distribuidas en toda la placa, siguiendo la estra dibujada, pero en
diferentes densidades, observndose una mayor descarga del inoculo
en el inicio de la estra y UFC individuales en el final.






Imagen n3: resultados de diluciones sucesivas. De izquierda a derecha, primera
dilucion y segunda dilucion.

Se realizaron solo dos diluciones utilizando como muestra una mezcla de
microorganismos. Luego del periodo de incubacin se observ en las
placas Petri lo siguiente:
- En la primera placa con la primera dilucin se observ una gran
cantidad de UFC circulares, muy pequeas y de color amarillento.
- En la segunda placa con la segunda dilucin se observ una
cantidad mucho menor de UFC, las cuales eran circulares, algunas
de mayor tamao que otras y con un color amarillento y crema ms
acentuado. Tambin se observa una mayor separacin entra las
UFC.
Se observ gran cantidad de
puntos amarillentos
Se observ el crecimiento de
microorganismos, pero en mucha
menor densidad que la placa
anterior. Se pudieron diferenciar
algunas colonias, unas ms
grandes de un color lechoso y
otras ms pequeas de color
amarillento
La diferencia de tamao entre unas colonias con otras se debe a
que se trata de un medio de cultivo comn (agar nutritivo), el cual
permite el crecimiento de diversos microorganismos.
Segn un anlisis cualitativo se observa claramente que las diluciones permiten
obtener cada vez menos colonias y ms separadas unas de otras.

VI. CUESTIONARIO
EJERCICIO N1
1. Por qu algunos microorganismos desarrollan en caldo un caracterstico
crecimiento tipo pelcula? Qu factores ambientales podran alterar la
formacin de una pelcula superficial?
Segn Koneman et al (2008) los microorganismos mviles muestran un crecimiento
difuso lejos de la lnea de inoculacin, mientras que los inmviles slo muestran
crecimiento a lo largo de la lnea de corte. Adems nos dice que para el
establecimiento de la movilidad de microorganismos se utilizan medios semislidos
para permitir que el microorganismo se expanda. Si combinamos esto con el
hecho de la existencia de microorganismos que necesita la presencia de oxgeno
para su crecimiento podemos encontrar una razn para el crecimiento tipo
pelcula en el caldo (Cultivo no slido). MAD (2002, editor) confirma esto al
mencionarnos al V. cholerae cuyo aislamiento se basa en el rpido crecimiento de
este microorganismo sobre agua de peptona alcalina (Caldo de cultivo) en
condiciones de aerobiosis y nos recalca que el crecimiento de este
microorganismo se manifiesta con la formacin de una pelcula en la superficie del
medio luego de pocas horas de incubacin. Forbes (2009) nos pone otros ejemplos
al mencionarnos al Proteus mirabilis, P. penneri y P. vulgaris, quienes presentan un
crecimiento tipo enjambre en agar sangre y agar chocolate, cuya diseminacin
da como resultado una superficie delgada de crecimiento sobre la superficie del
agar.
Por dicha razn uno de los factores ambientales ms importantes para el desarrollo
de dicha pelcula es la composicin del aire, especialmente la proporcin de
oxgeno presente en este ya que debe ser suficiente para el crecimiento de
microorganismos. Por otro lado se deben tener condiciones que permitan dicho
desarrollo como una temperatura apropiada, pH del medio, niveles de radiacin
escasos. Segn vayan variando estos factores se limitar la presencia de ciertos
microorganismos en el cultivo y, si son extremos, no habr ningn microorganismo
salvo los extremfilos que sean capaces de habitarlo.

2. Cuando utiliza tubos de agar inclinado para el estudio de las caractersticas de
crecimiento es preferible inocular con aguja de klle y no con asa. Por qu?
Para observar las caractersticas de crecimiento en agar inclinado es importante el
uso de aguja de klle pues se desea realizar una puncin profunda para observar
cmo se extienden los microorganismos al crecer. Por este propsito es
aconsejable el uso de una aguja de kller al representar un punto de inoculacin
estrecho que permita observar los ligeros cambios en la expansin del cultivo, si se
utilizara el asa de klle se tendra una zona y no un punto de inoculacin dando
como resultado un posible error al observar el crecimiento dado que no se posee
una lnea inicial de aplicacin de microorganismos, sino un rea. Mac Faddin
(2003) nos dice esto y afirma que en un medio de agar inclinado el proceso de
inoculacin debe hacerse primero realizando una estra en el pico de flauta y
luego una puncin en el fondo del tubo.

3. Qu factores influenciarn en la abundancia del crecimiento en caldo, agar
inclinado y agar vertical?
De la Rosa y Prieto (2003) nos dicen que entre los principales factores que
determinan el crecimiento microbiano podemos encontrar los siguientes:
Agua: Requerimiento absoluto para el crecimiento bacteriano debido a
que al menos el 80% de la masa de estas es agua, por lo que la
disponibilidad de esta condiciona el tamao de las poblaciones
bacterianas.
Oxgeno: Las bacterias difieren en sus necesidades de oxgeno. As se
pueden separar en aerobias (Crecen en una atmsfera con presencia de
21% de oxgeno), anaerobias (Crecen en ausencia de oxgeno), aerobias
estrictas (No pueden crecer en anaerobiosis), anaerobias estrictas (No
crecen en aerobiosis) y facultativas (Crecen en aerobiosis y anaerobiosis),
finalmente las que son incapaces de utilizar oxgeno como aceptor final en
su respiracin pero pueden crecer en presencia de oxgeno se llaman
aerotolerantes. As el tipo de bacteria determina la composicin del aire del
medio de cultivo. Adems esta necesidad influye, en ciertas ocasiones, en
la virulencia de las bacterias y en las enfermedades que producen.
Anhdrido carbnico: Muchas bacterias patgenas, como los
meningococos, requieren un contenido de 5 a 10% de CO2 en la atmsfera.
Temperatura: Las bacterias tambin difieren en su temperatura ptima de
crecimiento. As tenemos psicrfilas (Debajo de 20C), mesfilas (Entre 20 y
40C) y termfilas (Entre 55 y 80C), siendo la mayora de bacterias
patgenas mesfilas y crecen mejor a temperaturas alrededor de 37C
(Temperatura del cuerpo humano)
pH: El pH afecta mucho el desarrollo ptimo de las bacterias. En el caso de
las que producen enfermedades en el hombre ste punto est en el pH
fisiolgico (7,2)
Productos metablicos bacterianos: Las bacterias sintetizan estructuras y las
transportan a donde corresponda, algunas de las cuales son de gran
inters.
Por otro lado, Tortora et al (2007) nos menciona los parmetros que deben
tenerse en cuenta en los medios de cultivo para el desarrollo adecuado de los
microorganismos. Entre estos est la presencia de una fuente de energa, carbono,
nitrgeno, azufre, fsforo y cualquier otro factor de crecimiento que el organismo
no pueda sintetizar.
EJERCICIO N2
1. Qu procedimiento seguira a continuacin del desarrollado en estos
ejercicios para obtener el cultivo puro de cada cepa contenida en la mezcla?
Cmo podramos comprobar que estas cepas obtenidas finalmente
corresponden a las colonias aisladas?
Luego de los mtodos de aislamiento se obtienen colonias diferenciadas e
individuales de diferentes tipos de microorganismos. Estas pueden ser purificadas.
Para esto se selecciona la colonia cuya cepa se desee obtener en estado
puro. Esta es trasplantada a otra placa de agar mediante el mtodo de
agotamiento de superficie y el uso de la aguja de klle. En este medio se le darn
las condiciones de cultivo indicadas para la proliferacin de microorganismos
(37C por 24 horas). Tiempo despus se volver a obtener una placa petri con
presencia de microorganismos y colonias individuales, pero en esta placa se
presentar una mayor presencia de la colonia seleccionada si la inoculacin se
realiz de la forma correcta. Este proceso se ha de repetir hasta obtener la
totalidad de colonias de la especie deseada y puede realizarse para todas los
cultivos cuyas cepas se deseen obtener.
Para comprobar que estas cepas provienen de las colonias aisladas se
realizara un anlisis y comparacin macroscpica y luego microscpica de un
cultivo proveniente de la cepa pura y de las colonias originales presentes en el
primer agar Mac Conkey. As se comprueba gracias a las caractersticas,
microscpicas principalmente, si son o no de la misma especie y, por lo tanto, de
las colonias aisladas del inicio.

2. Qu factores limitan el tamao de las colonias en una placa de cultivo?
Alarcn (2004) nos dice que existen ciertos factores limitantes del crecimiento
microbiano cuyo conocimiento es importante para su control, entre estos estn:
Temperatura ptima de crecimiento de algunas bacterias: La
temperatura ambiental afecta directamente el funcionamiento de las
enzimas bacterianas siendo la temperatura ptima de crecimiento
aquella en la cual el microorganismo se multiplica a su mxima
velocidad.
Influencia de la presin osmtica: El crecimiento bacteriano es
afectado grandemente por la cantidad de agua que entra o sale de la
clula, especialmente cuando se encuentra la bacteria en una solucin
hipertnica debido a que se inhibe su crecimiento. Este grado de
inhibicin depende del tipo de soluto y de la naturaleza del organismo.
pH
Luz ultravioleta
Por su parte, Pumarola y Pumarola (1995) nos dicen que cuando se utilizan
como inculo clulas en estado metablico latente, son factores de importancia
crtica para iniciar el crecimiento el pH, la temperatura, la presencia de
concentraciones adecuadas de oxgeno (Potencial de oxidacin-reduccin) y
concentraciones favorable de CO2, adems de ciertas sustancias nutritivas, en
especial las que se producen lentamente o con dificultad por s mismas.

3. Suponga que recibe una muestra de leche en polvo y se le pide determinar el
nmero total de colonias por gramo. Plantee una metodologa cuantitativa
basada en diluciones sucesivas para resolver el problema.
En primer lugar se alistaran 10 tubos con 9 mL de agar licuado, mantenindolos
en este estado mediante calor. Posteriormente en un dcimo tuvo se realizara la
disolucin de 1 gramo de muestra en 9 mL de agua destilada de alta pureza. Se
homogeniza y posteriormente se extrae una alcuota de 1 mL y se agrega al primer
tubo de agar licuado. Luego se homogeniza y se extrae una alcuota de 1 mL de
este para agregarlo al siguiente y as sucesivamente.
Posteriormente se vacan los contenidos de los tubos, cada uno a una placa
petri y se llevan a incubar a 37C por 24 horas. Tiempo luego del cual se procede al
recuento de colonias al microscopio tomndose como valor aceptable aquel que
oscile entre 30 y 300. Luego de esto se extrapola este nmero hasta llegar a la
concentracin de bacterias en el gramo de muestra utilizado y ya se tendra el
nmero de colonias por gramo de la muestra de leche en polvo.

4. En qu consiste la tcnica del nmero ms probable? Qu usos tiene?
MAD (Editor, 2006) nos dice que la tcnica del nmero ms probable (NMP) es
un mtodo estadstico basado en la dispersin aleatoria de los microorganismos en
un volumen de agua determinado, es decir, muestras repetidas del mismo tamao
de un mismo producto, por lo que cabe esperar que contengan el mismo nmero
de microorganismos como promedio. Esta cifra media estimada es el Nmero Ms
Probable. De esta forma, si un lquido posee 100 microorganismos en 100 mL, cada
muestra de 10 mL debera contener 10 microorganismos; la de 1 mL, 1
microorganismo y la de 0,1 mL solo 1 microorganismo cada 10 muestras.
Por dicha razn si se siembran varios tubos de medio con muestras de distinto
volumen es posible calcular el NMO de microorganismos en 100 mL de medio con
cualquier combinacin de resultados obtenidos de las muestras. La siembra se
realiza por triplicado o quintuplicado. Tras incubar se observa turbidez, cambio de
color o produccin de gas, segn los casos, obtenindose un valor numrico que,
a travs de las tablas, indica la cifra ms probable de microorganismos en la
muestra, sobre la base del nmero de tubos que manifiestan resultado positivo.
Existen tablas para muestras de 10 mL, 1 mL y 0,1 mL. En la determinacin existen
tres fases: Presuntiva, confirmativa y de anlisis completo. Adems permite el
procesamiento de muestras claras o turbias. Sin embargo, existen ciertos
inconvenientes como no proporcionar un recuento preciso, sino una estimacin
estadstica de la presencia de un determinado microorganismo; la necesidad de
mltiples tubos de fermentacin y el tiempo de espera entre 5 y 7 das.

5. De qu manera se pueden preservar cepas puras por largos periodos?
Se puede proveer al medio de un ambiente externo estril, colocar a las cepas
puras en un cultivo dentro de una placa petri o tubo, este cerrado y colocarlo en
una cmara estril o donde se realice vaco. IICA (1985) nos dice que otra forma
de conservacin del material biolgico, ya sea en tubos o cajas de petri
conteniendo medio de cultivo slido, para que la clula no sufra cambios por
deterioro, puede darse por un sistema de perlas, que consiste en adherir a perlas
de vidrio suspensin de bacterias, o conservarlas en forma liofilizada (Actividad de
agua baja)

6. Qu tcnicas de cultivo se emplean para aislar microorganismos
anaerbicos?
Koneman et al (2008) nos dice que antes del aislamiento de cultivos es necesario
un reconocimiento de posibles especies presentes. Esto se realiza mediante el uso
de distintos cultivos, como el agar sangre, en el cual crecen muy bien los
anaerobios estrictos como Clostridium novyi y Clostridium haemolyticum.
Menciona adems la tcnica de seleccin de esporas como mtodo de
aislamiento para Clostridium sp. y cultivos anaerobios en general. Luego menciona
mtodos con fines especiales para el aislamiento primario de anaerobios en la flora
normal descritos en el Manual Madsworth, medios selectivos y una tcnica de
enriquecimiento en fro para ayudar al aislamiento de especies de Mobiluncus sp.
en muestras vaginales por Smith y Moore, un medio diferencial y selectivo para el
aislamiento de Bacteroides ureolyticus. Por Eley y cols, un medio selectivo para
Bacteroides gracilis realizado por Lee y cols, un medio selectivo para el aislamiento
de especies de Anaerobiospirillum sp. proveniente de heces, realizado por Malnick
y cols; adems menciona medios selectivos adicionales con fines especiales y
procedimientos para el aislamiento y la cuantificacin de Clostridium difficile, c.
perfringens y C.botulinum de heces o muestras de alimentos.

VII. CONCLUSIONES

Se puede hacer una distincin de la presencia de microorganismos en un
medio lquido por la turbidez que presenta este una vez contaminada. En este
medio existe una numerosa cantidad de gneros y especies de
microorganismos ya que el caldo nutritivo es un medio no discriminativo.

En la aislacin de microorganismos en el agar manitol salado podemos concluir
que hubo proliferacin exitosa de bacterias del genero Staphylococcus ya que
este medio es diferencial porque esta compuesto por nutrientes especficos
para ese genero de bacterias adems de tener una alta conc. salina.


La aislacin de bacterias en agar Mac Conkey se realiz con xito. Este medio
es selectivo y diferencial que se emplea ms a menudo para la aislacin de
enterobacterias siendo el ms comn E-coli; contiene violeta cristal para inhibir
el crecimiento de cocos gran positivos y rojo neutro como indicador de pH,
que le otorga propiedades diferenciales. Los fermentadores de lactosa
producen cidos orgnicos que disminuyen el pH de medio prximo a la
colonia. En esa zona el rojo neutro vira al rojo o rosado. Los no fermentadores
de lactosa permanecen incoloros y translcidos. Se puede concluir que el
microorganismo aislado es Escherichia coli.
En un aislamiento por diluciones se obtiene el recuento de las colonias, las
cuales permitirn conocer el nmero de clulas existentes en el cultivo original.






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