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ENZIMAS

Fundamentos y correlacin clnica de la cintica enzimtica

Laboratorio de Patologa Clnica Vallarta


ANALISIS CLINICOS Y MICROBIOLOGICOS Q.F.B. Hctor Alonso Mora Garca

OBJETIVOS DE LA PLATICA

ENZIMAS

1. 2. 3. 4.

Conocer los fundamentos de la cintica enzimtica. Conocer su distribucin a nivel celular y tisular. Conocer los mecanismos bsicos de liberacin, difusin y eliminacin de enzimas. Aumentar los niveles de correlacin entre la clnica y el laboratorio.

ENZIMOLOGIA
En 1926, Sumner cristaliz la ureasa. Despus, se observ que la actividad enzimtica era un reflejo de la integridad de los diferentes rganos. De aqu en adelante naci la enzimologa clnica. Se tipific la capacidadad informativa de diferentes enzimas para el diagnstico y pronstico de numerosos sndromes. Se inician estudios moleculares para explicar los mecanismos de difusin y liberacin de enzimas hacia los compartimentos sanguneos y urinarios.

A NIVEL MOLECULAR
Caractersticas
SITIO ACTIVO

ENZIMAS

Macromolculas proteicas Arquitectura globular Estructura tridimensional Cuentan con sitios activos Tamao molecular variable

ENZIMAS
DIMENSION MOLECULAR
1`000,000 300,000 200,000 180,000 140,000 100,000 90,000 80,000 50,000 40,000 140,000

L I P A S A

A M I L A S A

F O S F

LDH

CK

TGO

A C I D A

F O S F . A L C A L I N A

TGP

5 N U C L E O T I D A S A

82,000

GGT GGT

GGT

MASA MOLECULAR DE LAS PRINCIPALES ENZIMAS EN QUIMICA CLINICA

ENZIMAS
DIMENSION MOLECULAR

PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS


Condicionamientos en relacin a su tamao molecular

Difusin de los tejidos a la sangre Eliminacin por las diferentes vas de excrecin Amilasa y Lipasa atraviesan fcilmente el glomrulo renal

Otras enzimas como la GGT se asocian a apoprotenas o lipoprotenas de membranas y circulan bajo 3 formas distintas en cuanto a tamao molecular se refiere.

ENZIMAS
FUNCION

CATALISIS BIOLOGICA.

Aumentan considerablemente la velocidad de las reacciones qumicas Una molcula enzimtica a temperatura ambiente, transforma de 10 a 1000 molculas de sustrato por segundo. La disposicin espacial del sitio activo le permite reconocer un solo sustrato Lo cual se aprovecha para medir especficamente actividades enzimticas

ISOENZIMAS y FORMAS MULTIPLES


LA ESPECIFICIDAD ENZIMATICA, No es absoluta en todos los casos

Protenas enzimticas diferentes:


- Provenientes de diferentes especies, - De un mismo individuo, pero de tejidos o compartimentos celulares distintos ...

Pueden catalizar una misma reaccin qumica


Concepto de ISOENZIMA LDH: 1, 2, 3, 4, 5 CK: MM, MB, BB

ISOENZIMAS y FORMAS MULTIPLES


NOMENCLATURA > UNION INTERNACIONAL DE BIOQUIMICA

Formas mltiples de enzimas:

Para todas las protenas que catalizan la misma reaccin qumica en una misma especie. - Ejemplo: Formas circulantes de la GGT

Isoenzimas:

Para las formas mltiples que provienen de una modificacin gentica de la estructura primaria de la protena y no de una modificacin ulterior de una misma secuencia. - Ejemplo: Isoenzimas de la CK y LDH

De aqu se derivan 2 tipos de aplicaciones:


1. 2. Anlisis de isoenzimas como marcadores genticos Anlisis de isoenzimas como marcadores muy especficos de dao a nivel tisular, celular o sub-celular.

LAS ENZIMAS A NIVEL CELULAR


LOCALIZACION Y SIGNIFICADO CLINICO DE SU LIBERACION
Membrana citoplasmtica Fosfatasa alcalina 5 nucleotidasa GGT Citoplasma ALAT ASAT LDH CK Mitocondrias ASAT CK Lisosomas Fosfatasa cida

SIGNIFICADO CLINICO
Mitocondriales Indica fenmenos patolgicos ms severos que las citoplsmicas Membrana Estn ancladas slido y profundo en la membrana por lo que se liberan irregularmente en funcin de un dao.

Microsomas (Retculo endoplsmico) GGT

LAS ENZIMAS A NIVEL TISULAR


ESPECIFICIDAD
Los tejidos estn equipados de enzimas en relacin con su funcin, en gran parte determinada por la naturaleza de las reacciones qumicas que en el se producen.

Especificidad:
Las enzimas son marcadores tisulares no absolutos Se encuentran en cantidades comparables en diferentes tejidos An as, hay algunas enzimas que son buenos marcadores tisulares: - ALAT (TGP): marcador heptico - CK: marcador musculo equeltico y cardico Las isoenzimas compensan la falta de especificidad absoluta: - LDH: miocardio - CK-MB: miocardio - CK-MM: msculo esqueltico

LAS ENZIMAS A NIVEL TISULAR


SENSIBILIDAD
Es la actividad relativa de las enzimas en los tejidos en relacin con el suero.
Suero Normal ASAT (TGO) ALAT (TGP) LDH CK 1 Msculo esqueltico X 5,000 X 300 X 700 X 50,000

Eritrocitos X 15 X7 X 300 X <1

Hgado X 7,000 X 3,000 X 1,500 X <10

Corazn X 8,000 X 400 X 1,000 X 10,000

1 1 1

Estos gradientes de concentracin determinan la sensibilidad diagnstica de las enzimas sricas para demostrar un dao tisular especifico.

LIBERACION DE LAS ENZIMAS


Experimentalmente ( Wilkinson 1970- ) demostr una estrecha relacin entre la baja del estado energtico de la clula y la liberacin de enzimas por parte de la misma. Su experimento consisti en disminuir progresivamente la cantidad de ATP de un medio de cultivo que contena linfocitos, y midi paralelamente la liberacin de LDH por estos linfocitos:
Concentracin de ATP mmol/L LDH 2 ATP 60 Liberacin de LDH (%)

R E S U L T A D O S

40 1 20 0 1 2 3 4 Tiempo ( horas)

LIBERACION DE ENZIMAS
De 1976 1980 Friedel y Diederichs continuaron los experimentos de Wilkinson y obtuvieron excelentes y contundentes resultados:

1.

Para un nivel energtico intracelular normal,


La clula ocupa un volumen definido. Las bombas inicas ATP dependientes de las membranas determinan este volumen captando potasio y liberando calcio, sodio y agua. Las bombas inicas se alteran y la clula se hincha. La concentracin intracelular de calcio se eleva paralelamente a la hinchazn. El calcio activa los filamentos contrctiles situados en el lado interno de la membrana, formndose unas vesculas y hendiduras en la misma, que se conocen como mecanismo de poro. Este estado es reversible y se debe al sufrimiento celular. Las enzimas pueden salir de la clula por estos poros.

2.

Si el ATP intracelular disminuye,


3.

Cuando la clula se encuentra totalmente exenta de ATP,


La integridad de la membrana no se mantiene. Se establece un estado irreversible de necrosis celular. La clula vierte todo su contenido en el medio que la rodea.

LIBERACION DE ENZIMAS
Hiptesis de otros Autores
Con relacin al aumento del calcio intracelular:
Provoca una activacin de la Fosfolipasa A2 de membrana Transformacin de los fosfolpidos de membrana (lecitina) a lisolecitina Se produce una desorganizacin de membrana que afecta a la permeabilidad de esta y conduce a la liberacin de macromolculas enzimticas.
SUFRIMIENTO CELULAR MUERTE CELULAR

CELULA NORMAL

K K Ca

K K Ca

ATP
Ca

ATP
Ca

ATP = 0
Ca

K Ca

ENZIMAS
DIFUSION HACIA EL COMPARTIMENTO SANGUINEO UNA VEZ LIBERADAS LAS MACROMOLECULAS ENZIMATICAS Llegan a la circulacin utilizando diferentes vas Se enfrentan a un entorno celular variado
1. Tejido intersticial 2. Capilares sanguneos 3. Vasos linfticos

Proximidad entre clulas y capilares sanguneos variado Espesor de la membrana basal variado
ESTO CONDICIONA, la difusin de enzimas desde los tejidos hacia los vasos sanguneos
TEJIDO INTERSTICIAL ARTERIAL CAPILAR SANGUINEO

VASO LINFATICO VENOSO

ENZIMAS
DIFUSION HACIA EL COMPARTIMENTO SANGUINEO

TIPOS DE DIFUSION ENZIMATICA


Ilustracin Caractersticas Forma de difusin Ejemplo
Membrana basal muy permeable Clulas muy prximas a los capilares Membrana basal semi-permeable Clulas ms alejadas de los capilare Membrana basal gruesa e impermeable a las macromolculas Clulas alejadas de los capilares Directamente en la sangre Hgado Bazo

Paso parcial o total de enzimas a los conductos linfticos

Corazn Pncreas Prstata

Paso obligatorio por la linfa

Msculos esquelticos

ENZIMAS
DIFUSION HACIA EL COMPARTIMENTO SANGUINEO

CORRELACIONES
1. Una hipoxia experimental sobre un hgado aislado y perfundido, origina una elevacin enzimtica srica desde el sptimo minuto. En las patologas cardicas, pancreticas y prostticas, transcurren varias horas entre el dao celular y las elevaciones sricas enzimticas. Las elevaciones enzimticasque acompaan el esfuerzo muscular, pueden prolongarse en iniciar hasta varios das despus de haber realizado el esfuerzo.

2.

3.

ELIMINACION DE ENZIMAS
A TRAVES DE HIGADO, RION, INTESTINO Y MACROFAGOS DEL SRE RANGOS DE VIDA MEDIA ENZIMATICA
F.ALC.

7 das 6 das 5 das 4 das 3 das


TGP F.ACIDA LDH1

GGT

2 das
AMIL LIP CK-MB CK TGO LDH5

1 da

ENZIMAS
LIBERACION, DIFUSION y ELIMINACION ACTIVIDAD ENZIMATICA MEDIDA EN SANGRE

1. 2. 3.

Liberacin celular Distribucin y difusin a travs de compartimentos anatmicos Eliminacin


CELULA SIN CONTACTO DIRECTO CON LA SANGRE CELULA EN CONTACTO DIRECTO CON LA SANGRE

LIBERACION CELULAR

DISTRIBUCION Y DIFUSION
TEJIDO INTERSTICIAL

SANGRE
LINFA

ELIMINACION
ORGANOS DE ELIMINACION

ORINA

MEDIDAS SERICAS REPETIDAS A INTERVALOS FIJOS Y ADECUADOS, PERMITEN APRECIAR LA EVOLUCUION DE ENTIDADES CLINICAS DIVERSAS

ENZIMAS SERICAS y PANCREATITIS AGUDA


PANCREATITIS CRONICA NEOPLASIAS PANCREATICAS PANCREATITIS AGUDA
ELEVACIONES ENZIMATICAS INCONSTANTES Y POCO SIGNIFICATIVAS ELEVACIONES ENZIMATICAS FRANCAS Y SIGNIFICATIVAS

MECANISMO FISIOPATOLOGICO
AUTOLISIS DEL PARENQUIMA DEL PANCREAS EXOCR. AMILASA LIPASA ORINA

TEJIDO INTERSTICIAL
OTROS ORGANOS

VASOS LINFATICOS

ATRAVIESAN GLOMERULO RENAL

CIRCULACION SANGUINEA

ENZIMAS SERICAS y PANCREATITIS AGUDA


CINETICA Y CAPACIDAD INFORMATIVA CUADRO CLASICO

ENZIMAS SERICAS
ELEVACION INICIAL NIVEL MAXIMO

TIEMPOS
4 6 HRS DESPUES DEL INICIO DE PANCREATITIS AGUDA ENTRE LAS 20 30 HRS

NORMALIZACION

ENTRE EL 2do. 8vo. Da

La hiperamilasuria se retrasa 5 6 horas respecto a las variaciones sricas Puede persistir varios das, Incluso despus de la normalizacin de la Alfa-amilasemia.

ENZIMAS SERICAS y PANCREATITIS AGUDA


SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD EFICACIA Conclusiones del Dr. Brault (Francia) del seguimiento de 7,000 pacientes
SENSIBILIDAD DIAGNOSTICA AMILASEMIA LIPASEMIA ISOAMILASA PANCREATICA RELACION DEL ACLARAMIENTO DE AMILASA / CREATININA ESPECIFICIDAD DIAGNOSTICA EFICACIA GLOBAL

67% 67% 75%

85% 88% 85%

78% 80% 81%

77%

67%

71%

En la pancreatitis aguda, el inters de las variaciones enzimticas reside en el diagnstico diferencial frente a un abdomen agudo, pero no es determinante para el pronstico.

ENZIMAS SERICA Y EL HIGADO


EL HIGADO Es el rgano ms rico en enzimas 2 tercios de sus protenas celulares son enzimas que catalizan cerca de 1000 reacciones qumicas diferentes. Estructura anatmica muy particular Corte esquemtico de un sinusoide heptico

Estn desprovistos de pared propia


Canalculo biliar Hepatocitos Hacia la vena centrolobulillar microvellosidades mezcla de sangre portal y sangre perifrica

Las enzimas liberadas por los hepatocitos se vierten directamente a la sangre, sin pasar al compartimento intersticial ni al linftico. La ultraestructura en las microvellosidades de los hepatocitos multiplica la superficie de contacto y de intercambio con la bilis y la sangre (alrededor de 600m2).

ENZIMAS HEPATICAS
SENSIBILIDAD EN LA DETECCION DE ALTERACIONES HEPATICAS

Schmidt y col. Estudiaron la frecuencia relativa de las elevaciones de actividades enzimticas hepticas en un grupo de 13,000 pacientes portadores de diversas hepatopatas, encontrando lo siguiente:
100%
95% GGT 83% 71% TGP 60% FALC 34% LDH

50%

TGO

La GGT es el marcador ms sensible de disfuncin heptica. Si la GGT es normal, la probabilidad de tener un higado sano es muy alta.

ENZIMAS HEPATICAS
DIAGNOSTICO DE HEPATITIS VIRALES AGUDAS
Elevacin de enzimas citoplasmticas: aminotransferasas Elevacin de enzimas de membrana: - 5nucleotidasa - GGT - Fosfatasa alcalina Valores normales x 15 a 150 TGP > TGO Poca relacin con la gravedad del dao. Valores normales x 2 a 4 En relacin con la colestasis heptica.

Las enzimas citoplasmticas tienden a normalizarse en 3 a 5 semanas En la fase terminal de formas raras de hepatitis fulminantes, las aminotransferasas descienden bruscamente, de forma inmediata a la necrosis masiva del hgado. La prolongacin de niveles elevados de aminotransferasas por ms de 5 semanas, indican un paso a la cronicidad.

ENZIMAS HEPATICAS
HEPATITIS CRONICAS: A) PERSISTENTES B) AGRESIVAS

ETIOLOGIA: MEDICAMENTOSA, AUTOINMUNE y VIRAL HEPATITIS POR VIRUS A : Generalmente no evolucionan a la cronicidad HEPATITIS POR VIRUS B : Aprox. un 10% evoluciona a la cronicidad HEPATITIS POR VIRUS C : Aprox. un 20% evoluciona a la cronicidad DESPUES DE UNA HEPATITIS VIRAL AGUDA: Para descartar el paso a la cronicidad son necesarios chequeos trimestrales de aminotransferasas por 9 meses en Hepatitis B y por ms de un ao en Hepatitis C. - 3 resultados normales consecutivos excluyen esta eventualidad HEPATITIS CRONICA PERSISTENTE TGO 2 a 5 veces los valores TGP normales TGO / TGP Gralmente prximo a 1 GGT Elevacin moderada Fosfatasa alcalina Normal HEPATITIS CRONICA AGRESIVA Hasta 10 veces los valores normales Muy frec. superior a 1 Elevacin ms franca En general normal

ENZIMAS HEPATICAS
DIAGNOSTICO DE COLESTASIS
Elevacin de enzimas de membrana: - GGT - Fosfatasa alcalina - 5nucleotidasa Precede a la ictericia

Colestasisis intraheptica: 5Nucleotidasa x 2 a 3 veces Colestasisis extraheptica: 5Nucleotidasa x 5 a 7 veces

Fosfatasa alcalina: Se aumenta la sntesis por la colestasis. Se aumenta tambin en muchas otras circunstancias fisiolgicas y fisiopatolgicas. es un marcador sensible pero poco especfico GGT: Se aumenta la sntesis y se libera ms fcilmente de membrana 5nucleotidasa: Es un excelente marcador de colestasis. La normalizacin de niveles inicia inmediatamente despues de resolverse el cuadro.

ENZIMAS HEPATICAS y ALCOHOL


En el diagnstico de etilismo crnico la GGT tiene una sensibilidad del 70 85% y una especificidad del 88%.
ALCOHOL ETILICO
GGT U/L 150 Induce hipertrofia y toxicidad del retculo endoplsmico del hepatocito La Fosfatasa alcalina no es inducida por el alcohol.

La GGT se usa en el control de la abstinencia alcoholica En caso de cirrosis la vuelta a la normalidad es ms lenta

100

50 36

lmite superior de valores normales

semanas 1 2 3 4 5 6 7 8 9

ENZIMAS HEPATICAS
Elevacin moderada de transaminasas: TGO/TGP > 1 ORIGEN ETILICO: GGT elevada ORIGEN BILIAR: Fosfatasa alcalina y 5nucleotidasa

CIRROSIS

METASTASIS La 5nucleotidasa es muy eficaz para este diagnstico HEPATICAS

La localizacin celular de las enzimas que se elevan en suero, permiten dilucidar la naturaleza de la hepatopata

ENZIMAS SERICAS y CANCER


Variaciones enzimticas cualitativas CANCER Aparicin de enzimas nuevas o fetoplacentarias Variaciones cuantitativas de la actividad de las enzimas clsicas
MECANISMOS ENZIMAS LIBERADAS LDH Fosfohexosa isomerasa Fosfatasa cida TIPO DE CANCER 3070 % de los cnceres segn localizacin y estado clnico Cncer de prstata

Actividad metablica Masa tisular y/o sufrimiento del tejido peritumoral Retrodiferenciaciones o desdiferenciaciones con aparicin de formas fetales embrionarias o placentarias

FAL Isoenzima Reagan FAL Isoenzima de Nagao CK-BB

Cncer de Pulmn, mama, ovario y colon Cncer de pncreas Cncer de prstata

ENZIMAS SERICAS y CANCER


SENSIBILIDAD ESTADIO OCULTO DEL CANCER PRIMITIVO Muy raramente se producen variaciones enzimticas significativas. UN TUMOR DE APROXIMADAMENTE 109 CELULAS Equivalente al tamao de un guisante de 1 gr., es lo que se necesita para que aparezcan en suero actividades enzimticas anormales.

UTILIDAD REAL DE LAS ENZIMAS EN CANCEROLOGIA


Son un elemento complementario en el diagnstico diferencial Son testigos de la evolucin y proliferacin cancerosa Identifican metstasis Control del tratamiento con antineoplsicos La fosfatasa cida aumenta paralelamente al desarrollo del tumor, a su vascularizacin y a su proliferacin metastsica.
SIN METASTASIS 20 25 % de los casos 50 65 % de los casos CON METASTASIS 70 80 % de los casos 85 95 % de los casos

EN EL CANCER DE PROSTATA

CARCINOMA PROSTATICO Fosfatasa cida total: elevada Fosf. Ac. Fracc-prost.: elevada

ENZIMAS SERICAS y CANCER


METASTASIS HEPATICAS : METASTASIS OSEAS : Fosfatasa alcalina Fosfatasa alcalina GGT 5nucleotidasa Fosfatasa cida

EN EL CONTROL DEL TRATAMIENTO ANTICANCEROSO


Fosfatasa alcalina total : Control de la respuesta al tratamiento de tumores seos tipo osteosarcoma. Fosfatasa cida : Control del tratamiento del cncer prosttico. LDH : Control del tratamiento el cncer de testculo. U/L 1500 1000 500 250
CIRUGIA

das
1 2 3 4 5 6 14

ENZIMAS SERICAS
COMO SE CUANTIFICAN EN EL LABORATORIO
ENZIMAS TRANSFORMACION DE SUSTRATO

P
COENZIMAS SUERO

.
NADP, NADPH
CONSUMO DE COENZIMAS

SUSTRATO COENZIMAS

ENZIMAS

.
RESULTADOS EN U/L

SENSOR OPTICO AUTOMATICO CON TEMP. CONTROLADA

PROCESADOR
CONVERSION DE SEALES ANALOGICAS EN LOGICAS

CUANTIFICA LA EXTINCION DE COENZIMAS

A INTERVALOS FIJOS DE TIEMPO

La extincin coenzimtica es directamente proporcional a la actividad enzimtica. Las lecturas en los intervalos de tiempo que se realizan no deben tener diferencias mayores a 2DS. La temperatura de reaacin debe ser perfectamente controlada, ya que las actividades enzimticas varan con la temperatura.

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