UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE FARMACIA Y BIOANALISIS ESCUELA DE BIOANALISIS ASIGNATURA: BIOTECNOLOGIA

INTEGRANTES: Ana Garca C.I. 19631606 Carla Finol C.I. 20938561 Zirley

MERIDA, ENERO 2014

ndice
GENERALIDADES.................................................................................................................................. 4 ANTICUERPO MONOCLONAL .......................................................................................................... 5 HIBRIDOMA ..................................................................................................................................... 5 ENZIMA HGPRT................................................................................................................................ 5 ENZIMA TK ....................................................................................................................................... 5 MEDIO HAT...................................................................................................................................... 5 PRODUCCIN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES DE ORIGEN MRIDO (DE RATONES) .................. 6 INMUNIZACIN ............................................................................................................................... 6 FUSIN ............................................................................................................................................ 7 SELECCIN ....................................................................................................................................... 7 EVALUACIN DE LOS SOBRENADANTES DE CULTIVO ..................................................................... 8 CLONAMIENTO ................................................................................................................................ 9 ESCALAMIENTO DE LA PRODUCCIN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ................................... 9 CONCLUSION ..................................................................................................................................... 11 BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................................... 12 Grande, L. (1999). El Sueo de lo Posible: Biotica y Terapia Gnica. Madrid: Universidad Pontifica Comillas ............................................................................................................................................. 12

INTRODUCCION El descubrimiento y caracterizacin de los anticuerpos tiene una larga historia, que es la de la propia inmunologa, y se remonta a finales del siglo XIX. En esa poca, los microbilogos estudiaban los mecanismos de defensa del organismo contra los agentes microbianos, en particular contra las toxinas bacterianas. Von Behring y Kitasato sentaron en los aos noventa del siglo xix las bases de la inmunidad humoral al descubrir que el suero produca sustancias que antagonizaban toxinas como la diftrica o la tetnica. Ehrlich, a finales de siglo, consolid la idea de que las toxinas generaban antitoxinas sricas que se comportaban segn las leyes de la qumica; las clulas de la sangre eran capaces de producir unas cadenas laterales que reaccionaban frente a las toxinas de manera especfica como una llave con su cerradura. Por las distintas propiedades de reaccionar las antitoxinas se denominaban de varias maneras: aglutininas, opsoninas, etc. (Garcia, 2011). En los aos treinta del siglo xx Landsteiner, el descubridor del sistema ABO, identifica todas esas funciones y las centra en una sola molcula, los anticuerpos, y al tiempo va sustituyndose el nombre de toxina por el de antgeno. Aos ms tarde, este mismo autor, junto con Pauling, desarrolla la teora instruccionista de formacin de los anticuerpos, segn la cual los antgenos determinaran la conformacin de los anticuerpos acomodndola a su estructura. A finales de los cuarenta se descubre el origen celular de los anticuerpos en las clulas B y plasmticas. Aos ms tarde se describen las cadenas ligeras y se identifican las inmunoglobulinas A, D y E (Garca, 2011). Actualmente despus de muchos avances cientficos existen los anticuerpos monoclonales que son una poderosa herramienta para el diagnstico de laboratorio y un instrumento cada vez ms utilizado en el tratamiento de diversas enfermedades, los cuales se definirn durante el desarrollo de este trabajo.

GENERALIDADES

ANTICUERPO Son glicoprotenas del tipo gamma globulina. Pueden encontrarse de forma soluble en la sangre u otros fluidos corporales de los vertebrados, disponiendo de una forma idntica que acta como receptor de los linfocitos B y son empleados por el sistema inmunitario para identificar y neutralizar elementos extraos tales como bacterias, virus o parsitos (Figura 1). En esencia, las molculas de anticuerpos llevan a cabo dos funciones principales en la defensa inmunitaria. La primera es reconocer y unirse al material extrao (el antgeno). Esto significa la unin a estructuras moleculares en la superficie del material extrao (determinantes antignicos) que difieren de las estructuras moleculares elaboradas por las clulas del husped. Esos determinantes antignicos suelen expresarse en copias mltiples sobre el material extrao, por ejemplo, protenas o hidratos de carbono de la superficie de la clula bacteriana o en las espculas de la envoltura sobre la superficie de un virus. Los anticuerpos del husped pueden reconocer una variedad grande de estructuras diferentes: el ser humano es capaz de producir anticuerpos contra miles de millones de estructuras moleculares distintas. Esto se describe como diversidad del anticuerpo y es necesario para responder a la enorme diversidad de estructuras moleculares asociadas con patgenos (a menudo con alto poder de mutacin). (Delves, Martin, Burton y Roitt, 2008). El simple acto de unin del anticuerpo puede ser suficiente para inactivar a un patgeno o mantener inocua a una toxina. Por ejemplo, el anticuerpo que recubre un virus puede impedir que este ingrese en las clulas diana y neutralizar, por consiguiente, el virus. Sin embargo, en muchos casos se despliega una segunda funcin de la molcula de anticuerpo para activar la eliminacin del material extrao. En trminos moleculares, esto implica la unin de ciertas molculas (molculas efectoras) al material extrao recubierto por anticuerpos para activar los mecanismos complejos de eliminacin, por ejemplo, el sistema de protenas del complemento o la fagocitosis por las clulas del sistema inmunitario del husped, como neutrfilos y macrfagos. Los sistemas efectores poderosos son generalmente activados solo por molculas de anticuerpos agrupadas sobre la superficie celular extraa y no por el anticuerpo libre no unido al ligando. Esto es crucial si se consideran las concentraciones tpicamente elevadas de anticuerpos sricos. (Delves, Martin, Burton y Roitt, 2008).

ANTICUERPO MONOCLONAL Se denomina anticuerpo monoclonal al producido mediante el cultivo de un solo tipo o clon de clulas hibridas (hibridoma), entre clulas capaces de producir anticuerpos y clulas de mieloma; por tanto, est constituido por molculas de una sola especie de inmunoglobulina que provienen de un nico clon (S.E.C.H., 1999). Este clon de linfocitos B fabrica anticuerpos idnticos y especficos para un antgeno. Con esto se consigue producir anticuerpos monoclonales, muy tiles y utilizados en biomedicina y en biologa molecular. En medicina se utilizan, por ejemplo, para detectar la presencia y cantidad de una sustancia en la sangre (S.E.C.H., 1999).

HIBRIDOMA Un hibridoma es una clula hbrida (quimera) producto de la fusin de una clula mieloma (un tumor que produce anticuerpos) y una clula plasmtica. Cada clon de hibridomas produce un tipo de anticuerpo de la clula plasmtica: un anticuerpo monoclonal. (Grande, 1999).

ENZIMA HGPRT La Hipoxantina Guanina Fosforibosil Transferasa es una enzima codificada en humanos por el gen HPRT1. HGPRT es una transferasa que juega un papel central en la generacin de nucletidos de purina a travs de la va de recuperacin de purina. Las clulas B contienen esta enzima, lo que les permite sobrevivir cuando se fusionan con las clulas de mieloma cuando se cultivan en un medio HAT para producir anticuerpos monoclonales (Garca, 2011).

ENZIMA TK La Timidina Quinasa es una enzima que permite a una clula utilizar una va metablica alternativa para incorporar timidina en el ADN. Se utiliza como marcador seleccionable para identificar las clulas eucariticas transfectadas (Garca, 2011).

MEDIO HAT Es un medio de cultivo especial que contiene hipoxantina/ aminopterina/ timidina, que se utiliza para seleccionar las clulas hibridas durante el proceso de anticuerpos monoclonales destruyendo las clulas de mieloma deficientes de TK

(Timidina Quinasa) o aquellas deficientes de HGPRT (Hipoxantina Guanina Fosforibosil Transferasa). Las clulas de mioloma carecen de la enzima HGPRT o de TK durante este proceso y a raz de ello se cultivan en este medio pues estas enzimas sintetizan purinas utilizando como fuente precursora a la hipoxantina. La ausencia de estas enzimas no perjudica el crecimiento de estas clulas de mieloma ya que en ausencia de la enzima utilizan un camino metablico alternativo para sintetizar purinas. Sin embargo, la presencia de aminopterina en el medio HAT anula la posibilidad de sobrevida y hay una total dependencia del compuesto (HGPRT o TK) (Garca, 2011).

PRODUCCIN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES DE ORIGEN MRIDO (DE RATONES)

INMUNIZACIN En teora, es factible producir anticuerpos monoclonales especficos para cualquier antgeno capaz de ser reconocido por los linfocitos B. Para la inmunizacin es conveniente el uso de preparaciones puras de antgeno en las cuales el peligro de competencia antignica, que pudiese desviar la respuesta inmune humoral hacia una molcula irrelevante, no existe. Pero en muchos casos el antgeno de inters se encuentra en una molcula de la superficie celular difcil de aislar, lo que obliga a la utilizacin de clulas Completas o extractos de membranas para la inmunizacin. En otros casos, por ejemplo cuando se trata de drogas o molculas pequeas, stas deben ser conjugadas a portadores, y son estos conjugados las preparaciones usadas para la inmunizacin (Montao y Romano, 1995). A menos que se trate de molculas poco inmunognicas, la inmunizacin se realiza rutinariamente mediante la inyeccin del antgeno por va subcutnea o intraperitoneal y en la forma de una emulsin. Ello permite la liberacin lenta y constante del antgeno, asegurando una estimulacin permanente. Esta inmunizacin se efecta en mltiples ocasiones, normalmente en intervalos de dos semanas, para asegurar una buena estimulacin y amplificacin de los clones de linfocitos B especficos para el antgeno de inters. La ltima estimulacin usualmente se hace tres das antes de la fusin y por va intravenosa para as obtener, en el bazo del animal inmunizado, una mxima respuesta y una poblacin de clulas respondientes en fase de divisin (Montao y Romano, 1995).

FUSIN Luego de culminado el protocolo de inmunizacin y que se tiene la certeza de que el mismo ha sido efectivo, el animal experimental es sacrificado y se le extrae el bazo. Los linfocitos B, bien como parte del total de la suspensin de clulas esplnicas o previamente purificadas, se mezclan con un nmero apropiado de clulas de mieloma que se mantienen creciendo exponencialmente in vitro. Lo que sigue a continuacin es el proceso de fusin en s, el cual debe realizarse a 37 y consiste en aadir a la mezcla de clulas un pequeo volumen de un agente fusgeno denominado polietilenglicol (PEG), mezclando suavemente por espacio de uno a tres minutos. En estas condiciones, las membranas de algunas de las clulas se fusionan, unindose los citoplasmas y formndose los hibridomas. El PEG luego se elimina por lavado y las clulas fusionadas se siembran en microplacas de cultivo (Montao y Romano, 1995). El proceso de fusin es muy ineficiente: en general, menos del 1% de las clulas terminan fusionndose. Esto trae como consecuencia que se requiera de un nmero de clulas relativamente alto para el proceso de fusin (un bazo de ratn contiene del orden de 101 clulas). En algunas circunstancias es posible enriquecer la poblacin de linfocitos B especficos para el antgeno, lo cual se logra asociando el antgeno a una fase slida y utilizando procedimientos de aislamiento como separacin inmunomagntica o roseteo con glbulos rojos recubiertos con el antgeno de inters. De tenerse el equipo necesario, en los casos en los que se dispone de pocas clulas, es preferible realizar la fusin mediante el proceso denominado electrofusin, el cual resulta mucho ms eficiente (Montao y Romano, 1995).

SELECCIN Dado que la fusin es un evento completamente al azar, la mezcla de clulas obtenidas luego de la misma estar formada por esplenocitos, clulas de mieloma, esplenocitos fusionados entre s, clulas de mieloma fusionadas entre s y adems por los hibridomas linfocito B-clula de mieloma. En cultivo, los esplenocitos no fusionados mueren con el tiempo por ser clulas normales. Sin embargo, las mielomatosas al ser clulas tumorales pueden vivir indefinidamente y como se replican con mayor rapidez que los hibridomas, creceran en forma predominante, "ahogando" al resto de las clulas (Montao y Romano, 1995). De lo anterior se desprende la necesidad de disponer de un mecanismo de seleccin que permita solamente el crecimiento de los hibridomas, eliminando a

las clulas mielomatosas. Esto se obtiene con el llamado medio HAT y el fundamento en que se basa es el siguiente: Las clulas eucariotas disponen de dos vas para la sntesis del ADN. Una es la llamada "va principal o de novo" y la otra es la "va de rescate", en la cual se requiere la enzima hipoxantina-guaninafosforibosil-transferasa (HGPRT). La clave de la seleccin est en que las clulas de mieloma que se utilizan para la fusin son deficientes en la enzima HGPRT, es decir, que sintetizan su ADN nicamente por la va principal. Esta va principal puede ser bloqueada por la adicin de la droga aminopterina. De manera que, si al medio de cultivo en el que crece el producto de fusin se aade aminopterina, las clulas mielomatosas no fusionadas o fusionadas entre s morirn, ya que sern incapaces de sintetizar ADN. Si consideramos ahora las clulas hbridas, stas tienen la capacidad de crecimiento tumoral heredada de las clulas mielomatosas, pero tambin tienen el gen que codifica la enzima HGPRT, heredado de los linfocitos normales, pudiendo sintetizar ADN por la va de rescate. De esta forma, en presencia de Hipoxantina-Aminopterina-Timidina (HAT) las nicas clulas con capacidad de crecimiento, "seleccionadas" gracias a un fenmeno de complementacin gnica, son las hbridas (Montao y Romano, 1995). Existe an otro evento de seleccin, el cual est destinado a identificar y aislar, del total de hbridos producidos, a los hibridomas productores de los anticuerpos de inters. La identificacin se logra con un mtodo apropiado para la evaluacin de los sobrenadantes de cultivo y el aislamiento se realiza mediante el clonamiento (Montao y Romano, 1995).

EVALUACIN DE LOS SOBRENADANTES DE CULTIVO Luego de unos siete a diez das post-fusin, en cada pozo de cultivo habr varios hbridos creciendo, cada uno produciendo un anticuerpo distinto y ser necesario aislarlos para obtener anticuerpos de una sola especificidad. Para determinar en cules cultivos se encuentran los anticuerpos con la especificidad deseada, y por ende las clulas productoras de los mismos, se realizan ensayos de evaluacin o "screening" en los sobrenadantes de cultivo. La forma que toman estos ensayos de identificacin es variada y depende en buena medida del antgeno emulado. Las ms usadas son pruebas tipo ELISA, "dot-blot" o radioinmunoensayo cuando se trata de antgenos solubles, y pruebas de inmunofluorescencia, inmunohistoqumica o de aglutinacin si el antgeno est asociado a la membrana celular. En todo caso, embarcarse en la tarea de producir anticuerpos monoclonales de una especificidad dada sin antes tener un procedimiento de prueba o screening para dicho anticuerpo que sea rpido, sencillo, especfico, sensible y aplicable a un nmero elevado de muestras, es una tarea destinada al fracaso (Montao y Romano, 1995).

CLONAMIENTO Para obtener una preparacin monoclonal de anticuerpos, es necesario aislar clones de clulas, en los que cada una es rplica exacta de la otra. El procedimiento mediante el cual se obtienen muchas clulas idnticas por replicacin a partir de una sola se denomina clonamiento. El mtodo ms comn consiste en sembrar suspensiones celulares a gran dilucin de manera que en un volumen dado pueda haber en promedio de ninguna a, es que las clulas no crecen bien cuando estn aisladas. La manera usual de resolver este problema es utilizar clulas nodrizas, generalmente fibroblastos o macrfagos, que proveen la ayuda necesaria para el crecimiento a baja densidad. Otro procedimiento menos empleado para el aislamiento de los hibridomas es la siembra en medios semislidos de cultivo, la posterior toma de las colonias y su siembra en medio lquido (Montao y Romano, 1995).

ESCALAMIENTO DE LA PRODUCCIN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES Una vez que se han superado todos los inconvenientes y se ha logrado obtener el hibridoma productor del anticuerpo deseado, el prximo paso es su cultivo a escala para obtener el anticuerpo en las cantidades deseadas. La produccin a mediana escala de los anticuerpos se puede efectuar inoculando el hibridoma correspondiente en la cavidad peritoneal de ratones singnicos a la lnea de mieloma utilizada para la fusin y hacindolo crecer como un tumor mielomatoso, obtenindose el anticuerpo en forma de lquido asctico. A otra escala de produccin, el cultivo se puede hacer en botellas rotatorias, en fibras huecas o en fermentadores especiales diseados para tal fin. Para aplicaciones clnicas el anticuerpo debe estar caracterizado tanto qumica como funcionalmente y con un alto grado de pureza. Otro aspecto de importancia para la produccin es et almacenaje de los hibridomas. Esto se logra mediante congelamiento en tanques especiales de nitrgeno lquido, en los cuales las clulas son congeladas cuando se encuentran creciendo en fase exponencial y con un alto ponerle de viabilidad (Montao y Romano, 1995) (En la figura 2 se muestran los pasos necesarios para el desarrollo de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales de ratn).

CONCLUSION

Los anticuerpos monoclonales han producido desde su descubrimiento una revolucin de gran calado en el diagnstico y el tratamiento de numerosas enfermedades. La utilizacin de anticuerpos monoclonales humanizados y humanos ha mejorado notablemente su tolerancia. La tecnologa actual de fabricacin de estos anticuerpos permite nuevos diseos que pueden ampliar sus posibles aplicaciones en medicina.

BIBLIOGRAFIA

Montao, F. y Romano E. (1995). Anticuerpos Monoclonales y su Aplicacin en Hematologa. Consulta Online (http://www.interciencia.org.ve) Garca, A. (2011). Anticuerpos monoclonales: Aspectos bsicos. Neurologa, 26 (05). Consulta Online: (http://zl.elsevier.es/es/revista/neurologia-295) Delves, P.; Martin, S.; Burton, D. y Roitt, I. (2008). Inmunologa: Fundamentos. Argentina: Editorial Medica Panamericana. Sociedad Espaola de Ciencias Hortcolas (S.E.C.H.). (1999). Diccionario de Ciencias Hortcolas. Consulta Online: (http://books.google.es/books?id=oW6dbRgw62gC&hl=es) Grande, L. (1999). El Sueo de lo Posible: Biotica y Terapia Gnica. Madrid: Universidad Pontifica Comillas

Fig. 1: Disposicion global simplificada de la estructura del anticuerpo

Fig. 2: Resumen del Proceso de Produccin de un Anticuerpo Monoclonal Mrido