Tcnica histolgica

Dr. Gabriel Magarios Definicin La tcnica histolgica es una serie secuencial de pasos a travs de los cuales una muestra de tejido llega a transformarse en delgados cortes coloreados capaces de ser observados al microscopio. Sinopsis general Paso Obtencin Objetivos Medios usuales

- Proveer el material para su - B i o p s i a estudio al microscopio - Reseccin quirrgica - Autopsia - Preservar el material - Evitar la autlisis - Eliminar los microorganismos - Formol al 10 % - Bouin - Glutaraldehdo

Fijacin

Inclusin

- Embeber el material en un medio - Parafina fcil de cortar en fetas muy - Acrlicos delgadas - Resinas Epoxi - Lograr lminas muy delgadas que - Micrtomo rotatorio sean atravesadas por la luz - M. de deslizamiento - Ultramicrtomo - Visualizar los tejidos - Hematoxilina - e o s i n a - Identificar molculas en ellos - Tricrmicos (Histoqumica) - Histoqumica - Preservar el corte, mantenindolo - Blsamo del C a n a d aislado del aire y deshidratado - Medios plsticos

Corte

Coloracin

Montaje

Pasos de la tcnica histolgica Obtencin Consiste en la provisin del material que se desea estudiar por medio del microscopio. El mtodo seleccionado debe ser el adecuado para cada tipo de material. En todos los casos el instrumental con el cual se seccionan los tejidos debe estar muy afilado para evitar aplastar sus elementos, as como se debe evitar cualquier otro tipo de maltrato en su manipulacin. Los principales mtodos empleados son: la biopsia, la reseccin quirrgica y la autopsia.

- La biopsia consiste en la extraccin de pequeos fragmentos de tejido de un organismo vivo. Este procedimiento puede ser realizado de muy diversas formas, consideraremos algunas: - biopsia incisional : se realiza seccionando con instrumentos cortantes como el bistur. - biopsia por punch : el punch es un instrumento filoso con forma de sacabocados que se utiliza para tomar biopsias de piel. - biopsia por puncin : se realiza con agujas de biopsia y recientemente tambin con agujas del tipo intramuscular (microbiopsia). - biopsia endoscpica: se hace a travs de endoscopios, que son instrumentos flexibles que permiten la observacin de algunas cavidades internas del organismo. - La reseccin quirrgica consiste en la extirpacin de rganos completos o de grandes partes de los mismos, a travs de un procedimiento quirrgico. - La autopsia o necropsia es el examen de los rganos luego de la muerte, generalmente con el objetivo de determinar las causas de la misma. Cualquiera sea el procedimiento empleado para la obtencin, el material que resulta del mismo debe ser inmediatamente fijado o congelado para evitar los procesos de autodestruccin de las clulas conocidos como autlisis. Fijacin La fijacin es en esencia un mtodo para la preservacin de la morfologa y la composicin qumica de las clulas y los tejidos. Consiste en producir la muerte de las clulas, de manera tal que las estructuras que posean stas en el estado viviente se conserven con un mnimo de modificaciones, a lo largo del tiempo y de los subsiguientes pasos de la tcnica. Asimismo algunos mtodos tratan de conservar intacta su composicin qumica. La fijacin debe realizarse inmediatamente de extraer las clulas del organismo, para evitar las lesiones agnicas ocasionadas por la anoxia, que inicialmente producen cambios osmticos y luego alteraciones estructurales y bioqumicas ms profundas, fenmenos conocidos en conjunto como autlisis. Por el mismo motivo los fijadores deben actuar sobre fragmentos relativamente pequeos de tejidos (como regla general menos de 1 cm cbico), para que la difusin del fijador desde las superficies hasta la parte central del bloque tisular se haga en un tiempo reducido. Propiedades de los fijadores: - Producen una rpida muerte celular, evitando la autlisis - Preservan la morfologa celular y tisular - Preservan la composicin qumica - Penetran a los tejidos con relativa rapidez - Facilitan la coloracin posterior - Inhiben el crecimiento microbiano y por lo tanto la putrefaccin - Aumentan la consistencia de los tejidos - Algunos de ellos colorean sustancias de los tejidos

- Efectos indeseables de algunos fijadores: - Retraen los tejidos - Precipitan en forma de cristales - Endurecen demasiado las muestras - Poseen olor desagradable e irritan la piel y las mucosas - Producen alteraciones importantes a nivel molecular - Producen alteraciones importantes a nivel ultraestructural La eleccin del fijador adecuado est dictada por el propsito perseguido y para ello deben tenerse en cuenta las propiedades y los efectos indeseables enumerados arriba, que aparecen en mayor o menor medida en cada caso. Clasificacin general de los fijadores - Fsicos - Calor - Desecacin - Microondas - Alcoholes - Metanol - Etanol - Formaldehdo - Glutaraldehdo - Actico - Pcrico - Osmico - Bicromato de p o t a s i o - Bicloruro de mercurio - Alcohol etlico + Acido a c t i c o - Acido pcrico + Formol + Acido a c t i c o - Bicromato de potasio + Bicloruro de mercurio + Acido a c t i c o - Formaldehdo + Glutaraldehdo

- Qumicos simples

- Aldehdos

- Acidos

- Sales

- Mezclas de qumicos

- Carnoy

- Bouin

- Zenker

- FaGlu

Tambin debe considerarse: - Su versatilidad para fijar distintos tipos de tejidos - La facilidad para implementar su empleo - Su estabilidad a temperatura ambiente - Su costo comercial Hoy en da el fijador histolgico universal de mayor versatilidad frente a los diferentes tejidos, de fcil utilizacin y econmico, que cumple mejor con la ecuacin entre propiedades y efectos indeseables, es el formol diludo al 10 %, especialmente si se lo prepara en una solucin a pH neutro.

Revisin general sobre los diferentes tipos de fijadores Los mtodos fsicos empleados para la fijacin son el calor, la desecacin y el microondeado, aunque el fro se utiliza en ocasiones como alternativa a la fijacin. El calor produce artificios de retraccin violentos y desnaturaliza severamente la estructura proteica, por lo cual casi no se lo emplea. La desecacin se emplea para fijar extendidos celulares realizados directamente sobre los portaobjetos a partir de material fresco (por ejemplo una gota de sangre). El microondeado, recientemente incorporado como mtodo de fijacin, produce agitacin molecular a nivel de los dipolos que es ms o menos homognea en todo el espesor de piezas de considerable tamao. Su efecto se produce por una combinacin del calor generado en el tejido y la precipitacin in situ de las protenas por ruptura de los puentes de hidrgeno. Los mtodos de congelacin preservan la composicin qumica pero no son en sentido estricto mtodos de fijacin, aunque en algunos casos pueden utilizarse para reemplazarlos. La metodologa ideal para la congelacin comienza con la introduccin de pequeas piezas del tejido en un bao de isopentano, refrigerado por nitrgeno lquido a una temperatura de -160 a 180 C. No causa retraccin del tejido; la preservacin es homognea en todo el espesor de la pieza; no hay extraccin de sustancias solubles; la composicin qumica se mantiene prcticamente sin cambios y la estructura, generalmente, se conserva con las muy escasas modificaciones producidas por los cristales de hielo, que son menores cuanto ms rpida haya sido la congelacin. La rapidez del congelamiento permite tambin sorprender a las clulas en momentos crticos de su funcin, como en la exocitosis de vesculas secretoras. Una de las mayores utilidades del sistema de congelacin es poder obtener rpidamente cortes histolgicos durante una ciruga para realizar un diagnstico intraoperatorio, mientras el paciente permanece an anestesiado. En estas biopsias por congelacin, donde la rapidez del diagnstico histopatolgico es esencial para determinar la conducta quirrgica, se utilizan por lo general micrtomos de congelacin refrigerados por la expansin de dixido de carbono lquido. La calidad de los preparados es apenas aceptable, pero suficiente

para los fines diagnsticos. Algunos fijadores como el formol, el glutaraldehdo, el bicromato y el bicloruro de mercurio actan formando puentes cruzados entre las protenas y dando lugar a fuertes uniones entre molculas proteicas, siendo llamados por ello fijadores generadores de puentes cruzados. En contraposicin los alcoholes, la acetona y el cido actico precipitan las protenas en su lugar por alteracin de los puentes de hidrgeno de las mismas sin daar su estructura primaria y por ello se los denomina fijadores coagulativos. Para el estudio de la cromatina y los cromosomas se emplean frecuentemente los fijadores cidos (generalmente con cido actico), y para el estudio de la actividad enzimtica se emplean la acetona, el glutaraldehdo o al formaldehdo, que preservan muchos sistemas enzimticos. Las mezclas se utilizan para aprovechar las cualidades ms sobresalientes de varios fijadores a un mismo tiempo. Por ejemplo el Carnoy combina al etanol con el cido actico, ambos muy buenos fijadores para cromatina. El Bouin posee formol, fijador universal con gran poder de penetracin pero lento para actuar, con el cido actico de gran velocidad penetracin y muy buen fijador nuclear, ambos sumados al cido pcrico que acta principalmente a nivel citoplasmtico. Se lo emplea mucho en biopsias de mdula sea por ser adems un buen decalcificador y en biopsias testiculares por sus resultados empricos. Para microscopa electrnica se emplea la fijacin con glutaraldehdo, seguida con una posfijacin con tetrxido de osmio, en ambos casos controlando cuidadosamente la osmolaridad y pH de las soluciones fijadoras. El formol Con el nombre de formol puro se conoce la solucin al 40 % de formaldehdo en agua. El esta solucin se diluye al 10 % en agua o buffer (9 partes del solvente y 1 parte de formol puro) para su utilizacin, por lo que el formaldehdo en ella se encuentra al 4 %. El formaldehdo es bastante inestable en solucin degenerando en cido frmico, el cual es muy mal fijador. Para evitar que el cido frmico deteriore los tejidos se lo neutraliza con carbonato de calcio o con soluciones buffer, constituyendo el formol neutro en el primer caso y el formol buffereado en el segundo. La solucin de formol al 10 % tiene un extraordinario poder de penetracin a los tejidos, pudiendo fijarse con ella piezas relativamente grandes, pero su velocidad de penetracin y de fijacin son lentas, demorando para ello no menos de 8 horas y siendo lo ptimo entre 12 y 24 horas. El formaldehdo reacciona con los grupos amino, carboxilo e indol de las protenas, y produce entonces uniones de metileno no solo dentro de una misma protena sino que adems lo hace con otras molculas proteicas adyacentes (efecto conocido como cross-linking o formacin de puentes cruzados). Este fenmeno sigue ocurriendo a lo largo del tiempo y deteriora progresivamente la estructura molecular de los tejidos, en especial de las protenas, dificultando el acceso de los anticuerpos hacia sus epitopes blanco, fenmeno usualmente conocido como enmascaramiento antignico. Esto es reversible en un comienzo a travs de una corta digestin enzimtica de las protenas o con microondeado, que rompen parte de los puentes cruzados entre las protenas. Si la fijacin se prolonga a lo largo del tiempo ms all de las 36 horas comienzan los fenmenos de sobrefijacin que son progresivamente irreversibles. Por otra parte el

formaldehdo reacciona con los hidratos de carbono formando hemiacetales inestables que pueden ser eliminados por lavado prolongado. Esto puede explicar porqu los epitopes ricos en polisacridos son generalmente resistentes a la fijacin en formol.

Es importante recordar: - En caso de no saber cual es el fijador ideal para una determinada muestra de tejido, debe utilizarse formol. - Nunca debe emplearse el formol puro, sino diluido al 10 %. - El tiempo de fijacin debe oscilar entre 12 y 36 horas. - Siempre debe emplearse abundante fijador (unas 10 veces mayor volumen que la pieza a fijar). - El recipiente en el que se realice la fijacin debe tener boca ancha y debe ser rotulado inmediatamente. Inclusin Para la obtencin de cortes finos es un requisito indispensable que el tejido haya sido previamente endurecido: hasta un cierto punto, cuanto mayor sea la firmeza del tejido, tanto ms delgada resulta el corte histolgico. Con el fin de endurecer los tejidos existen dos mtodos principales: la congelacin o la inclusin. Para las tcnicas ms frecuentes se emplea el mtodo de inclusin. El procedimiento es lento pero los preparados son de gran calidad. El tejido se impregna en un material que le confiere una consistencia adecuada para el corte. Para los cortes que deben observarse con el microscopio ptico se usa casi exclusivamente la parafina. Dado que sta es una sustancia hidrofbica los tejidos fijados se deshidratan en alcoholes de concentracin creciente pasndolos despus por solventes intermediarios como el xileno, el benceno o el tolueno (conocidos como agentes aclarantes), y luego son colocados en una estufa con parafina fundida entre 56 y 60 C, dado que esta es slida a temperatura ambiente. Luego de impregnar al tejido, se deja solidificar a la parafina con el tejido includo, constituyendo los bloques o tacos histolgicos. En ocasiones el tejido se impregna con acrlicos de bajo peso molecular como el metilmetacrilato, lo que permite obtener cortes ms delgados, procedimiento conocido como microscopa ptica de alta resolucin. Para microscopa electrnica se incluye casi invariablemente en resinas epoxi, y los bloques resultantes, de gran dureza, son seccionados por la navaja de diamante o de vidrio del ultramicrtomo Corte Los tejidos deben ser cortados en lminas delgadas para posibilitar su observacin con el microscopio, los instrumentos utilizados para la obtencin de cortes son los micrtomos. Bsicamente, todos los tipos de micrtomo constan de una navaja muy afilada que seccionar el taco histolgico y un mecanismo de avance automtico regulable de a unos pocos micrones (usualmente entre 5 y 8 micrones). Los cortes as obtenidos presentan pequeos pliegues y arrugas que pueden

eliminarse si se los flota en agua tibia, debido a la elevada tensin superficial del agua. Luego de ello se recogen sobre delgadas lminas de vidrio llamada portaobjetos, a las cuales se adhieren generalmente a travs de adhesivos como el silane o la poli-L-lisina. Los cortes se secan y luego se los pasa por solventes intermediarios como el xileno, el benceno o el tolueno y se los hidratada en alcoholes de concentracin decreciente hasta llevarlos al agua destilada para su posterior coloracin. El sistema de congelacin se utiliza para obtener rpidamente cortes histolgicos durante una ciruga para realizar un diagnstico intraoperatorio por medio de micrtomos de congelacin refrigerados por la expansin de dixido de carbono lquido, o bien para conseguir cortes de tejido con su estructura qumica prcticamente inalterada, para los cuales se emplea generalmente el denominado criostato, compuesto por un micrtomo includo en una cmara de baja temperatura. Coloracin La obtencin de cortes delgados soluciona uno de los inconvenientes de la observacin microscpica pero hace evidente a otro de ellos: si bien permite que los cortes sean transparentes, la falta de colores y contrastes en las estructuras celulares no permite visualizar prcticamente ningn componente. La tincin o coloracin se efecta con dos propsitos: - La coloracin rutinaria trata de posibilitar el estudio morfolgico o estructural, sin que se pueda obtener mayor informacin sobre la naturaleza qumica de las estructuras observadas. - La histoqumica utiliza mtodos tendientes a identificar a un determinado tipo de molcula o sustancia, visualizndola microscpicamente. La mayora de los colorantes citolgicos o histolgicos son de naturaleza orgnica y aromticos. Se reconocen dos tipos de colorantes: bsicos y cidos. En los colorantes bsicos el grupo que imparte el color (grupo cromforo) es bsico (catinico). Por ejemplo, el azul de metileno es el clorhidrato de tetrametiltionina, en el que la parte cida (ClH) es incolora. Algunas veces los dos componentes de la sal son cromforos, como en el caso del eosinato de azul de metileno. El grupo por medio del cual el colorante se combina con el tejido se designa auxocromo. La coloracin rutinaria ms empleada es la combinacin de un colorante bsico (hematoxilina) y uno cido (eosina). Caractersticamente la hematoxilina colorea los ncleos y el retculo endoplasmtico rugoso y la eosina colorea los citoplasmas y la mayora de los elementos fibrilares del espacio intercelular. Histoqumica La histoqumica es el conjunto de tcnicas de coloracin destinadas a visualizar sustancias especficas en los tejidos. Este propsito es tanto cualitativo como cuantitativo. Puede realizarse con fines diagnsticos y desde ya resaltemos que los procedimientos histoqumicos (en especial la inmunohistoqumica) se convirtieron en un instrumento invalorable en el diagnstico y/o pronstico de innumerables enfermedades. El mtodo histoqumico en sentido estricto es microscpico debiendo cumplirse varias condiciones: 1) la sustancia original debe ser inmovilizada y visualizada por el microscopio en su

localizacin celular original 2) la sustancia debe ser identificada por un procedimiento que sea especfico para ella o para el grupo qumico al que pertenece.

El siguiente cuadro permite una ubicacin general: - Lpidos - Sudanes - Aceite rojo 0 - Tetrxido de o s m i o - PAS - Azul de Alcian - Metacromasia - Acidofilia y basofilia - Impregnacin argntica - Histoenzimologa - Inmunohistoqumica - Verde de metilo - Pironina - Anaranjado de acridina - Reaccin de Feulgen - Hibridacin in s i t u

- Hidratos de carbono

- Protenas

- Acidos nucleicos

Deteccin de lpidos Durante la tcnica histolgica rutinaria los solventes orgnicos utilizados en los procedimientos de inclusin previos al corte histolgico solubilizan los lpidos. Para evitarlo, se emplean cortes por congelacin. El procedimiento utilizado ms frecuentemente en la demostracin de los lpidos consiste en su tincin con un colorante del grupo de los Sudanes o del Aceite Rojo 0. Estas sustancias son muy solubles en los lpidos y relativamente solubles en solventes como el alcohol 70. Por lo tanto, si una solucin de Sudanes en alcohol se pone en contacto con una preparacin histolgica, como el colorante es menos soluble en alcohol que en los lpidos tiende a abandonar la solucin para pasar a stos (del mismo modo que el pimentn colorea intensamente las gotitas de grasa de un puchero a la espaola), coloreando tanto las gotitas de triglicridos como estructuras lipoproteicas del tipo de la mielina o polmeros lipdicos del tipo de la lipofuscina. El osmio es un fijador que insolubiliza a los lpidos y al mismo tiempo les imparte un color oscuro, por lo que en ocasiones se lo utiliza como fijador y a la vez colorante en preparados de microscopa ptica. Deteccin de Hidratos de Carbono

Reaccin del PAS Tanto la reaccin del PAS como la de Feulgen se basan en la utilizacin del reactivo de Schiff. Este es un reactivo para grupos aldehdos, y stos se pueden demostrar en algunos hidratos de carbono (por oxidacin selectiva), en el ADN (por hidrlisis selectiva) y en algunos lpidos. El reactivo de Schiff se prepara tratando fucsina bsica, que contiene parafucsina (cloruro de triaminotrifenilmetano) con cido sulfuroso. La parafucsina se transforma en un compuesto incoloro (cido bis-N aminosulfnico o reactivo de Schiff), que luego es recoloreado por grupos aldehdo, en este caso los que puedan estar presentes en los tejidos. La reaccin de PAS (Periodic Acid-Schiff) est basada en la generacin de grupos aldehdos libres mediante la oxidacin de los grupos gliclicos 1-2 de los polisacridos, por medio del cido perydico. Este mtodo es positivo para glucgeno, mucinas, mucoprotenas, cido hialurnico y quitina. Metacromasia La propiedad de teir ciertos componentes celulares con un color que difiere del original del propio colorante se denomina metacromasia, y aparentemente depende de la formacin de agregados polimricos del colorante al combinarse con ciertos compuestos. Es caracterstica de algunos colorantes bsicos del grupo de las tiazinas, especialmente la tionina, azur B y azul de toluidina, al colorear molculas con grupos cidos ubicados de modo repetitivo y muy prximos entre s, como ocurre con los glucosaminoglucanos, en particular con los sulfatados (condroitin-sulfato, heparina). Por oposicin, la propiedad de los colorantes teir con su color original se denomina ortocromasia. Deteccin de protenas Acidofilia y basofilia Se conoce como acidofilia y basofilia a un conjunto de coloraciones basadas en el comportamiento de las diferentes protenas a las variaciones del pH. Para comprender esto es conveniente que aprender cul es el mecanismo de accin de la mayora de los colorantes. Se deber recordar la propiedad que tienen las protenas, ciertos polisacridos y cidos nucleicos de ionizarse como bases o como cidos. La ionizacin cida se produce por los grupos carboxilo (.COOH), hidroxilo (-OH), sulfato (.HSO4) o fosfato (.H2PO4). En las protenas la ionizacin bsica se realiza en el grupo amino (.NH2) y en otros grupos bsicos. El punto isoelctrico es el pH en el cual dichas molculas biolgicas no se ionizan en ningn sentido, y que es muy caracterstico de cada una de ellas. Si el pH del medio en el que se realiza la coloracin es superior al punto isoelctrico, los grupos cidos se ionizan y si es menor, se ionizan los grupos bsicos. A causa de esta propiedad, por encima de su punto isoelctrico las protenas reaccionan con colorantes bsicos (violeta cristalino, azul de metileno, fucsina bsica) y por debajo de l, con colorantes cidos (naranja G, azul de anilina), pudiendo de este modo identificarse por ejemplo los diferentes

grnulos proteicos de secrecin de una glndula como la hipfisis. Es interesante considerar tambin que para los cidos nucleicos la carga neta est determinada primeramente por la disociacin de los grupos fosfatos, y el punto isoelctrico es muy bajo (pH 2 o menos). Por esta causa la tincin a pH bajo con colorantes bsicos es casi selectiva para los cidos nucleicos.

Impregnacin argntica El nitrato de plata, en condiciones muy controladas de concentracin, pH y salinidad del medio, precipita sobre grupos amino libres muy caractersticos de algunas protenas permitiendo su identificacin. Actividad enzimtica Las enzimas son catalizadores biolgicos de estructura proteica. La actividad de muchas de ellas puede evidenciarse microscpicamente. En algunos casos la preservacin de esta actividad requiere de cortes de criostato, pero en otros la enzima resiste una breve fijacin en acetona fra, formaldehdo, glutaraldehdo y otros dialdehdos. Las tcnicas enzimticas se basan en la incubacin de los cortes de tejidos con un sustrato apropiado. Por ejemplo, en el mtodo de Gomori para la fosfatasa alcalina se emplean como sustratos steres fosfricos de glicerol. El ion fosfato liberado por hidrlisis enzimtica se convierte en una sal metlica insoluble generalmente en presencia de calcio, y sta a su vez se puede visualizar por su conversin en sulfuro de plomo, plata metlica, sulfuro de cobalto u otros compuestos coloreados. Inmunohistoqumica La inmunohistoqumica se basa en la deteccin de sustancias de los tejidos por medio del uso de anticuerpos. Dichos anticuerpos pueden obtenerse por medio de la inmunizacin de animales de laboratorio contra la protena, polisacrido, cido nucleico u otro tipo de molcula que se desea detectar, en cuyo caso las inmunoglobulinas han sido producidas por varios clones de plasmocitos por lo cual se denominan anticuerpos policlonales. La otra posibilidad, que vali el Premio Nobel a C. Milstein, consiste en fusionar clulas inmortales de un plasmocitoma (tumor maligno de los plasmocitos) con linfocitos B de un ratn sensibilizado contra la sustancia que se desea detectar. El resultante se conoce como hibridoma. Dado que se aslan colonias celulares (clones) en las fases iniciales, cada una de ellas proveniente de una nica clula, los anticuerpos se denominan monoclonales. Ultimamente la ingeniera gentica ha ingresado en el campo de la produccin de anticuerpos, avanzando hacia el ideal de su obtencin "a medida" de la protena que se desea detectar. En la inmunohistoqumica se hace actuar sobre un corte histolgico una solucin con la inmunoglobulina (anticuerpo) capaz de unirse especficamente al componente del tejido que se pretende demostrar (el antgeno). Los anticuerpos que se unen al antgeno no son visibles por s mismos, por lo que es necesario emplear sistemas de visualizacin, habitualmente de tipo enzimtico, aunque tambin se emplean

sustancias fuorescentes para el correspondiente microscopio, o sustancias electrodensas como el oro coloidal o la ferritina, que pueden ser identificadas en microscopa electrnica. Han aparecido seis generaciones sucesivas de sistemas, en orden cronolgico de aparicin y de sensibilidad creciente: 1) Las marcaciones directas, en las que se liga una enzima, fluorocromo o metal pesado al anticuerpo. Este sistema es de muy baja sensibilidad, restringindose actualmente su utilidad a las tcnicas de inmunomicroscopa electrnica cuantitativa. 2) Las marcaciones indirectas en un paso en las que aparece el concepto de anticuerpo primario y secundario, siendo el primario el dirigido contra la protena que se desea detectar y el secundario un anticuerpo contra el anticuerpo primario, marcado enzimticamente. Esto aumenta la sensibilidad del mtodo y facilita el trabajo, puesto que para varios anticuerpos primarios se emplea el mismo secundario. 3) Los sistemas de tipo peroxidasa antiperoxidasa (PAP) que constituyen el primer gran avance en el aumento de la sensibilidad. En estos, luego de incubar con el anticuerpo primario se emplea un anticuerpo secundario en exceso que har de puente entre el primario y un complejo de la enzima peroxidasa con anticuerpo antiperoxidasa. Es importante que los anticuerpos antiperoxidasa sean producidos en el mismo animal que el anticuerpo primario, para que el secundario pueda funcionar como puente. 4) Los sistemas de tipo complejo de avidina biotina (ABC) que se basan en el uso de las lectinas. Estas son sustancias de estructura polisacrida obtenidas de vegetales, bacterias, huevos, etc., capaces de ligarse entre s con extraordinaria afinidad. Para su empleo se liga biotina a los anticuerpos secundarios, despus de lo cual se incuba el tejido con un complejo de avidina unida a biotina marcada con peroxidasa. Recientemente la avidina ha sido reemplazada por la estreptavidina (producida por los estreptococos), que tiene mayor afinidad y menor tendencia a adherirse inespecficamente a los tejidos. Una variante de estos mtodos es el sistema biotina - estreptavidina marcada (LsAB), en el cual luego del secundario biotinilado se incuba el tejido con estreptavidina marcada con peroxidasa. 5) La tecnologa en polmeros consiste en montar los anticuerpos secundarios y las enzimas sobre macromolculas muy flexibles y estables en solucin, de modo que se puede reducir la tcnica a un solo paso luego de incubar con el anticuerpo primario e inmediatamente revelar. Esta tecnologa ha aumentado significativamente la sensibilidad de las tcnicas inmunohistoqumicas, permitiendo utilizar muy diluidos los anticuerpos primarios. Con el mismo principio se han producido anticuerpos primarios y las enzimas sobre las mismas macromolculas reduciendo la tcnica a un solo paso. 6) Los sistemas de amplificacin catalizada de la seal (CSA) constituyen el salto ms reciente en sistemas de deteccin. Este sistema consiste en efectuar una inmunomarcacin convencional con sistema biotina-estreptavidina hasta el paso del revelado. Normalmente las marcaciones con la enzima peroxidasa se revelan con diaminobencidina (DAB), la cual permanece incolora y estable en solucin hasta que se oxida con el oxgeno naciente en la degradacin del perxido de hidrgeno por la accin de la peroxidasa, precipitando como su derivado de coloracin parda. El sistema de amplificacin catalizada de la seal emplea para el paso del revelado

un derivado fenlico biotinilado (tiramina biotinilada) incoloro y estable en solucin hasta que se oxida con el oxgeno naciente en la degradacin del perxido de hidrgeno por la accin de la peroxidasa y precipita en el tejido, dejando en este gran cantidad de biotina. Posteriormente el tejido se incuba nuevamente con estreptavidina ligada a peroxidasa y finalmente se efecta el revelado convencional con DAB. Este sistema multiplica unas 1000 veces la sensibilidad con respecto al sistema ABC.

Deteccin de cidos nucleicos Los mtodos citoqumicos para cidos nucleicos dependen de las propiedades delos tres componentes que constituyen sus nucletidos (pentosa, cido fosfrico y base nitrogenada). La basofilia est originada por la presencia de los grupos fosfato, tanto del ADN como del ARN y para ella son muy utilizados el Azur B y el azul de toluidina a pH muy bajo. El verde de metilo en ciertas condiciones colorea principalmente al ADN, y la pironina al ARN. Utilizando el colorante anaranjado de acridina sobre un corte de tejido, luego de la acetilacin, es posible obtener una fluorescencia verde para el ADN y roja para el ARN. Reaccin de Feulgen La reaccin de Feulgen depende de la presencia de desoxirribosa. En este mtodo, los cortes de tejido fijados se someten a una hidrlisis cida dbil con cido clorhdrico, y luego se tratan con el reactivo de Schiff. Esa hidrlisis es suficiente para extraer el ARN, que desaparece, pero no el ADN. El mecanismo de la reaccin tiene los siguientes pasos: 1) la hidrlisis cida extrae las purinas a nivel de la unin desoxirribosa-purina del ADN y de esta manera libera los grupos aldehdos de la desoxirribosa; 2) los grupos aldehdos libres reaccionan con el reactivo de Schiff. Cuando se aplica a la clula, la reaccin es positiva en el ncleo y negativa en el citoplasma. En el ncleo las masas de cromatina condensadas son particularmente positivas; el nucleolo es Feulgen-negativo. En condiciones estrictamente controladas, la intensidad de esta coloracin se correlaciona con la cantidad de ADN presente, y se puede determinar citoespectrofotomtricamente. La determinacin de la ploida celular por este mtodo es particularmente empleado en el estudio ciertos tumores humanos, especialmente como factor pronstico y condicionante de la terapia. Hibridacin in situ La hibridacin in situ consiste en la deteccin de secuencias muy especficas de un cido nucleico a travs de su capacidad de aparearse con una secuencia complementaria. Esta tcnica se implementa usualmente para el ADN, consistiendo su primer paso en separar las cadenas del mismo (desnaturalizacin), por medio del calentamiento a 90 C. A continuacin se incuba el corte con una secuencia de ADN de simple cadena y complementaria con la que se quiere investigar conocida como sonda y que se ha marcado de alguna manera (generalmente con fluorescena o con biotina). Posteriormente se visualiza con alguno de los sistemas similarmente a como

se lo hace para la inmunohistoqumica. Los principales tipos de hibridacin in situ son: 1) La hibridacin no fluorescente de ADN, utilizada frecuentemente para detectar virus y otros microorganismos con ADN, para identificar copias simples de genes individuales, y para identificar traslocaciones y otras anomalas cromosmicas. 2) La hibridacin no fluorescente de ARN mensajero, empleada para el estudio de la expresin de genes a nivel celular y subcelular. 3) La hibridacin fluorescente de ADN (FISH), de gran utilidad para realizar el cariotipo del ncleo en interfase. Montaje Consiste en colocar sobre el corte histolgico ya coloreado una delgada lmina de vidrio llamada cubreobjetos, el cual se adhiere con algn adhesivo transparente conocidos como medios de montaje. Previamente, y dado que stos son una sustancias hidrofbicas los cortes se deshidratan en alcoholes de concentracin creciente pasndolos despus por solventes intermediarios como el xileno, el benceno o el tolueno. El medio de montaje clsico es el Blsamo del Canad, el cual prcticamente se ha dejado de utilizar debido a que ha sido superado por los medios sintticos como el DPX y otros. Artificios de la tcnica Con el nombre de artificios de la tcnica se conocen una serie de imgenes que se observan en los cortes histolgicos ocasionadas por los diferentes pasos de la tcnica histolgica. El siguiente cuadro general sirve de orientacin: - Obtencin - Atriccin y aplastamiento del tejido por pinzas, e t c . - Desecacin, en general por depositar pequeas muestras de tejido sobre una gasa y demorar su fijacin - Autlisis, por demorar la fijacin - Autlisis, por emplear pequeos volmenes de fijador para piezas mayores de 1 cm c b i c o - Retraccin, mayor con los alcoholes - Pobre coloracin, mayor con las sales y el o s m i o - Precipitados, mayor con las s a l e s - Retraccin, por sobrecalentamiento - Rayas, por melladura de las navajas - Pliegues, por falla al extender los c o r t e s

- Fijacin

- Inclusin - Corte

- Coloracin

- Ausencia de coloracin, generalmente en las reacciones histoqumicas por falla en alguno de sus p a s o s - Sobrecoloracin, al extenderse en el t i e m p o - Precipitados, por no filtrar los colorantes - Burbujas de aire y gotas en el medio de montaje

- Montaje