DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LAS BAYAS DE GOJI.

Muestra: ZUMO DE BAYAS FRESCAS DE GOJI BIO-ENER S.L. Botella de 0,5 L recibida en julio-2009, para su anlisis en Septiembre/Octubre Referencia interna: 09/321-2009

Responsable: Dra. Mara Pilar Almajano (CEIB)

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NDICE OBJETIVO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 ANTIOXIDANTES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 IMPORTANCIA DE LAS BAYAS DE GOJI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 CUANTIFICACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE, POLIFENOLES Y FLAVONOIDES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 CAPTURA DE RADICALES POR EL METODO TEAC. Cuantificacin de polifenoles totales por el mtodo de Folin-Ciocalteu Cuantificacin de flavonoides Oxigen Radical Absorbance Capacity (ORAC) CONDICIONES GENERALES DEL ESTUDIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 MTODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 BIBLIOGRAFA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

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OBJETIVO El objetivo de este estudio es estudiar la evolucin de la capacidad antioxidante del producto Zumo de bayas de Goji a lo largo de 30 das y en diferentes condiciones de temperatura. Este producto est comercializado por la empresa BIO-ENER S.L. Se determina la evolucin: de la capacidad antioxidante por el mtodo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) de la capacidad antioxidante por el mtodo ORAC (Oxigen Radical Absorbance Capacity) de los polifenoles totales por el mtodo Folin- Ciocalteu de los flavonoides por el mtodo interno (ref Santas et al. 2008)

ANTIOXIDANTES Los antioxidantes son molculas que tienen la propiedad de evitar o prevenir la oxidacin con otras molculas. Se produce una oxidacin, siempre que una especie cede electrones a otra, la especie que gana electrones se reduce, y la que pierde se oxida. En estas reacciones de oxidacin, a veces, se pueden producir radicales libres, especies muy oxidativas y que pueden producir daos al organismo. Los antioxidantes son especies que acaban estas reacciones, inhibiendo algn producto intermedio y oxidndose los mismos. Las clulas, como parte de su propio metabolismo, producen radicales libres y especies reactivas del oxigeno (ROS). Estos radicales libres, son bloqueados por un complejo sistema antioxidante de enzimas como la catalasa, superxido dismutasa, glutatin peroxidasa y un continuo de antioxidantes no enzimticos, como las vitaminas A,E y C, glutatin, ubiquinona o flavonoides. Si se produce un desequilibrio entre los proxidantes y los antioxidantes, se llega a un estado de estrs oxidativo, que puede ser producido por una excesiva produccin de radicales libres. La dieta juega un papel importante en la prevencin de las enfermedades relacionadas con el estrs oxidativo, fundamentalmente a travs de la ingestin de compuestos bioactivos de origen vegetal. Entre ellos, las vitaminas hidrosolubles y liposolubles, carotenoides y una gran variedad de compuestos fenlicos, la capacidad antioxidante y beneficiosa de los cuales estn siendo investigados ampliamente en los ltimos aos. Los compuestos fenlicos, constituyen una de las principales clases de metabolitos sencundarios de los vegetales, donde tienen diversas funciones fisiolgicas. Entre otros, intervienen en el crecimiento y reproduccin de las plantas y en los procesos defensivos, (patgenos, depredadores, incluso radiacin ultravioleta). Los compuestos fenlicos presentan un anillo benzo hidroxilado, como un elemento comn en todas sus estructuras moleculares, las cules pueden incluir grupos funcionales como esters, metil-esters, glicsidos, etc. Los compuestos fenlicos comprenden desde molculas simples como lo cidos benzicos hasta polmeros complejos como las ligninas. Dentro de cada familia, el nmero de compuestos fenlicos existentes, sern ms o menos variado. Por ejemplo, se conocen ms de 400 flavonoides diferentes, distribuidos en diversas subfamilias, Los compuestos fenlicos estn presentes en todo el reino vegetal y sus cantidades y tipos varan en funcin de la especie, variedad y parte del vegetal considerado (frutas, semillas, brotes hojas....) horas de exposicin solar, grado de maduracin, condiciones de cultivo, etc.
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A los alimentos los compuestos fenlicos, se presentan conjugados con azcares, como la glucosa, galactosa, arabinosa, ramosa, xilosa o los cidos glucornicos y galacturnicos. Tambin pueden unirse con cidos carboxlicos, cidos orgnicos, aminocidos y lpidos. En la actualidad, este grupo de compuestos de origen vegetal, presentan un gran inters nutricional, por su contribucin, al mantenimiento de la salud humana. De hecho, desde 1.990, diversas organizaciones internacionales, en el mbito de la nutricin, recomiendan un consumo diario como mnimo de cinco raciones de fruta o verdura, para asegurar una adecuada ingesta de antioxidantes y prevenir enfermedades relacionadas con el estrs oxidativo. La actividad antioxidante de los compuestos fenlicos, viene determinada por su estructura qumica, por lo que existen grandes diferencias en la efectividad en los antioxidantes entre los diferentes grupos de compuestos. Los compuestos fenlicos pueden actuar, como donantes de hidrgeno o electrones a las reacciones de terminacin, que rompen el ciclo de generacin de nuevos radicales libres, anticipando las reacciones de terminacin actuando como un antirradicalarios. El radical fenoxil generado es menos reactivo, ya que se estabiliza por resonancia con los electrones del anillo aromtico. La alimentacin aporta sustancias necesarias para el metabolismo humano, pero es justamente este mecanismo el que, al mismo tiempo, produce especies secundarias como radicales libres, muy reactivos y oxidantes, con efectos negativos para la salud. Los seres vivos, tienen un complejo sistema, para hacer frente a esta oxidacin, y en especial, los vegetales, por estar expuestos a la radiacin solar. Ciertas sustancias, llamadas antioxidantes, desde vitaminas hasta polifenoles, bloquean la accin de estos radicales libres.

Importancia de las bayas de Goji. Durante los ltimos aos, las Bayas de Goji, han estado consideradas como uno de los alimentos, con mayor capacidad antioxidante, que las ha hecho especialmente populares. Las bayas de Goji, (o cerezas de Goji) son el fruto de un arbusto llamado Lycium barbarum L. de la familia de las Solnaceas. Esta planta es bien conocida en la medicina tradicional china. Hoy en da est muy usada como alimento funcional, con una larga variedad de efectos beneficiarios para la salud. Por ejemplo, reduccin de la glucosa sangunea, efectos anti-envejecimiento, beneficios inmunolgicos, efectos anticancergenos, incluso anti-fatiga (Harunubu et al.2009). El primer archivo chino que documenta el uso del Lycium barbarum L., tiene aproximadamente 2.300 aos. Los frutos de la planta pueden ser utilizados, para producir diferentes tipos de productos saludables, como frmulas, y zumos medicinales. Algunos constituyentes del Lycium barbarum L, han sido estudiados qumicamente, especialmente los polisacridos glicoconjugados, presentes en las bayas. El objeto de este estudio es Zumo de bayas frescas de Goji obtenido directamente de las bayas y sin adicin de otros componentes. Algunos estudios han cuantificado la capacidad de diversas frutas, como la guayaba, la papaya, la banana, la carambola, la manzana de Jamaica, o la naranja. La Guayaba, (138 mg equivalente de cido glico/100 g de fruta entera) es la que ms capacidad antioxidante muestra, seguida por la carambola (131 mg/100), la naranja (75 mg/100), el mango (54 mg/100), la banana (51 mg/100), la manzana de Jamaica (35 mg/100), y la papaya 28 mg/100), todos ellos medidos con mg equivalente de cido glico/100 gr fruta entera (Lim et al.2007)
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Cuantificacin de la actividad antioxidante, polifenoles y flavonoides Existen diversos mtodos de medir la actividad antioxidante total. Algunos de stos mtodos, se pueden basar en diversos procedimientos, como es la captacin de radicales libres, generados o bien la medicin de los polifenoles totales, contenidos en la muestra, por el mtodo de Folin-Ciocalteau. Captura de radicales por el mtodo TEAC El mtodo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity), es un mtodo que sirve para cuantificar la capacidad antirradicalaria de los compuestos antioxidantes, es decir, sirve para cuantificar la captura de los radicales libres. El mtodo TEAC, se genera un radical libre positivo, estable, llamado ABTS (Acido 2,2 -azinobis-(3-etilbenzotioazoln-6- sulfnico) mediante una reaccin entre ste y el persulfato de potasio. A ste, se le aade el antioxidante que queremos estudiar, y comprobamos la disminucin de la absorvencia de la muestra, ya que el ABTS posee un grupo cromforo que observa la luz a 734 nm. Cuantificacin de polifenoles totales por el mtodo del Folin-Ciocalteu El ensayo Folin-Ciocalteu, ha estado utilizado durante muchos aos, como medida del contenido en compuestos fenlicos totales en productos naturales. An as, el mecanismo bsico es una reaccin redox, por lo que se puede considerar, como otro mtodo de medida de la actividad antioxidante total. El mtodo que se utiliza actualmente, es una modificacin, efectuada por Singleton y Rossi (1965) de un mtodo que se utilizaba, para la determinacin de la tirosina, que estaba basado en la oxidacin de los fenoles, por un reactivo de molibdeno y wolframio. La mejora introducida por Singleton y Rossi, fue el uso de un heteropolianio fosfrico de molibdeno y tungsteno que oxida los fenoles con mayor especificidad, (3H2O-P2O5-13WO3-5MoO3-10H2O y 3H2O-P2O5-14WO3-4MoO3-10H2O) La oxidacin de los fenoles, presentes en la muestra, causa la aparicin de una coloracin azulada que presenta un mximo de absorcin a 765 nm, y que se cuantifica por espectrofotometra en base a una recta patrn de cido glico. Se trata de un mtodo preciso y sensible, pero que, an as, padece numerosas variaciones, cuando es aplicado por diferentes grupos de investigacin, fundamentalmente en lo relativo a los volmenes utilizados de la muestra, concentracin de reactivos y tiempo y temperatura de incubacin. Tambin se producen numerosas variaciones, en el modo de expresar los resultados, de manera que el patrn recomendado de cido glico, ha sido sustituido, en ocasiones por otros. El ensayo de los fenoles totales, se utiliza con frecuencia en el estudio de las propiedades antioxidantes de alimentos vegetales, como zumos de fruta, al tratarse de un parmetro que generalmente, muestra una estrecha correlacin con los diferentes mtodos de medir la actividad antioxidante. As, cuando se evalan, las propiedades antioxidantes de estos alimentos, el anlisis de fenoles, proporciona informacin valiosa a la hora de seleccionar, variedades con mayor potencial antioxidante.

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Cuantificacin de flavonoides Se realiza por un mtodo interno descrito en Santas et al. Mediante separacin y posterior cuantificacin por espectrofotometra UV-Vis. Oxigen Radical Absorbance Capacity (ORAC)* El mtodo ORAC se aplica con frecuencia para asegurar la capacidad antioxidante en muestras biolgicas y alimentos. Se basa en la inhibicin del radical peroxil oxidativo inducido por composicin trmica de compuestos azo como el 2,2`-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH). As, el ensayo ORAC combina tiempo y disminucin de la inhibicin, a diferencia del mtodo TEAC que nicamente evala la disminucin en la inhibicin. Inicialmente, el mtodo ORAC se realizaba con B-phycoercythrin (B-PE) como compuesto fluorescente, ya que posee diferentes longitudes de onda de excitacin y emisin, elevado campo de fluorescencia, sensibilidad a las especies reactivas de oxigeno (ROS) y solubilidad en agua. An as, la B-PE presenta una serie de inconvenientes: baja pureza del reactivo (aproximadamente del 30%) que provoca muchas variaciones en los resultados si se utilizan reactivos procedentes de diferentes lotes, no es fotoestable por lo que transcurrido un cierto tiempo, pierde totalmente la coloracin e interacciona con los polifenoles. Estos inconvenientes han provocado que a partir del ao 2001 este mtodo se haya adaptado para ser utilizado con fluorescencia (FL) (36-dihydroxy-spiro(isobenxofuran-1(3H),9(9H)-xanthen)-3-one) como compuesto fluorescente. El mecanismo de la reaccin se basa en la transferencia de un tomo de hidrogeno (Hidrogen Atom Transfer, HAT) del antioxidante al radical libre. Por esto, se utiliza el radical iniciador, el AAPH, para generar el radical peroxil ROO Un mol de AAPH, pierde un mol de nitrgeno, para generar dos mols de radical AAPH en un ratio constante. En una solucin saturada de aire, el radical AAPH reacciona rpidamente con el oxgeno para dar un radical peroxil ms estable, ROO. La prdida de fluorescencia de la FL es el indicador de la extensin de la oxidacin con el radical peroxil. En presencia de un antioxidante, RRO capta, preferiblemente, un tomo de hidrgeno del antioxidante estable (ArO). Como consecuencia, la disminucin de la fluorescencia de la FL por accin del radical peroxil es disminuida o inhibida. Las reacciones que tienen lugar son:

Donde A-H representa al radical iniciador AAPH, FL-H es el compuesto fluorescente (FL) y ArOH es el antioxidante. La proteccin del antioxidante se mide a partir del rea de fluorescencia bajo la curva (AUC) de la muestra en comparacin con la AUC del blanco, donde el antioxidante no est presente. La AUC se calcula mediante la siguiente expresin:

* Se explica con ms profundidad debido a que es el ms utilizado y a la vez ms desconocido procidimentalmente.

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Donde: I: nmero de ciclos. F: unidades de fluorescencia CT: tiempo de cada ciclo en minutos. En este caso, CT es igual a 2

La figura 1 muestra un ejemplo de las AUC del blanco y de los patrones, Trolox 20 mM, 40 mM,100 mM, 200 mM y 300 mM (concentraciones iniciales en muestra)

Figura 1. AUC de blancos y patrones de Trolox. El rea limpia bajo la curva (AUC lmpia) se encuentra por diferencia entre el AUC de la muestra y el AUC del blanco. Esta AUC limpia (y) se representa delante de la concentracin de Trolox como patrn (X) obteniendo la recta de regresin lineal, a partir de aqu, se calculan los moles equivalentes de Trolox por litro de muestra. Se ha de remarcar que este calibrado con Trolox, se ha de realizar cada vez. A la figura 2, se indica un ejemplo de la recta de calibrado obtenida por un ensayo del mtodo ORAC.

Figura 2. Calibrado del mtodo ORAC para un ensayo determinado

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Condiciones generales del estudio La muestra se conserv con refrigeracin (t=4C 2 C) y con la botella cerrada hasta el momento del inicio del proceso. Condiciones climticas. Se reproducieron las condiciones que se pueden llevar a cabo en casa. Se consider dos situaciones, (cada una en una botella). La cantidad necesaria para el anlisis se extraer peridicamente de ellas, en condiciones higinicas. Una de las botellas se mantuvo a la temperatura de 20C (en un climatizador) durante todo el tiempo que dur el experimento. La otra se conserv a temperatura ambiente, es decir sobre una mesa protegida de la luz. Ambas se dejaron desde el 16 de septiembre, durante 30 das. La evolucin de la temperatura ambiente da una media de 25,4C. Debido a la evolucin del experimento (posible contaminacin a temperatura no refrigerada), a partir del 1 de Octubre, se inician los estudios a temperatura de refrigeracin (4C), con otra botella. La desviacin mxima de las condiciones reales de las cmaras respecto las condiciones establecidas es de 2C. Se registr diariamente las condiciones de temperatura. Duracin del estudio. Todos los estudios se dieron a trmino durante un periodo de 30 das. Control del producto. El producto fu analizado al inicio del estudio y a lo largo de la duracin de ste, mediante controles peridicos cada 5 das. En cada control, se realizaron tres determinaciones por cada una de las pruebas y cada una de las temperaturas. Toma de muestras Cada 5 das y a la misma hora, se homogeneiza la muestra de la botella (por agitacin manual) y se cogen 10 mL. No se pudo utilizar directamente el producto. Del zumo se separa la partculas en suspensin, mediante centrifugacin a 1200 rpm durante 10 minutos y se coge el sobrenedante, utilizando esta como muestra* La metodologa utilizada en los anlisis corresponde a los mtodos de procedimiento normalizados de trabajo validados, basados en desarrollos internos. Los ensayos se llevaron a trmino con los controles y las garantas establecidas en nuestro sistema de gestin basado en la norma ISO-17025. Algunas de las muestras, (inicial y final) se validaron por HPLC.
*Tambin se extrajo los polifenoles del precipitado. Presenta resultados similares al sobrenadado, pero no se recogen en este informe.
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Mtodos
Determinacin de polifenoles totales y de flavonoides. El mtodo de Folin-Ciocalteu se ha utilizado para la determinacin de polifenoles totales, siendo el patrn y la referencia el cido glico. Los resultados se expresan, como equivalentes en mg de cido glico por L de zumo. Para realizar este mtodo, se utiliz las extracciones realizadas anteriormente. El mtodo de Folin-Ciocalteu, se basa en una reaccin entre el reactivo Folin-Ciocalteu activado con una base, como carbonato de sodio. El mtodo de flavonoides cuantifica los polifenoles ms activos como antioxidantes. Para que la muestra no salga del rango lineal de la ley de Lambert-Beer, ni del rango de lectura del aparato, se diluye adecuadamente la muestra. Los resultados se expresaron mediante una calibracin previa realizada con cido glico como patrn.

Estudio de la capacidad antirradicalaria. El mtodo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) es un mtodo que sirve para medir capacidad antirradicalaria de una muestra. Se compara la cantidad de inhibicin del radical libre de la muestra con la de un patrn, Trolox, un ismero hidrosoluble de la vitamina E, a partir de una recta de calibrado. Los valores obtenidos son similares (no equivalentes) a la capacidad antioxidante que tendra la vitamina E, pero con la ventaja que, al ser hidrosoluble no queda retenido en el organismo. El mtodo ORAC (Oxigen Radical Absorbance Capacity) se aplica para medir la capacidad antioxidante en muestras biolgicas y alimentos. Combina tiempo y disminucin de la inhibicin, a diferencia del mtodo TEAC que solamente evala la disminucin en la inhibicin.

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Resultados a) La actividad antioxidante del Goji presenta los siguientes valores: I) Entre 60 y 75 miliequivalentes de Trolox/L de muestra a lo largo del mes, medido por el mtodo ORAC que determina todas las especies reactivas al oxgeno. En la figura 3 se recoge la evolucin.

Figura 3: Evolucin de antioxidantes totales por ORAC II) Entre 23 y 30 miliequivalentes de Trolox/L de muestra a lo largo de un mes, medido por el mtodo TEAC, que determina las especies reactivas frente radicales libres. Los resultados se recogen en la figura 4.

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Figura 4: Evolucin de los compuestos antirradicales por TEAC. b) Los polifenoles totales, determinados por el mtodo Folin-Ciocalteu, estn entre 2 y 3 equivalentes en gramos de cido glico/L de muestra. La figura 5 muestra la evolucin a lo largo de un mes.

Figura 5: Evolucin de los compuestos fenlicos. c) Los flavonoides totales se encuentran en el rango de 0,2 a 0,6 equivalentes en gramos de cido glico/L de muestra. En la figura 6 se recoge la evolucin.

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Figura 6: Evolucin de los compuestos flavonoides

CONCLUSIONES: Por tanto, se puede afirmar que la capacidad antioxidante mostrada por el zumo de Goji, de aproximadamente unos 240 mg/100 g (medidos con mg equivalentes de cido glico, por cada 100 gr de zumo de Goji), presentan una capacidad antioxidante, casi dos veces superior a la Guayaba o la carambola, unas tres veces superior a la naranja, seis veces superior al mango y a la banana y unas siete veces superior a la manzana de Jamaica y la papaya.

Bibliografa Harunobu Amagase, Buxiang Sun, Carmia Borek, Lycium barbarum (goji) juice improves in vivo antioxidant biomarkers in serum of healthy adults, Nutrition Research, Volume 29, Issue 1, January 2009, Pages 19-25. Y.Y. Lim, T.T. Lim, J.J. Tee, Antioxidant properties of several tropical fruits: A comparative study, Food Chemistry, Volume 103, Issue 3, 2007, Pages 1003-1008.

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